El laboratorio de microbiología frente al bioterrorismo (página 2)

La respuesta mundial a los crecientes peligros de las armas biológicas, no ha satisfecho la esperanza requerida. El tratado de 1972 para la no proliferación de armas químicas y

biológicas, fue un paso útil que cimentó el consenso internacional de que éste tipo de armas era moralmente horrible. Las violaciones flagrantes al pacto por las naciones que se habían comprometido a cumplirlo, subraya sus inherentes debilidades.

Durante la "guerra fría" a pesar de que predominó el concepto de lo que se ha denominado como "ceguera nuclear", visión definida como la actitud de que el poder de destrucción nuclear es tal que nada más puede ser tomado en cuenta, Estados Unidos continuó con un programa de armas biológicas, al igual que Rusia, desarrollándose dos sitios principales de producción de agentes biológicos: Fort Detrick en Estados Unidos.

Al Hakam en Irak y BioPreparat , Obolensk, Stepnogorsk, Vector, Sverdlovsk y la Isla Vozrozhhdeniye en la Unión Soviética.

La batalla de gobierno americano contra las cartas cargadas de esporas ilustró las enormes lagunas científicas respecto al Ántrax, uno de los gérmenes más antiguos y más eficaces que los científicos militares habían convertido en arma.

El 21 de Enero de 1999 el expresidente norteamericano Bill Clinton manifestó en una conferencia de prensa : " Ni siquiera las armas nucleares o las armas químicas son tan aterradoras como la guerra bacteriológica. Aunque un ataque químico sería finito, un ataque biológico se extendería por la tierra, sobre todo si los perpetradores liberaran un agente contagioso que no fuera identificado rápidamente, ni tratado de manera adecuada. Un ataque con gérmenes, sería un regalo que va de mano en mano ".

Las toxinas biológicas son cientos e incluso miles de veces más letales por unidad de peso que cualquier agente químico conocido. Desde la perspectiva militar, las armas biológicas tienen diferentes tiempos para hacer su efecto, lo que las hace impredecibles, y por lo tanto ejemplares para operaciones clandestinas y/o guerra de baja intensidad.

Se estima que un arsenal biológico puede ser producido en un espacio de no más de cinco metros cuadrados y con una inversión de $ 10,000.00 en equipo. Por esto, " la bomba atómica de los países pobres " puede ser desarrollada por cualquier país a un costo muy bajo. Se estima que el costo por atacar con armas convencionales a civiles desprotegidos es de aproximadamente $ 2000.00 por kilómetro cuadrado, de 800 dólares con armas nucleares, 600 dólares con gases químicos, y un dólar con el uso de armas biológicas. ( Ref. Robinson p. The problems of chemical and biological Warfare.1998. CB Weapons today. ).

Muestras de la biotecnología aplicada al terrorismo, especialmente en el campo de la ingeniería genética fueron los trabajos del equipo militar Ruso de investigaciones en los Institutos Obolensk y BioPreparat que manifestaban haber podido reestructurar la legionella modificada con genes de mielina, tal que aunque el microorganismo fuera eliminado, aún permanecía en el paciente síntomas de parálisis y daño cerebral como reacción posterior por la infección de esta cepa de Legionella recombinante. Igualmente se trabajó en introducir en la bacteria de la peste ( Yersinia pestis ), el gen que crea la toxina de la difteria. Así también cepas de Ántrax resistente a antibióticos y a las vacunas, como también cepas mortales con marcadores étnicos.

La comunidad internacional ha empezado a debatir si los ingenieros genético y los médicos militares, deberían adoptar su propia versión del juramento Hipocrático : No hacer daño

Todo lo anterior nos permite hacer válido en nuestros tiempos las palabras del estadista americano Thomas Jefferson : El precio de la libertad, es la eterna vigilancia.

OBJETIVOS DE LAS ARMAS BIOLÓGICAS

Los objetivos de las armas biológicas dependen de lo que se pretende conseguir, tanto en la población como en el ambiente; sin embargo, ellas están dirigidas principalmente a :

• Seres humanos ( Combatientes o civiles ).

• Cosechas alimenticias.

• Animales.

• Plantas de tratamiento de agua.

• Suelo.

• Aire.

• Combinaciones de varios objetivos.

La utilidad de las armas biológicas están dirigidas principalmente para :

• Eliminar a la población para ocupar territorio

• Eliminar o invalidar fuerzas militares o estratégicas

• Producir terror

• Objetivos políticos

El bioterrorismo en la historia

El empleo de agentes biológicos como arma no es un concepto nuevo. La historia de su uso ofrece numerosos ejemplos de su utilización aun antes del desarrollo de la microbiología. Existen evidencias que sugieren que civilizaciones como las de los persas y romanos contaminaban el agua potable de pozos y acueductos de sus enemigos arrojando en ellos animales muertos.

En el siglo VI AC Asirios envenenan los pozos enemigos con desechos pútridos.

Durante el siglo XIV en el sitio de Kaffa (ahora Feodossia ) en Ucrania, las fuerzas tártaras sitiaron la ciudad y obligaron a rendirse a sus habitantes infectándolos intencionalmente con Yersinia pestis al lanzar con catapultas por sobre las murallas de la ciudad los cuerpos sin vida de sus propios soldados muertos por plaga. Esta enfermedad epidémica causó el aniquilamiento de un tercio de la población europea de la época. Esta misma estrategia bélica fue utilizada por el ejército ruso contra Suecia en 1710.

En 1532 en la conquista de Perú, Francisco Pizarro reparte ropa ( frazadas ) de muertos por viruela entre los Incas, consiguiendo la diseminación de la viruela en forma muy efectiva. Igual en EEUU, en 1763, Sir Jeffrey Amherst, comandante de tropas británicas durante la guerra de independencia de Estados Unidos, diseminó la viruela entre los nativos americanos utilizando pañuelos y cobijas de personas que habían muerto de viruela.

Entre 1937 y 1941 en la unidad 731, se experimentó en Ping Fang Manchuria una amplia gama de agentes virales y bacterianos, especialmente Antrax, inoculándolos directamente o a través de aire, agua o alimentos contaminados tanto en animales como en humanos, causando la muerte de más de 10,000 personas. Con posterioridad a la Segunda Guerra Mundial se estimó que alrededor de 3000 prisioneros murieron en relación a estos experimentos. En 1940, se produjo una epidemia de plaga en China y Manchuria, su inicio se relacionaron con una "lluvia de pulgas" infectadas con Yersinia pestis arrojadas por aviones japoneses que sobrevolaron la zona afectada.

En 1979 una falla en los sistemas de filtración dio origen a un pequeño aerosol de esporas de ántrax, que se diseminó en la población de Sverldovsk, originando 79 casos de ántrax de los que 66 murieron. En 1984 Durante un solo mes en   Dallas, Oregon, 751 personas desarrollaron gastroenteritis por Salmonella luego de la contaminación de los "salad bar" en varios restaurantes por el culto religioso Rajneeshees.

En el año 2001 los casos de contaminación por Anthrax en EEUU fueron actos terroristas.

Característica del arma biológica ideal

Las armas biológicas se caracterizan por tener grandes ventajas como :

• Cobertura de grandes áreas.

• No producen daños al material inerte.

• Son baratos al comparar con otras armas.

• Difícil detección e Identificación debido a los largos períodos de incubación.

• No detectable por nuestros sentidos : Incolor, inodor.

• Permiten el progreso Epidémico.

Por lo anterior, las características de un arma biológica perfecta deben ser :

• Alta infectividad ( Dosis infectante baja ). Que requiera pocos organismos o pequeña cantidad de material.

• Que sea muy contagioso ( Rapida diseminación ).

• Altamente letal.

• De fácil diseminación y estable en almacenamiento ( Listo para usar )

• Resistente a las condiciones ambientales.

• Resistente a tratamiento ( Vacunas, antibióticos, drogas, antídotos, etc ).

Creemos que ésta denominación recae sin lugar a dudas en el Ántrax.

Elementos que sugieren un ataque bioterrorista

Durante la rutina diaria de los microbiólogos, se tiene una idea razonable de los microorganismos que están involucrados en los diferentes procesos infecciosos, por lo que la investigación se enfoca en primer lugar en los agentes típicos de los enfermedades infecciosas. Sin embargo, cuando se trata de un ataque terrorista con armas biológicas, el microbiólogo debe pensar primero en lo menos probable, ya que los agentes involucrados no forman parte de la rutina investigativa en los laboratorios de microbiología. Por esto decimos que en caso de sospecha de ataque bioterrorista, " Cuando oigas pasos sonar … piensa primero en , no en caballo "

Algunos elementos que pueden sugerir un ataque bioterrorista pueden ser:

• Epidemia sorpresiva de síndromes clínicos específicos en población definida.

• Aumento rápido de número de enfermos procedentes de población sin factores de riesgo.

• Muertes inexplicadas.

• Brote de enfermedad más grave que lo conocido.

• Muchos casos de enfermedad adquirida por vía menos frecuente.

• Casos únicos de enfermedad previamente inexistente.

• Brotes por cepas inusuales.

• Brotes en humanos con casos en animales.

• Mayor número de casos con evolución fatal de los esperados.

• Brotes anunciados por grupos terroristas.

• Inusual brote de enfermedad fuera de temporada o área geográfica.

• Enfermedad inexplicada en adultos jóvenes.

• Aumento de casos de parálisis flácida aguda o erupciones en extremidades.

• Enfermo con una enfermedad inusual y que está descrita como potencial arma biológica en personas que no estaban expuestos a éstos agentes por su trabajo, viajes, etc.

Ref. CDC- MMWR. October 19,2001/50(41);893-89

Por lo anterior, es importante tener siempre presente que :

• A diferencia de las sustancias químicas, los efectos de los agentes biológicos serán vistos en muchos casos en días después de la exposición.

• El reconocimiento precoz de los casos ( la mayoría tiene signos inespecíficos ), es vital para organizar un sistema de vigilancia que evite la propagación masiva.

Defensas contra las armas biológicas

• UMáscara respiratoriaU : Los filtros, normalmente de carbón activado, han de bloquear las partículas mayores de un micrometro.

• URefugioU : Lo mejor es un habitación cerrada, aislada con un recubrimiento plástico o de cualquier otro material aislante y ventilación con aire filtrado.

• UDescontaminación.

• UVacunación U: Para agentes específicos. Para muchos agentes no se conoce vacuna.

• UAntibióticosU : Son eficaces frente algunas bacterias, pero no frente a todas.

( Ineficaces contra los virus.)

• USistemas de detecciónU : La mejor arma es la prevención.

Agentes etiológicos de las armas biológicas

Desde el punto de vista práctico, casi cualquier germen capaz de causar enfermedad, puede ser utilizado como arma biológica, ya que cada uno tiene características morfológicas, patológicas y epidemiológicas que pueden ser aplicadas dependiendo del daño que se quiera infligir. Sin embargo, en Centro para el Control de Enfermedades Transmisibles de Atlanta ( CDC ) ha hecho una clasificación que es utilizada mundialmente. En dicha lista se incluye tres categorías en función de la facilidad de su transmisión y mortalidad producida.

•  CATEGORIA A :

• Requieren alta prioridad de respuesta

• Se diseminan fácilmente o se transmiten persona a persona

• Producen alta mortalidad, con potencial para un gran impacto en salud pública.

• Pueden causar pánico y desequilibrio social

• Requieren acción especial/intervención sanitaria pública

• Es necesario preparación previa del personal

Entre ellos están :

• Bacillus anthracis (ántrax)

• Toxina del Costridium botulinum (botulismo)

• Yersinia pestis (peste)

• Variola mayor (viruela)

• Francisella tularensis (tularemia)

• Fiebre hemorragica viral ( Ebola, Lassa, Marburg )

CATEGORIA B :

• Se diseminan con facilidad moderada

• Causan morbilidad moderada y mortalidad baja

• Requieren refuerzos específicos de la capacidad diagnóstica y aumento en la vigilancia de la enfermedad

Incluye a

• E. coli 0157:H7

• Brucelosis

• Shigella dysenteriae

• Enterotoxina B de Estafilococcus aureus

• Vibrio cholerae

• Burkholderia mallei

• Burkholderia pseudomallei

• Toxina del Cl. perfringes

CATEGORIA C :

• Son fácilmente disponibles.

• Presentan facilidad en su producción y diseminación.

• Posee potencial para provocar alta morbilidad y mortalidad, además de tener impacto público importante.

Entre ellos

• Hanta virus

• Fiebre amarilla

• TBC multirresistente

• Cryptosporidium sp

• Virus Nipah

Bioseguridad en el manejo de agentes biológicos peligrosos

Las Normas de trabajo en microbiología obligan al establecimiento rutinario de medidas estrictas en el manejo de especimenes potencialmente peligrosos. Estas indicaciones se multiplican cuando se trata de microorganismos potencialmente utilizables como armas biológicas, debido a la letalidad reconocida de éstos agentes. Por lo anterior recomendamos firmemente las Normas del CDC de Atlanta al respecto. ( Ref. Primary Containment For Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. CDC/NIH. U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service. Washington, 1995 ). (Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service (4ª ed.). Washington, 1999 ).

Cabina de Seguridad Clase III

URiesgo en el laboratorio de los agentes de bioterrorismoU :

PRECAUCIONES

• Utilizar cabina de seguridad biológica de nivel II ( BSL-2) ó III ( BSL-3).

• Evitar cualquier actividad en el área del personal con riesgo de exposición y especialmente la producción de aerosoles.

• Descontaminar el laboratorio después de cada uso y descarte todo el material en receptáculos apropiados. Esterilice la bata.

• Evite tocarse las mucosas con las manos ( con o sin guantes ).

Las peores amenazas

Las peores amenazas están como es de esperar, dentro del grupo A , y entre ellas describiremos a las principales :

• Bacillus anthracis

• Yersinia pestis

• Francisella tularensis

• Viruela

• Toxina del Clostridium botulinum

• Fiebre hemorragica viral ( Virus de Ebola, Lassa y Marburg ).

Todos estos microorganismos utilizan uno o varias rutas de entrada al organismo, :

• Ingestión (Gastrointestinal ) por contaminación del agua y alimentos

• Inyección (Piel / Membranas mucosas) por cortaduras, lesiones leves, etc

• Inhalación (Respiratorio ). Especialmente aerosol. Contaminación del aire

a) Bacillus anthracis

UB. anthracis en agar sangre

B. anthracis , un bacilo grampositivo esporulado, fué la primera bacteria que se identificó como causante de una enfermedad. Su nombre deriva del griego Anthrakis que significa carbón, en alusión al color negro de su pústula, por lo que se le conoce también como Carbunco. Ya El Génesis lo cita como causante de la V Plaga de Egipto. Es una enfermedad zoonótica caracterizada por la habilidad del bacilo para formar esporas. El Carbunco natural es primariamente una enfermedad zoonótica de herbívoros : Cabras, ovejas, vacas, caballos y otros animales transmiten el bacilo por medio de la piel, cuero, lana, pelo, huesos, heces, orina y saliva.

Es endémica en muchos países como México, Nicaragua, Argentina, Bolivia, Perú, Africa central y China. Las humanidad tuvo la suerte que dos de los más grandes microbiólogos lo estudiaran : Roberto Koch reprodujo la enfermedad en animales y Luis Pasteur creó la primera vacuna ( animales ).

Los factores de virulencia que se conocen son tres proteínas denominadas en conjunto toxina del carbunco y un polipéptido capsular antifagocitario.

Ellos son el Factor Edema (FE), el Factor Letal (FL) y el Factor Antígeno protector (AP). Los genes encargados de elaborar la toxina del carbunco y el polipéptido capsular se hallan en plásmidos de B. Anthracis independientes. La combinación de los factores en una cepa produce los signos clínicos específicos, así :

FE + AP : Produce edema. 

AP + FL : Producen la actividad letal.

FE + FL : Inactivo. 

AP + FL + FE : Produce edema y necrosis y es letal.

La toxina del Factor Letal (LF) del Anthrax afecta las células dendríticas y disminuye la respuesta inmune para combatir el microorganismo ( Ref. Nature. Emory University. July 17, 2003 ).

Algunas características clínicas son :

• Dosis infectiva (LD50): 8,000 – 15,000 esporas

• Periodo de Incubación : 1-6 días

• Duración de la enfermedad : 3-5 días

• Fiebre, malestar y fatiga

• Abrupto distrés respiratorio…muerte < 24 hrs

• No hay transmisión de persona a persona

• Los aislamientos son sensibles a las drogas de elección : Doxyciclina y Ciprofloxacina.

El ántrax es considerada el arma biológica perfecta por sus características :

• Letal ( forma respiratoria )

• Requiere dosis baja

• Bajos costos de producción

• Fácil almacenamiento

• No detectable por los sentidos ( Inolor, Indolor )

• Resiste malas condiciones ambientales ( espora )

• Fácil de diseminar

• Resistente a desinfectantes

La Oficina de Evaluación de Tecnología del Congreso Americano informó que un pequeño aeroplano cargando 100 kg de esporas de ántrax podría utilizar un fumigador para diseminar una dosis fatal para 3.000.000 de personas. Un informe de la Organización Mundial de la Salud estimó que si un aeroplano libera 50 kg de ántrax a lo largo de 2 km en la dirección del viento, sobre una población de 500.000 personas, 95.000 podrían morir y 125.000 serían incapacitadas.

Tiene tres formas de infección : Inhalación, cutánea e intestinal.

Ciclo del Anthrax

a1 ) Ántrax cutáneo :

Ocurre al entrar en contacto la bacteria ( Espora ) con piel no intacta. Tiene un periodo de incubación de 1 a 10 días. Produce una pápula indolora, luego evoluciona a úlcera necrótica típica. Esta es la forma más común en casos naturales. Generalmente ocurre en la cabeza, antebrazos y manos, causando inicialmente un prurito, luego evoluciona a una pápula y luego a una escara negra hundida, rodeada de edema.

a2) Ántrax intestinal :

La forma intestinal de Antrax puede seguir al consumo de alimentos, especialmente carne de animales contaminados, caracterizado por una inflamación intestinal aguda. Perido de incubación de 1 a 10 días.

Los signos iniciales son náusea, pérdida de apetito, vómito y fiebre , seguido de dolor abdominal, vómito y severa diarrea sanguinolenta.

Tiene una mortalidad entre el 50% – 100%, especialmente en niños.

c3 ) Ántrax por inhalación :

Las esporas de ántrax aerosolizado causan la forma respiratoria de la enfermedad (conocida tradicionalmente como la enfermedad de los cargadores de lana). Las Esporas son inhaladas y luego ingeridas por los macrófagos . Pasan a alveolos y bronquiolos donde germinan y producen toxinas que causan edema , hemorragia y efusión pleural.

Luego de un período de incubación de 1 a 5 días, el paciente desarrolla una enfermedad prodrómica caracterizada por fiebre, malestar, tos no productiva y malestar respiratorio. Un período asintomático de 2 a 3 días puede ocurrir, o el paciente puede progresar directamente a una enfermedad fulminante con disnea severa, estridor, cianosis, distrés respiratorio, mediastinitis hemorrágica, shock séptico, meningitis (50%) y muerte. Una vez que los síntomas ocurren, el ántrax inhalatorio es usualmente fatal a pesar del tratamiento antibiótico ( Ciprofloxacina ).

Las cartas contaminadas con ánthrax enviadas a los senadores Brokaw y Daschle y a algunos medios periodísticos posterior al ataque a las Torres Gemelas de New York, provocaron el caos mas grande en los sistemas de correo del mundo. La aparición del primer caso de ántrax pulmonar en Florida confirmó estas aprehensiones. Entre octubre y noviembre del 2001 ocurrieron 10 casos de ántrax pulmonar producto de inhalación de esporas enviadas por correo en cartas o paquetes. Mas de 125,000 muestras clínicas evaluadas. Un millón de muestras ambientales estudiadas. Incluso fue necesario la preparación de Manuales para la vigilancia de las cartas en el correo. ( Ref. CDC – Recommendation for Protecting Workers from Exposure to Bacillus anthracis in Work Sites where Mail is Handled or Processed. Oct 31, 2001 ). Todo lo anterior obliga a los laboratorios a establecer protocolos de trabajo para manejar casos similares en el futuro.

DIAGNOSTICO ETIOLOGICO DEL ANTHRAX:

a) Especimenes aceptables:

1. Anthrax cutáneo:

a. Etapa vesicular: Coleccione el líquido vesicular de manera aséptica con un hisopo estéril, de una vesícula no abierta.

Nota: Los bacilos del ántrax son vistos con más probabilidad por tinción de Gram en la etapa vesicular.

b. Etapa de Escara : Recoger el material de la escara cuidadosamente

levantando el borde externo de la escara; insertar un hisopo estéril, después

rotar lentamente debajo del borde sin desprenderla.

2. Ántrax gastrointestinal:

a. Cultivo de sangre: Recoger el volumen de la sangre y el número apropiados de botellas según el protocolo del laboratorio. En fases posteriores enfermedad (2-8 días post-exposición) los cultivos pueden producir crecimiento del microorganismo, especialmente si se obtienen antes del tratamiento con antibióticos.

b. Heces: Transfiera = 5 g de las heces directamente en un envase hermético, limpio, seco, estéril y de boca ancha.

c. Hisopo Rectal : Para pacientes a los que no se les puede recoger espécimen, obtenga una muestra insertando un hisopo rectal dentro del esfínter anal.

3. Ántrax por Inhalación:

a. Cultivo de sangre: Recoger el volumen de sangre y el número apropiados de set según el protocolo del laboratorio.

b. Esputo: Recoger > 1 ml de espécimen del tracto respiratorio inferior en un envase estéril. El ántrax de Inhalación por lo general no da lugar a la formación de esputo.

b) Transporte del espécimen y almacenamiento:

1. Hisopos : Transportar directamente al laboratorio a temperature ambiente. Para transporte por > de 1 hora, transportar a 2 – 8°C.

2. Heces : Transportar las heces no preservadas al laboratorio dentro de 1 hora. Para transporter por > 1 hora, trasnporte a 2-8°C en medio de Cary-Blair o equivalente.

3. Esputo : Transportar en envase estéril, con tapa de rosca, a temperature ambiente. Cuando el tiempo de transporte es de > 1 hora, transporte a 2 – 8°C.

4. Hemocultivos : Transporte directamente al laboratorio a temperature ambiente.

c) Cultivo :

c1) En la cabina de bioseguridad clase II o III, inocule la muestra en medios de agar sangre al 5%, agar alcohol-fenil-etílico y Tioglicolato o su equivalente.

c2) Incubar por 24 horas a 35 – 37 ? C a temperatura ambiente ( CO2 es aceptable ).

d) Lectura :

Observe el crecimiento y haga las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación y diferenciación del germen.

d1 ) Criterios de identificación presuntiva :

• Bacilos Grampositivos

• Crecimiento característico en agar sangre ( Colonias rugosas, de 2 a 5 mm de diámetro, convexa, de bordes irregulares )

• Formador de esporas

• Movilidad negativa

• Catalasa positiva

• Formación de cápsula (La tinta china permite visualizar la cápsula en muestras de sangre y LCR ).

• No hemolítica en agar sangre

Criterio de descarte : La morfología al Gram, la hemólisis o la movilidad, pueden descartar la presencia del B. anthracis.

Frotis por Gram de B. anthracis

Tips:

• La especie más común de Bacillus sp. enviado al CDC para descartar B. anthracis es la variedad no motil de B. megaterium.

• Diferenciar las colonias del B. cereus var. mycoides.

• Inactivación en el laboratorio : 121º C por 45 minutos.

Ref. J. of Clin. Microb. Vol.41, No.2, February 2003

UDIFERENCIACIÓN ENTRE BACILLUS ANTHRACIS Y BACILLUS sp

Ref : Bioterrorism: Implications for the clinical microbiologist. Clin. Microb. Review, April 2001, p.364-381, Vol.14, No.2

Vacuna contra el Anthrax :

• La primera vacuna por Luis Pasteur (1881).

• 6 dosis (ya hay protección después de 3era).

• Efectividad 93% para infección cutánea y muy alta para respiratoria.

• Vacuna para animales no sirve para humanos.

• Indicación limitada a personal de laboratorios de ántrax, militares, trabajadores con animales.

• La vacuna consiste en un filtrado estéril no infeccioso de un cultivo de una cepa atenuada de B. anthracis, absorbida a un adyuvante( hidróxido de aluminio). BioThrax"¢ [BioPort Corporation, Lansing, Michigan].

• El componente protectivo de la vacuna es un extracto de antígeno protector. Formaldehído (concentración final, 0,02% ) es adicionada como estabilizador y cloruro de benzeno (0.0025 % ), como un preservativo.

• Es imposible contraer la enfermedad a partir de la vacuna.

UDesinfección / Destrucción de esporas de B. anthracisU:

Desinfectantes usados para destruir las esporas del B. anthracis

• Formalina al 2 a 10% por 30 minutos a 40 °C

• Formalina al 0.25% por 6 horas a 60°C

• Acido paracetico al 3% a razón de 8 litros (2 galones) /metro cuadrado por 10 minutos.

• Hipoclorito del sodio (10.000 PPM) 5 –10 minutos a temperatura ambiente

• Iodo a 100 –300 PPM por 1 –5 minutos a temperatura ambiente

Uso del calor para destruir el B. anthracis

Para pequeños volúmenes o contaminación ligera, autoclavar a 121 Po PC por 30 minutos. Para bolsas de autoclave, etc. que contiene los materiales usados y contaminados del laboratorio, platos de cultivo, etc, autoclavar a 121°C por 60 minutos

Fumigación:

El formaldehído es un gas y es generado hirviendo las soluciones del gas en agua

( formalina ) o calentando formaldehído fuertemente. El agua se satura hasta aproximadamente 37%, por lo que la formalina concentrado es 37% formaldehído.

( Ref. CDC- Manual of Laboratory Diagnosis of Anthrax. Annex 5- T Disinfection and Sterilization Practices). T

b) YERSINIA PESTIS :

A lo largo de la historia, Yersinia pestis, agente causante de la Plaga o Peste Negra, una enfermedad zoonótica que ha provocado más de 200 millones de muertes, especialmente en el medioevo ( 1300´s ), luego del contagio, una vez que llega al flujo sanguíneo del enfermo, infecta sus ganglios linfáticos, formando los 'bubones'. Después, el patógeno llega a los pulmones y la enfermedad se vuelve mortal. Constituye una enfermedad de la antigüedad, de la que existen numerosas narraciones bíblicas y medievales, y que ha permanecido hasta nuestros días.

La transmisión al hombre es mayor durante primavera y verano, época en la que se incrementa la vida al aire libre y el contacto con los animales responsables de la transmisión. Los roedores urbanos y selváticos ( ratas, ardillas y coyotes ) y las pulgas son los principales agentes transmisores de la enfermedad. El hombre se contagia cuando es picado por las pulgas de las ratas infectadas. La peste bubónica posee un período de incubación de hasta una semana, tras la cual los microorganismos proliferan en los ganglios linfáticos de la región del cuerpo donde se produjo la picadura.

Existen distintas formas clínicas, de las cuales la más común es la forma bubónica. Otras menos comunes, pero más graves son la neumónica ( respiratoria ) , septicémica y meníngea. Habitualmente comienza como un cuadro febril, acompañado de escalofríos, cansancio y dolores de cabeza. Posteriormente aparece el denominado bubón, con hinchazón y un intenso dolor en la región corporal afectada a la palpación de ganglios linfáticos (sobre todo de la ingle, axila y cuello). Estas lesiones son ovaladas, de varios centímetros de diámetro, sobreelevadas y de color rojizo.

 Lo característico del cuadro es la brusca instalación de la fiebre y el bubón que en el curso de pocos días puede llevar a la muerte. La peste septicémica se caracteriza por presentar, además de los bubones, una invasión de los microorganismos de la circulación sanguínea con gran repercusión del estado general. En la de tipo neumónica se produce una de las complicaciones más serias de la peste: la neumonía secundaria, que llega a los pulmones a través de la sangre.

Se ha demostrado la relación de algunas pulgas ( Xenopsylla cheopsis ) como parte importante en el ciclo de la enfermedad. Recientemente se han identificado 2 factores bacterianos llamados Hemin Storage Phenotype (Hms) y Yersinia Murine Toxin (Ymt), que juegan un importante papel en mantener el ciclo de la Y. pestis en el vector.

Ref. ASM News, Vol.69, No.7, July 2003

Muestras Aceptables :

•  1. Tracto respiratorio bajo (neumónica): Lavado bronquial o aspirado transtraquial  (= 1 ml). Las muestras de esputo se pueden examinar pero esto no se aconseja dado a su contaminación con flora normal de la garganta.

•  2. Sangre (septicémica): Extraiga una cantidad apropiada de sangre en volumen y  número de juegos de acuerdo al protocolo establecido del laboratorio. Nota: en  los casos en que se sospecha de plaga, una muestra adicional de sangre o cultivo   de caldo (por lo general caldo nutriente) se debe de incubar a temperatura   ambiente (22-28 °C), la temperatura a la cual Y. pestis crece más rápidamente.   No agite el cultivo adicional en caldo ya que las características de la formación   de crecimientos de Y. pestis se puedan visualizar claramente.

• Aspire una muestra de tejido (bubónico o biopsia: hígado, bazo, médula ósea o pulmón). Nota: los aspirados pueden producir poco material; por lo tanto un pequeño chorro con solución salina estéril se puede utilizar para obtener una cantidad adecuada de muestra. La jeringa y la aguja de la muestra aspirada deben permanecer tapadas, aseguradas con cinta adhesiva y enviadas al laboratorio.

Transporte de la muestra

 1. Respiratoria o esputo: transporte las muestras en contenedores estériles con tapa  de rosca a temperatura ambiente. Si se sabe que el material será transportado de entre 2-24 horas después de la toma de la muestra, entonces mantenga el contenedor de transporte entre 2-8°C.

 2. Sangre: Transporte las muestras directamente al laboratorio a temperatura  ambiente. Manténgala a temperatura ambiente hasta que se coloque en una incubadora o instrumento para cultivos de sangre. No se refrigere. Siga los  protocolos establecidos del laboratorio para el procesamiento de cultivos de sangre.

 3. Muestras de tejido aspirado y biopsias: Remita la muestra de tejido o aspirados en  un contenedor. Para muestras pequeñas añada de 1-2 gotas de solución salina  normal para mantener el tejido hidratado. Transporte la muestra a temperatura  ambiente para su procesamiento inmediato. Mantenga la muestra fresca (a baja  temperatura) si se espera que su procesamiento se retarde.

 4. Hisopos: No se recomiendan las muestras de tejidos tomadas con hisopo. Sin  embargo si se toma una muestra con hisopo, este deberá reinsertarse en el paquete  de transporte para ser transportado.

Frotis:

La presencia de células bipolares en estos frotis deben de disparar la sospecha de plaga. La tinción Wright frecuentemente revela las características bipolares de tinción de Y.pestis, mientras que la tinción de Gram puede no revelarlas. La tinción Wright-Giemsa son las más confiables para resaltar las características bipolares de tinción de estos bacilos gram negativos.

Tinción Giemsa de frotis sanguíneo con Y. pestis, de un paciente con septicemia

Observe el teñido bipolar de las células

Cultivo:

Sembrar en agar sangre de carnero, EMB, McConkey y medio en caldo enriquecido, tal como caldo cerebro corazón ( BHI ).

 Incubación de cultivos:

 a. Temperatura: 28°C (óptima) ó 35-37°C (para crecimiento más lento)

 b. Atmósfera: Atmósfera ambiental, o enriquecida con COB2 Bal 5% es aceptable

 c. Duración de la incubación: Retenga las placas primarias por cinco días. Las placas se   deben de retener hasta o por 7 días si el paciente a recibido tratamiento con antibióticos   bacteriostáticos.

 Características:

 a. Platos de agar sangre : Y.pestis crece como colonias gris-blancas, translúcidas, usualmente de manera pequeñas para ser vistas como colonias individuales a 24 horas de incubación. Después de la incubación por 48 horas, las colonias son de color gris-blanco a amarillo y opacas. Después de 48-72 horas de incubación tienen una apariencia elevada irregular de "huevo frito", que se vuelve más prominente a medida que el cultivo envejece. La hemólisis no se presenta o es muy poca en los glóbulos rojos de cordero. Y. pestis crecerá en colonias pequeñas no fermentadoras de lactosa en MAC o agar EMB.

 b. Tubos de caldo nutritivo : Y. pestis crece típicamente en cúmulos que se describen como "floculantes" o "estalactita" en apariencia cuando el caldo de cultivo no es agitado o mezclado. Esta característica NO es exclusiva de Y. pestis.

Criterio de sospecha :

Cualquier muestra de cultivo aislado del tracto respiratorio, sangre o nódulo linfático conteniendo las características principales que se describen más abajo deben

considerarse sospechosas de la presencia de Y. pestis.

 1. Bacilos con características bipolares de tinción (Wright-Giemsa) en frotis directo.

 2. Colonias del tamaño de la punta de una aguja a las 24 horas en SBA.

 3. No fermentador de lactosa, puede no ser visible en MAC o en EMB a las 24   horas.

 4. Oxidasa y ureasa negativos.

 5. Catalasa positivo.

 6. Frecuentemente crece mejor a 28°C.

Llave para el diagnóstico etiológico:

• Cocobacilos gram-negativos

• pleomórfico.

• Anaerobio facultativo.

• No mótil. No esporulado.

• Catalasa y Urea negativo.

• TSI : K/A

• No H2S. No gas.

• Lactosa negativo.

• Crece un poco lento.

• Temperatura óptima : 28 ºC.

Limitaciones

Yersinia pestis crecerá en un medio rico nutritivo general pero su ritmo de crecimiento es menor que en la mayoría de otras bacterias; por lo tanto su presencia se puede enmascarar por organismos que se multiplican más rápidamente.

• La tinción bipolar de células no es una característica limitada a Y. pestis; Yersinia spp, enterobacterias y otros organismos gram negativos, principalmente Pasteurella spp. Pueden exhibir las mismas características de tinción.

• Algunos sistemas automatizados de identificación no identifican a Y.pestis adecuadamente. Y.pestis ha sido identificada falsamente como Y. pseudotuberculosis, Shigella, Salmonella HB2BS-negativa, o Acinetobacter (Wilmoth, 1996). Y. pestis produce una reacción ácida o alcalina en medio inclinado de triple azúcar–hierro. En la mayoría de los sistemas comerciales convencionales de identificación el organismo aparece como relativamente inerte haciendo que pruebas bioquímicas posteriores sean de poco valor.

UDiagrama de flujo para identificar Y. pestis

Peste Bubónica

Peste Negra

Yersinia pestis

Tips:

• Diagnóstico: Tinción bipolar, apariencia de pin de seguridad en Wright´s o Giemsa.

• Cultivo de sangre, esputo, o aspirado de nodulos.

• Serología en estadíos Agudo/convalesciente.

• Fluorescencia directa. ( Antígeno F1 )

• Título de > 1:128 en suero.

Cultivo de Yersinia pestis de 72h con apariencia de huevo estrellado

Vacuna :

• No se produce desde 1990.

• No disponible para uso masivo

• No sirve para forma neumónica

• No sirve después de la exposición

• Requiere múltiples dosis

c) BOTULISMO:

Descripción del organismo:

Clostridium Botulinum es un grupo de organismos anaerobios estrictos, que se encontran comúnmente en suelos y los habitat acuáticos a través del mundo. Ellos son parecidos y solo son semejantes en que pertenecen al género clostridia y producen neurotoxinas antigenicamente distintas, con acciones farmacológicas similares. C. botulinum es un organismo bacilo Grampositivo, mótil, anaerobio, con espora oval-subterminal. Los siete tipos de C. botulinum (A – G) se distinguen por las características antigenicas de las neurotoxinas que producen. El botulismo humano es causado sobre todo por cepas de C. botulinum que producen los tipos A, B, y E de la toxina, pero los casos raros del tipo F también se han divulgado.

En la evaluación clínica hay que descartar el sindrome de Guillain-Barré y miastenia gravis Los exámenes pueden incluir Scan de cerebro, examen de LCR, electroencefalograma. La vía más directa para confirmar el diagnóstico es la demostración de la toxina del botulismo en suero o heces. También se puede confirmar con animales de laboratorio ( ratones ). La bacteria puede ser aislada en las heces de personas enfermas e infantes con botulismo, pero requiere confirmación.

La toxina botulínica del Clostridium botulinum es termolábil, produce una parálisis flácida aguda, simétrica, descendente, con efectos en 12 a 36 horas desde la exposición. La dosis infectiva es baja de 0.001 (g/kg. Su efecto más importante es la parálisis respiratoria. Los pacientes requieren apoyo de ventilación mecánica por semanas o meses. La Antitoxina no está disponible en el país.

Clostridium botulinum

Hay tres clases principales de botulismo:

• El botulismo transmitido por los alimentos ocurre cuando una persona ingiere la toxina preformada que conduce a la enfermedad entre unas pocas horas a días.

• El botulismo infantil ocurre cada año en un número pequeño de lactantes susceptibles quienes hospedan TClostridium botulinumT en su tracto intestinal.

• El botulismo en la herida ocurre cuando las heridas están infectadas por TClostridium botulinumT que secreta la toxina.

Sintomatología :

Con el botulismo transmitido por los alimentos, los síntomas empiezan entre 6 horas a 2 semanas (más comúnmente entre 12 y 36 horas) después de comer los alimentos que contienen la toxina. Los síntomas del botulismo incluyen :

• Doble visión

• Visión borrosa

• Párpados caídos

• Dificultad para hablar y dificultad para tragar

• Sensación de sequedad en la boca

• Debilidad muscular que siempre desciende a través del cuerpo: primero los hombros son afectados, luego la parte superior de los brazos, la parte inferior de los brazos, los muslos, las pantorrillas, etc.

La parálisis de los músculos respiratorios puede causar que una persona pare de respirar y muera, a menos que se proporcione asistencia para la respiración (ventilación mecánica). El botulismo no se transmite de una persona a otra. El botulismo transmitido por los alimentos puede ocurrir en todas las edades.

El CDC mantienen un suministro de la antitoxina contra el botulismo. La antitoxina es eficaz en reducir la gravedad de los síntomas si se administra a principios del curso de la enfermedad. La mayoría de los pacientes se recuperan después de semanas a meses de atención médica adecuada.

Muestra

Tipos de muestras aceptables

1. Muestras clínicas

2. Muestras post mortem

3. Cultivos o aislamientos

4. Muestras de alimentos sólidos o líquidos

5. Muestras ambientales

Procedimiento :

1. Heces: Coloque una cantidad de heces del tamaño de una nuez en un contenedor irrompible y etiquételo cuidadosamente. La evidencia confirmatoria de botulismo se puede obtener de muestras de heces de 10 a 50 g.

2. Enema: Coloque aproximadamente 20 ml de líquido extraído por enema en un contenedor estéril, irrompible y etiquételo cuidadosamente. Se debe evitar que el material con la toxina se diluya innecesariamente.

3. Vómitos y aspirados gástricos : Coloque 20 ml en un contenedor estéril e irrompible y etiquételo cuidadosamente.

4. Suero: Use tubos sin anticoagulante para obtener suero. Las muestras se deben de obtener tan pronto como se presenten los síntomas pero antes de administrada la antitoxina. Se debe centrifugar la sangre y colectar el suero, el que será enviado a un laboratorio especializado.

5. Tejidos o exudados: Colóquese dentro de un contenedor irrompible y estéril y etiquételo cuidadosamente. La muestra se deberá colocar en un frasco Port-A-Cult y envíese al laboratorio apropiado, preferentemente sin refrigeración para intentar el aislamiento de C. botulinum.

6. Post mortem: Obtenga muestras intestinales de diferentes niveles de ambos intestinos. Coloque 10 g. por muestra en un frasco estéril e irrompible etiquetado

cuidadosamente. Obtenga ya sea contenido gástrico, suero, tejido o muestras de tejidos siempre y cuando sea apropiado.

7. Cultivo: Envíe cultivos aislados sospechosos anaeróbicamente (cubra el medio líquido con una capa de 2 pulgadas de parafina fundida. Los cultivos se pueden enviar a temperatura ambiente o refrigerados.

8. Muestras de alimentos: Los alimentos se deben de dejar en su contenedor original de ser posible o colocarse en contenedores estériles e irrompibles etiquetados cuidadosamente. Coloque los contenedores individualmente a prueba de fugas (por ejemplo: bolsas plásticas selladas) para prevenir la contaminación cruzada durante su transportación.

9. Muestras con hisopos (ambientales o clínicos): Envíe los hisopos clínicos en un medio de transporte anaeróbico (por ejemplo: Tubos Port-A-Cult). Los hisopos ambientales (de los cuales se pueden aislar esporas) se pueden enviar en contenedores plásticos sin medio alguno. Los hisopos se pueden enviar a temperatura ambiente o refrigerados. Tome muestras con 3 a 4 hisopos de cada lugar potencial.

10. Muestras ambientales: Tome el tamaño de muestra que se indica para cada posible ubicación

(1) Suelo (50-100 g)

(2) Agua (= 100 ml)

11. Liberación intencional de toxina (por inhalación o ingerida) :

a. Suero

b. Heces obtenidas mediante enema con agua estéril

c. Alimento sólido o líquido

d. Hisopo nasal o muestra ambiental

e. Aspirado de contenido gástrico

Información relacionada con la muestra :

1. Alimentos

Los alimentos en los que se espera que se desarrolle con mayor probabilidad C. botulinum, son aquellos que tienen un rango general de pH de 3.5 a 7.0, siendo un rango de pH más común el de 5.5 a 6.5. Sin embargo los alimentos en los que se sospecha la presencia de C. botulinum, independientemente de su pH podrían ser examinados, dado que condiciones ambientales localizadas que pudieron estar presentes en el alimento, podrían sostener el desarrollo de C. botulinum.

La toxina botulínica en productos comerciales es rara. El laboratorio deberá notificar a las autoridades si se sospecha que un producto comercial se encuentra contaminado con la toxina botulínica.

2. Heces: C. botulinum ha sido aislado de muestras de heces fecales obtenidas seguidamente del tratamiento con antitoxinas. Acto seguido, enviar la muestra a

un laboratorio capaz de detectar la toxina del C. botulinum, utilizando el protocolo de envío de muestras peligrosas.

NOTA : En caso de contacto con el CDC de Atlanta : National Botulism Surveillance and Reference Laboratory: Tel. ( 001 )-404-639-3867.