Anaplasma marginale. Métodos empleados en el diagnóstico (página 2)

2.1. Proteínas de los cuerpos iniciales

Como se ha mencionado anteriormente, se han caracterizado seis MSPs, denominadas: MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 (Palmer y McGuire, 1984) y MSP5 (Tebele y McGuire, 1991).

Estas proteínas presentan un polimorfismo variable entre distintos aislamientos de A. marginale. Se encuentran en una estrecha relación intermolecular en la superficie de membrana de los cuerpos iniciales (Vidotto y col., 1994) y además pueden contener estructuras helicoidales con segmentos transmembrana, dominios para la constitución de complejos multiméricos y regiones que funcionan como secuencia señal (Barbet y Allred, 1991; Tebele y McGuire, 1991; Palmer y McElwain, 1995; Alleman y Barbet, 1996). La inmunización del ganado con membranas de A. marginale que contienen las proteínas de superficie induce inmunidad protectora contra la enfermedad clínica (Tebele y McGuire, 1991).

La proteína MSP1 fue originalmente descrita como AmF105 (Palmer y McGuire, 1984) y está compuesta por dos subunidades MSP1a (105 kDa) y MSP1b (100 kDa), unidas por enlace disulfuro. Se ha demostrado que el complejo y las dos subunidades separadas, median la adherencia a los eritrocitos bovinos (McGuire y col., 1984), esto sugiere que MSP1a y MSP1b funcionan como adhesinas y se podrían requerir para la invasión de los eritrocitos, ya que anticuerpos específicos para MSP1 bloquean la unión de A. marginale a éstos. Además estos anticuerpos opsonizan los organismos vivos para la fagocitosis de los macrófagos (Cantor y col., 1993). Por otra parte la inmunización del ganado bovino con la proteína MSP1 nativa confiere un 100 % de protección contra la rickettsemia aguda y la enfermedad (Palmer y col., 1986; Palmer y col., 1989).

La inmunización del ganado bovino con la proteína MSP1 nativa purificada confiere protección contra la rickettsemia aguda. Sin embargo, a diferencia de estos resultados, cuando se utiliza la proteína nativa, la inmunización con las proteínas recombinantes MSP1a, MSP1b o la combinación de ambas, no induce protección significativa (Palmer y McElwain, 1995). La MSP1b recombinante utilizada en los ensayos fallidos de inmunización se derivó de una copia del gen, el único miembro de la familia secuenciado hasta este momento (Barbet y Allred, 1991). Actualmente se sabe que existe coexpresión de al menos dos copias diferentes del gen, en la fase aguda de la anaplasmosis y la expresión de proteínas MSP1b con epitopes B variables (Camacho y col., 2000).

La proteína MSP2 está presente en la membrana como un tetrámero adyacente a las proteínas MSP1, MSP3 y MSP4. Sus subunidades están unidas mediante puentes disulfuro, es relativamente inmunodominante y posee un peso molecular de 36 kDa (Palmer y col., 1988; Palmer y McElwain, 1995). Esta proteína es altamente polimórfica, con presencia de epitopes conservados (Palmer y col., 1994), aunque presenta epitopes B diferentes, en las regiones polimórficas. Se ha demostrado la expresión de diferentes variantes antigénicas de esta proteína, durante la rickettsemia aguda (Eid y col., 1996). La conservación de la estructura genómica para la generación de variantes de MSP2 y de epitopes CD4+ en A. marginale y A. centrale indica que estas dos especies presentan un repertorio similar de epitopes MSP2 al sistema inmune y esto puede ser responsable de la eficacia de protección contra A. marginale cuando se prueban vacunas de A. centrale (Brayton y col., 2002; Shkap y col., 2002).

La MSP3 está codificada por una familia multigénica, es también inmunodominante durante las infecciones natural y experimental. Tiene un peso molecular de 86 kDa y se puede encontrar además en A. centrale y A. ovis (Palmer y McElwain, 1995). Es estructural y antigénicamente diferente entre cepas de A. marginale, presenta polimorfismo de talla entre aislamientos geográficamente diferentes (Alleman y Barbet, 1996) y es expresada por un simple ² locus² , en el cual la variación de los genes msp3 expresados es generada por recombinación utilizando seudogenes (Meeus y col., 2003).

La proteína MSP4 de 31 kDa, es altamente conservada entre los distintos aislamientos de A. centrale y A. marginale. Esta proteína contiene bloques de aminoácidos relacionados con la proteína MSP2 (Alleman y Barbet, 1996). Sus epitopes conservados son de gran importancia tanto para el diagnóstico como para el desarrollo de una vacuna (Tebele y McGuire, 1991; Oberle y col., 1993). Se ha comprobado que funciona como adhesina al igual que la MSP2 y las subunidades del complejo MSP1 y que tanto la nativa como la recombinante protegen a animales inmunizados en retos con cepas homólogas (McGarey y col., 1994).

Otra de las proteínas, con una talla conservada entre todos los aislamientos y presente en todas las especies conocidas de Anaplasma spp., es la MSP5. Tiene un peso molecular de 19 kDa, es de poca complejidad estructural y muy importante en el ciclo de vida celular, aunque se desconoce exactamente su función. Se encuentra formando un dímero en la membrana, cuyas subunidades se unen por puentes disulfuros. La proteína nativa y la recombinante muestran un epitope reconocido por el anticuerpo monoclonal AnaF16C1 (Visser y col., 1992), presente en los estadios del parásito en la garrapata y en la forma intraeritrocítica, utilizándose en ensayos de ELISA competitivo, para la identificación de los animales infectados persistentemente (Knowles y col., 1996). Este epitope induce altos títulos de anticuerpos en todas las especies infectadas, incluyendo bovinos, chivos y carneros (Visser y col., 1992; Ndung´u y col., 1995; Knowles y col., 1996; Munodzana y col., 1998; Torioni y col., 1998).

La conservación de la talla molecular de MSP5 entre cepas (Corona 2005), tiene un contraste marcado con el polimorfismo observado para otras MSPs de A. marginale, principalmente MSP1a (Allred y col., 1990; Corona y col. 2005) y MSP2 (Oberle y col., 1988).

Kano y col., (2002), realizaron la caracterización antigénica de aislados de A. marginale de diferentes regiones geográficas de Brasil y en todos los aislados estudiados estuvo presente la proteína MSP5, lo que coincidió con previos estudios realizados que demostraban la conservación de esta proteína en aislamientos de América, África e Israel (Visser y col., 1992; Knowles y col., 1996; Vidotto y col., 1998).

Oliveira y col., (2003), sugieren que esta proteína puede ser utilizada como antígeno para el diagnóstico serológico debido a la conservación de los epitopes para las células B entre diferentes aislamientos estudiados, corroborando la hipótesis de que este polipéptido tiene una función fundamental en el ciclo biológico del hemoparásito, estando presente durante las fases aguda y crónica de la infección bovina (Knowles y col., 1996).

3. Características de la enfermedad

3.1. Incidencia mundial de la enfermedad

La anaplasmosis bovina es una enfermedad económicamente importante por los enormes gastos que ocasiona, principalmente en las regiones tropicales y subtropicales, incluyendo los Estados Unidos, donde se reporta una mortalidad anual entre 50 000 a 100 000 animales muertos, con un costo de hasta 300 millones de dólares (Palmer y McElwain, 1995).

Un estudio realizado en el norte de Veracruz (México), mostró que el 69 % del ganado estaba infectado (Cossio y col., 1997). Esta alta prevalencia está asociada con un significativo rango de transmisión, pues el 26 % del ganado que murió en México durante 1995, fue debido al movimiento de ganado susceptible a áreas con alta prevalencia de la enfermedad y por la subsiguiente transmisión de la misma. Tasas similares de infección, entre el 73 % y 78 % se han calculado con anterioridad para el ganado de St. Lucia (Hugh-Jones y col., 1988) y el Salvador (Payne y Scott, 1982), respectivamente.

La enfermedad se reporta en muchas áreas del mundo, existiendo datos de la presencia de anaplasmosis bovina en la India (Chitravel y col., 1998) y otras regiones de Asia y el Pacífico, donde es considerada una enfermedad endémica, causante de pérdidas considerables en el ganado importado, pues las razas de ganado responden de una manera muy diferente a una misma infección (http://www.fao.org/docrep/V8300S/v8300sOp.htm).

En Argentina, en el año 2000 se reportó la existencia de un rebaño donde el 50 % de los animales tenía anticuerpos contra A. marginale por la prueba de aglutinación en tarjeta y en el año 2003 se reportó una alta incidencia de la anaplasmosis, a pesar de no ser una enfermedad de declaración obligatoria (Spath, 2003). En Colombia está considerada como de una gran importancia, ya que constituye una restricción para el incremento de la productividad ganadera del país (Benavides y col., 2000; Hans, 2001).

La anaplasmosis bovina se detectó en Suiza, en una explotación ganadera en dos sitios diferentes, con un 8.2 % de muestras positivas por ELISA (Kinhm, 2002). En South África se reportó un 50-75 % de prevalencia de infección (Masika y col., 1997). En Venezuela se observó una muy alta incidencia de la enfermedad (Melendez y Forlano, 1997) y en el estado de Paraná, en Brasil, se reportaron valores de 87.6 % de animales positivos en una región donde la anaplasmosis es endémica (Vidotto y col., 1998).

En Cuba, durante los primeros años de la década de los 90 la anaplasmosis bovina se presentaba como una de las primeras causas de mortalidad en el ganado adulto. Solamente en el año 1993 se estimó una pérdida superior a los dos millones de dólares (según datos de la Dirección de Medicina Veterinaria de Cuba).

A comienzos de la década del 2000 se observa un cambio positivo con relación a la enfermedad, reportándose en los comienzos de este año una morbiletalidad de un 10 % por la enfermedad (Informe Primer Trimestre, IMV 2000). Esta situación esta dada porque a partir del período especial, en nuestro país existió un cambio en el componente racial de la ganadería, con el predominio de animales más resistentes a las garrapatas, unido a la incorporación de nuevas tecnologías en el control de ixodidos, como la vacunación contra Boophilus microplus con la vacuna recombinante Gavac, y la combinación de ésta con baños garrapaticidas programados. Esto permitió disminuir la población del vector hasta niveles que garanticen la premunición en los animales menores de nueve meses, aspecto este que resulta importante estudiar desde el punto de vista epizootilógico, para lo cual se hace imprescindible contar con técnicas diagnósticas sensibles y específicas.

3.2. Transmisión

El estudio de la transmisión de A. marginale es de fundamental importancia para establecer un control efectivo de la enfermedad. Son amplias y muy variadas las formas en que puede transmitirse el parásito y dependen de la presencia de vectores (biológicos y mecánicos), la existencia de animales susceptibles y de condiciones ecológicas favorables (Palmer y McElwain, 1995).

Esta enfermedad puede ser transmitida por artrópodos hematófagos tales como algunos géneros de garrapatas (Yeruhan y Braverman, 1981), principalmente Boophilus spp. y Dermacentor spp. (Kocan y col., 1986; Zaugg y col., 1986; Potgieter y col., 1993), moscas de establo, Stomoxys calcitrans (Yeruham y Braverman, 1981) y mosquitos Siphona spp. y Psophona spp.; tábanos, Tábanus spp. (Ristic, 1968) y por la forma iatrogénica que también juega un papel muy importante en la diseminación de la enfermedad a través de material quirúrgico contaminado (Palmer y col., 2000). A pesar de esto, Kessler, (2001), planteó que la capacidad de transmisión de Anaplasma marginale por insectos hematófagos debe ser objeto de posteriores estudios, antes de considerarlos como vectores epidemiológicamente importantes.

Las vías más importantes de transmisión de la enfermedad son: la mecánica en la que se introducen directamente los eritrocitos infectados, ya sea por inoculación natural a través de picaduras de artrópodos hematófagos parasitados o artificialmente con objetos punzantes contaminados (Richey y Palmer, 1990) y la transmisión vertical de tipo placenta-feto, cuando la madre sufre anaplasmosis aguda (Zaugg, 1990). Este autor demostró que A. marginale, podía, en el segundo y tercer trimestre de gestación, atravesar la barrera placentaria e infectar al feto y que probablemente esto no sucedía dentro de los eritrocitos, sino que era una fase extraeritrocitaria del parásito. Según Rey y col., (2003), la vía de transmisión trasplacentaria debe ser tomada en cuenta como factor de riesgo en zonas donde la anaplasmosis es endémica.

Kessler, (2001), reportó sus consideraciones acerca de que las garrapatas del género Boophilus son el vector biológico principal de la transmisión de la anaplasmosis en Brasil, teniendo en cuenta que la transmisión iatrogénica (transfusiones de sangre, intervenciones clínicas a la masa bovina, y la vacunación masiva) puede ser evitadas con las medidas higiénicas. En Cuba, aunque no se han realizado estudios de la transmisión de la enfermedad, el principal vector involucrado en la transmisión parece ser garrapatas del género Boophilus, teniendo en cuenta que este género es el más extendido en nuestro país.

Es necesario identificar los factores que influyen en la transmisión y desarrollo de este patógeno en las garrapatas para facilitar el mejoramiento de estrategias para el control de la enfermedad (Walade y col., 1996). La transmisión se logra fundamentalmente por transferencia de garrapatas infectadas y puede ocurrir de forma intraestadial y transestadial, para lo cual el macho juega un papel relevante en este proceso (Zaugg y col., 1986).

La transmisión del microorganismo a través de las diferentes especies de garrapata puede ocurrir de forma transestadial, es decir, de larvas a ninfas y de ninfas a adultos (Kocan y col., 1981; Kocan y col., 1986). Además puede ocurrir del estado de larva a adulto sin reexposición en el estadio como ninfa y por adultos machos que se transfieren del ganado infectado a otro susceptible.

Algunas cepas de A. marginale infectan a las garrapatas (Idaho, Virginia, aislados de Washington); sin embargo, aparentemente otras no las infectan (Illionis, Florida) (Smith y col., 1986; Wickwire y col., 1987; Zaugg y col., 1996), por razones que no se conocen, pero que apoyan las evidencias existentes de la variación antigénica del parásito.

A diferencia de los pequeños cuerpos de inclusión que contienen de cuatro a seis rickettsias en los eritrocitos bovinos, grandes colonias que contiene muchos organismos se observan en las garrapatas infectadas naturalmente. El ciclo de desarrollo del microorganismo comienza en las células del intestino medio con la subsecuente infección de las células musculares del intestino. El desarrollo final ocurre en las glándulas salivares, desde donde la rickettsia se transmite al huésped vertebrado. En cada sitio de desarrollo en la garrapata, A. marginale se multiplica dentro de inclusiones unidas a las membranas, llamadas colonias. Cada ciclo involucra dos estadios: una forma reticulada o vegetativa y la forma densa infectiva. La forma reticulada que se divide por fisión binaria es observada primero, dentro de las colonias, que posteriormente se condensan para dar lugar al estado electrodenso capaz de sobrevivir fuera de las células e infectar a otras (Kocan y col., 1996).

En cuanto a la existencia de animales susceptibles se describen infecciones subclínicas en búfalos de agua, ovinos y caprinos (Cossio y col., 1997). En bisontes se observó parasitemia moderada con respuesta a anticuerpos específicos, demostrándose la secuencia de infección bovino-bisonte-bovino (Chitravel y col., 1998). La rickettsia se detectó en la sangre de alces (Cervus elaphus) infectados, pero no se notó signos clínicos de la enfermedad (Zaugg y col., 1996, García y col., 1998). Estos resultan susceptibles a la infección con A. marginale y A. ovis y su sangre, infectada con ambos hemoparásitos es infectiva para bovinos y chivos susceptibles, por lo que lo constituyen un reservorio (Zaugg y col., 1996).

Todo el ganado es potencialmente susceptible a la infección con Anaplasma marginale, aunque ciertas razas desarrollan resistencia a las garrapatas, e inducen un decremento en la transmisión. Los portadores crónicos asintomáticos y otros animales resistentes son responsables también de preservar el agente etiológico en la naturaleza (Blood y col., 1983).

Palmer y col., (2001), reportaron la presencia de sólo un genotipo de A. marginale en los bovinos infectados. de la Fuente y col., (2002b), han reportado que en A. marginale ocurre exclusión de la infección en los eritrocitos bovinos y en las células de garrapatas, resultando en el establecimiento de sólo un genotipo, siendo el primer reporte de exclusión de la infección para A. marginale y especies de Ehrlichias. Recientemente se demostró que la exclusión de la infección con genotipos de A. marginale también ocurre en garrapatas experimentalmente infectadas, así como en bovinos y en el cultivo de células de garrapatas, resultando en el establecimiento de solo un genotipo por garrapata (de la Fuente y col., 2003a).

de la Fuente y col., (2003b), demostraron que no ocurre transmisión no sistémica de A. marginale desde garrapatas infectadas a no infectadas, por lo tanto, esto no parece ser un medio de transmisión de A. marginale. La infección en las garrapatas machos no se incrementa mientras conviven con las garrapatas hembras, por lo tanto, la coalimentación de Dermacentor spp. adulta parece no influenciar en la dinámica de transmisión de A. marginale.

3.3. Patogenia y síntomas clínicos

A. marginale es estrictamente intracelular, un parásito obligado que infecta al eritrocito bovino y que raramente se observa fuera de las células. El organismo penetra por invaginación al eritrocito sin que ocurra destrucción de las células, se encierra en una vacuola y se multiplica por fisión binaria en forma de cuerpo de inclusión, pudiendo observar de dos a tres cuerpos. El período prepatente durante la incubación de la enfermedad es de dos a tres semanas y la duración depende de la cantidad de organismo infectante (Medellín, 2003).

La enfermedad se caracteriza por marcada anemia hemolítica, altos niveles de rickettsemia, disminución del peso, aborto y en muchos casos la muerte en animales de más de tres años de edad. La anemia máxima ocurre de uno a seis días después de la parasitemia y persiste por cuatro a 15 días, donde hasta el 75 % de los eritrocitos se pierden de la circulación. El período de convalecencia es de uno a dos meses, y está acompañado por incremento de la hematopoyesis y puede haber recurrencia de la parasitemia. Los parámetros hemáticos retornan a los normales, pero los organismos continúan presentes en la circulación periférica. Los animales que sobreviven a la infección aguda permanecen como portadores con continuos ciclos submicroscópicos de rickettsemia que pueden persistir durante toda la vida del animal (Viseshakul y col., 2000).

En los portadores vertebrados, A. marginale invade los eritrocitos maduros con la formación de una vacuola, derivada de estos, alrededor de los microorganismos (Francis y col., 1979). Se multiplica y luego, nuevos organismos salen del glóbulo rojo, utilizando mecanismos hasta ahora desconocidos pero aparentemente no líticos (probablemente exocitosis) e infectan los eritrocitos aledaños. Después que el parásito entra al huésped bovino el número de células rojas infectadas se duplica entre las 24 y 48 horas siguientes. La infección puede detectarse por microscopía entre 20 y 40 días después de la transmisión, dependiendo del número de microorganismos transmitidos y de la virulencia del aislado (Richey, 1981).

Un animal infectado no presenta síntomas clínicos hasta que más de un 15 % de los eritrocitos no hayan sido parasitados. En ese momento, la parasitemia comienza a incrementarse geométricamente y posteriormente los eritrocitos infectados se eliminan del torrente circulatorio mediante fagocitosis por las células del retículo endotelial del bazo, hígado y nódulos linfáticos; induciéndose el desarrollo de una fase de inflamación aguda. La subsecuente fiebre, temperaturas de hasta 41° C, es el primer síntoma clínico de la enfermedad (Richey y Palmer, 1990). La respuesta febril es seguida de anorexia, depresión y debilidad muscular, acompañada de una acidosis severa. La destrucción continuada de eritrocitos, sin liberación de hemoglobina, trae consigo palidez mucosal, sangre acuosa y posteriormente ictericia, pudiendo aparecer anticuerpos antieritrocitarios, lo que puede exacerbar la anemia. Luego de esta fase aguda se presenta la hiperaguda, donde ocurre una pérdida dramática de peso, aborto de vacas preñadas, fallo cardiopulmonar y muerte (Alderink y Dietrich, 1981). Estas últimas consecuencias ocurren con frecuencia al cabo de las 24 a 36 horas del pico de parasitemia, donde hay infectados hasta un 90 % de los eritrocitos (Richey y Palmer, 1990).

Los animales que sobreviven a esta fase disminuyen drásticamente la parasitemia y desarrollan una marcada respuesta regenerativa a la anemia. No hay evidencias de que exista una supresión al nivel de médula ósea. Los parámetros hematológicos retornan gradualmente a valores normales luego de muchas semanas (Swift y Thom, 1983).

El ganado recuperado puede permanecer infectado persistentemente con bajos niveles de parasitemia, que fluctúa por períodos largos de tiempo. A estos animales se les denomina portadores asintomáticos de la enfermedad, en los cuales la enfermedad es difícil de diagnosticar por los métodos tradicionales (Visshakul y col., 2000).

Estos animales afectados pueden desarrollar la forma crónica de la enfermedad sin manifestaciones clínicas. Esta forma además de presentarse como secuela de la convalescencia de las infecciones agudas, también puede ser el resultado de una infección inducida con cepas atenuadas (premunización) (Palmer y McGuire, 1995).

Las huellas postmortem que deja esta enfermedad son atribuidas fundamentalmente a la anemia hemolítica severa. El bazo frecuentemente está agrandado y se torna de color rojo marrón. Son comunes la hepatomegalia y un engrandecimiento de la vesícula biliar, con bilis oscura. Si el animal ha muerto en estadios tardíos de la infección aguda se puede presentar el íctero (Richey y Palmer, 1990).

3.4. Inmunidad y resistencia

El ganado puede contraer la enfermedad a cualquier edad, sin embargo la mortalidad y severidad aumentan con la misma. Los terneros de menos de 6 meses exhiben una resistencia natural, pues aún cuando se infectan, raramente exhiben los signos clínicos (Alonso y Blandino, 1988). El ganado entre 6 meses y tres años comienza a incrementar el padecimiento y ocurren más muertes con el avance de la edad. En general la parasitemia y la anemia son menos graves en los animales jóvenes, posiblemente debido a que la respuesta inmune celular es mayor por la competencia del timo, el sistema hematopoyético es más activo y por el papel más activo de la hemoglobina fetal (Richey y Palmer, 1990).

A. marginale induce en el organismo respuesta humoral y mediada por células, sin embargo, los anticuerpos al parecer juegan un papel menos importante (Bautista-Garfias y col., 2000). Los animales infectados desarrollan anticuerpos, fundamentalmente del tipo IgG e IgM, y exhiben durante las últimas etapas de la infección aguda una respuesta mediada por células, en la que aparecen los macrófagos activados segregando IFN-g , que estimula fuertemente la proliferación de linfocitos de sangre periférica (Galade y col., 1996). La respuesta celular se correlaciona parcialmente con el desarrollo de la inmunidad. En contraste, la respuesta humoral se correlaciona pobremente con el desarrollo de resistencia. Sin embargo, existen antígenos claves de A. marginale que estimulan la producción de anticuerpos neutralizantes, por lo que la respuesta humoral juega algún papel en el desarrollo de la inmunidad contra la anaplasmosis (Richey y Palmer, 1990; de la Fuente y col., 2002a).

El estudio de los mecanismos inmunes protectores contra A. marginale se focaliza fundamentalmente en la fase aguda de la enfermedad. Palmer y col., (1999) plantearon la hipótesis de que la eliminación de A. marginale requiere de la inducción de niveles altos de anticuerpos de la subclase IgG2 dirigidos contra los epitopes B de la superficie del microorganismo. Así mismo, sugirieron la activación de los macrófagos, mediada por células T CD4+, que llevan a la opsonización, fagocitosis y destrucción del patógeno (Bock y col., 1997).

El ganado que se recupera de una infección aguda y que por tanto ha tenido una infección preinmune por un aislamiento medianamente virulento de A. marginale o A. centrale desarrolla resistencia a una reinfección con la misma cepa. En algunos casos el ganado recuperado queda desprotegido o parcialmente protegido contra aislamientos heterólogos (Richey y Palmer, 1990).

Factores solubles de células mononucleares (linfocitos y monocitos) de la sangre de ganado infectado, reducen la proporción de eritrocitos que contienen organismos viables "in vitro", indicando que puede ocurrir un mecanismo independiente de anticuerpos para el control de la rickettsemia durante la anaplasmosis aguda (Wyatt y col., 1996). A pesar de que ante la invasión de este parásito median ambas respuestas, el sistema inmune del hospedero es incapaz de eliminar completamente la infección en la fase crónica de la enfermedad. Esto podría deberse a la variabilidad antigénica de este microorganismo. Se ha visto que tanto en la fase aguda como en la crónica hay un comportamiento de aumento y disminución de los niveles de eritrocitos infectados, lo cual sugiere que participan los mismos mecanismos de respuesta primaria del hospedero para controlar ambos ciclos de rickettsemia (Kieser y col., 1990).

3.5. Epidemiología. Tratamiento y control de la anaplasmosis

La existencia de inmunidad previa, la velocidad de transmisión y la edad a la que ocurre el primer contacto con el parásito (primoinfección), determinan el efecto clínico que causará este contacto entre el huésped y el parásito. El cuadro clínico típico de la infección aguda por A. marginale ocurre únicamente en animales adultos susceptibles cuando se transportan a regiones endémicas. En los sitios donde las garrapatas son abundantes la epidemiología de esta enfermedad se caracteriza por la estabilidad enzoótica, que implica la presencia de un alto porcentaje de ganado infectado, con la rara ocurrencia de la enfermad clínica (Benavides, 1985). Esta relación se mantiene debido a dos factores: la inmunidad pasiva (anticuerpos), proveída por el calostro y la temprana infección de los terneros, los que se demostró que poseen resistencia innata hasta cerca de los nueve meses de edad. Durante esta edad los animales adquieren la infección sin presentar los signos aparentes de la enfermedad y la inmunidad resultante, una vez establecida, es mantenida en el ganado adulto mediante reinfecciones, sin síntomas clínicos (Cetrá y col., 2000).

En regiones donde la población de garrapatas se reduce artificialmente con un intenso control, se rompe el equilibrio, pues no todos los terneros se infectan antes de los nueve meses de edad, creando así un segmento de ganado susceptible, que muy posiblemente desarrollarán la enfermedad clínica aguda cuando tengan contacto con el hemoparásito tiempo después. Esta situación es conocida como inestabilidad enzoótica, en la cual la enfermedad se vuelve periódicamente aparente, coincidiendo con períodos favorables para la reproducción de las garrapatas (Benavides, 1985).

Hasta la fecha no se cuenta con un procedimiento efectivo para el control de la anaplasmosis en muchas áreas, a pesar del incremento de los portadores, animales susceptibles, vectores de transmisión y de las cuantiosas pérdidas económicas que provoca (Palmer y col., 1999). Los métodos de control para la anaplasmosis no han cambiando marcadamente durante los últimos 50 años e incluyen el control de los artrópodos, la quimioprofiláxis, la vacunación, y el mantenimiento de los rebaños libres de Anaplasma (Guglielmone y col., 1996; Kocan y col., 2000).

En nuestro país el control de la anaplasmosis se ha llevado a cabo fundamentalmente mediante tratamiento terapéutico, uso de insecticidas y acaricidas y más recientemente con el uso de la vacuna recombinante contra B. microplus (Gavac) (2do Taller Nacional de Control de la garrapata, La Habana, Cuba, 2000).

En muchos casos la infección se controla, en parte, por la administración de bajas dosis de tetraciclina y se estudió el efecto de ésta en el cultivo de células de garrapata, quedando demostrada su utilidad para la evaluación de nuevos antibióticos en el control de la anaplasmosis (Blouin y col., 1998). En los casos clínicos severos se hace necesaria la terapia de soporte, mediante la aplicación de hidratantes, antihistamínicos y analgésicos para eliminar de manera efectiva los estados de portador (Medellín, 2003).

El ganado que se recupera de la infección aguda desarrolla inmunidad protectora, que puede inducirse con vacunas muertas (Montenegro-James, 1991). Sin embargo, la producción de vacunas a partir del microorganismo muerto o de su fraccionamiento, resultó poco conveniente e incosteable, ya que no se había logrado establecer un cultivo ² in vitro² donde pudiera replicarse el parásito, lo que obligaba al uso de bovinos vivos. Según Blouin y col., (1998), la propagación de A. marginale en una línea celular derivada de Ixodes scapularis, con potencialidad para ser utilizada como antígeno, constituye un avance importante para el desarrollo de una vacuna mejorada contra la anaplasmosis bovina. Sin embargo, no se debe dejar de tener en cuenta la variabilidad antigénica que se presenta en aislados de regiones geográficamente diferentes.

4. Diagnóstico de la enfermedad

El control de la anaplasmosis, además de requerir de una vacuna efectiva, necesita de métodos de diagnóstico que permitan conocer la prevalencia del microorganismo en las diferentes zonas de los países tropicales y subtropicales, además que permitan identificar de forma segura a los animales portadores para el movimiento de animales a zonas libres del hemoparásito (Camacho y col., 2000).

El diagnóstico diferencial de fiebre, anemia hemolítica aguda e icterus en el ganado adulto incluye babesiosis, eperytrozoonosis, theileriosis, leptospirosis, hemoglobinuria bacilar, hemoglobinuria postparto, toxicidad por plantas y ántrax. La ausencia de hemoglobinuria en caso de anemia aguda, apoyada por la identificación positiva del eritrocito parasitado, diferencia estas otras enfermedades hemolíticas de la anaplasmosis clínica (Richey y Palmer, 1990).

El diagnóstico de la anaplasmosis se dificulta debido fundamentalmente a lo difícil de detectar los portadores, ya que no hay síntomas clínicos que lo diferencien de los bovinos no infectados y los cuerpos de inclusión dentro de los glóbulos rojos no son lo suficientemente numerosos como para ser detectados por los métodos tradicionales (Aboytes-Torres y Buening, 1990; Masika y col., 1997).

4.1. Identificación del agente

Entre los métodos utilizados para la detección del agente podemos citar la subinoculación de eritrocitos infectados en animales esplenectomizados, la tinción de Giemsa a los frotis de sangre, ELISA que detecta antígeno y las técnicas moleculares, como hibridación de ácidos nucleicos y PCR (World Organization for Animal Health, 2000).

4.1.1. Estándar de oro

Para la detección de animales infectados persistentemente el método que se considera el estándar de oro, consiste en la subinoculación de eritrocitos infectados con A. marginale, a animales susceptibles esplenectomizados. Sin embargo, este procedimiento no es práctico en las pruebas de rutina (Luther y col., 1980) por la manipulación quirúrgica que conlleva y porque proporciona poca información sobre los niveles de parasitemia (Visser y Ambrosio, 1987).

4.1.2. Tinción con Giemsa a los frotis de sangre

Entre otras técnicas utilizadas para detectar el organismo se incluye la tinción con Giemsa a los frotis de sangre (Gainer, 1961). Sin embargo, cuando el animal está en la fase crónica o en el estadio de portador no expresa un elevado nivel de parasitemia como para ser detectado por la tinción (Trueblood y Palmer, 1998).

La tinción con Giemsa es un método confiable, barato y capaz de detectar niveles de parasitemia de 0.1 a 0.2% (Eriks y col., 1989), o sea sólo pude detectar niveles mayores a 106 eritrocitos infectados por mililitro de sangre (Gale y col., 1996), además, resulta tedioso, no apropiado para un gran número de muestras e incapaz de discernir con facilidad cuando el eritrocito está invadido por A. marginale o por A. centrale (Visser y Ambrosio, 1987).

La tinción mediada por anticuerpos puede ser utilizada como una técnica de tinción alternativa. Su mejor aplicación es para detectar A. marginale en muestras de sangre tomadas post-mortem para lo que muestra ser más sensible que la tinción con Giemsa para este propósito (Johnston y col., 1980).

4.1.3. ELISA para detectar antígeno

El ELISA para detectar antígeno se desarrolló en el Laboratorio Internacional para la Investigación de enfermedades de animales en Kenya, y en la Universidad de Washington, en los Estados Unidos, mostrando alta sensibilidad y especificidad, además de poder ser diseñado de diferentes maneras (Harlow y Lane, 1988).

El ensayo ELISA desarrollado para detectar antígeno, utilizando anticuerpos monoclonales para epitopes conservados de la proteína de superficie MSP1, logró discriminar entre anaplasmosis y otras enfermedades hemoparasíticas clínicamente similares, sin embargo, la sensibilidad de este ensayo no fue mayor de 0.01 (1,1 % de parasitemia), por lo que la prueba no resultó idónea para la detección de portadores (Trueblood y col., 1991).

4.1.4. Técnicas moleculares

Las sondas de ácidos nucleicos, las cuales hibridan solamente con su secuencia complementaria, constituyen una prueba sensible y específica para el diagnóstico (Engleberg y Eisenstein, 1984). Además la intensidad de la señal de hibridación obtenida se correlaciona con el número de parásitos, dando información del nivel de parasitemia. (Barbet y col., 1986; Wirth y col., 1986).

En el diagnóstico de A. marginale se han utilizado sondas de ADN genómico (Ambrosio y Potgieter, 1987) y recombinantes, basadas en ADN (Visser y Ambrosio, 1987; Goff y col., 1988) o ARN (Eriks y col., 1989), pero en ocasiones la limitada sensibilidad de la sonda prohíbe la detección de portadores sanos con muy bajo nivel de parasitemia (Shompole y col., 1989).

Con una sonda de ARNm derivada del gen msp1a , se logró mejorar la sensibilidad detectándose niveles de parasitemia entre 0.0025 y 0.000025 % en los portadores sanos. Esto hace que la prueba sea 4000 veces más sensible que la microscopia óptica, además de que es capaz de detectar la infección en estadios tempranos, lo que resulta de gran importancia para evitar las pérdidas que ocasiona esta enfermedad (Eriks y col., 1989).

La sensibilidad de este ensayo resultó útil para la detección de niveles de infección en garrapatas y para la identificación de ganado persistentemente infectado, además de determinar la prevalencia e incidencia de garrapatas infectadas en áreas enzoóticas. El uso de esta sonda ayuda a las estrategias de control racional de la garrapata, combinado con la vacunación, para reducir los daños de la enfermedad (Goff y col., 1988).

Kocan y col., (1998), desarrollaron una sonda de ADN no radioactiva para detectar A. marginale en ganado y garrapata, mostrando igual sensibilidad y especificidad que las sondas radioactivas, además de poder ser utilizada en la hibridación "in situ ".

La sensibilidad y especificidad del PCR resultan de gran valor para la identificación de patógenos de vectores artrópodos. Este método ha detectado R. typhi y B. burgdorferi en artrópodos, además de ser utilizado para la identificación de garrapatas infectadas con el aislamiento Virginia de A. marginale, usando cebadores diseñados a partir de la secuencia nucleotídica del gen msp1b del aislamiento Florida. Puede ser utilizado para estudios epizootiológicos de garrapatas de campo, en la cual la infección puede ser difícil de detectar por otros métodos. (Stich y col., 1991; Stich y col., 1993).

La infección persistente de A. marginale en ovejas fue caracterizada por Palmer y col., (1998), utilizando el PCR (gen msp5), pudiendo observar un patrón de persistencia similar al del ganado bovino. Figueroa y col., (1993), desarrollaron una PCR múltiple para la detección de B. bovis, B. bigemina y A. marginale a partir de sangre de bovino, con buenos resultados.

Torioni y col., (1998), optimizaron un PCR ² nested² acoplado con análisis de secuencia e hibridación para identificar el gen msp5 de A. marginale, siendo capaz de detectar hasta 30 eritrocitos infectados por mililitro de sangre, lo cual lo hace de 10-100 veces más sensible que los PCR previamente descritos, sondas de ARN y ensayos de hibridación (Eriks y col., 1989; French y col., 1998; Gale y col., 1996; Ge y col., 1996; Ge y col., 1997). El PCR ² nested² unido con la hibridación resulta un método altamente sensible y específico para detectar animales infectados con A. marginale.

Georges y col., (2001) desarrollaron un método de hibridación reversa y PCR (RLB) de las regiones 16S ó 18S del ARNr para la detección de hemoparásitos en bovinos, demostrando una gran prevalencia de infecciones mezcladas, lo que indica que animales infectados con Babesia spp., estaban también infectados con Theileria spp. ó Anaplasma spp. Un PCR simple basado en el gen msp1a ha logrado diferenciar A. marginale en Norte América, pero no se ha probado con aislados de otros lugares (Palmer y col., 2001).

Como parte de nuestros resultados en esta temática, contamos con un ensayo de PCR capaz de detectar hasta un 0.000025% de parasitemia (Corona, 2005) permitiendo diagnosticar A. marginale en animales sin manifestaciones clínicas de la enfermedad, lo cual significa contar con una poderosa herramienta para su utilización en diferentes estrategias de monitoreo y control de la enfermedad.

4.2. Diagnóstico serológico

Las pruebas serológicas son de gran importancia para estudios epidemiológicos con el objetivo de caracterizar áreas de estabilidad e inestabilidad enzoótica. La aplicación de estas pruebas resulta relevante en lugares donde se practique el control intensivo de garrapatas, en los centros de inseminación y transferencia de embriones, así como en los lugares donde se produzcan animales de elite o reproductores puros, relacionados también con la industria lechera ().

El diagnóstico serológico incluye pruebas como fijación del complemento, aglutinación en tubos capilares, aglutinación rápida en tarjeta, ensayos de IFI, y las pruebas Dot-ELISA y ELISA. Las pruebas serológicas como fijación del complemento y aglutinación en tarjeta, son los métodos más comúnmente utilizados para detectar animales infectados con A. marginale en el campo y fueron métodos aceptados para el movimiento de animales a nivel internacional (Word Organization for Animal Health, 2000).

Todos estos ensayos para la detección de anticuerpos utilizan antígenos crudos obtenidos de A. maginale parcialmente purificado, lo que provoca que se pierda la sensibilidad y especificidad que se requiere para un diagnóstico eficaz (Montenegro-James y col., 1985, Kocan y col., 1996). Una parte de los errores que se cometen con estos ensayos, se debe a los resultados falsos positivos, causados por la contaminación con eritrocitos y la presencia de anticuerpos antieritrocitos en el suero de algunos animales. La frecuencia de anticuerpos contra los eritrocitos se ve marcadamente aumentada en el suero de los animales vacunados con vacunas derivadas de sangre, tales como las que se utilizan para Babesia spp. (Duzgun y col., 1988). Otra parte de los errores, se deben a las reacciones falso negativas, provocadas en algunos casos por la baja sensibilidad del método o porque algunos ensayos como el de fijación de complemento, no detectan todos los isotipos de las inmunoglobulinas (McGuire y col., 1979).

4.2.1. Fijación del complemento

Esta prueba utiliza el proceso estándar de fijación del complemento. El antígeno consiste de cuerpos de Anaplasma que han sido separados del eritrocito por lisis, aunque se utiliza también una técnica que requiere solo pequeñas cantidades de los reactivos (Avon, 1974)

La fijación del complemento ha sido uno de los métodos más utilizados para detectar animales infectados con A. marginale, en el campo (González y col., 1978). A pesar de que esta técnica ha sido utilizada por muchos años, existen evidencias de que le falta sensibilidad y tiene errores por su limitada habilidad para detectar bajos niveles de anticuerpos. Puede ser utilizada como una prueba de monitoreo, pero no para los programas de erradicación, ya que muchos animales infectados pueden ser diagnosticados como negativos, pues no es capaz de detectar anticuerpos contra A. marginale en animales portadores (McElwain, 2000). Existen otras desventajas entre las que se encuentran la complejidad y laboriosidad que requiere y la baja especificidad y sensibilidad, sobre todo en países donde hay presentes enfermedades hemoprotozoarias (Palmer y col., 1986).

4.2.2. Pruebas de aglutinación

Se han descrito dos pruebas de aglutinación: la aglutinación en tubos capilares y la aglutinación rápida en placa (Amerault y col., 1972). En ambos casos el resultado es leído como positivo o negativo, pero no determina título de anticuerpos. Este último puede llegar a rendir un 2 % de falsos positivos y 16 % de falsos negativos en un estudio controlado. Esta técnica puede ser desarrollada en el laboratorio o en el campo, dando el resultado en muy pocos minutos, pero como se dijo anteriormente, existe un gran problema con las reacciones no específicas (Teclaw y col., 1985).

4.2.3. Inmunofluorescencia indirecta de anticuerpos (IFI)

Esta prueba ha sido utilizada para el diagnóstico de anaplasmosis y frecuentemente se ha considerado una prueba sensible, sin embargo, por sus características en ocasiones se considera no útil, pues pueden ocurrir reacciones falsas positivas, que se atribuyen al largo período de incubación de esta enfermedad (Goff y col., 1988).

Goff y col., (1988) y Montenegro-James y col., (1985) reportaron ensayos de IFI, los cuales presentan un número alto de reacciones falsas positivas y un alto fondo de fluorescencia. McGuire y col., (1984), realizaron una IFI donde utilizaron como antígeno una muestra cruda de A. marginale, contaminado con membranas eritrocitarias, dando una serie de resultados falsos positivos y falsos negativos en el ganado infectado agudamente y en el convaleciente; en el ganado persistentemente infectado arrojó un porciento de falsos negativos. Así mismo, la IFI ha sido utilizada para estudios epidemiológicos (Duzgun y col., 1988; Jongejan y col., 1988).

4.2.4. Dot- ELISA y ELISA

Se han desarrollado pruebas ELISA para identificar anticuerpos contra A. marginale en suero bovino (Duzgum y col., 1988; Ndung’u y col., 1995; Knowles y col., 1996). El ELISA es una prueba sensible, específica y brinda la posibilidad de una mejor interpretación de los resultados, comparada con las técnicas antes mencionadas (Duzgum y col., 1988). En 1986, Palmer y McGuire realizaron un ELISA utilizando la proteína MSP3, pero actualmente se ha comprobado que ésta presenta epitopes comunes con A. ovis y no se encuentra conservada entre los diferentes aislamientos de A. marginale por lo que el uso, en el diagnóstico en general, de la proteína nativa o recombinante no es recomendado (Alleman y Barbet, 1996). El uso de la proteína MSP5 como antígeno ha mostrado buenos resultados en la detección de diferentes especies del género Anaplasma (Ndung'u y col., 1995).

Otros ensayos inmunoenzimáticos usan como antígeno epitopes del polipéptido MSP1 (Trueblood y col., 1991) y cuerpos iniciales de A. marginale, dando este último reacción cruzada con A. centrale (Nakamura y col., 1989). Este tipo de antígeno también se ha usado en pruebas Dot-ELISA obteniéndose buenos resultados (Montenegro-James y col., 1992).

Para mejorar los parámetros de sensibilidad y especificidad se han desarrollado técnicas de diagnóstico utilizando anticuerpos monoclonales (Trueblood y col., 1991) y antígenos recombinantes (Knowles y col., 1996; Torioni y col., 1998). El establecimiento de un ensayo de ELISA competitivo (Torioni y col., 1998), utilizando la proteína recombinante MSP5, permitió el incremento de la sensibilidad a un 96 % y la especificidad de un 95 %, pudiendo detectar las infecciones persistentes del parásito, por lo que los autores sugieren esta técnica para estudios epidemiológicos, programas de erradicación y para la regulación internacional para el movimiento del ganado. La utilización de un rMSP5 cELISA demostró que este es altamente específico para el diagnóstico serológico de anaplasmosis en ganado de Norteamérica.

Reyna-Bello y col., (1998), desarrollaron un ensayo ELISA para el diagnóstico serológico de la anaplasmosis bovina con la proteína MSP5 de A. marginale. El ELISA desarrollado con sueros de campo de diferentes regiones geográficas de Venezuela mostró una seroprevalencia de la enfermedad de un 47 %, lo que coincidió con los resultados de los estudios epidemiológicos realizados. Estos resultados confirman la importancia de la MSP5 como un antígeno útil para el diagnóstico serológico de la anaplasmosis bovina.

Más recientemente, Bowles y col., (2000), han desarrollado un ELISA comercial para la detección de anticuerpos contra A. marginale y A. centrale en Australia y Zimbabwe, mostrando una sensibilidad y especificidad en Australia de 100 % y 83.3 %, respectivamente y en Zimbabwe una sensibilidad de un 100 %, no siendo posible calcular la especificidad por la poca cantidad de sueros positivos con que contaban. Estos autores concluyeron que el ELISA es una alternativa útil para los estudios epidemiológicos cuando se compara con la prueba de aglutinación en tarjeta. Braz Junior y col., (2002) desarrollaron un sistema ELISA para la detección de anticuerpos anti A. marginale con un 100 % de especificidad y un 94.87 % de sensibilidad.

A pesar de los resultados obtenidos con los ensayos de ELISA, se hace necesaria la existencia de una prueba diagnóstica que se pueda realizar al lado del animal, que resulte sensible y específica, para lo cual la proteína MSP5 recombinante promete ser un fuerte candidato (Corona, 2005), lo que permitirá un diagnóstico rápido y efectivo de la enfermedad en el campo. Se deben tener muy en cuenta las potencialidades que muestran el gen msp5 y la proteína MSP5 de Anaplasma marginale para la determinación del agente y de anticuerpos contra éste. Trabajos previos han demostrado que la proteína MSP5 de A. marginale resulta de gran utilidad en ensayos de formato ELISA (Torioni y col., 1998), ya que elimina los problemas señalados de los antígenos crudos, utilizados en otras técnicas como la aglutinación en tarjeta y que el gen msp5 es de gran utilidad para el diagnóstico molecular, mediante PCR, en animales persistentemente infectados (Torioni y col., 1998). Este gen y su producto de expresión son recomendados en el monitoreo de animales para el movimiento internacional de ganado y en programas de control de la anaplasmosis bovina (Palmer y McElwain, 1995).

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Autor:

Belkis Corona,

Majela Rodríguez

Siomara Martínez

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA)

Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.