Anaplasma marginale. Métodos empleados en el diagnóstico

1. Resumen
2. Generalidades de Anaplasma marginale
3. Biología Molecular de A. marginale
5. Diagnóstico de la enfermedad
6. Referencias

Resumen

Anaplasma marginale es una rickettsia del genogrupo II de las Ehrlichias, que parasita los eritrocitos maduros del ganado bovino y causa severas pérdidas económicas fundamentalmente en las zonas tropicales y subtropicales (Palmer y col., 1999). Este microorganismo presenta múltiple variabilidad antigénica, de morfología, virulencia, transmisibilidad por garrapatas y habilidad para inducir protección cruzada contra aislamientos heterólogos (Palmer y McElwain, 1995). Se han caracterizado seis proteínas de superficie de membrana de los cuerpos iniciales de este organismo, portadoras de epitopes B y T, denominadas proteínas mayoritarias de superficie (MSPs) y designadas 1a, 1b, 2, 3, 4 y 5. Estas proteínas son reconocidas por anticuerpos neutralizantes y se encuentran en una estrecha relación intermolecular en la superficie de la membrana de los cuerpos iniciales.

Algunas de estas proteínas inducen una protección total o parcial en animales vacunados, aunque el nivel y la uniformidad de la misma, es variable (Palmer y McElwain, 1995). A pesar de las cuantiosas pérdidas económicas producidas todos los años, a nivel mundial hasta el momento no se cuenta con un método de control eficaz contra la enfermedad, por lo que resulta de gran importancia desarrollar una vacuna capaz de prevenir la infección con este patógeno y contar con técnicas de diagnóstico más sensibles y específicas que permitan la detección de animales portadores para ser utilizadas en estudios epizootiológicos y para el control de la enfermedad (Echaide y col., 1998; Corona, 2005). A partir de estas premisas nos proponemos como objetivo exponer los resultados más importantes relacionados con la anaplasmosis bovina y los métodos utilizados en el diagnóstico de Anaplasma marginale.

1. Generalidades de Anaplasma marginale

1.1. Clasificación taxonómica

Anaplasma marginale se consideró como un protozoo hemático durante mucho tiempo. Las investigaciones ulteriores demostraron que se clasifica dentro del orden Rickettsiales, familia Anaplasmataceae, género Anaplasma (Ristic y Kreier, 1984). El análisis filogenético, utilizando secuencias de la región 16S del ARNr, permitió esclarecer la relación dentro de los genogrupos de las especies de Ehrlichias, situando a A. marginale dentro del árbol filogenético, en el genogrupo II

de las Ehrlichias, las cuales son patógenos de animales y humanos que se transmiten por garrapatas (Biberstein, 1999).

Se conocen cuatro especies del género Anaplasma, como agentes causantes de la anaplasmosis: A. marginale, que es la más patógena para los bovinos; A. centrale, causante de una relativa forma benigna de anaplasmosis en bovinos; A. caudatum también en ganado bovino y A. ovis, causante de un padecimiento limitado a ovinos y caprinos (Ristic y Kreir, 1984), siendo A. marginale la única especie identificada en Cuba (Alonso y col., 1989). La secuencia nucleotídica de la región 16S del ARNr de A. centrale está estrechamente relacionada con la secuencia de A. marginale con un 98.08 % de identidad (Inokuma y col., 2001).

Dumler y col., (2001), propusieron que en la familia Anaplasmataceae se incluyeran especies del género Wolbachia, Ehrlichia, Cowdria y Neorickettsia y conservar los géneros Anaplasma y Aegyptianella dentro de la familia. Propusieron, además que miembros del grupo de E. phagocytophila, incluyendo E. phagocytophila, E. equis, E. granulocítica humana (HGE), así como E. bovis y E. platys debían ser unidos con el género Anaplasma. Cada uno de estos agentes persiste en sus respectivos hospederos mamíferos y se transmite dentro y no entre las generaciones del vector biológico. Por otra parte, se han encontrado genes homólogos entre los miembros de este grupo, algunos de los cuales son miembros de familias de multigenes que pueden estar arreglados en ² tandem² o dispersos en el cromosoma (Dame y col., 1992; Walker y Dumler, 1996).

1.2. Caracteres morfofuncionales y culturales

A. marginale es un microorganismo sin forma definida. Se establecieron tres categorías de acuerdo a su talla: El clásico cuerpo marginale, una forma intermedia cuerpo inicial y la de tamaño pequeño conocido como cuerpo polihédrico (Ristic y Watrach, 1963; Palmer y McGuire, 1984; Ristic y Kreier, 1984).

En los hospederos vertebrados, Anaplasma spp., infecta a los eritrocitos maduros con la formación de una vacuola derivada de dichos eritrocitos, alrededor del organismo (Francis y col., 1979). Cada organismo tiene un diámetro de 0.55- 0.85 m m y contiene los cuerpos iniciales que consisten en agregados granulares densos rodeados por una doble membrana de 40-50 m m de espesor. El microorganismo se replica dentro del eritrocito por fisión binaria para formar hasta ocho organismos individuales dentro de una vacuola simple (Ristic y Watrach, 1963; Palmer y McGuire, 1984; Ristic y Kreier, 1984). Posteriormente, los organismos salen del eritrocito, utilizando mecanismos aparentemente no líticos e infectan los eritrocitos aledaños (Erp y Fahrney, 1975).

El cuerpo inicial se encuentra dentro de los glóbulos rojos en número variable y está formado por material fibrilar y varios gránulos electrodensos que contienen ADN, ARN y hierro orgánico, rodeados por una doble membrana. Estos cuerpos iniciales, a la vez, son limitados por una vesícula intracitoplasmática, constituida por una sola membrana, y que también posee material fibrilar, nombrada cuerpo de inclusión (Ristic y Kreier, 1984).

Nakamura y col., (1989) demostraron la presencia de carbohidratos en la superficie de los cuerpos iniciales de A. marginale, pero al parecer éstos no son importantes en la hemaglutinación de los cuerpos iniciales, ya que cuando se trató con NaIO4 o neuroaminidasa, no se encontraron diferencias con respecto al control. Esto sugiere que aparentemente los carbohidratos de superficie de los cuerpos iniciales no juegan un papel importante en la adhesión de A. marginale. Cuando se trataron los eritrocitos bovinos con a quimotripsina o neuroaminidasa, fue evidente la pérdida de la hemaglutinación, no así cuando se siguió el tratamiento con tripsina y varias fosfolipasas, lo que sugirió que el ligando del receptor de los eritrocitos está compuesto parcialmente por proteína y/o ácido siálico (McGarey y Allred, 1994).

Este hemoparásito se caracteriza además, por producir catalasas, no producir pigmentos y no formar esporas u otros estados de resistencia. Es sensible a la tetraciclina e insensible a las penicilinas, sulfonamidas, estreptomicina y arsenicales. Su infectividad puede ser destruida al exponerlo a 60°C, al menos por 50 minutos y a rayos X o a sonicación a 35°C por 90 minutos. (Ristic y Kreier, 1984).

En Brasil se detectaron y aislaron cepas de A. marginale con un apéndice de inclusión. El mismo presenta estriaciones longitudinales electrodensas y no se origina directamente del cuerpo de la rickettsia, sino de un complejo localizado en la unión entre la membrana de inclusión y el apéndice. Este apéndice permanece en las células huéspedes, incluso aún después que A. marginale abandonan los glóbulos rojos (Ribeiro y Passos, 1996; Stich y col., 1997).

A. marginale se logró cultivar, pero por cortos períodos de tiempo, mediante la propagación del parásito en un cultivo de una línea celular derivada de embriones de garrapata Dermacentor variabilis, pero para poder mantener el crecimiento se necesitaron realizar pases continuos, pues este microorganismo requiere para su propagación de células hospederas con una alta actividad de crecimiento y multiplicación y un medio con suero fetal bovino (Hidalgo y col., 1989). Sin embargo, Munderloh y col., (1996), lograron propagar continuamente esta rickettsia en una línea celular derivada de Ixodes scapularis, usando como inóculo sangre de bovino infectado. Un segundo aislamiento, derivado de vacas naturalmente infectadas en Oklahoma, se propagó en la misma línea celular de garrapata, lo que tiene potencialidad para ser utilizado como antígeno para el desarrollo de una vacuna mejorada contra la anaplasmosis en los Estados Unidos (Blouin y col., 1998).

2. Biología Molecular de A. marginale

A. marginale presenta un ADN circular de doble cadena, cuya talla total oscila entre 1 200 y 1 250 kpb, determinado por los análisis de restricción realizados al genoma de la cepa Florida, con las enzimas Sfi I y Pac I. El análisis en electroforesis de campo pulsante, de los productos de las digestiones, realizadas al genoma de diferentes cepas, dio como resultado la existencia de un considerable polimorfismo entre estas, aunque la talla total del genoma es constante, con un contenido de G + C de 56 %, lo cual se determinó por análisis espectral (Alleman y col., 1993).

En este parásito se describen seis genes (msp1a , msp1b , msp2, msp3, msp4 y msp5), que codifican para las proteínas principales de superficie de los cuerpos iniciales, que constituyen blancos de la respuesta inmune del hospedero contra el patógeno (Palmer y McGuire, 1984; Tebele y McGuire, 1991). Hasta la fecha varios de los genes que codifican para las MSPs se han clonado, secuenciado y expresado (Barbet y col., 1986; Allred y col., 1990; Barbet y Allred, 1991; Visser y col., 1992; Oberle y col., 1993; Alleman y col., 1998). Estos trabajos han revelado que algunos de estos genes son polimórficos entre cepas y existen en familias de multigenes.

El gen msp1a codifica para la proteína de membrana MSP1a y se encuentra representado en el genoma por una simple copia. Posee una gran similitud con los genes de E. coli, en cuanto a las secuencias consenso de la región promotora, sin embargo, no se ha detectado una secuencia con similitud a la de Shine-Delgarno de E. coli (Palmer y McGuire, 1990). Este gen presenta un alto polimorfismo de talla entre los aislamientos de distintas regiones geográficas, debido a que posee secuencias oligonucleotídicas repetidas en tandem (Oberle y col., 1988; Allred y col., 1990; Palmer y McGuire, 1990). Estas secuencias se encuentran repetidas en el gen 2, 4, 6 y 8 veces en los aislamientos Virginia, Washington, Idaho y Florida respectivamente (Palmer y McGuire, 1990; de la Fuente y col., 2002a; de la Fuente y col., 2002b).

A partir de estudios realizados a este gen, en el aislado Habana de A. marginale pudimos comprobar la presencia de 5 repetidos en tandem en dicho aislado (Corona y col., 2004, Corona y col., 2005), de ahí el alto polimorfismo de talla observado, por lo que se ha utilizado para la diferenciación y detección específica de aislamientos de A. marginale (Lew y col., 2002).

Por su parte, el gen msp1b está formado por una familia de multigenes, compuesta al menos por cuatro copias (Camacho y col., 2000). Este gen también presenta dominios de secuencias repetidas, al igual que msp1a , aunque son de menor extensión. Por ensayos de RFLP, se demostró que esta familia de genes es polimórfica entre aislados de regiones geográficamente diferentes (Barbet y Allred, 1991). En estos momentos se sabe que todas las copias del gen son capaces de expresarse y que codifican para proteínas estructuralmente únicas (Camacho y col., 2000).

El gen msp2 está formado por una familia multigénica. Presenta una gran variabilidad fundamentalmente en su extremo 5’ (Palmer y col., 1994) y codifica para moléculas proteicas estructuralmente distintas, las cuales presentan epitopes B diferentes, en las regiones con alto polimorfismo de aminoácidos. Durante la fase aguda de la enfermedad hay transcripción de diferentes copias de este gen paralelamente (Eid y col., 1996; French y col., 1998).

El gen msp3 forma parte también de una familia multigénica, cuyas copias se encuentran ampliamente distribuidas a través del cromosoma (Alleman y Barbet, 1996). El análisis de la secuencia de tres genes reveló regiones conservadas y regiones variables dentro del marco abierto de lectura de los mismos. Este gen codifica para una proteína de 86 kDa, que es considerada un antígeno inmunodominante (Palmer y col., 1986; McGuire y col., 1991).

El gen msp4 se encuentra como una simple copia en el genoma de A. marginale y codifica para una proteína de 31 kDa (MSP4) (Oberle y col., 1988, Palmer y col., 1988). Según nuestros resultados se obtuvo la amplificación de este gen en tres aislados cubanos de A. marginale con una talla de 800 pb (Corona y col., 2000). Un rasgo peculiar de este gen, es que la secuencia de la región 3' contiene repeticiones imperfectas invertidas que exhiben abundantes estructuras secundarias (Oberle y col., 1993). de la Fuente y col., (2002a), han demostrado que este gen proporciona información filogenética sobre la evolución de los aislamientos de A. marginale, a diferencia del gen msp1a , que puede brindar información filogeográfica, sólo cuando se analizan un gran número de aislamientos de un área geográfica.

El gen msp5 está representado en el genoma como una simple copia, altamente conservada entre las cepas de A. marginale estudiadas (Martínez y col., 2004, Corona y col., ). La presencia del gen en todas las especies de Anaplasma, incluyendo A. ovis, sugiere que este gen es esencial en el ciclo de vida del parásito, lo que avala el uso del mismo para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico molecular. Se han identificado elementos de control procariontes en la secuencia de este gen, los cuales son funcionales en la bacteria E. coli (Visser y col., 1992).