Enfermedades abortivas en los animales

Indice1. Abortos 2. Patogenia 3. Enfermedades abortivas causadas por diversas bacterias 4. Campylobacteriosis genital bovina 5. Aislamiento de Campylobacter fetus 6. Listeriosis 7. Tuberculosis bovina 8. Enfermedades originadas por hongos que pueden causar abortos 9. Aspergilosis 10. Mucormicosis 11. Candidiasis

1. Abortos

Se define como la expulsión uterina en cualquier etapa de la gestación de un feto muerto o vivo que no ha alcanzado el grado de desarrollo para ser viable. El aborto no es una enfermedad específica, sino un signo clínico de numerosas enfermedades que afectan ya sea al feto, a la placenta, al aparato reproductor de la madre o que causan enfermedad sistémica en la madre. El aborto es sin duda el signo de dichas enfermedades que más alarma causa entre los propietarios, ya que se ven afectados por la pérdida de fetos y bajas en la producción, además de que en muchos casos la fertilidad subsecuente del animal se ve afectada negativamente.

2. Patogenia

Se considera que aproximadamente el 90% de los abortos son debidos a causas infecciosas. Los mecanismos por los cuales un agente infeccioso produce aborto son variados y dependerán del tipo de organismo infectante, el órgano que ataca o la etapa de gestación en la que actúa; muchas enfermedades sistémicas de la madre pueden resultar en aborto aún cuando los órganos reproductores no se vean directamente afectados, en éstos casos el aborto puede resultar por una marcada elevación de la temperatura materna, la cual causa hipoxia y acidosis en el feto. De la misma forma infecciones localizadas en cualquier órgano y causadas por microorganismos Gram- pueden resultar en una endotoxemia capaz de producir el aborto debido a la capacidad que tienen las endotoxinas de inducir la síntesis de prostaglandina F2α en muchos tejidos. Ademαs, las endotoxinas causan coagulaciσn intravascular, interfiriendo con la coagulación sanguínea a nivel de la placenta. En el caso de infecciones que afectan directamente al feto o a la placenta, el organismo responsable debe primero llegar al útero gestante. Para lograrlo es posible que siga una de las siguientes rutas:

• Vía hemática: Es la vía más común y adquiere mayor importancia hacia el final de la gestación. El organismo infectante puede entrar al organismo materno a través del aparato digestivo (Brucella abortus, Salmonella, Leptospira, Listeria), o de la mucosa nasal o conjuntival ( Rinotraqueitis infecciosa bovina, Leptospira, parainfluenza, diarrea viral bovina); en todo aso siempre existe una bacteria o viremia materna antes de que se produzca invasión del útero, desde el cual el organismo infectante puede invadir la placenta y luego pasar al feto.
• Vía ascendente: ésta vía de infección es más común en las fases tempranas de la gestación. Los microorganismos pueden entrar por vagina (Campylobacter, Trichomona, Corynebacterium pyogenes, ureaplasma), desde donde ascienden hacia el útero o pueden ser depositados directamente en el útero durante la cópula o la inseminación artificial.
• Vía descendente: es la ruta más rara y consiste en el descenso de una infección desde los oviductos hacia el útero, puede ocurrir en casos de peritonitis.

Una vez que el organismo infectante llega a la placenta, se encuentran con una variedad de condiciones que favorecen su establecimiento y desarrollo en ese lugar. Por ejemplo, la tensión de oxígeno en la placenta es baja y favorece el desarrollo de organismos anaeróbicos. Además, la placenta produce algunas sustancias que estimulan el crecimiento de algunos microorganismos. La Brucella abortus, por ejemplo, es estimulada por la sustancia erithritol que se encuentra en grandes cantidades en la placenta y líquidos fetales. Esta sustancia es un carbohidrato que Brucella abortus usa como fuente de energía y que también se encuentra en vesículas seminales y testículos de los machos, lo que explica la preferencia de ésta bacteria por éstos tejidos. El insuficiente desarrollo inmunológico del feto, y por ende de la placenta contribuye también a facilitar el establecimiento de los microorganismos infectantes. Cuando el microorganismo llega a la placenta o feto, se pueden presentar una variedad de condiciones dependiendo de la virulencia o patogenicidad del microorganismo:

• Si el microorganismo es de baja patogenicidad, y solo causa una ligera inflamación de la placenta, es posible que el aborto no se produzca y se lleve a cabo un parto a término, aunque probablemente seguido de una retención placentaria.
• Si el microorganismo tiene una patogenicidad intermedia la inflamación de la placenta puede ser moderada, con focos de placentitis severa que irán extendiéndose lentamente. Este avance progresivo de la inflamación interfiere con el funcionamiento normal de la placenta, lo que causa estrés en el feto sin llegar a matarlo, como resultado del estrés la hipófisis fetal libera ACTH, la cual inicia la cascada de eventos que desencadenan en parto, y como consecuencia se produce el aborto de un feto recién muerto o el parto de un feto vivo pero inmaduro, y por tanto con pocas posibilidades de sobrevivir.
• Si el microorganismo es de patogenicidad elevada puede matar al feto muy rápidamente, ya sea por los daños causados a la placenta o al feto mismo. En éstos casos la muerte fetal se producirá antes de que se desencadene el mecanismo del parto, por lo que muchas veces el feto morirá y permanecerá dentro del útero para convertirse bien sea en un feto momificado, en un feto macerado o en un feto enfisematoso. En algunos casos el feto será finalmente expulsado varios días después de su muerte, presentando un grado de autólisis elevado que indica que la muerte ha ocurrido tiempo atrás.

La placentitis que a menudo resulta de la infección del útero y placenta puede causar hipoxia del feto. En éstos casos es común observar que el líquido amniótico está teñido con meconio, esto es el resultado de baja oxigenación del intestino fetal, la cual causa que se incremente el peristaltismo y se relaje el esfínter anal, resultando en expulsión de meconio hacia la cavidad amniótica. Además la hipoxia estimula el reflejo respiratorio del feto, el cual comienza a hacer movimientos inhalatorios, resultando en la inhalación de líquido amniótico hacia los pulmones, lo cual resulta en neumonía fetal. Al avanzar la hipoxia el feto muere por asfixia, y en caso de sobrevivir hasta que se produzca el parto es muy posible que muera en las primeras horas después del nacimiento debido a la neumonía desarrollada durante la vida fetal. En los casos en los que el organismo infectante invada el feto a partir de la placenta, dicha invasión puede seguir dos vías:

• Puede penetrar al feto por vía circulatoria a través del cordón umbilical.

Cuando la infección penetra el feto vía circulatoria, el primer órgano encontrado va a ser el hígado, el cual puede sufrir necrosis, como en el caso de IBR o hepatitis supurativa, o como en el caso de infecciones por Listeria o Campylobacter fetus. Posteriormente el agente infectante invade la circulación general del feto y puede lesionar otros órganos, causando neumonía, lesiones renales o lesiones oculares.

• Puede penetrar vía oral al tragar el feto líquido amniótico contaminado con el microorganismo infectante.

Si el agente infectante llega al feto atravesando las membranas fetales para llegar a la cavidad amniótica, el contacto de la piel del feto con líquido amniótico contaminado favorecerá el desarrollo de dermatitis o además el feto deglutirá líquido amniótico contaminado, lo que resultará en lesiones intestinales.

Causas de abortos mas comunes en animales domesticos Infecciosas

• Bacterias:
• • Brucelosis: Brucella abortus (bovinos), Brucella suis (cerdos), Brucella melitensis (cabras), Brucella ovis (ovinos), Brucella canis (caninos).
  • Vibriosis: Campylobacter fetus (bovinos y ovinos).
  • Salmonelosis: Salmonella abortus ovis (ovinos), Salmonella abortus equi (equinos).
  • Leptospirosis: Leptospira pomona, Leptospira gripotiphose, Leptospira icterohemorrágica, Leptospira canicola, Leptospira hardjo, (afectan todas las especies).
  • Listeriosis: Listeria monocytogenes (ovinos y bovinos).
  • Metritis contagiosa equina: Haemophilus equigenitalis.
  • Ureaplasmosis: Ureaplasma urealyticum (bovinos).
  • Streptococcus zooepidermicus (equinos).
  • Tuberculosis: Mycobacterium bovis (bovinos).
  • Esporádicamente: Escherichia coli, Corynebacterium pyogenes, Pasteurella multocida, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomona aeruginosa (en cualquier especie).
• Hongos
• • Aspergillosis: Aspergillus spp (afecta todas las especies).
  • Mucormicosis: Rhizophus, Absidia, Mucor ( Afectan todas las especies).
  • Candidiasis: Candida albicans (equinos).

Criterios para el diagnostico de causas de aborto

La historia clínica individual es importante para el diagnóstico, pero igualmente importante es la historia clínica a nivel del hato; factores tales como incidencia de abortos, repetición de calores, cambios en el índice de concepción, edad o número de pariciones de las hembras afectadas, pueden ser de gran utilidad en la orientación del diagnóstico. Para llevar a cabo ésta parte del diagnóstico en forma apropiada es importante contar con registros confiables de todos los aspectos reproductivos del hato.

Muchas enfermedades que causan abortos presentan además otros signos a nivel de aparato reproductor, los que nos pueden ayudar a diferenciar entre enfermedades parecidas. Como ejemplo de algunos signos característicos de una enfermedad podemos citar el elevado índice de retenciones placentarias en brucelosis bovina, incremento en el número de servicios por concepción (infertilidad) en Vibriosis. En ocasiones la enfermedad que está causando abortos en las hembras causa signos característicos en los machos, como es el caso de vesiculitis y epididimitis causadas por Brucella. Para el diagnóstico a nivel de laboratorio es necesario recordar que el aborto puede deberse a causas que afectan a la madre, a la placenta, al feto, o a una combinación de ellos, por lo que las muestras que se envíen al laboratorio deben incluir muestras de material biológico materno (suero, moco cervical o vaginal, etc.), placentario (cotiledones, líquido amniótico, etc.) y fetal (líquido abomasal, pulmones, etc).

Entre los errores mas frecuentemente cometidos por el clínico están el no dar importancia a la obtención de muestras de la madre, así como la obtención de material placentario a partir de la porción de la placenta que queda colgando por la vulva que a menudo está contaminada por materia fecal. Antes de enviar muestras al laboratorio es importante examinar detalladamente al feto y la placenta. En el feto se deberá determinar la edad aproximada, ya que varias enfermedades causan abortos en periodos específicos de la gestación; también se deberá determinar si el feto presenta signos de haber muerto tiempo antes de ser abortado (autólisis, pigmentación), se deberá revisar al feto en busca de lesiones específicas. En el caso de placentas se deberá hacer un descripción de su condición, si están frescas, descompuestas, retenidas o hemorrágicas. Se examinará tamaño y peso de la placenta, tamaño de los cotiledones y otros factores que puedan indicarnos si la placenta estaba teniendo una función normal o alterada. Por la naturaleza misma del problema es posible que el aborto se detecte varias horas o días después de su ocurrencia, por lo que el feto y las placentas pueden encontrarse en un estado avanzado de autólisis o putrefacción, siendo inutilizables para el diagnóstico de laboratorio. Por ésta razón es importante la utilización de pruebas de diagnóstico que se aplican a nivel del hato, no necesariamente en los animales que han abortado, y que nos pueden indicar la presencia de una enfermedad en el hato que podría explicar los casos de aborto que se hayan presentado; como ejemplo tenemos la prueba de anillo en leche para brucelosis.

3. Enfermedades abortivas causadas por diversas bacterias

Brucelosis Producida por diversas especies de Brucella, son causadas por Brucella abortus (bovinos), Brucella suis (cerdos), Brucella melitensis (cabras), Brucella ovis (ovinos), Brucella canis (caninos). Se caracteriza por aborto al final de la gestación y cifras elevadas subsiguientes de infertilidad.

Frecuencia Ampliamente distribuida, posee importancia económica en casi todo el mundo, sobre todo en ganado lechero. La frecuencia vería considerablemente entre países, regiones y hatos. El microorganismo puede transmitirse al hombre y causar fiebre ondulante al consumir leche infectada o entrar en contacto con animales contaminados. El microorganismo puede aislarse de muchos órganos, además de ubres y útero.

Etiología Se han registrado infecciones por Brucella abortus en la mayor parte de las especies, pero con frecuencia sólo se observa en bovinos que pueden tener cualquier edad, pero la infección solamente persiste en animales adultos desde el punto de vista sexual.

Transmisión Se observa la concentración más elevada de Brucella abortus en el contenido de útero gestante, en feto y membranas fetales, pudiendo ser consideradas éstas estructuras como las fuentes más importantes de infección. la enfermedad se transmite por ingestión, penetración de la conjuntiva y piel indemne y contaminación de la ubre durante el ordeño. La ingestión de pastos u otros alimentos contaminados con secreciones de animales enfermos es el método más frecuente de propagación. En la mayoría de los casos la contaminación es directa y aunque la posibilidad de infección por medio de moscas, perros, ratas, garrapatas, calzado, trajes y otros objetos inanimados existe, sin embargo no se considera de mayor importancia en lo que se refiere a medias de control

Patogenia Brucella abortus tiene predilección por el útero grávido, ubres, testículos y glándulas sexuales masculinas accesorias, ganglios linfáticos, cápsulas articulares y bolsas. La sustancia denominada erithritol producida por el feto y que estimula el crecimiento de Brucella abortus, ocurre normalmente en concentraciones muy elevadas en la placenta y líquidos fetales y quizá dependa de ella que se localice la infección en éstos tejidos. Al producirse la invasión del útero grávido las lesiones se inician en la pared del órgano, pero pronto es ocupada la luz del útero, dando lugar a endometritis ulcerosa grave de los espacios situados entre los cotiledones. Los líquidos fetales y cotiledones placentarios son invadidos inmediatamente después con destrucción subsecuente de las vellosidades. El aborto suele producirse hacia los tres últimos meses de la gestación, siendo el periodo de incubación inversamente proporcional a la etapa de desarrollo del feto en el momento de la infección.

Manifestaciones CLÍNICAS El aborto después del quinto mes de gestación constituye el signo clínico cardinal de éste padecimiento, se registran casos de 2 y 3 abortos en la misma vaca, retención de placenta y metritis. Infecciones mixtas pueden producir metritis que puede ser aguda con septicemia y muerte consecutiva o crónica seguida de esterilidad. En machos se observan orquitis y epididimitis, afección de uno o ambos sacos escrotales con tumefacción aguda y dolorosa. Los toros suelen ser estériles cuando la orquitis es aguda pero pueden recuperarse si el testículo dañado es uno solo.

Patología Clinica Los análisis de laboratorio usados en el diagnóstico de brucelosis incluyen el aislamiento del microorganismo y pruebas en busca de la presencia de aglutininas contra Brucella abortus en suero sanguíneo, leche, moco vaginal, suero lácteo y plasma seminal. El aislamiento del microorganismo por cultivo o inoculación al cobayo se efectúa a partir del abomaso o pulmones de fetos abortados o de placenta. Si esto no es posible podemos obtener una muestra de exudado uterino, ya que el microorganismo persiste en el tejido días después del parto. Pueden observarse frotis obtenidos de puntos de fijación de la placenta. Se dispone de pruebas serológicas para la identificación de aglutininas contra Brucella abortus en suero sanguíneo y leche. Se recomienda la prueba de anillo en leche para detectar vacas infectadas. Hay criterios especificados para el uso de la prueba de aglutinación en tubo, animales con titulo de anticuerpos contra Brucella abortus < a 30 UI serán aceptados mientras que aquellos superiores a 67 UI serán eliminados y los animales ubicados entre éstos títulos se declaran indecisos.

Pruebas complementarias

• En suero sanguíneo: aglutinación en tubo (lenta), aglutinación en placa( rápida), fijación de complemento, inactivación por calor, aglutinación en placa ácida, mercaptoetanol, rivanol, bloqueo de anticuerpos, fijación en superficie.
• En leche: anillo, aglutinación en placa leche completa, aglutinación suero en tubo, placa en suero, fijación de complemento en suero.
• Prueba de aglutinación en moco vaginal o plasma seminal.
• Cultivo de moco vaginal, semen, heces o producto del feto abortado.

Preparación de los antígenos Para la práctica de las diversas pruebas de aglutinación y para la prueba de fijación del complemento (FdC) se emplean preparaciones antigénicas en forma de suspensiones de células enteras elaboradas a partir de las cepas lisas 99 o 1119-3 de Brucella abortus. Para las pruebas del anillo lácteo, de rosa de bengala y pruebas de aglutinación en placa tamponada se utilizan preparaciones similares, aunque teñidas respectivamente con hematoxilina, rosa de bengala o verde brillante/violeta cristal.

Para la producción de antígenos de diagnóstico debe usarse la cepa 99 (Weybridge) o la cepa 1119-3 (United States Department of Agriculture, USDA) de B. abortus. Las cepas deben ser completamente lisas y no aglutinables ni en solución salina ni en acriflavina al 0,1% (p/v). Tienen que constituir cultivos puros y ajustarse a las características típicas de las cepas independientes de CO2 del biovar 1 de B. abortus. Para obtener un conjunto de cultivos germinales de partida es preciso cultivar las líneas germinales originales. El lote germinal así obtenido deberá presentar todas las propiedades características de estas cepas, y deberá conservarse después por liofilización o congelación a la temperatura del nitrógeno líquido. Para proceder a la elaboración del antígeno, debe inocularse un cultivo germinal de las cepas 99 o 1119-3 de B. abortus en una serie de agares inclinados de infusión de patata, que después se incuban a 37°C durante 48 horas. El agar de suero-dextrosa, así como el agar soja-tripticasa (al que puede añadirse suero equino al 5% o extracto de levadura al 0,1%), constituyen medios sólidos satisfactorios, siempre y cuando se utilice un cultivo germinal conforme a las instrucciones expuestas más arriba. Tras comprobar la pureza del cultivo, se resuspende éste en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril, pH 6.4, y se siembran capas de agar de infusión de patata o agar de dextrosa-glicerol en frascos de Roux. Después se dejan éstas en incubación a 37°C durante 72 horas, con la superficie inoculada vuelta hacia abajo. Tras comprobar la pureza de los cultivos de los frascos, sometiendo una muestra de cada uno de ellos a tinción Gram, se recogen los organismos. Para ello se añaden a cada recipiente 50-60 ml de solución salina fenolada (0,5% de fenol en solución de cloruro sódico al 0,85%), se agitan suavemente los frascos y se decanta la suspensión. Después se mata a los organismos por calor, manteniéndolos a 95°C durante 1 hora. Previa comprobación de la ausencia de organismos viables, se almacena el antígeno a 4°C. Un sistema alternativo de producción de antígeno consiste en un cultivo celular, ya sea por lotes o continuo, en un fermentador. Para este cultivo se utiliza un medio líquido con la siguiente composición (por litro de agua destilada): D-glucosa (30 g), una peptona de gran pureza (30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), dihidrógenofosfato sódico (9 g) e hidrógenofosfato bisódico (3,3 g). El pH inicial es de 6.6, aunque tiende a aumentar hasta 7.2-7.4 durante el ciclo de crecimiento. Es necesario cerciorarse de que los lotes de peptona y de extracto de levadura son capaces de inducir un buen crecimiento, sin formación de células anormales o disociadas. Durante la fase de crecimiento se requiere ventilación y agitación vigorosas, y puede ser necesario asimismo ajustar el pH por adición de HCl 0,1 M estéril. El inóculo de células germinales se elabora tal y como ha quedado descrito más arriba. En el caso del cultivo por lotes, éstos deben incubarse a 37°C durante 48 horas. Las series de cultivo continuo pueden prolongarse durante periodos mucho más largos, aunque su mantenimiento exige una mayor habilidad técnica. El cultivo se recoge por centrifugación con el fin de sedimentar los organismos que, a continuación, serán resuspendidos en solución salina fenolada y sometidos a una temperatura de 80°C durante 90 minutos (lo que causará su muerte). Tras comprobar la ausencia de viabilidad del cultivo, se guarda éste a 4°C. En el curso del proceso deberán realizarse comprobaciones periódicas de los cultivos, tanto en medio sólido como en medio líquido, a fin de verificar su pureza, la presencia de un número adecuado de organismos viables y la posibilidad de disociación de las colonias a formas rugosas. Puede determinarse el volumen del concentrado celular de las suspensiones muertas mediante centrifugación de volúmenes de 1 ml en tubos Wintrobe, a 3.000 g durante 75 minutos.

El antígeno para la prueba de FdC (Weybridge) se prepara a partir de un concentrado de organismos muertos de la cepa 99 o 1119-3 de B. abortus, diluyendo dicho concentrado en solución salina fenolada hasta alcanzar una concentración del agregado celular del 2%. Se diluye luego esta suspensión en solución salina fenolada, se titula frente al antisuero estándar internacional contra B. abortus (International Standard anti-B. abortus serum, ISABS) o un suero estándar equivalente, y se ajusta la concentración celular a fin de obtener la sensibilidad adecuada. Tras incubación a 37°C durante 18 horas, debería obtenerse una suspensión estable blanco-grisácea sin agregación o depósitos visibles. El antígeno utilizado en la Unión Europea (UE) debe ser estandarizado frente al ISABS de tal forma que produzca un 50% de fijación frente a una dilución de 1/200 del suero estándar. Es necesario que la dilución antigénica produzca también una fijación completa a las diluciones inferiores del suero, dado que una concentración de antígeno demasiado débil (o demasiado fuerte) puede no inducir un 100% de fijación a las diluciones inferiores del suero. En el caso de que haya dos diluciones antigénicas apropiadas, se elegirá la suspensión en la que el antígeno esté más concentrado, lo que evitará la aparición de la prozona. Por lo general, y al término del proceso, el antígeno se presenta en forma de concentrado, que antes de su utilización deberá ser disuelto en diluyente de FdC. El antígeno no debe ser congelado. En la fase de recogida es preciso realizar comprobaciones de la pureza y lisura de las células que van a utilizarse para la preparación de los antígenos de las pruebas del anillo lácteo, de rosa de bengala, de aglutinación en placa tamponada, de aglutinación o de FdC. Una vez muertas, estas células deben formar suspensiones estables en solución salina fisiológica y no manifestar indicios de autoaglutinación. Una vez muertas las células, debe comprobarse también la ausencia de viabilidad de la suspensión: tras 10 días de incubación a 37°C, no deberá observarse signo alguno de crecimiento.

a) Pruebas del antígeno tamponado de Brucella

• Prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala

El antígeno para la prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala se prepara depositando células muertas de la cepa 99 o 1119-3 de B. abortus por centrifugación (por ejemplo, durante 10 minutos a 23.000 g y 4°C), y resuspendiendo después las células de manera homogénea en solución salina fenolada, a razón de 1 g por 22,5 ml. (Nota: si durante la preparación del concentrado celular se ha empleado celulosa carboximetil sódica como agente de sedimentación, será necesario eliminar los residuos insolubles antes de proceder a la tinción. Para ello se filtrará la suspensión con un pre-filtro AMF-CUNO Zeta-plus [tipo CPR 01A].) Por cada 35 ml de esta suspensión se añade 1 ml de rosa de bengala (Cl. No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada. Se deja la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, y a continuación se filtra a través de un algodón. Hecho esto, se centrifuga para depositar las células teñidas, que después se resuspenden de modo homogéneo a razón de 1g de células por 7 ml de diluyente (21,1 g de hidróxido sódico disueltos en 353 ml de solución salina fenolada, más 95 ml de ácido láctico y ajustado a un total de 1.056 ml con solución salina fenolada). Esta suspensión debe ser de un color rosa intenso, y el sobrenadante de una muestra centrifugada debería quedar exento de coloración; el pH debe ser de 3.65±0,05. Después de la filtración a través del algodón, se filtra dos veces más la suspensión a través de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. 13430. A continuación se ajusta el volumen del concentrado celular a un 8%, a falta de proceder a la estandarización final frente a sueros estándar. Se guarda la suspensión a 4°C en la oscuridad. Nunca debe congelarse el antígeno. Cuando se procede con arreglo al protocolo estándar, el antígeno de la prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala debe producir una reacción claramente positiva frente a diluciones 1/45 y 1/47,5 del ISABS (en solución salina), pero no a diluciones de 1/55. También debe ofrecer, ante un determinado panel de sueros, una pauta de reacciones positivas y negativas semejante a la que induce un lote previamente estandarizado.

Protocolo La prueba de aglutinación en placa o en tarjeta de rosa de bengala constituye un procedimiento adecuado para la realización de cribas (screening) de las muestras de suero. Para la realización de esta prueba se mezcla el suero (0,03 ml) con un volumen igual de antígeno sobre una placa de esmalte o de porcelana blanca. Cada reacción debe ocupar aproximadamente un diámetro de 2 cm. Se agita suavemente la mezcla durante 4 minutos a temperatura ambiente, y después se examina para detectar en ella la presencia de aglutinación (1). Toda reacción visible a simple vista será considerada positiva. Esta prueba es muy sensible, en especial sobre animales vacunados, y deberán confirmarse las muestras positivas mediante la prueba de FdC o una técnica de detección específica de IgG-1. Se producen falsos negativos, que pueden ser detectados mediante nuevos exámenes del animal a intervalos mínimos de 3 meses.

• Prueba de aglutinación en placa de Brucella tamponado

El antígeno para la realización de esta prueba se prepara a partir de la cepa 1119-3 de B. abortus según el protocolo descrito por Angus y Barton (2). Se necesitan dos soluciones de tinción: una solución de tinción biológica certificada de verde brillante en agua destilada (2 g/100 ml) y una solución de tinción biológica certificada de violeta cristal en agua destilada (1 g/100 ml). Una vez preparadas, se guardan ambas soluciones por separado durante un periodo de 24 horas, transcurrido el cual se mezclan a volúmenes iguales en un frasco oscuro y se guardan en la nevera, durante un periodo no inferior a 6 meses, antes de su utilización. Puede usarse la mezcla de tinción entre los 6 y los 12 meses posteriores a su preparación. Transcurrido este tiempo deberá desecharse la mezcla. El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente 150 g de NaOH en 3-4 litros de solución salina fenolada estéril. Se añade ácido láctico (675 ml) a esta solución, y se ajusta el volumen final a 6 litros con solución salina fenolada estéril. El pH de la solución deberá ser de 3.63-3.67. Se diluye el agregado celular de B. abortus en solución salina fenolada hasta una concentración de 250 g/litro. Se añaden 6 ml de tinción por litro de suspensión celular, y se agita vigorosamente la mezcla antes de filtrarla a través de algodón absorbente estéril. Se hacen sedimentar las células en una centrífuga refrigerada, y después se resuspende el agregado celular en diluyente tamponado (descrito más arriba) hasta una concentración de 50 g/100 ml. Se deja esta mezcla en agitación durante 2 horas, y después se diluye todavía más por adición de 300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de suspensión celular (esto es, hasta una concentración final de 50 g de concentrado celular/400 ml de diluyente tamponado). Se remueve la mezcla a temperatura ambiente durante 20-24 horas, antes de ajustar la concentración celular a un 11% (p/v) en diluyente tamponado. Antes de la realización de la prueba es preciso remover esta suspensión durante toda la noche. A falta de las pruebas finales de control de calidad, se embotella el antígeno, se marca en la etiqueta una fecha de caducidad de 1 año y se guarda a 4°C hasta el momento de su utilización. No debe congelarse la preparación.

El pH del antígeno tamponado debe ser de 3.7±0.03, y el pH de una mezcla suero/antígeno de razón 8:3 debe ser de 4.02±0.04. La suspensión al 11% de células teñidas debe tener un color verdeazulado. Debe verificarse cada lote de antígeno, sometiendo a prueba un mínimo de 10 sueros débilmente reactivos y comparando los resultados con los que deparan uno o más lotes anteriores de antígeno. Si es posible, los lotes de antígeno deberán compararse con el antígeno estándar preparado por el NSVL del USDA.

Protocolo Para una primera criba (screening) de las muestras de suero, éstas pueden ser sometidas también a la prueba de aglutinación en placa tamponada. Se mezcla el suero (0,08 ml) con un volumen de 0,03 ml de antígeno sobre una placa de vidrio dividida en cuadrados de 4 cm de lado. Tras la mezcla inicial, se somete la placa a un movimiento basculante repetido tres veces, a fin de garantizar una dispersión uniforme de los reactivos. Después se incuba la placa en una cámara húmeda a temperatura ambiente (20-25°C) durante 4 minutos. Se retira la placa y se repiten los movimientos descritos anteriormente, después de lo cual se devuelve la placa a la cámara para una segunda incubación de 4 minutos. En este punto debe ser retirada, removida de nuevo y examinada en busca de indicios de aglutinación (1). Toda reacción visible a simple vista será considerada positiva. Al igual que la prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala, esta prueba es muy sensible, especialmente en el caso de animales vacunados. Las muestras positivas deben ser verificadas mediante la prueba de FdC o una técnica de detección específica de IgG-1. Se producen falsos negativos, que pueden ser detectados mediante el examen de nuevas muestras del animal extraídas a intervalos mínimos de 3 meses.

b) Prueba de fijación del complejo La prueba de FdC es el método más extendido para una confirmación del diagnóstico. Existen numerosas variantes de la misma pero, con independencia de la que se elija, deberá usarse en la prueba un antígeno preparado a partir de una cepa lisa autorizada de B. abortus, como la cepa 99 o la 1119-3. El antígeno, además, deberá ser estandarizado frente al segundo ISABS. Es posible preparar el antígeno para la prueba de FdC mediante procedimientos especiales (1, 12), pero también cabe servirse del antígeno empleado para la prueba de aglutinación típica, previa dilución 1/200 (en solución tampón FdC) de la suspensión stock del mismo antes de su estandarización. Antes de su estandarización frente al segundo ISABS (descrita más adelante), el volumen del agregado celular de la suspensión antigénica concentrada para la prueba de FdC debe ser de aproximadamente un 2%. La concentración de fenol no debe exceder el 0,5%. La apariencia del antígeno, una vez llevado a una dilución 1/10 en solución salina fenolada, debe ser el de una suspensión blanca, densa y uniforme, sin agregación o depósito visibles tras una incubación a 37°C durante 18 horas. A la dilución de trabajo utilizada en la prueba no debe producir efectos anticomplementarios. El antígeno no debe ser congelado. El método de microtitulación constituye un procedimiento adecuado para la realización de esta prueba. Todas las diluciones se realizan en solución tampón preparada a partir de una solución stock de: cloruro de sodio (42,5 g), ácido barbitúrico (2,875 g), dietilbarbiturato de sodio (1,875 g), sulfato de magnesio (1,018 g) y cloruro de calcio (1,147 g) en un litro de agua destilada. Esta solución debe ser diluida antes de su empleo, por adición de cuatro volúmenes de una solución de gelatina al 0,04% (el conjunto constituye el tampón FdC). El sistema revelador es una suspensión de hematíes frescos de oveja al 3%, sensibilizados con un volumen igual de suero de conejo antihematíes de oveja diluido hasta el punto en que contenga el quíntuple de la concentración mínima necesaria para producir un 100% de hemólisis en presencia de una dilución 1/30 de complemento fresco de cobaya. Este último debe ser titulado de manera independiente para determinar la concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis en una suspensión de hematíes de oveja sensibilizados; esta concentración quedará definida como la unidad de complemento. El antígeno estándar de B. abortus para la prueba de aglutinación será diluido en un tampón FdC hasta una concentración tal que arroje un 50% de fijación de complemento (1,25 unidades) ante una dilución 1/200 del segundo ISABS (que puede solicitarse al Laboratorio de Referencia de la OIE para la brucelosis2). Se diluyen los sueros problema en volúmenes iguales de tampón FdC, después de lo cual serán inactivados por calentamiento a 58°C durante 50 minutos.

Protocolo

• Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos clásicas, se depositan volúmenes de 25 µl de suero problema diluido en los pocillos de la primera y segunda hileras. Además, se depositan unidades de 25 µl de tampón de FdC en todos los pocillos salvo los de la primera hilera.
• Se practican entonces diluciones seriadas de razón 2, transfiriendo volúmenes de 25 µl de suero de la segunda hilera en adelante.
• Se añaden a cada pocillo 25 µl de antígeno diluido a la dilución de trabajo, así como 25 µl de complemento con un contenido de 1,25 unidades. Se preparan los pocillos control, que deberán alojar: sólo diluyente; suero + complemento + diluyente; antígeno + complemento + diluyente; y complemento + diluyente. Cada uno de ellos deberá contener un volumen total de 75 µl
• Se incuban las placas a 37°C durante 30 minutos, con agitación durante los 10 primeros minutos, o bien a 4°C durante toda la noche.
• Se añaden a cada pocillo volúmenes de 25 µl de hematíes de oveja sensibilizados, y se incuban de nuevo las placas a 37°C durante 30 minutos, con agitación ocasional en el curso de los primeros 10 minutos.
• Tras dejar reposar las placas a 4°C durante 2-3 horas, a fin de posibilitar la sedimentación de las células no lisadas, se procede a la lectura de los resultados.

Se compara el grado de hemólisis con los estándares correspondientes a un 0, 25, 50, 75 y 100% de lisis celular. Los resultados deben expresarse siempre en Unidades Internacionales de FdC (UI de FdC), calculadas en relación a las que se han obtenido en una titulación paralela con un suero estándar calibrado frente al ISABS. Por lo general, se considerarán positivos los sueros que induzcan fijación completa a un título equivalente o superior a 20 UI de FdC/ml. En las pruebas realizadas sobre animales vacunados pueden aparecer falsas reacciones positivas. Las hembras vacunadas con vacunas de la cepa 19 a la edad de entre 3 y 6 meses serán consideradas positivas si los sueros producen reacción de fijación positiva a un título de 30 UI de FdC/ml, siempre y cuando los animales tengan por lo menos 18 meses de edad en el momento de ser sometidos a prueba. También pueden darse falsos positivos en animales infectados por organismos antigénicamente afines a Brucella. Estos suelen causar muchos menos problemas en la prueba de FdC que en las pruebas de aglutinación descritas en (a).

c) ELISA indirecto Se han descrito numerosas variantes de esta técnica ELISA indirecta. El mercado ofrece la posibilidad de adquirir diversos ensayos comerciales, pero sólo se recomienda el uso de aquellas pruebas ELISA que utilizan lipopolisacárido (LPS) liso de B. abortus. El espectro de isotipos y subclases de inmunoglobulina bovina detectables por ELISA depende de la especificidad del conjugado anti-inmunoglobulina (o anticuerpo secundario) que se emplee en la prueba. Un ELISA indirecto específico para la detección de anticuerpos contra la IgG1 da resultados que equivalen casi exactamente a los de la prueba de FdC. Esta prueba puede ser utilizada para el estudio de muestras tanto de leche como de suero. La utilización de conjugados específicos tanto para la cadena pesada como para la ligera de la molécula de inmunoglobulina proporciona una sensibilidad de diagnóstico en cierta medida mayor que la prueba de FdC, aunque entraña una cierta pérdida de la especificidad de diagnóstico. Al igual que las demás pruebas convencionales empleadas para el estudio serológico de la brucelosis bovina, el ELISA indirecto no permite distinguir entre anticuerpos resultantes de una infección y anticuerpos inducidos por vacunación con la cepa 19. Las técnicas ELISA pueden ser usadas como pruebas de criba (screening) o como pruebas de confirmación. No obstante, la eficacia de ELISA en términos de sensibilidad y especificidad de diagnóstico dependerá de la especificidad a la inmunoglobulina que posea el conjugado (véase más arriba), así como del factor de dilución elegido para las muestras problema. El empleo de conjugados de especificidad de amplio espectro, así como el de diluciones bajas, redundará en una prueba de criba de elevada sensibilidad de diagnóstico. Por el contrario, los conjugados de especificidad de espectro reducido (p.e. anti-IgG1), y las diluciones altas del suero problema, resultarán en una prueba de confirmación de especificidad de diagnóstico elevada.

La prueba se lleva a cabo en miniplacas de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano. La elección de la miniplaca tendrá un ligero efecto sobre la eficacia de la prueba, en términos de la actividad de fondo a la que dará lugar. Cuando se utiliza el antígeno LPS, las miniplacas de adherencia proteica entre débil y media proporcionan el nivel más bajo de ruido de fondo. La solución tampón para el tapizado antigénico es carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9.6, compuesta por: NaHCO3 (2,93 g), Na2CO3 (1,59 g) y NaN3 (0,2 g) en 1 litro de agua destilada o desionizada. El tampón diluyente del conjugado y de los sueros problema es PBS 0,01 M, pH 7.2 + Tween 20 al 0,05% (v/v), que se compone de: Na2HPO4 (1,21 g), KH2PO4 (0,20 g), NaCl (8,00 g) y KCl (0,20 g) en 1 litro de agua destilada o desionizada + 0,5 ml de Tween 20 por litro. La solución tampón de lavado es PBS 0,002 M, pH 7.4, + Tween 20 al 0,05%. El conjugado empleado debe contener un anticuerpo policlonal específico tanto de la cadena pesada como de la ligera de la IgG1 bovina, marcado con peroxidasa de rábano. El sistema de substrato es H2O2 4,4 mM y ABTS 3,6 mM (ácido 2,2'-Azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]) en tampón fosfato/citrato 0,05 M, pH 4.5, cuya composición es: Na2HPO4 0,2 M (25,7 ml), ácido cítrico 0,1 M (24,3 ml) y agua destilada/desionizada (50 ml) (ajústese el pH en caso necesario). La solución de parada de la reacción enzimática consiste en dodecilsulfato de sodio al 4% o NaN3 0,1 M en agua destilada/desionizada.

Preparación del antígeno Puede extraerse LPS liso, mediante el método de agua caliente/fenol caliente, a partir de células de B. abortus muertas por calor. Brucella difiere de la mayoría de las demás bacterias Gram negativas en que, tras la extracción, su LPS queda retenido en la fase de fenol en lugar de la fase hídrica. Para la extracción se suspenden, en 170 ml de agua destilada, ya sea 5 g de células liofilizadas o bien 50 g de concentrado celular húmedo de la cepa 99 de B. abortus. Se calienta esta suspensión a 66°C. Se añade un volumen igual de fenol al 90% (p/v) en agua destilada, también llevado a 66°C, y se remueve la solución de manera continua durante 20 minutos. Transcurrido este tiempo, se enfría la mezcla a 4°C y se centrifuga durante 20 minutos a 12.000 g y 4°C. Se deja reposar el sobrenadante (que contiene el LPS) en un embudo separador, a temperatura ambiente durante 24 horas. Se recupera y filtra (Whatman #3) la fase de fenol (capa inferior), y se añaden tres volúmenes de metanol (con metanol al 1% saturado con acetato de sodio). Se deja precipitar la solución a 4°C durante 2 horas. A continuación se resuspende el precipitado en el volumen mínimo necesario de agua destilada, y se centrifuga a 6.000 g durante 20 minutos. Se resuspende el sedimento en 80 ml de agua destilada y se remueve a 4°C durante toda la noche. A continuación se centrifuga la solución durante 15 minutos a 10.000 g y 4°C, y se decanta el sobrenadante. Se añaden de nuevo 80 ml de agua destilada al sedimento, se remueve durante 1 hora y se centrifuga de nuevo como se ha descrito anteriormente. Se reúnen los sobrenadantes, se filtran (filtro de membrana de 0,3 µm) y se añaden ribonucleasa, desoxirribonucleasa y proteinasa K, a razón de 50-100 µg de cada una. Se incuba la mezcla a 20°C durante 18 horas, después de lo cual se precipita de nuevo con metanol y se resuspende del mismo modo que se ha hecho anteriormente. Se dializa la suspensión frente a agua destilada hasta que quede libre de fenol (lo que se comprueba añadiendo cloruro férrico al agua destilada y esperando a que no aparezca el habitual color morado). El antígeno resultante se liofiliza en volúmenes tales que contengan cantidades de 1 mg de LPS.

Protocolo

• Se diluye el antígeno LPS en tampón de tapizado hasta una concentración establecida mediante titulación cruzada, por lo general de cerca de 1 µg/ml, y se depositan volúmenes de 100 µl de esta solución en todos los pocillos. Se dejan después las miniplacas en incubación, ya sea a 37°C durante 2 horas o a 4°C durante toda la noche. Dado que se trata de la técnica ELISA en fase sólida, será necesario lavar las miniplacas entre cada uno de los pasos de la prueba, a fin de eliminar el exceso de reactivos que no se hayan fijado o no hayan reaccionado. De tres a cuatro ciclos de lavado con tampón de lavado son suficientes. Antes de la adición del siguiente reactivo, las placas deberán ser volteadas y golpeadas sobre una superficie absorbente, no filamentosa, con objeto de eliminar todo posible residuo.
• Se llevan los sueros problema y los controles a una dilución de 1/200 en tampón diluyente y se aplican volúmenes de 100 µl de estas soluciones en los pocillos oportunos. Se cubren o sellan las placas y se colocan en un agitador rotatorio. Se incuban a 37°C durante 1 hora en agitación constante. Se lavan las placas como se ha descrito anteriormente.
• Se diluye el conjugado enzimático en tampón diluyente y se añaden volúmenes de 100 µl del mismo a todos los pocillos. Se cubren o sellan las placas y se colocan en un agitador de placas rotatorio. Se incuban a 37°C durante 1 hora en agitación constante. La dilución óptima de conjugado debe ser aquella que, al reaccionar con el control fuertemente positivo en condiciones estándar, arroje una absorbancia comprendida entre 1,0 y 1,4 unidades de absorbancia (véase el paso vi). Siempre que sea posible deberá usarse el ISABS. Se lavan las placas como se ha descrito anteriormente.
• Se prepara una solución fresca de substrato-cromógeno, añadiendo 60 µl de una solución stock de H2O2 (al 3%) a 12 ml de tampón fosfato/citrato más ABTS 3,6 mM. Se colocan 100 µl de la solución substrato-cromógeno en cada pocillo. Se transfieren después las placas a un agitador de placas rotatorio y se incuban a 37°C durante exactamente 15 minutos en agitación constante. Tras la incubación de 15 minutos se añaden 100 µl de solución de parada a todos los pocillos, y se agitan brevemente las placas sobre el agitador a fin de garantizar una mezcla completa. Todos los pocillos contienen ahora un volumen total de 200 µl.
• Se lee la subsiguiente coloración con un fotómetro de miniplacas, utilizando un filtro de interferencia de 405 ó 414 nm.
• Los datos pueden ser expresados de formas diversas, pero se recomienda expresar la reactividad del suero problema en forma de porcentaje de positividad con respecto a un suero control fuertemente positivo estandarizado (19).

Los sueros control fuertemente positivos deben prepararse de tal manera que, prediluidos en suero negativo, exhiban una actividad de anticuerpos que caiga en el fragmento lineal de la curva dosis/respuesta correspondiente al suero original no diluido, justo debajo de la porción en meseta de dicha curva. Hoy en día se está trabajando en la preparación de un suero estándar primario elaborado según este criterio, con vistas a su utilización internacional para el calibrado de pruebas de ELISA indirecto. Dicho suero debería estar disponible en breve plazo. Utilizando este protocolo de ELISA indirecto en condiciones de laboratorio óptimas, el valor umbral (o punto final) que discrimina entre resultados positivos y negativos debe situarse entre un 10 y un 15% de positividad. Dentro de este intervalo, la sensibilidad de diagnóstico debería ser igual o superior a la que ofrece la técnica del antígeno tamponado de Brucella en las pruebas realizadas sobre ganado infectado, y la especificidad de diagnóstico debería ser equivalente a la que proporciona el método de FdC en pruebas realizadas sobre ganado no vacunado. Cabe suponer que la especificidad de diagnóstico en el examen de grupos vacunados es en cierta medida inferior a la que ofrece la FdC. A falta de agua de calidad óptima, o si se modifica cualquiera de los parámetros de la prueba, puede ser necesario elevar el valor umbral para obtener la adecuada eficacia de diagnóstico.

Diagnostico

• Asegurar le edad del feto mediante inspección y registro de crías.
• Tomar muestras de sangre para pruebas serológicas con relación a Vibriosis, listeriosis y Leptospirosis.
• Examinar líquidos uterinos y contenido de abomaso fetal a la primera oportunidad en busca de tricomonas, y subsiguientemente por métodos de cultivo para identificar brucelas, vibriones, Trichomona, listeria y hongos.
• Completar pruebas mediante cultivos de los pulmones fetales para leptospira y placenta o líquido uterino en busca de bacterias y hongos especialmente si no se dispone de feto.
• Examinar placenta fijada para formular en su caso diagnóstico de placentitis.
• En fetos abortados se observan petequias múltiples características en piel, conjuntiva y mucosas, hipertrofia de ganglios linfáticos y afección nodular del hígado.

Control Se basa en la higiene, vacunación, prueba y eliminación de reactores. Medidas higiénicas como el aislamiento o eliminación de animales infectados, destrucción de placentas, secreciones uterinas y fetos abortados, desinfección de zonas contaminadas. Prevención: administración de la vacuna contra la brucelosis cepa 19 o RB51.

4. Campylobacteriosis genital bovina

Aislado por primera vez en 1913 a partir de abortones de vaca y de oveja, el Campylobacter fetus, fue durante mucho tiempo considerado como un agente simple de los abortos en al ganado vacuno. La aplicación de la inseminación artificial y el tratamiento de los toros han contribuido considerablemente a la reducción de ésta afección. Sin embargo, ésta enfermedad es hoy una causa importante de aborto en la oveja. La Vibriosis presenta todos los caracteres de una enfermedad venérea. Es de naturaleza enzoótica y hace su aparición generalmente después del acoplamiento con un macho infectado; la inseminación artificial a partir de un semen contaminado puede contribuir a la diseminación de la enfermedad. E toro constituye un verdadero reservorio natural de Campylobacter fetus, ya que su presencia no produce ningún signo de enfermedad. Las hembras afectadas se inmunizan espontáneamente después de algunos meses, y su poder reproductor vuelve a ser normal. Recientemente se han realizado ensayos con el fin de proteger hembras por medio de vacunación.

Agente Etiológico Campylobacter fetus, es un bacilo curvo microaerofílico, sin agrupación definida, Gram negativos, con movimiento característico en espiral que se observa en microscopía de campo oscuro o contraste de fases. Difícil de observar en frotis teñidos a campo claro, generalmente móviles, acapsulados y no esporulados. En el plano patológico pueden considerarse dos variedades de Campylobacter fetus. El Campylobacter fetus serotipo venerealis, el más frecuentemente encontrado; y el Campylobacter fetus serotipo hyointestinalis responsable de abortos esporádicos en bovinos, ovinos y cerdos. Campylobacter fetus ya sea del tipo venerealis o hyointestinalis producen formas alargadas en los cultivos, sobre medios de verde brillante. Las dos subespecies son catalasa +, Campylobacter fetus ss. venerealis es H2S(-), mientras que el Campylobacter fetus hyointestinalis es H2S condicionado, es decir, que solo dará lugar al desprendimiento de H2S cuando el medio sea adicionado de cistina.

Epidemiologia Los bóvidos son naturalmente receptivos, pero ésta receptividad varía según el sexo, la edad e incluso según los individuos; las hembras inmaduras resisten generalmente a los intentos de transmisión. En el toro, el Campylobacter fetus vive de forma saprofita en la superficie de la mucosa prepucial, los toros jóvenes son más resistentes a la infección. En la vaca, el Campylobacter fetus presenta un tropismo particular para el aparato genital y especialmente para el útero grávido, en el cual se desarrolla con preferencia a nivel del espacio útero-corial. Es interesante señalar que ciertas cepas semejantes al Campylobacter fetus son fuente de infección para la especie humana y que los trastornos observados consisten en diarreas y abortos.

Vias De Infección Enfermedad esencialmente venérea, la Vibriosis se transmite del toro a la vaca y recíprocamente con ocasión del coito, pudiendo también transmitirse por medio de la inseminación artificial, cuando se usa un semen contaminado. La transmisión toro a toro puede llevarse a cabo en caso de recogidas sucesivas cuando no se toma la precaución de reservar una vagina artificial para cada toro. La transmisión por contacto entre animales sanos y animales infectados es negada por diversos autores, en éste caso la contaminación se produciría durante el celo y como consecuencia de un posible contacto entre los órganos genitales externos de una hembra infectada y la de una no infectada. Ciertas cepas de Campylobacter pueden provocar una infección ocasional del ganado vacuno por otra vía distinta a la venérea; frecuentemente ésta infección se acompaña de aborto y no de infertilidad. Sin embargo un toro puesto en contacto de una cama previamente contaminada por un toro infectado, tiene un 50% de probabilidades de albergar el microorganismo y propagarlo 1 a 2 meses más tarde.

Localización En al macho el Campylobacter fetus se localiza a nivel de la mucosa prepucial. En la hembra se encuentra en los distintos segmentos del aparato genital: vagina, cuello y útero. Este alcanza los cuernos uterinos de 12 a 14 días después de la infección y en un 25% de los casos, llega hasta los oviductos. La infección regresa después de 40-60 días para localizarse en el segmento vaginocervical; las secreciones vaginales permanecen virulentas durante 2-4 meses. Sin embargo se puede encontrar Campylobacter fetus en la vagina de vacas gestantes. El microorganismo se encuentra en el feto (líquido abomasal, riñón, hígado), en membranas y líquidos fetales y en los flujos uterovaginales después del aborto.

Patogenia Y Lesiones Después de una infección provocada por el coito o la inseminación, la mucosa vaginal presenta una inflamación con destilación de exudados, en los que se puede demostrar la presencia de Campylobacter fetus durante los primeros 9 días. El Campylobacter fetus puede comprometer la fertilización y la implantación y ser origen de una mortalidad embrionaria. Las primeras modificaciones histológicas del endometrio son observadas 16-21 días después de una infección experimental. En el útero grávido el Campylobacter fetus se ubica sobre los cotiledones que se vuelven hemorrágicos y se cubren de placas blanquecinas, grisáceas o amarillentas; la base se engruesa por la presencia de un exudado viscoso, gris amarillento, mientras que los espacios intercotiledonarios están edematosos y recubiertos de depósitos granulosos y grisáceos. El feto no presenta necesariamente lesiones particulares; sin embargo en ciertos casos puede encontrarse un edema gelatinoso subcutáneo y un exudado fibrinohemorrágico más o menos abundante a nivel de las cavidades pleural y pericárdica. En éstas condiciones el hígado puede hipertrofiarse y contener islotes necróticos.

Sintomatología La repetición de celos y la irregularidad estral en las hembras cubiertas constituyen un claro exponente para sospechar que el macho está infectado. Los dos síntomas dominantes en la infección en la hembra son la infertilidad y los abortos. Los ciclos estrales se repiten con tendencia a la irregularidad o a alargarse; se pueden observar al mismo tiempo síntomas de vaginitis y cervicitis, y también ciertas descargas purulentas. Después de un periodo de tres a cuatro meses se establece un estado de inmunidad que influirá sobre la posible evolución de la enfermedad en el hato; la fertilidad tiende a volver a la normalidad y los individuos adultos se reestablecen en primer lugar. El aborto vibriónico sobreviene no importa en qué momento de la gestación, lo más corriente hacia el quinto mes, pero la cantidad de abortos son generalmente escasos, la infección por Campylobacter fetus hyointestinalis se exterioriza generalmente por abortos esporádicos; la fertilidad en éste caso puede ser normal. En caso de aborto precoz el feto puede ser expulsado con todas sus envolturas, mientras que la retención placentaria es frecuente si el accidente se sitúa en las proximidades del final del parto ; frecuentemente ésta es origen de una infección uterina secundaria, nueva causa de infecundidad.

Inmunidad La curación espontánea del ganado, 3-6 meses después de haber comenzada la infección es considerada como la resultante de una inmunidad adquirida, pero de la cual se desconoce el tiempo de persistencia. Los estudios experimentales realizados han demostrado la presencia de anticuerpos en moco cervical y suero sanguíneo, estando en función de la vía utilizada para obtener la inmunización y el tipo de antígeno empleado. Sin, embargo existe una relación directa entre la intensidad de la actividad uterina y la presencia de anticuerpos en el moco uterino.

Diagnostico Los síntomas clínicos conducen solamente a una sospecha de la enfermedad; la prueba real de la existencia de ésta depende del laboratorio, y se basa en poner en evidencia, bien el agente infeccioso o bien los anticuerpos que éste ha producido.

Identificación del agente La campilobacteriosis se diagnostica bacteriológicamene, ya sea por aislamiento de Campylobacter fetus en cultivo o por inmunofluorescencia. El cultivo bacteriológico puede realizarse bien directamente a partir de muestras o bien después del transporte y/o enriquecimiento de las mismas. En caso de que el procesado de las muestras en laboratorio vaya a realizarse en un plazo superior a las 6 horas desde la recogida de las mismas, será indispensable mantenerlas en un medio especial de transporte. Si no se utiliza dicho medio de transporte, las muestras deben ser remitidas al laboratorio en un recipiente opaco y aislado térmicamente (a una temperatura de entre 4 y 30°C).

• Toma de muestras

En el macho: Moco o secreciones prepuciales; semen. El moco prepucial o el esmegma pueden ser obtenidos por raspado (24), succión (con una pipeta de Bartlett) (1) o lavado prepucial (6). También puede obtenerse el esmegma de la vagina artificial, tras recoger el semen mediante el lavado de dicha vagina con 20-30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para realizar el lavado prepucial se introducen 20-30 ml de PBS estéril, pH 7.2, en la bolsa prepucial. Tras practicar sobre ésta un masaje vigoroso durante 15-20 segundos, se recoge el líquido de lavado en un frasco estéril, que inmediatamente se sella y envía al laboratorio. El semen debe ser recogido en las condiciones de mayor asepsia posible. Para proceder a su recogida se utiliza un tubo estéril, que se sella inmediatamente después. Las muestras de esmegma obtenidas por raspado o succión, así como las muestras de semen, pueden ser diluidas en PBS o sembradas directamente en un medio de cultivo o un medio de enriquecimiento (medios de enriquecimiento y transporte [MET], medio de Stuart o medio SBL). Se sellan las placas que contienen el medio de transporte y se envían al laboratorio de análisis en un recipiente termoaislante (a 4-18°C) y opaco (9).

En la hembra: Moco vaginal y cervicovaginal. La toma de muestras puede realizarse con una torunda, o bien por succión (con una pipeta de Bartlett) o lavado de la cavidad vaginal. Para obtener muestras de buena calidad es indispensable utilizar un espéculo estéril, preferiblemente desechable (25). Previa limpieza de la región vulval, se realiza un lavado de la cavidad vaginal introduciendo 20-30 ml de PBS estéril con una jeringa unida a un catéter estéril. Se succiona y reintroduce el líquido cuatro o cinco veces antes de recogerlo definitivamente en un frasco estéril, que inmediatamente después será sellado y remitido al laboratorio. También puede recogerse el líquido de lavado vaginal mediante un tampón de gasa estéril mantenido en el interior de la vagina durante 5-10 minutos después de la introducción de PBS. Las muestras de moco vaginal obtenidas por succión deben ser diluidas en PBS o sembradas directamente en un medio de cultivo o enriquecimiento.

Fetos abortados, placentas En caso de aborto, las muestras más adecuadas son, además de la placenta, el contenido estomacal, el hígado y los pulmones del feto. La recogida de muestras deberá realizarse en las condiciones de mayor asepsia posible. Las muestras serán remitidas al laboratorio en un recipiente refrigerado y termoaislado (a 4-8°C).

Procesado de las muestras A su llegada al laboratorio, las muestras serán sembradas directamente en medio de cultivo o, en caso necesario, sometidas a un tratamiento adicional.

• Muestras del tracto genital

Dado que el moco vaginal puede ser muy viscoso, es posible que se precise su licuefacción. Para ello se añade un volumen igual de una solución de cisteína (solución acuosa de hidrocloruro de cisteína a una concentración de 0,25 g/100 ml, pH 7.2, esterilizada por filtración a través de una membrana). Transcurridos 15-20 minutos, puede sembrarse el moco diluido y licuado en medio de aislamiento. Cuando el moco no es muy viscoso, es posible sembrarlo directamente o bien disuelto en un volumen igual de PBS, pH 7.2.

• Fetos abortados, placentas

El contenido del estómago fetal se siembra directamente sobre un medio de cultivo adecuado. Los órganos y trozos de órganos internos se esterilizan a la llama y seguidamente se homogenizan, hecho lo cual se siembra el homogenado en el medio de cultivo.Tras el lavado de las membranas placentales con solución salina normal o PBS a fin de eliminar la mayor parte de la contaminación de superficie, se raspan las vellosidades coriónicas y se transfiere el raspado a medios de cultivo.

• Medios de enriquecimiento y transporte (MET) Existen varios MET disponibles, como el de Clark (Australia), el de Lander (Reino Unido), el medio SBL (Francia) y los medios de Foley y Clark (utilizados en Estados Unidos) (12, 18-20).

• MET australiano El MET australiano es un medio excelente, aunque su preparación resulta larga y difícil, lo que dificulta su empleo sistemático cuando debe procesarse un gran número de muestras. Contiene suero bovino estéril más 5-fluorouracilo (300 µg/ml), sulfato de polimixina B (100 Unidades Internacionales [UI]/ml), verde brillante (50 µg/ml), ácido nalidíxico (3 µg/ml), y cicloheximida (100 µg/ml). Se distribuye esta mezcla en frascos de 10 ml provistos de un tapón interior de goma y un tapón exterior de rosca metálico. Se colocan los frascos en un baño maría a 100°C. Cuando el medio se ha solidificado, se perfora el tapón de goma con una pipeta y se reemplaza el aire contenido en el frasco por una mezcla de 5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 90% de nitrógeno. Es necesario llevar a cabo este paso dentro de un recipiente anaeróbico. Antes de su utilización se guardará el medio así preparado en el refrigerador durante una semana. Su vida media a 4°C es de 3 meses. Con uso de una jeringa se inyecta en el medio aproximadamente 1 ml de la muestra problema, haciendo pasar la aguja a través del tapón de goma. Se guarda aproximadamente a 18°C y se remite al laboratorio el frasco así inyectado. El tiempo invertido en su transporte no debe exceder las 48 horas. Cuando el frasco llega al laboratorio, debe ser incubado a 37°C durante 4 días, transcurridos los cuales se introducen en él 3 ml de solución salina normal. Tras vigorosa agitación del frasco, se extrae 1 ml de líquido de su interior, que será sometido a continuación a una prueba de detección de Campylobacter, ya sea mediante su aislamiento en cultivo o por inmunofluorescencia.

• Medio de Lander (Reino Unido) Este medio es en un caldo de Mueller-Hinton, al que antes de su esterilización se añaden 5 g de carbón bacteriológico/litro. Llegado el momento de su utilización se añaden, en condiciones de esterilidad, los siguientes ingredientes por litro: dos frascos de factor de crecimiento para Campylobacter (Oxoid), sangre de caballo hemolizada (70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de polimixina B (10.000 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprima ( 20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg ). Se distribuyen volúmenes de 10 ml del medio en contenedores universales de 28 ml, en los que puede permanecer almacenado durante por lo menos 3 semanas a 4°C. Se inoculan las muestras problema al medio. Previamente, pueden haberse pasado los fragmentos de muestra a través de un filtro de 0,65 µm de diámetro de poro. Tras una incubación de 3 días a 37°C, se distribuye el medio en medios de cultivo y de aislamiento.

• Medio SBL modificado (Francia) Este medio, descrito por Gastrin (1968) y modificado posteriormente por Clark (5), presenta la siguiente composición por litro: agar (8 g), tioglicolato de sodio (0,5 g), glicerofosfato de sodio (10 g), una solución acuosa de cloruro cálcico al 1% (10 ml), cisteína (hidroclorhidrato) (250 mg) y una solución acuosa de azul de metileno al 0,1% (2 ml). Tras su esterilización por autoclavado, y a fin de transformar el medio en un medio selectivo, se añaden a él los siguientes compuestos por ml: polimixina (1 UI), novobiocina (5 µg), bacitracina (15 unidades) y cicloheximida (20 µg). Finalmente, se distribuye el medio en condiciones de esterilidad en tubos anaeróbicos. Pueden colocarse en este medio de transporte torundas empapadas en diferentes muestras, y enviar el conjunto al laboratorio dentro de un recipiente termoaislado (a 18-30°C). Este debe llegar a su destino en un plazo de 24-48 horas.