5. Aislamiento de Campylobacter fetus
- Medios de cultivo para el aislamiento
Actualmente se utilizan numerosos medios para el diagnóstico bacteriológico de la campilobacteriosis genital bovina (3). Siguen algunos ejemplos:
• Medio de Skirrow (medio básico 1) Se disuelven 40 g de medio básico de agar sangre nº 2 (Oxoid) en 1 litro de agua destilada hirviendo y se distribuye la dilución caliente en botellas previamente esterilizadas en el autoclave (121°C durante 14 minutos). Tras dejar enfriar a 55°C, se añade, en condiciones estériles: sangre de caballo hemolizada (50 ml) y dos frascos de factor de crecimiento (mezcla de Skirrow) (22).
• Agar de corazón–cerebro (medio básico 2) Se diluyen en 1 litro de agua destilada: infusión de cerebro de ternero (200 g), infusión de corazón de buey (250 g), peptona proteosa (10 g), glucosa (2 g), cloruro de sodio (5 g), hidrogenofosfato disódico anhidro (2,5 g), medio de tiol (3 g) y agar (20 g). Se esteriliza la solución por autoclavado a 121°C durante 15 minutos. Es posible preparar este medio al instante o con antelación, en cuyo caso puede conservarse a 4°C durante aproximadamente 15 días.
• Agar de corazón-cerebro con sangre Este medio contiene medio básico 2 (enfriado hasta 63°C tras la esterilización o bien, si se parte del medio frío, calentado durante 30 minutos en el baño maría), más sangre de oveja calentada a 63°C durante 3 minutos (7-10 % en volumen).
• Medio selectivo Este medio consta de: medio básico 1 ó 2 (100 ml) llevado a 63°C como se ha indicado anteriormente; sangre de oveja (7-10% en volumen); y una de las dos mezclas siguientes: SEA mezcla inhibidora nº 1, que contiene (concentraciones finales): bacitracina (15 UI/ml), novobiocina (50 µg/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml) y cicloheximida (20 µg/ml). SEA mezcla inhibidora nº 2, que contiene (concentraciones finales): vancomicina (20 µg/ml), trimetoprima (10 µg/ml), sulfato de polimixina B (5 UI/ml) y cicloheximida (100 µg/ml). Antes de su adición al medio de cultivo, las soluciones de antibióticos deben ser esterilizadas por filtración.
• Medio selectivo de Clark Este medio consta de peptona (10 g), cloruro de sodio (5 g), extracto de carne (5 g) y agar (15 g). Se disuelven estos ingredientes, excepto el agar, en 1 litro de agua destilada (con agitación en caso necesario). Se ajusta el pH a 7.4-7.6, hecho lo cual se añade el agar y se lleva la mezcla a ebullición. Se esteriliza por autoclavado (121°C durante 15 minutos). Una vez enfriada la solución a 55°C, se añaden a ésta: en primer lugar un 10% de sangre bovina u ovina desfibrinizada y estéril, y después bacitracina (15 UI/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml), novobiocina (sal sódica) (5 µg/ml) y cicloheximida (10 µg/ml).
- Siembra del medio e incubación.
Se siembra cada muestra, bien directamente o bien previo paso a través de un filtro con un diámetro de poro de 0,65 µm, en una o dos placas de medio básico y una o dos placas de medio selectivo. A continuación se extiende el material con el asa metálica para facilitar el aislamiento de colonias individuales. Se incuban las placas a 37±1°C en una atmósfera con un 5% de O2, un 8% de CO2 y un 87% de N2 durante 5-7 días. El empleo de una estufa de triple gas con humedad controlada (mínimo 70%) ofrece las condiciones óptimas de cultivo. Cuando no se dispone de ella, es posible utilizar en su lugar un frasco o recipiente similar, introduciendo en él, en condiciones de vacío de 56 mmHg, una mezcla de 10% de CO2 y 90% de N2 hasta obtener una presión máxima de 0,2 bar. Se recomienda, cuando ello sea posible, esterilizar los gases introducidos en la estufa por filtración a través de membrana. Debe practicarse una comprobación sistemática de las condiciones de cultivo e incubación, mediante la siembra de dos cepas control. Dichos controles deberían ser establecidos para cada uno de los procesos de aislamiento. Sin embargo, es innecesario disponer más de un control por día, salvo si los lotes de medio utilizados son diferentes, en cuyo caso cada lote deberá llevar asociado su propio control.
- Lectura de los resultados
Las colonias de C. fetus suelen aparecer en los medios recomendados al cabo de 2-5 días. El crecimiento puede ser lento, especialmente en presencia de bacterias contaminantes en las muestras. Transcurridos de 3 a 5 días de incubación, las colonias suelen medir entre 1 y 3 mm de diámetro. Son ligeramente rosadas, de forma circular, convexas, lisas y brillantes, y presentan un reborde regular.
Pruebas de identificación Para realizar una prueba de identificación correcta es preciso disponer de un cultivo puro. No obstante, y en el supuesto de que existan muchas colonias sospechosas correctamente aisladas, será posible realizar las pruebas directamente sobre las colonias retiradas de las placas de aislamiento. En tal caso, y tras inocular de nuevo las colonias sospechosas a fin de obtener un cultivo puro, deberá repetirse la prueba. Las pruebas de identificación se basan en los siguientes criterios: aspecto y motilidad, en el caso de organismos vivos; tinción Gram; prueba de la oxidasa; y prueba de la catalasa. Se recomienda utilizar un microscopio de contraste de fases para la observación de las colonias vivas. C. fetus toma a menudo la forma de un bacilo curvo y fino, de 0,3-0,4 µm de anchura y 0,5-8,0 µm de longitud. No obstante, es posible observar simultáneamente formas cortas (con apariencia de coma), formas de tamaño medio (en forma de ’S’) y formas largas (helicoidales con presencia de espirales). Las bacterias se hallan invariablemente separadas unas de otras. C. fetus es móvil. Presenta una motilidad típica de tipo anfítrico polar, que desaparece frecuentemente en los subcultivos.
Pruebas de confirmación Estas pruebas (véase Tabla 1) deben ser realizadas sobre cultivos puros, con empleo, siempre que ello sea posible, de una suspensión estandarizada con un grado de turbidez inferior o equivalente a un McFarland nº 1.
- Prueba de requerimientos respiratorios
Toda cepa sospechosa debe ser sometida a esta prueba. Para su realización, se prepara una suspensión en una solución tampón, pH 7.2, que se inocula en tres placas de cultivo. Estas son después incubadas en atmósfera normal, o en una atmósfera con un 7 a 10% de CO2 o en una atmósfera que contenga la mezcla triple de gases anteriormente descrita. Se incluyen asimismo en la prueba dos cepas control. La prueba resulta positiva si se produce crecimiento bacteriano en alguna de las dos (o en ambas) atmósferas provistas de una mezcla gaseosa especial, y si además no hay crecimiento en la atmósfera ordinaria. No obstante, debe tenerse en cuenta que algunas cepas pueden dar lugar a un cultivo muy disperso en atmósfera normal. El crecimiento de C. fetus subespecie venerealis es dependiente de la triple mezcla gaseosa CO2-O2-N2, mientras que el de la subespecie fetus es dependiente de CO2.
Tabla 1. Características diferenciales del género Campylobacter. Requerimientos respiratorios Metabolismo respiratorio Prueba de crecimiento
CO2-O2- N2 CO2 Oxidasa Catalasa H2S(e) 25°C 42°C Glicina 1% NaCl 3.5% C. fetus subsp venerealis +(a) (+) 0(b)(+) + + – + – – – C. fetus subsp fetus – (+) +(c)(+) + + – + – + – C. jejuni – (+) -(d)(+) + + – – + + – C. faecalis – (+) – (+) + + ++ – + + ± C. sputorum subsp bubulus – (+) – (+) + – ++ ± – + + +(a) = Requiere la mezcla gaseosa; – = Ningún requerimiento; 0(b) = El requerimiento de CO2 no es estricto; (c) Crecimiento difícil para algunas cepas; (d) = El crecimiento de algunas cepas mejora en presencia de CO2; (e) = En medio de agar con triple azúcar y hierro; () = Crecimiento (+)o ausencia de crecimiento (-)de la cepa en un medio apropiado, en las condiciones que se especifican.
- Prueba de crecimiento en presencia de glicina
Toda cepa sospechosa debe ser sometida a esta prueba. Para ello debe prepararse una suspensión en solución tampón, pH 7.2. Se inocula dicha suspensión en un medio con glicina (15 ml de medio de sangre + exactamente 1,65 ml de solución acuosa de glicina al 10%) y en un medio de sangre básico. Se incuban los cultivos en las condiciones de atmósfera especificadas e incluyendo en paralelo dos cepas control (de las subespecies venerealis y fetus). Dado que todas las cepas son exigentes, la introducción de cualquier cambio en los medios, por pequeño que sea, puede condicionar el crecimiento. La falta de crecimiento en el medio con glicina debe ser considerada un indicio presuntivo de la presencia de C. fetus subespecie venerealis.
- Prueba de crecimiento en presencia de cloruro de sodio
Se prepara una suspensión de la cepa sospechosa en solución tampón, pH 7.2. Después se inocula dicha suspensión en un medio de sangre provisto de un 3,5% de NaCl (15 ml de medio de sangre + 2,04 ml de NaCl 5 M) y en un medio de sangre. Se incuban los cultivos en las condiciones de amósfera especificadas. La prueba debe incluir asimismo dos cepas control.
- Prueba de producción de sulfuro de hidrógeno
La prueba del sulfuro de hidrógeno (H2S) se efectúa en un medio de agar con triple azúcar y hierro (triple sugar iron, TSI) cuya composición es la siguiente: peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro), extracto de levadura (3 g/litro), cloruro de sodio (5 g/litro), citrato férrico (0,5 g/litro), tiosulfato de sodio (Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro), sucrosa (10 g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo de fenol (0,024 g/litro), agar (11 g/litro) y agua destilada (con la que se ajusta a 1 litro). Previa mezcla, y tras repartir el medio en tubos, se esterilizan éstos por autoclavado a 115°C durante 15 minutos. Es posible preparar el medio en el momento de su utilización o con antelación, en cuyo caso puede ser conservado en las condiciones habituales durante aproximadamente 3 semanas. Antes de su empleo, deberá fundirse el medio en un baño maría hirviendo e inclinar los tubos, de tal manera que se obtenga una pendiente con 3 cm de profundidad. Este medio, listo para usar, podrá ser conservado en las condiciones habituales durante 8-10 días antes de su utilización.
- Prueba de sensibilidad al trifeniltetrazolio, a la cefalotina y al ácido nalidíxico.
Para medir la sensibilidad al trifeniltetrazolio (TTC), a la cefalotina (CN) y al ácido nalidíxico (NA) se emplea la técnica del disco (23). Esta técnica consiste en empapar discos de papel de filtro en soluciones de TTC (30 mg/ml), CN (3 mg/ml) y NA (3 mg/ml), de tal manera que el contenido final de los discos sea respectivamente de 200 µg de TTC, 30 µg de CN y 30 µg de NA. A continuación se secan y almacenan los discos hasta el momento de su utilización. Para llevar a cabo la prueba se realiza una suspensión en PBS, pH 7.2, de células procedentes de cultivos de 72 horas de las cepas a examinar, a una concentración de 109 bacterias/ml. A continuación se toman volúmenes de 100 µl de dicha suspensión y se reparten éstos homogéneamente sobre un medio de sangre básico. Tras secado de las placas se deposita el medio de cultivo sobre su superficie y, por último, los discos de sensibilidad sobre éste. Se incuban después los cultivos a 37°C en una atmósfera apropiada. Los cultivos deberán ser examinados al cabo de sendos periodos de 48 y 96 horas. La presencia de una zona de inhibición de por lo menos 3 mm alrededor del disco indica sensibilidad de la cepa en cuestión al antibiótico. C. fetus subespecie venerealis, venerealis intermedius y fetus son sensibles al TTC y a la CN. Para una correcta identificación bacteriológica deben cumplirse los siguientes requisitos: ausencia de contaminación en las placas de cultivo; crecimiento satisfactorio de las cepas control desde el segundo día de incubación hasta el momento de la observación; obtención de resultados similares a los esperados en las pruebas realizadas sobre las cepas control. Un resultado negativo no será concluyente hasta transcurridos por lo menos 6 días de incubación en las condiciones requeridas.
Se considerará perteneciente a la especie C. fetus cualquier bacteria que presente las siguientes características: • Aspecto característico de las colonias sobre los medios de cultivo descritos anteriormente; • ausencia de crecimiento detectable a simple vista al cabo de 24 horas; • crecimiento lento (2-3 días) a 37±1°C en atmósfera especial (a una tensión de oxígeno reducida); • morfología característica de una bacteria espiral; • motilidad de tipo anfítrico; • Gram negativa; • oxidasa positiva; • catalasa positiva; • requerimientos respiratorios y propiedades bioquímicas característicos.
Inmunofluorescencia Esta prueba puede ser utilizada para identificar el organismo mediante la técnica directa o para confirmar la identificación de una cepa después de su aislamiento. No permite, en cambio, discriminar entre diferentes subespecies (22).
- Preparación de los sueros inmunes
Es preferible emplear cepas estándar de Campylobacter, procedentes de colecciones de cultivos reconocidas (C. fetus subespecie venerealis biotipo venerealis, C. fetus subespecie venerealis biotipo intermedius o C. fetus subespecie fetus). Se cultivan dichas cepas por separado, en atmósfera microaeróbica y en un medio de agar sangre, a 37°C durante 3 días. Pasado este tiempo, se recogen los microorganismos en PBS, pH 7.2, y se lavan dos veces por centrifugación. Después se inoculan conejos de 3 meses, por vía intramuscular, con 2 ml de una solución de 1011 bacterias/ml de una subespecie de C. fetus, previamente resuspendida en PBS más adyuvante incompleto de Freund. La inoculación se practica en cuatro sitios distintos, a razón de 0,5 ml por punto de inyección. Los animales deben ser sangrados antes de la inoculación, y a intervalos semanales después de la misma. Cuando los títulos séricos alcanzan valores elevados, estimados mediante la prueba de inmunofluorescencia o la de aglutinación, se inyectan a los conejos por vía intravenosa entre 0,1 y 1 ml de organismos viables (a razón de 1010 organismos/ml). 7 días más tarde se sangra a los conejos y se mezclan todos los sueros homólogos.
- Preparación de conjugados
La fracción de IgG se aísla por precipitación con sulfato sódico. Para ello, se ajusta el pH del suero a 8.0 con PBS 0,1 M, y se añaden 18 g de sulfato sódico anhidro por cada 100 ml. Se recoge el precipitado por centrifugación, y se resuspende en agua destilada hasta su volumen original. Después se precipita de nuevo, por adición de 12 g de sulfato sódico/100 ml. Se recoge el precipitado, se redisuelve en agua destilada, esta vez hasta la mitad del volumen original, y se dializa a 4°C frente a PBS, pH 7.2, hasta que todo el sulfato sódico haya sido eliminado. Hecho esto, se determina el contenido proteico y se ajusta la concentración de la solución para que contenga 1,0-1,5 g de proteína (albúmina sérica bovina) por 100 ml de PBS. Se ajusta el pH de esta solución a 9.0 con carbonato sódico 1 M. A continuación se añade el isómero 1 del isotiocianato de fluoresceína (fluorescein isothiocyanate, FITC) disuelto en un volumen mínimo de carbonato sódico 0,1 M, en una cantidad tal que proporcione una concentración final de 15 mg FITC/1,0 g proteína. Se remueve a 4°C durante 18 horas, transcurridas las cuales se ajusta el pH a 7.0 con ácido clorhídrico 0,1 M y se dializa a 4°C con cambios frecuentes de PBS. Se eliminan las trazas de FITC libre por filtración en gel (en Sephadex G25), y se guarda el producto final en pequeñas alícuotas a una temperatura igual o inferior a -20°C.
La dilución de trabajo del conjugado se determina sometiendo a prueba diversas diluciones del mismo en PBS frente a frotis de un cultivo de C. fetus; deberá seleccionarse el doble de la concentración más baja que llegue a producir una fluorescencia brillante de estos organismos. Vistos a gran aumento, los organismos adoptan un patrón de fluorescencia de morfología característica, y se localizan frecuentemente en los bordes del frotis.
- Prueba de inmunofluorescencia
Se fijan las muestras sobre portaobjetos de vidrio, se colorean con el antisuero marcado con FITC y se observan al microscopio en busca de organismos fluorescentes. La reacción de coloración se lleva a cabo en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos. Después se aclaran los portaobjetos lavándolos dos veces en PBS durante 10 minutos a fin de eliminar el exceso de conjugado. Hecho esto, se montan en glicerol tamponado (80% [v/v] glicerol + 20% tampón fosfato 0,1 M, pH 8.0). Por último, se sellan los cubreobjetos para evitar la desecación y se observan las preparaciones al microscopio bajo luz ultravioleta.
Se trata de una enfermedad común al hombre y a distintos animales domésticos especialmente a los rumiantes, en los que produce abortos más bien de forma esporádica que epidémica. La oveja es más sensible que la vaca y la cabra.
Etiologia Agente patógeno la Listeria monocytogenes es un germen Gram (+), aerobio), hemolítico y catalasa positivo. Ampliamente distribuido en la naturaleza en forma saprofita ; en el animal infectado se distribuye irregularmente, encontrándose en el SNC, lesiones necróticas de hígado y miocardio, en los abortos y envolturas fetales. La infección se establece a través de diferentes vías, especialmente por la mucosa nasal y ocular, y sobre todo a través del tubo digestivo cuando consumen alimentos contaminados. A ese respecto los forrajes mal conservados, ricos en ácido butírico, y en amoniaco, constituyen un medio favorable para la multiplicación de éste agente y para su diseminación. Se ha señalado la presencia de listerias en esperma de ovinos y caprinos, sabiéndose que las vacas enfermas pueden excretar éste germen por la leche durante varios meses.
Lesiones Se observan focos necróticos en el hígado y en la placenta, que puede estar cubierta de un exudado abundante, rojo marrón, particularmente en la oveja; infiltración leucocitaria a nivel de estos focos necróticos.
Síntomas Además de transtornos de naturaleza septicémica y encefalítica tales como actitudes anormales, desequilibrio, torneo, caída de orejas y parálisis del labio inferior, hay que resaltar el aborto que se produce en los últimos días de la gestación. En caso de parto normal el recién nacido puede morir en las primeras semanas de vida. El aborto puede ir acompañado de retención de envolturas fetales y también de metritis.
Diagnostico Por el cuadro clínico de la enfermedad puede ser sospechada pero no confirmada. El diagnóstico requiere el aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de muestras de líquido estomacal, de envolturas fetales, hígado, sistema nervioso o de los exudados de las cavidades. Corrientemente el examen bacterioscópico resulta negativo y es necesario recurrir a los cultivos o a las inoculaciones en animales de laboratorio. Las pruebas serológicas tienen un valor muy limitado.
7. Tuberculosis bovina
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por bacterias del genero Mycobacterium, las cuales presentan como rasgo característico el ser inmóviles, no esporulados y ácido-alcohol resistencia. Esta enfermedad ha sido erradicada de los países desarrollados. En otros países en donde la enfermedad clásica se ha reducido, la enfermedad es producida por micobacterias atípicas. Los niveles de infección de tuberculosis bovina en el rodeo nacional se estima entre un 3% a 4%.
Etiología Las micobacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, incluyendo desde saprofitas, patógenas, oportunistas y estrictamente patógenas. Los bacilos tuberculosos clásicos son: M. tuberculosis (Hombre) M. bovis (Bovinos) M. avium (Aves)
También se incluye en este grupo el Mycobacterium microti, el cual a diferencia de los anteriores no afecta humanos, pero produce tuberculosis en las ratas.
Transmisión Del 80% al 90% de los casos la transmisión ocurre por vía aerógena; con la tos o espiración de un animal infectado se expelen gran cantidad de microgotitas que contienen la bacteria las cuales al ser inhaladas por otro bovino llegan al sistema respiratorio dando comienzo a una nueva infección. Esto se ve favorecido por contacto directo diariamente de los bovinos en el pastoreo, comederos, corrales y salas de ordeño. Otra vía de ingreso es la digestiva por el consumo de pastos y alimentos contaminados con secreciones nasales, materia fecal y orina que contienen el agente causal. La vía digestiva es muy importante en terneros que se alimentan con leche cruda proveniente de las vacas enfermas, debido a que del 1% al 2% de las vacas infectadas eliminan el microorganismo en la leche. Otras vías no usuales pero probables son: la vía cutánea, congénita y genital.
Patogenia Factores de manejo, edad y nutrición son determinantes en la vía de infección, así como en el periodo de incubación, proceso de la enfermedad y diseminación. A partir de la puerta de entrada los bacilos se localizan en el complejo primario de los ganglios linfáticos regionales, luego se diseminan por vía linfática a la cadena ganglionar. Posteriormente la diseminación se da por vía hematógena a órganos parenquimatosos por ultimo el microorganismo es eliminado en exudados y secreciones de órganos infectados. La eliminación de Mycobacterium bovis por parte de los animales infectados es intermitente y no esta en relación con el grado de infección presente. Se ha comprobado que los animales infectados recientemente eliminan el microorganismo en las etapas tempranas de la enfermedad cuando a veces no son detectadas por pruebas diagnosticas.
Síntomas Los síntomas son poco manifiestos en el bovino, pero en algunos puede presentarse. La vía de ingreso del M. bovis y la localización de la lesión están íntimamente relacionadas en esta enfermedad. Las lesiones pueden localizarse en diferentes órganos y ganglios linfáticos, en forma de nódulos o tubérculos de material purulento-caseoso de color amarillento cuyo tamaño y cantidad varían.
Diagnostico El diagnostico de la tuberculosos en hatos primo-infectados se hace por la caracterización macro y microscópica de las lesiones en animales muertos en la finca o remitidos al matadero, seguido del aislamiento y tipificación en el laboratorio. En las áreas endémicas el diagnostico se hace antes de que muera el animal por dermoreacción, además debe hacerse vigilancia en los mataderos y hacer evaluación macro y microscópica de las lesiones compatibles con tuberculosis.
Lesiones Macroscopicas: Las lesiones pueden variar dependiendo de la localización anatómica y la forma de diseminación. Generalmente el hallazgo pulmonar es áreas de tamaño considerable con apariencia caseificada y zonas de mineralización. En las superficies serosas incluyendo las cápsulas de los órganos se observan nódulos firmes de superficie lisa, varían de 2 a 10 centímetros de diámetro. También pueden presentarse zonas caseificadas en las áreas profundas (Tuberculosis perlada). Nódulos firmes de aspecto granulomatoso con áreas de calcificación y caseificación en ganglios linfáticos y órganos parenquimatosos como el hígado y el riñón. Exudado de apariencia purulenta en meninges Focos muy pequeños menores de 1cm de diámetro en cualquier órgano (Tuberculosis miliar). Microscópicas En cualquiera de las formas en que se presenta la tuberculosis, esta se caracteriza por la formación de granulomas. Se pueden detectar bacilos ácido alcohol resistentes libres en el citoplasma de los macrófagos, histiocitos y células gigantes de la lesión granulomatosa.
Dermorreaccion El método clásico para la detección de la tuberculosis bovina es la prueba de la tuberculina.
Prueba Tuberculinica Cervical Simple En esta prueba el lugar de inoculación es el tercio medio del cuello. Esta zona se debe depilar con maquina o tijera a 5 cm. de diámetro aproximadamente. Se mide con un calibre el espesor de la piel previamente y se inyectan 0.1 ml de tuberculina PPD bovina de un miligramo por mililitro. La lectura se hace mediante un calibre a las 72 horas (más o menos 6 horas). Cuando la lectura se ve impedida por razones climáticas u otras causas, esta puede hacerse hasta 24 horas mas tarde. Si la lectura se realiza mas tarde de esto la prueba no tiene validez por lo que el diagnostico no será confiable y debe repetirse la prueba a los 60 días. Positivo: 3mm o mayor Negativo: menos de 3mm
Prueba Tuberculinica Ano-Caudal Esta prueba se realiza en el pliegue ano-caudal interno a unos 6 cm. de la base de la cola y en el centro del pliegue. Esta zona es menos sensible a la tuberculina que la piel del cuello. Se inyectan 0.1 ml de PPD bovina de un miligramo por mililitro. La lectura se hace mediante un calibre a las 72 horas (más o menos 6 horas). Positivo: 5mm o mayor. Sospechoso: 3mm/ mas o menos de 5mm. Negativo: menos de 3mm. Hay que tener en cuenta que todo animal sospechoso en un establecimiento donde se hayan detectado animales reaccionantes positivos en pruebas anteriores o en la que se esta realizando se le debe considerar positivo.
Prueba tuberculinica comparativa La prueba intradérmica comparativa se utiliza para la realización de un diagnostico diferencial entre animales infectados por Mycobacterium bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina por exposición a otras micobacterias. Este tipo de sensibilización puede ser atribuido a la gran reactividad antigénica cruzada existente entre las especies de micobacterias y otros géneros afines. Esta prueba consiste en la inyección de tuberculina bovina y tuberculina aviar en diferentes puntos del cuello y en la subsiguiente evaluación de la respuesta transcurridos 3 días. Para esta prueba comparativa la dosis de tuberculina no debe ser inferior a 2.000 UI de tuberculina bovina ni a 2.00 UI de tuberculina aviar. La distancia entre ambas inyecciones debe ser de aproximadamente 12 a 15 cm. Positivo: 4mm mayor que la tuberculina aviar Dudoso: entre 1 y 4mm mayor que la tuberculina aviar Negativo: cuando no hay reacción o cuando la reacción es igual o menor que la tuberculina aviar. En todas la inyección se realiza introduciendo la aguja oblicuamente en las capas profundas de la piel e inyectando la dosis de tuberculina. Después se comprueba que la inyección ha sido bien realizada detectándose al tacto una pequeña inflamación en el lugar de la misma.
Aislamiento Las micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistentes, no formadores de esporas y no encapsulados, por lo que en la coloración de Zielh-Neelsen se observan como bacilos rojo brillante sobre un fondo azul. Estos microorganismos son aerobios obligados que crecen en medios sintéticos simples, pero para el aislamiento primario a partir de muestras clínicas se requiere de un medio más complejo con una base de papa y huevo como el medio Löwestein-Jensen, o con una base de agar y suero como el medio Middlebrook. El cultivo se hace a 37º C con una atmósfera de 5-10 % de CO2, el crecimiento es lento y dura de 3 a 6 semanas en desarrollarse, las colonias son pequeñas, secas y con aspecto escamoso.
Control Y Erradicación Detección y eliminación de todos los animales infectados, control del movimiento de estos, vigilancia en mataderos y dermoreacción, y campañas de divulgación.
Prueba de la tuberculina El método clásico para la detección de la tuberculosis bovina es la prueba de la tuberculina, que requiere la inyección intradérmica de tuberculina bovina y ulterior detección, transcurridos 3 días, de una inflamación en el punto de inyección. La prueba intradérmica comparativa se utiliza para la realización de un diagnóstico diferencial entre animales infectados por Mycobacterium bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina por exposición a otras micobacterias. Este tipo de sensibilización puede ser atribuido a la gran reactividad antigénica cruzada existente entre las especies de micobacterias y otros géneros afines. Esta prueba consiste en la inyección de tuberculina bovina y tuberculina aviar en diferentes puntos del cuello, y en la subsiguiente evaluación de la respuesta transcurridos 3 días. La prueba de la tuberculina se aplica normalmente en la región de la tabla del cuello, aunque en circunstancias especiales puede realizarse en el pliegue caudal de la cola. La piel del cuello, no obstante, es más sensible a la tuberculina que la del pliegue caudal. Para compensar esta diferencia pueden inyectarse dosis superiores de tuberculina en esta última zona. Tradicionalmente se ha venido usando una tuberculina preparada en un medio sintético y concentrada por calor (Heat-concentrated synthetic medium, HCSM) aunque, en muchos países, ésta ha sido substituida por un derivado proteico purificado (Purified Protein Derivative, PPD). Siempre que su actividad biológica haya sido estandarizada correctamente, la tuberculina HCSM ofrece una potencia adecuada, pero su especificidad es inferior a la de la tuberculina PPD. Por otra parte, ha quedado demostrado que los PPDs bovinos preparados a partir de la cepa de producción AN5 de M. bovis son más específicos que los PPDs humanos elaborados a partir de M. tuberculosis. La potencia de las tuberculinas debe ser estimada por métodos biológicos, basados en su comparación con tuberculinas estándar. La potencia se expresa en UI. En varios países, y en lo que concierne al ganado vacuno, se considera aceptable una tuberculina bovina cuando su potencia estimada garantiza una dosis mínima por bovino de 2.000 UI (±25%). En el caso de sujetos con una sensibilidad alérgica reducida, será necesaria una dosis superior de tuberculina. Para la práctica de campañas de erradicación se recomiendan dosis de hasta 5.000 UI. El volumen de cada dosis inyectada no debe sobrepasar los 0,2 ml. Para la prueba intradérmica comparativa, la dosis de tuberculina inyectada no debe ser inferior a 2.000 UI de tuberculina bovina ni a 2.000 UI de tuberculina aviar. La distancia entre ambas inyecciones debe ser de aproximadamente 12 a 15 cm. En animales jóvenes, cuyo cuello tal vez no ofrezca espacio suficiente para cumplir con este requisito, deberá administrarse de forma simétrica una inyección en cada lado, en el centro del tercio medio del cuello. La utilización de una técnica de inyección correcta es de gran importancia. Las zonas de inyección deben ser afeitadas y limpiadas cuidadosamente. Se mide, con un calibrador de precisión, el espesor del pliegue de la piel en cada área afeitada. Debe emplearse una aguja corta con la punta biselada conectada a una jeringa graduada (que contiene la tuberculina). La inyección se realiza introduciendo la aguja oblicuamente en las capas profundas de la piel e inyectando a continuación la dosis de tuberculina. Después se comprueba que la inyección ha sido bien realizada, en cuyo caso podrá detectarse al tacto una pequeña inflamación en el lugar de la misma. Transcurridas 72 horas, vuelve a medirse el espesor del pliegue de piel en cada punto de inyección.
La interpretación de los resultados se basa en la observación de un aumento del espesor del pliegue cutáneo. En el caso de la prueba intradérmica simple (que requiere una única inyección de tuberculina bovina), la respuesta se considera negativa cuando no se observa más que una leve inflamación, con un incremento de espesor no superior a 2 mm y sin signos clínicos como la presencia de un edema difuso o generalizado, exudación, necrosis, dolor o inflamación de los conductos linfáticos de esta zona o de los ganglios linfáticos. El resultado será considerado dudoso cuando no se observe ninguno de estos signos clínicos y el aumento de espesor del pliegue cutáneo esté comprendido entre 2 y 4 mm. La reacción se considera positiva si se observan los mencionados signos clínicos o si se produce un engrosamiento del pliegue cutáneo igual o superior a 4 mm. Por otra parte, y en el caso de rebaños infectados por M. bovis, cualquier inflamación palpable o visible deberá ser considerada como sinónimo de resultado positivo. En cuanto a la interpretación de la prueba intradérmica comparativa, suele definirse el resultado positivo como una reacción positiva a la tuberculina bovina y un engrosamiento provocado por ésta superior en 4 mm al que produce la tuberculina aviar. El resultado se considera dudoso si la reacción a la tuberculina bovina es positiva pero el aumento de espesor es entre 1 y 4 mm superior al de la reacción aviar. La prueba será considerada negativa cuando la reacción a la tuberculina bovina sea negativa o, aún siendo positiva, el engrosamiento sea igual o menor que el provocado por una reacción positiva a la tuberculina aviar. El modelo de interpretación aquí descrito es utilizado en los países de la Unión Europea (UE), y su uso viene recomendado en la Directiva del Consejo Europeo 64/432/EEC (4). En ocasiones se adopta una interpretación más restrictiva. En el caso de la prueba de inyección en el pliegue caudal, todo cambio palpable o visible será considerado como reacción positiva.
8. Enfermedades originadas por hongos que pueden causar abortos
Hongos: Aspergilosis: Aspergillus spp (afecta todas las especies). Mucormicosis: Rhizophus, Absidia, Mucor ( Afectan todas las especies). Candidiasis: Candida albicans (equinos).
Causada por el Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus y otras especies de Aspergillus, es una enfermedad que afecta principalmente a los tejidos respiratorios, caracterizada por lesiones inflamatorias granulomatosas, pudiendo ocurrir diseminación hematógena a otros órganos; en ocasiones pueden ser afectados el ojo, la piel, las meninges y el tracto reproductor; la enfermedad es relativamente rara en animales domésticos y en los animales de compañía, pero ocurre con frecuencia en las aves de corral.
Prevalencia Es generalmente aceptado que el Aspergillus fumigatus es el miembro patógeno más importante del género, también es importante el Aspergillus flavus en las aves en cautiverio. Otras diversas especies de Aspergillus tienen potencial patogénico y en ocasiones han sido consideradas como agentes causales de enfermedad. En los últimos años los informes sobre Aspergilosis en los animales domésticos y en los animales de compañía han aparecido sólo en forma esporádica. Aunque la Aspergilosis equina fue descubierta por primera vez hace cerca de 100 años, la enfermedad aparentemente es muy rara en caballos, la mayoría de los primeros casos observados se referían a afecciones locales de las aberturas nasales. El Aspergillus fumigatus ha estado asociado con diarreas persistentes en los potros y abortos en bovinos. Los abortos equinos pueden ocasionalmente ser causados por el Aspergillus spp. La Aspergilosis ovina ocurre con poca frecuencia lo mismo que en porcinos, en aves es muy común.
Epidemiologia
El Género Aspergillus es de distribución mundial y tiene un papel muy importante en procesos de descomposición en el suelo. Su ciclo normal de vida es saprofito y no depende del parasitismo de los animales y el hombre para sobrevivir, prolíficos productores de esporas bajo un amplio rango de condiciones ambientales, la diseminación por el aire de sus esporas contribuye a su ubicuidad y a su papel de contaminantes comunes de los laboratorios. Aquellas especies que han sido identificadas como patógenos potenciales con facilidad pueden ser aisladas de aire, polvo, heno y paja; su patogenicidad se fortalece al tomar una acción combinada con antibióticos antibacterianos o esteroides adrenocorticoides, es decir que la administración de una de éstas sustancias puede volver a los animales altamente susceptibles a la Aspergilosis fatal.
Signos Clínicos Y Patología Los signos clínicos que han sido descritos en animales domésticos y mascotas no difieren materialmente de las neumonías producidas por otras causas. La temperatura elevada, descargas nasales mucopurulentas, conjuntivitis y tos o estornudo son más o menos, manifestaciones constantes. Los abortos micóticos bovinos en general ocurren del tercer al octavo mes de la gestación, el feto abortado rara vez está vivo, la placenta es retenida en aproximadamente el 60 % de los casos. Macroscópicamente, las lesiones placentarias del aborto micótico bovino debidas a Aspergillus fumigatus, muestran cotiledones de color amarillo a gris, los que están notablemente engrosados, en especial en la periferia. En algunos casos el tejido intercotiledonal aparece con aspecto de cuero y tiene un color gris que varía a moreno. El número de los cotiledones afectados es variable. Como característica se observa una placentitis necrosante con los cambios más severos en los cotiledones. Puede ocurrir extensa necrosis con infiltración polimorfo nuclear alrededor de las áreas necróticas y distribución difusa alrededor de la placenta; el edema y la hemorragia son comunes y extensas; la arteritis generalmente está presente y pueden ser observadas las hifas invadiendo las paredes de los vasos sanguíneos. Algunos fetos abortados aparecen normales a la inspección. Los que aparecen más afectados, generalmente muestran lesiones circunscritas, elevadas, grisáceas, semejantes a la "tiña".
Diagnostico De Laboratorio Los Aspergillus constituyen los hongos contaminantes más comunes en el laboratorio y rutinariamente pueden ser cultivados de la piel y del tracto respiratorio superior de los animales sanos; es evidencia presuntiva de Aspergilosis el aislamiento repetido de una especie del Aspergillus del material clínico en ausencia de otros agentes patógenos; la recuperación del microorganismo de tejidos flameados o no expuestos ayuda a soportar el diagnóstico. Otra evidencia se obtiene por la demostración en el tejido de micelio semejante al del Aspergillus spp y el diagnóstico se realiza a veces sobre ésta base. Una combinación de evidencias de cultivo e histológicas es la base más firme para el diagnóstico.
Examen microscópico directo Las reparaciones húmedas pueden observarse directamente. El material para raspados se obtiene con facilidad de las vías aéreas durante la necropsia de los animales afectados. Los frotis pueden ser teñidos con Gram. El micelio mide 4-6 μ de ancho, es tabicado y de un diámetro regularmente uniforme.
Cultivo El Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus, así como otras especies de Aspergillus crecen fácilmente en el agar glucosa de saboraud. Los antibióticos antibacterianos pueden ser utilizados en el medio, pero no deberá ser empleada la cicloheximida ya que la mayor parte de Aspergillus son sensibles a éste antibiótico. Las colonias de Aspergillus fumigatus crecen rápidamente y son planas. Al principio son blancas y ligeramente vellosas, pero conforme se desarrollan las conidias toman un color verde azulado oscuro y un aspecto pulverulento. Los cultivos viejos tienen una apariencia gris "ahumada", muy característica.
Pruebas de patogenicidad No es necesaria la inoculación animal para la identificación de agentes de la Aspergilosis.
Inmunología No se han desarrollado pruebas inmunológicas para el diagnóstico de la Aspergilosis en los animales.
Diagnostico Diferencial Clínicamente, la Aspergilosis de las mascotas y de los grandes animales domésticos necesita ser diferenciada de otras micosis y de infecciones respiratorias de etiología viral. El aborto micótico bovino puede ser parecido al de la brucelosis, Vibriosis y Leptospirosis.
Tratamiento No existe un tratamiento efectivo contra la Aspergilosis. El control de la enfermedad requiere de la localización de la fuente del hongo esporulante (generalmente la cama) y la eliminación, lo más posible de aquella.
Es una enfermedad granulomatosa que afecta a diversos animales y al hombre, causada por hongos del género Phycomycetes. Los miembros de la familia Mucoraceae pertenecen a ésta clase y la Mucormicosis comprende la enfermedad, en ocasiones denominada ficomicosis, causada por Mucor pusillus. Se cono ce de una multitud de casos de enfermedades mucormicoticas de los bovinos; En 1935, Jungherr atribuyó a hongos de los géneros Mucor y Rhizopus ser la causa de abortos y otros desórdenes reproductivos. Las lesiones micóticas fueron descritas en una gran variedad de órganos, las más comunes en placentitis micótica y/o neumonía aguda micótica.
Signos Clinicos Y Patología Adecuadas descripciones clínicas de las Mucormicosis animales sólo han sido registradas para los equinos, en las otras especies animales el diagnóstico se ha realizado por lo común en la necropsia, encontrándose las lesiones en una gran diversidad de órganos. En los equinos se observa como un área o áreas de granulación exuberante (frecuentemente en miembros entre el casco y el corvejón), pueden encontrarse en el abdomen ventral, cuello, belfos y en la piel que rodea los ollares; la mayoría se desarrolla más bien con lentitud en sitios en donde se considera que han sido traumatizados previa mente por cortaduras o golpes.
Diagnostico De Laboratorio Los mucormicetos son comunes en la naturaleza y se encuentran en ocasiones como contaminantes de laboratorio. Varios micólogos han indicado que éstos microorganismos pueden ser invasores secundarios y que muy rara vez son patógenos primarios.
Examen microscópico directo Mediante el examen de raspados de las superficies de las mucosas y de las lesiones granulomatosas para determinar la presencia de micelio ancho, no septado.
Cultivo El agar glucosa de saboraud constituye un medio satisfactorio para el aislamiento, restringe la mayoría de los contaminantes bacterianos y ésta característica puede ser incrementada por la adición de antibióticos antibacteriales. La cicloheximida no debe ser añadida al medio ya que los ficomicetos son sensibles a ella.
Pruebas de patogenicidad Las infecciones experimentales en animales no son útiles en el diagnóstico de laboratorio.
Inmunología Poco se conoce con respecto a la capacidad del huésped para defenderse contra la enfermedad mucormicótica, por lo general se considera que éstos hongos son apatogénicos, pero que bajo ciertas condiciones son capaces de establecerse en el tejido causando severos cambios patológicos y ocasionalmente una enfermedad fatal, un defecto inmunológico favorece la infección.
Causada por especies del género Candida (comúnmente Candida albicans), es una enfermedad esporádica del tubo alimenticio de las aves de corral, en ocasiones son afectados los cerdos algunas veces con alteración de la piel. Puede causar abortos o mastitis en el ganado. Las infecciones son raras en perros, gatos y caballos.
Signos Clinicos Y Patología Los signos clínicos en becerros incluyen diarrea acuosa y melena, con subsecuente anorexia, deshidratación y progresión gradual a la postración y la muerte. Las infecciones mamarias bovinas causadas por Candida spp en ocasiones son benignas y transitorias, algunas autolimitantes. Las infecciones más severas siguen después de los tratamientos con antibióticos. Candida tropicalis está asociado en casos de mastitis aguda con grados variables de gravedad, las ubres con hinchazón extensa con una consistencia esponjosa, leche de los cuartos afectados gris y viscosa, temperaturas entre 40º y 42º C, anorexia, claudicación y drástica baja en la producción de leche.
Diagnostico De Laboratorio Examen microscópico directo Los raspados de mucosa pueden ser extendidos en un portaobjetos y teñirse con Gram. o preparaciones directas pueden ser examinadas con lactofenol azul de algodón. Pueden demostrarse células redondas u ovales en gemación de 3-6μ de diámetro y fragmentos de micelio, algunas veces con células en gemación insertadas.
Cultivo Es esencial que se utilicen medios selectivos para el aislamiento primario; el caldo glucosado y agar saboraud soportan adecuadamente el crecimiento de Candida spp y restringen el crecimiento de diversas bacterias.
Pruebas de patogenicidad Los conejos y ratones sucumben a la inoculación IV de Candida albicans, pero no existe un empleo práctico de la prueba ya que otras especies de Candida spp pueden causar también la muerte de éstos animales.
Inmunología No existen pruebas serológicas adecuadas para el diagnóstico de Candidiasis en animales.
Diagnostico diferencial Como regla general las lesiones cutáneas y de las mucosas en la candidiasis en todas las especies animales, deben ser diferenciadas de las infecciones bacterianas y las dermatofitosis.
Tratamiento El sulfato de cobre a la dilución de 1:2000 en agua potable ha sido considerado como un tratamiento, algunos veterinarios recomiendan el cambio a nistatina si el sulfato de cobre no es efectivo.
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Autor:
José Angel Parada
Estudiante Ingeniería de Producción Animal. Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente. Universidad Francisco de Paula Santander. Cúcuta-Colombia.
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