Indice1. Introducción 2. Tipos de microscopios 3. Microscopia electrónica
Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 um dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.
Microscopio de campo claro – Es descendiente de los disponibles a partir de 1800.
Compuestos por: Fuente luminosa que ilumina la muestra Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra Platina sobre la cual se coloca la muestra Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este tipo de microscopio se deben utilizar métodos de tinción porque el campo claro de este no produce un nivel útil de contraste. Microscopio de contraste de fase – Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial. Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llegan hasta la retina del ojo y las hacen visibles. La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis. Microscopio de fluorescencia – Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas autofluorecentes su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración inmunocitoquímica. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Estos métodos sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en neurobiología y en detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos mineralizados.
Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir luz monocromática o casi monocromática, o entre el espécimen y el objetivo permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta el ojo o incida en una emulación fotográfica u otro procedimiento analítico.
Microscopio de barrido confocal – Se usa para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen.
Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales. Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolución de 0,1 um. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuntificar el DNA y el RNA de cada célula. Microscopio de polarización – Este microscopio es una simple modificación del microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador. Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia. Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones cristaloides de las células intersticiales testiculares.
3. Microscopia electrónica
Dentro de los microscopios electrónico tenemos el de barrido y el de transmisión. La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los ópticos esta en que la longitud de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolución. Microscopio electrónico de transmisión – La óptica es muy similar al óptico pero se diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible.
Este microscopio se basa en los siguientes principios: – Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (cátodo)
- Un ánodo, hacia el cual son atraídos los electrones
- Una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de aceleración entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la haz
- El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que las lentes de vidrio de un microscopio óptico
El condensador forma el haz y modifica el diámetro del haz que incide en el plano del espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio de un objetivo y se aumenta aun más con una o más lentes proyectoras. La imagen final se visualiza sobre una planilla cubierta por fósforo. Las porciones de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que absorvieron o esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales pesados durante la preparación del espécimen aparecen oscuras. Se coloca una placa fotográfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor, con la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla. Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio óptico pero requieren métodos más finos. Los preparados la restricción que tienen es que en cada paso se trabaja con especimenes de magnitud 3-4 órdenes menores o más finos que los utilizados para el microscopio óptico. Debido a la gran resolución de estos microscopios electrónicos la calidad de la fijación, es decir el grado de preservación de la estructura subcelular debe ser la mejor posible. La preparación de rutina de los especimenes para la microscopia electrónica de transmisión comienza con la fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado con un buffer y de una fijación con tetróxido de osmio. Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico de transmisión piezas de tejido no mayores de 1 mm3
El proceso de deshidratación es idéntico al empleado en la microscopia óptica El tejido incluido en material plástico se secciona por medio de micrótomos especialmente diseñados, que usan cuchillas de diamante. Debido al limitado poder de penetración de los electrones, el espesor de los cortes preparados para el microscopio electrónico de transmisión varia entre 50 nm y 150 nm. Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de líquido, se recuperan y se colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por plástico. Estas rejillas tienen 50-400 orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados. Por lo general, la coloración de los cortes para microscopio electrónico de transmisión se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad, tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales pesados se unen a los tejidos durante la fijación o la deshidratación o al sumergir las muestras en soluciones de tales iones después del corte. El teróxido de osmio que se emplea de rutina en el fijador se une a los componentes fosfolipídicos de las membranas, lo cual agraga densidad a la membrana. A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohólicas usadas en la deshidratación, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para teñir los cortes antes de observarlos con microscopio electrónico de transmisión. La congelación-fractura es un método especial de preparación de la muestra para microscopia electrónica de transmisión, de gran importancia en el estudio de membranas. El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un crioprotector, como el glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados centígrados. Microscopio electrónico de barrido – Se asemeja más que al microscopio electrónico de transmisión a los tubos de televisión de donde deriva la microscopia electrónica. Para analizar la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecación de punto crítico, se cubre con una película evaporada de oro-carbón, se monta en un taco de aluminio y se coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejía y analizar las características estructurales del mineral. Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a través de la superficie un tubo de televisión. Los electrones reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por uno o más detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en un televisión. Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen en una cinta de video. Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la catodoluminiscencia de las moléculas del tejido por debajo de la superficie y los electrones de Auger emitidos en la superficie. Muchos microscopios combinan las características de un microscopio electrónico de transmisión y de barrido, el cual permite microanálisis por rayos X con sonda electrónica. Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el haz de bombardea el corte histológico, y mediante analizadores apropiados se construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos que tienen número atómico mayor de 12, en concentración suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se pueda analizar.
Autor:
gon2002