En los últimos años hemos presenciado la escasez de alimentos en el mundo, no solo por la sobrepoblación mundial sino porque ciertos alimentos básicos se están utilizando para la elaboración de biocombustibles. Lo anterior ha generado un alza de precios, principalmente en el trigo, el maíz y el arroz, lo cual ha provocado que aumente la cifra de gente desnutrida y la muerte por inanición en los países más pobres como Haití y países del continente Africano.
En el caso de México, la población ha tenido que buscar nuevas opciones para complementar su alimentación, reduciendo el consumo de trigo, maíz y arroz, aumentando el consumo de otros de fácil elaboración y que provoquen sensación de saciedad rápidamente, aunque no sea lo más nutritivo para la población. En general, la comida rápida se caracteriza por tener un gran porcentaje de carbohidratos y grasa y un mínimo de proteínas, vitaminas y minerales, lo cual favorece la obesidad y otras enfermedades del tipo crónico degenerativas.
Sin embargo, dentro de la alimentación mexicana existe un tesoro que actualmente puede encontrarse en todo el mundo, es de fácil cultivo, tiene un delicioso sabor, es muy nutritivo y cuenta con un precio accesible, dicho alimento es el frijol.
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en nuestro país es un alimento característico dentro de nuestra gastronomía y se consume desde tiempos prehispánicos. Actualmente en México el frijol es la segunda fuente de proteína y además proporciona otros nutrimentos como minerales, vitaminas del complejo B, ácidos grasos poliinsaturados, carbohidratos y fibra dietaria. Una de las principales características del frijol es que se complementa perfectamente con el maíz, de esta manera los aminoácidos que no se encuentran en el frijol se encuentran en el maíz y viceversa, brindando una alimentación balanceada a quien lo consume.
Actualmente, además de los nutrimentos antes mencionados, se ha encontrado en el frijol común compuestos que ayudan a prevenir o reducir enfermedades de tipo crónico degenerativas.
El carácter nutracéutico que presenta esta leguminosa ha llamado mucho la atención de países desarrollados y en vías de desarrollo. Aunque su consumo ha disminuído debido a que se le considera un alimento de pobres no debe faltar en nuestra mesa y se debe luchar para que retome su lugar dentro de todos los estratos sociales.
Tomando en cuenta lo anterior, nuestro trabajo se enfoca en llevar a cabo el análisis de los efectos producidos al inocular con biofertilizantes (hongo micorrícico, Glomus mosseae y bacteria benéfica del suelo, Bacillus subtilis) el suelo donde se sembraron diferentes variedades genéticas de frijol comercial. Esto con la finalidad de identificar cual tratamiento produce mejores resultados, tanto agronómicos como nutricionales, en los diferentes materiales de frijol y así ofrecer a la población una nueva opción que fortalezca y mejore sus cultivos, sin dañar al medio ambiente.
OBJETIVOS
General
Evaluar la calidad nutricional y nutracéutica de diferentes materiales genéticos de frijol que se consumen en México, crecidos bajo el efecto de microorganismos benéficos (PGPR´s y los hongos micorrícicos arbusculares).
Específicos
Realizar mediciones agronómicas a las plantas de frijol crecidas en condiciones normales e inoculadas con Bacillus subtilis (PGPR) y Glomus mosseae (hongo micorrícico arbuscular).
Cuantificar el rendimiento de las semillas de cada variedad de frijol en cada tratamiento y analizar las características del grano cosechado.
Cuantificar en las semillas de cada variedad de frijol y en cada tratamiento, los compuestos fenólicos totales, taninos condensados, antocianinas y concentración de proteína por métodos fotométricos.
Cuantificar la concentración de antocianidinas por HPLC.
A. LEGUMINOSAS
Las leguminosas provienen de la familia Leguminosae, probablemente la segunda fuente de alimento más importante a nivel mundial. (Oboh, 2006). En comparación con los cereales, (quienes se encuentran en primer lugar) son ricas en proteínas de alta calidad, brindando al hombre una gran fuente de nutrición y una dieta balanceada que puede prevenirle de muchas enfermedades (Duranti, 2006).
Miles de especies de leguminosas existen pero los frijoles comunes (Phaseolus vulgaris L.) son los más consumidos en comparación con los demás. En varios países como México y Brasil los frijoles son la principal fuente de proteínas en la dieta humana (Broughton, 2003).
En cuanto a la concentración de proteína en las leguminosas, el frijol y el chícharo presentan alrededor del 20% en peso seco y la soya contiene por encima del 38 – 40%. Es por esto que las leguminosas se encuentran entre las fuentes más ricas de proteínas y aminoácidos para la nutrición humana y animal; además son de menor costo que los productos animales (carnes, pescado y huevo), por lo cual son consumidas en todo el mundo como la principal fuente de proteína, especialmente en los países pobres o en vías de desarrollo donde el consumo de proteínas animales puede ser limitado como resultado de la economía, la sociedad, la cultura o los factores religiosos (Oboh, 2006).
Desde un punto de vista nutricional, la proteína de leguminosas es relativamente baja en aminoácidos azufrados como la metionina y cisteina, por lo que la calidad de la proteína en la semilla de leguminosa es sub-óptima. (Broughton, 2003) pero la cantidad de otros aminoácidos esenciales como la lisina y triptófano es mucho mayor que en los cereales. (Duranti, 2006). Ante lo anterior, estudios recientes han señalado que la dieta con leguminosas debe ser complementada con carbohidratos complejos, fibras solubles, vitaminas esenciales y metales (Beninger y col, 1998; Mazur y col, 1998; Romani, 2004; Oboh, 2006).
Dentro de las leguminosas también existen compuestos antinutricionales (ANC), producto de la adaptación evolutiva, y que le permiten a la planta sobrevivir y completar su ciclo de vida bajo condiciones naturales. Estos componentes con propiedades antinutricionales y tóxicas son los que juegan un papel protector contra insectos, hongos, predadores y un gran número de condiciones de estrés.
El efecto antinutricional de las leguminosas consiste en la acción de varias enzimas digestivas como la tripsina, quimiotripsina y la amilasa. Sin embargo, esto se manifiesta sólo si la semilla o la harina son consumidas sin cocinar. Una vez cocinadas estas proteínas se inactivan desnaturalización y pueden jugar un papel nutricional positivo debido a su alto contenido en aminoácidos azufrados (Duranti, 2006).
Además, las leguminosas son fuente importante de macro y micronutrientes y juegan un papel destacado en las dietas tradicionales de muchas regiones del mundo. Las leguminosas han sido reconocidas como alimento funcional debido a que promueven una buena salud y tienen propiedades terapéuticas.
Los compuestos que brindan características de alimento funcional al frijol son los fenoles simples, los fenilpropaniodes, derivados del ácido benzóico, flavonoides, estilbenos, taninos, lignanos, y ligninas (Xu y Chang, 2007).
Además de lo anterior, la familia Leguminosae es una hortaliza importante, ya que los granos y el alimento pueden ser obtenidos con una mínima inversión en fertilizantes nitrogenados (Oboh, 2006). Esto se debe la asociación que existe entre las leguminosas y las bacterias que fijan nitrógeno del aire. Esta fertilización interna es la principal razón por la que las leguminosas son más ricas en proteínas que todas las otras plantas (Broughton, 2003). Actualmente el valor anual total del cultivo de leguminosas en el mundo es de dos billones de dólares americanos (Duranti, 2006).
Género Phaseolus
El género Phaseolus pertenece a la subtribu Phaseolinae, que forma parte de la tribu Phaseolae, clasificada dentro de la subfamilia Papilionoideae y familia Leguminosae. (Debouck, 1991). Este género pertenece al grupo de las leguminosas de gran importancia económica y alimentaria. Posee características botánicas distintivas: follaje con tricomas anclados, nodos de inflorescencia que perdieron los nectarios extraflorales, de bractéolas florales aún concluida la floración y estilo no extendido por debajo del estigma, pétalos que están equilibrados, tanto en la parte lateral como en los extremos y fuertemente enrollados y nodos de la inflorescencia que pierden los nectarios extraflorales (Debouck, 1998).
Estudios basados en datos morfológicos, clasificación taxonómica tradicional, análisis genéticos y sitios de restricción de DNA de cloroplasto sugirieron que el género Phaseolus es originario de América y que posee alrededor de 55 especies silvestres que han sido encontradas desde el Suroeste de Estados Unidos hasta el norte de Argentina (Delgado-Salinas et al., 1988). Se considera que la especiación o formación de las diferentes especies del género se efectuó en los neotrópicos y fue favorecida por el conjunto de características geográficas, climáticas y ecológicas, así como del área de transición entre climas templados y de alta elevación, desiertos y trópicos secos. Sin embargo, sólo cinco de ellas han sido domesticadas (Debouck, 1987). El género Phaseolus es monofilético y originario de América; posee nueve especies: P. vulgaris, P. filiformis, P. lunatus, P. polystachius, P. leptostachyus, P. pauciflorus, P. tuerckheimii y P. peicellatus y P. microcarpus (Delgado-Salinas et al., 1999), formadas a su vez por subgrupos, de tal forma que las cinco especies domesticadas en el género provienen de los grupos P. vulgaris y P. lunatus (Delgado-Salinas et al., 1999).
Como resultado de la domesticación, el frijol silvestre experimentó importantes cambios, los más notables fueron la aparición de diferentes tipos de crecimiento (determinado e indeterminado), insensibilidad al fotoperiodo, gigantismo de la hoja, vaina y semilla, pérdida de la dormancia y supresión de la dehiscencia de las vainas, así como la aparición de variedad de tamaños, formas y colores de las semillas. La aparición de estas últimas características en la semilla de frijol fue influenciada por un segundo proceso de selección hecho por el hombre que inicia con el comienzo de la agricultura hasta nuestros días, lo que provocó la reducción de la posibilidad de éxito y mantenimiento de una gran variedad de genotipos, dando oportunidad sólo a aquellas que poseen características valiosas para el agricultor, como color, tamaño, rendimiento, etc. (Sonnante et al., 1994; Gepts y Debouck, 1991; Gepts et al., 1998).
Frijol cultivado (criollo y mejorado)
Dentro del grupo de frijol cultivado se encuentra el frijol criollo y mejorado, los cuales son utilizados para el consumo humano. El frijol criollo surge de manera natural como resultado del proceso evolutivo de domesticación, de manera que también se aprecia una disminución de la diversidad genética en comparación con sus progenitores silvestres. El frijol criollo no ha sido manipulado genéticamente e históricamente ha sido sembrado por los campesinos en forma local en casi todos los estados de la República, representando una amplia variedad en la morfología y color de las semillas.
Por otro lado, el frijol mejorado ha sido producto del mejoramiento genético a través de selecciones dirigidas por el hombre para obtener las características de su interés, ya sea conferir resistencia a ciertos patógenos, tales como virus, hongos y bacterias, o incrementar rendimiento, tamaño de la semilla, permeabilidad, etc. Las variedades mejoradas han sido generadas por programas de mejoramiento genético mediante la cruza de materiales criollos relacionados genéticamente, los cuales con el tiempo van excluyendo la base genética en la que está basado el mejoramiento, amenazando la base genética de sus antecesores, de tal manera que la diversidad genética de estos materiales es menor (Harlan, 1987). Dentro de las características más importantes del frijol cultivado podemos mencionar que son plantas arbustivas, de estatura corta, semillas de rápida maduración, la vaina es ideal para abrir, es una planta de vida corta, anual y de tallos frágiles, posee pedúnculos cortos y grandes vainas suculentas con dehiscencia no violenta, de grandes semillas y más permeables al agua, además poseen una gran variedad de colores y adaptaciones fisiológicas, aunque estas últimas son debidas a la selección hecha por el hombre (Guzmán-Maldonado y Paredes-López, 1999).
Producción
Los frijoles son las semillas de leguminosa más importantes para el consumo humano en el mundo. La producción total excede los 23 millones de toneladas (MT) de los cuales 7 MT son producidos en Latinoamérica y África. Solo en México, el área destinada a la siembra de frijol gira alrededor de 2259 ha×10-3 y la producción es de 1300 MT×10-3.
El consumo promedio anual per capita de frijol en México es de aproximadamente 16 Kg por año, el estado de Durango sobresale con un promedio de 18 kg por año, el rango según el estrato social varía entre 10 y 26 Kg (Broughton, 2003). Según este, hay una disminución en el consumo del frijol en México con respecto a los datos presentados en 1997 por Castellanos, donde se estimaba que el consumo per capita anual por la población mexicana era de 22 Kg.
Existen hábitos preferenciales en el consumo del frijol en México, las principales características que utilizan los consumidores para definir sus preferencias se basan en el tiempo de cocción y sabor, además del color, tamaño y brillantez. Se estima que en el Noroeste de México el 90% de los encuestados consume frijol azufrado, en el Noreste el 70% consumen frijol pinto o bayo, en el Sur el 90% consume frijol negro y en el Centro se consumen todas las clases comerciales, sobresaliendo Flor de Mayo y Flor de Junio (Castellanos et al., 1997).
El frijol es una importante fuente de alimento, principalmente en forma de semilla madura y en menor proporción como vaina verde o ejote; además, en algunos países de América Latina, así como en el este y centro de África, las hojas o flores tiernas de las plantas de frijol son cosechadas y consumidas como vegetales frescos. Su uso no sólo es exclusivo del hombre, también el ganado es alimentado con hojas, tallos, cáscara de las vainas y rastrojo seco, que finalmente es incorporado al suelo para incrementar la materia orgánica (Singh, 1999). Además de ser fuente directa de alimento, el cultivo trae otras ventajas como el suministro y biodisponibilidad de nitrógeno a otros cultivos por la asociación simbiótica con microorganismos del suelo. También como alternativa en la rotación de cultivos, adiciona fertilidad al suelo y reduce costos de producción, evitando la contaminación de aguas subterráneas y aumentando la producción de proteína de las leguminosas. En comparación con otras leguminosas, el frijol se ha considerado una planta pobre en la fijación de nitrógeno, posiblemente por la baja eficiencia de su simbiosis; sin embargo, la principal razón por la que se cultiva en cantidades importantes en México es para la alimentación.
Situación del frijol en México
En México, la industria del frijol no está muy desarrollada, no obstante que ocupa el segundo lugar en importancia en la dieta alimentaria en la mayoría de la población mexicana. En la década de los noventa, el procesamiento del frijol comenzó a tomar fuerza, lo cual ha obedecido a cambios en los hábitos alimenticios principalmente en las zonas urbanas, donde la mujer participa con mayor frecuencia en el sustento de la economía familiar, lo que acorta los tiempos para la elaboración de los alimentos (FIRA, 2001).
Considerando el excesivo aumento de la población y que se estima para el año 2030 un incremento de 50%, será un gran reto abastecer de alimento a toda la población mundial. Por otro lado, considerando que las tierras de cultivo disminuirán, así como los recursos naturales (agua, fertilidad del suelo, etc.), es urgente adoptar sistemas de producción y agricultura más eficientes y sustentables.
Por ejemplo, en la actualidad el hombre ha satisfecho la demanda de alimento mediante el incremento de producción a través del uso de mejoramiento genético, fertilizantes, pesticidas, agua y el empleo de una mayor extensión de tierras de cultivo; sin embargo, los recursos escasean día con día rápidamente. Las costumbres en el consumo del frijol son muy arraigadas, por lo que se debe tener en consideración las preferencias del consumidor antes de establecer alguna estrategia de mejoramiento genético para que éste no sólo resulte satisfactorio genética y fisiológicamente, sino también en la aprobación y demanda de la población.
Importancia del frijol en la dieta
En muchos países de América Latina, como en México, el maíz y el frijol son la principal fuente de proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales para la población (Guzmán-Maldonado et al. 2000). Por otro lado, se ha demostrado que el frijol además contiene gran cantidad de compuestos nutracéuticos que varían dependiendo de la especie y color, tales como la fibra, inhibidores de proteasa, acido fítico, polifenoles y taninos (Espinosa-Alonso y col, 2006).
El frijol común (Phaseolus vulgaris) es por mucho uno de los más importantes cultivos (leguminosa comestible cultivada y cosechada como semilla seca) en el mundo (Singh, 1999), es el tercero en importancia después del frijol de soya (Glycine max (L.) Merr.) y el cacahuate (Arachis hypogea L.) (Lin, 2008).
El frijol en América Latina y África constituye la segunda fuente de proteína vegetal. En el caso de México, el frijol ha formado parte importante de la cultura gastronómica, llegando a constituir hasta el 15% de la dieta en las zonas más marginadas (el maíz aporta hasta el 65%). La combinación frijol-maíz logra el aporte de hasta el 70% de las calorías requeridas y el 50% del requerimiento de proteínas (Castellanos y col, 1997). Además, la combinación potencializa el valor nutritivo de la proteína ingerida ya que el frijol aporta la lisina y triptófano deficientes en maíz y éste a su vez aporta los aminoácidos azufrados (metionina y cisteina) deficientes en frijol (Reyes-Moreno y Paredes-López, 1993).
Características nutricionales del frijol
Dentro de las características más importantes que destacan el valor nutritivo de las leguminosas en la nutrición humana es que presentan de 2 a 3 veces más proteína que los cereales. Además de un alto contenido de minerales, especialmente Fe, Ca y Zn (Deshpande, 1992). En particular, se considera que el frijol es un alimento rico en macronutrientes como las proteínas (16 – 33%), carbohidratos (60 – 70%), aunque escaso en grasa (1 – 3%), además contiene vitaminas y micronutrientes que elevan aún más su valor nutricional.
Las proteínas presentes en el frijol, juegan un papel esencial en la nutrición humana por complementación con otros alimentos como el maíz en América Latina y el este de África y el arroz en Brasil. Por otro lado, las proteínas de origen animal como la caseína de la leche y la albúmina de huevo presentan perfiles de aminoácidos más completos y en años recientes se ha considerado que es más saludable sustituir en una buena proporción por proteínas de origen vegetal debido a que el consumo excesivo de proteínas de origen animal puede ser calciurético y con el tiempo se puede provocar mayor riesgo de fracturas. Debemos considerar además que en muchas ocasiones la proteína de origen vegetal es la única opción de consumo debido principalmente a la economía de gran parte de la población, por lo que el frijol representa la segunda fuente de proteína en México, cubriendo las necesidades básicas para el buen desarrollo y funcionamiento del organismo (Guzmán-Maldonado y Paredes-López, 1999).
Dentro de las proteínas del frijol común (Phaseolus vulgaris L.), las globulinas representan entre el 50 y 75% del total (Muller y Gottschalk 1983; Alli y col, 1994). Hay dos tipos de proteínas en este grupo, las faseolinas y las lectinas (Staswick y col, 1986). Las de mayor importancia son las faseolinas (glicoproteína trimerica) porque son las mejores proteínas de las leguminosas para la nutrición humana y por ser las más abundantes, ya que conforman el 40 % de la proteína total en la semilla (Ma y Bliss, 1978), (Gepts 1988, 1990), (Aswathi, 1993), (Sharma, 2006) Estas proteínas pueden ser observadas mediante la técnica SDS-PAGE, donde las bandas correspondientes a las subunidades de la faseolina (43-53 kDa) aparecen como las mas intensas y de mayor tamaño en comparación con las demás (Carbonaro, 2006). También se observan fitohemaglutininas (55-65 kDa), argelinas (31-40 kDa) e inhibidores de a-amilasa (15-18 kDa) (Bernal y col, 2006).
En base a lo anterior, la faseolina se ha considerado como el principal determinante de la calidad nutricional y de la cantidad de proteína presente en las semillas de frijol (Bliss y Brown, 1983; Gepts y Bliss, 1984). Sin embargo, la faseolina es deficiente en aminoácidos azufrados como la metionina y la cisteína, contrario a los cereales que generalmente contienen suficientes aminoácidos azufrados pero son deficientes en aminoácidos esenciales como la lisina y triptófano (presentes en las leguminosas). Por lo anterior es que el consumo combinado de cereales y leguminosas en una proporción de 2:1 produce un equilibrio mejorando el balance en la dieta de sus consumidores (Bressani, 1983) (Broughton, 2003).
Aún cuando el contenido de proteína en la semilla de frijol es alto (20% de peso seco aproximadamente), su valor nutricional es pobre debido a factores intrínsecos de la semilla, tales como la presencia de inhibidores de tripsina, taninos y ácido fítico que inhiben de forma irreversible a las proteasas intestinales, formando complejos con las proteínas, disminuyendo su solubilidad e hidrólisis. Sin embargo, la actividad de los inhibidores puede ser eliminada hasta en un 90% durante la cocción (Deshpande, 1992), los taninos y el ácido fítico pueden ser removidos en una buena proporción durante el remojo (Maga, 1982; Barampama y Simard, 1994). Es importante destacar que dichos componentes tienen propiedades duales ya que han sido asociados con la prevención de enfermedades de tipo crónico degenerativas, lo cual ha provocado que en años recientes se haya incrementado la importancia del frijol y exista un mayor interés por su carácter nutracéutico.
Además el carácter nutracéutico del frijol se debe tembién a la actividad antioxidante y antimutagénica que brindan los compuestos fenólicos presentes en la semilla. Porque pueden ayudar en la prevención de enfermedades degenerativas como el cáncer. Existen reportes de efectos anticarcinogénicos de los extractos fenólicos de frijol común que respaldan su potencial uso como alimento funcional (Preza y Lerma, 2003). (Rocha-Guzmán, 2007). El color del frijol es importante, algunos estudios señalan que los frijoles negros poseen mayor contenido de fenoles que aquellos de color claro (Barampama y Simard, 1993). Tambien es importante señalar que los factores ambientales, el lugar de crecimiento y los factores genéticos del cultivo influencian el nivel de los fenoles totales. Por otro lado, la concentración y la composición de fenoles, así como la de taninos totales (procianidinas) y la de antocianinas determinan el color de la semilla de frijol (Feenstra, 1960).
Nutracéuticos: salud y dieta
En los últimos años se ha reconocido que las enfermedades crónico degenerativas asociadas a los problemas de obesidad, tales como diabetes, enfermedades cardiovasculares, hipertensión y cáncer están afectando a una gran parte de la población mundial, no sólo en países desarrollados en los cuales existe abundancia de alimento, sino también en los países en vías de desarrollo, donde existe malnutrición (WHO, 2003). Dos factores principales son la causa de este importante problema de salud, la dieta y la falta de actividad física. Desde tiempos remotos, Aristóteles sugirió la importante relación entre salud y dieta, poniendo como manifiesto "que tu alimento sea tu medicina"; sin embargo, los patrones de alimentación han cambiado hacia una dieta no balanceada. Así mismo, debido al creciente aumento de la población, el principal objetivo en cuanto a nutrición ha sido alcanzar los requerimientos calóricos necesarios sin tomar en consideración el balance o calidad de los alimentos ingeridos.
Por otra parte, en América Latina se han presentado cambios en los patrones de alimentación debido al desarrollo, la industrialización, los estilos modernos de vida, etc., que han afectado los patrones alimenticios de la población, incrementando el consumo de alimentos ricos en carbohidratos y grasas y reduciendo la ingesta de cereales, leguminosas, frutas y verduras (Bermúdez y Tucker, 2003). Para tratar de frenar y combatir estos problemas de salud, la Organización Mundial de la Salud ha propuesto que la mejor estrategia es la prevención y en los últimos años se ha dado gran importancia a cambiar los hábitos alimenticios, recomendando una dieta rica en frutas y verduras y baja en carbohidratos y grasas, generado una tendencia hacia los estudios sobre los compuestos nutricionales cuya ingesta beneficia directamente a la salud. A estos compuestos se les ha denominado como "nutracéuticos", término creado en 1979 como resultado de la fusión de nutrientes y fármacos por Stephen De Felice fundador y presidente de la Fundación de Innovación en Medicina (FIM, Cranford, NJ) quien explicó que un Nutracéutico es "cualquier alimento, o parte de un alimento que puede proveer de beneficios a la salud, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades". (Durante, 2006). Muchos de estos compuestos cuentan con propiedades antioxidantes (Erdman y col, 2007), antimutagénicas (Aparicio-Fernández y col, 2005) y anticarcinógenas (González de Mejía y col, 2005) que previenen al organismo de enfermedades crónicas y se encuentran en frutas, leguminosas y vegetales.
Las leguminosas además de jugar un papel importante en el aporte nutrimental de muchas personas a través del planeta, también brindan beneficios a la salud y propiedades terapéuticas (Geil y Anderson, 1994). Estudios epidemiológicos han mostrado correlaciones entre el consumo de alimentos con alto contenido de fenoles, como las frutas, vegetales, granos y leguminosas y la disminución de muchas enfermedades, por ejemplo, el cáncer, envejecimiento prematuro y enfermedades cardiovasculares (Anderson y col, 1999; Kushi y col, 1999; Miller y col, 2000; Kris – Etherton y col, 2002). Un estudio epidemiológico reciente señaló que de entre muchos alimentos comunes, sólo el consumo de frijoles y lentejas está relacionado con la baja incidencia de cáncer de seno (Adebamowo y col, 2005). También se han reportado actividades antioxidantes significativas producidas por compuestos fenólicos en muchas leguminosas consumidas comúnmente (Tsuda y col, 1993, 1994, 1996; Takahata y col, 2001; Cardador-Martínez y col, 2002; Duenas y col, 2002, 2004; Troszýnska y col, 2002; Amarowicz y col, 2003, 2004; Beninger y Hosfield 2003; Lee y col, 2004; Madhujith y col, 2004; Heimler y col, 2005; Madhujith y Shahidi 2005; Takahashi y col, 2005). (Xu, Yuan y Chang, 2007).
Compuestos nutracéuticos en frijol
El color de la cubierta de las semillas es atribuido a la presencia y a la concentración de los polifenoles, así como de los glicósidos de flavonoles, taninos condensados y antocianinas (Beninger y Hosfield, 1999; Takeoka, G. R. y col, 1997; Choung y col, 2003; Salinas-Moreno y col, 2005; Romani y col, 2004) y su función es proteger a la semilla contra patógenos y predadores (Islam y col, 2003). Estos compuestos tienen actividades antioxidantes, antimutagénicas y anticarcinogénicas y también propiedades contra radicales libres (González de Mejía y col, 1999; Cardador-Martínez y col, 2002; Beninger y Hosfield, 2003).
Los polifenoles de frijol seco pueden actuar como antioxidantes que inhiben la formación los radicales libres que resultan de la degradación natural de los alimentos (Namiki, 1990). Recientemente se ha demostrado que los taninos condensados y los hidrolizables de peso molecular relativamente alto, también son efectivos antioxidantes, con mayor actividad que los fenoles simples (Hagerman, y col, 1998; Beninger, 2003).
El carácter nutracéutico del frijol ha llamado la atención en los países desarrollados debido a los importantes beneficios que aporta a la salud, incluyendo la reducción del contenido de colesterol en sangre, la tolerancia a la glucosa, disminución de enfermedades cardiovasculares y prevención de ciertos tipos de cáncer (Messina, 1999; Guzmán-Maldonado y Paredes-López, 1998).
Los beneficios a la salud por el consumo de antocianinas, son bien conocidos por los países desarrollados como EUA, su consumo es entre 180-215 mg por día, obtenido principalmente por alimentos rojos y azules y por el vino tinto. Sin embargo, estas mismas fuentes no son disponibles en todos los países en vías de desarrollo por lo que una buena alternativa es la ingesta de 100 g de frijoles negros, que pueden incorporar lo mismo o mayores cantidades (349 mg/dia) de antocianinas en la dieta básica (Espinosa-Alonso, 2006).
Contenido Fenólico Total
Los fenoles naturales realizan sus efectos benéficos en la salud principalmente a través de su actividad antioxidante (Fang y col, 2002). Estos compuestos son capaces de remover los radicales libres, realizar catálisis para quelar metales, activar enzimas antioxidantes e inhibir oxidasas (Heim y col, 2002).
Los compuestos fenólicos son originados a partir de una de las principales clases de metabolitos secundarios en plantas, derivados de la fenilalanina. Las plantas y los alimentos contienen una gran variedad de derivados fenólicos, incluyendo simples fenoles, fenilpropanoides, derivados del ácido benzoico, flavonoides, estilbenos, taninos, lignanos y ligninas, suberina y cutina. Los compuestos fenólicos son esenciales para el crecimiento y reproducción de plantas, actúan como antipatógenos. Contribuyen con la pigmentación de las plantas y son atrayentes de polinizadores. Además actúan como pesticidas naturales y participan en el establecimiento de la simbiosis con el género Rhizobium. Protegen a las plantas de la luz UV y son antioxidantes naturales. Esta última propiedad atrae enormemente nuestra atención debido a la constante formación de radicales libres que ocurren de forma natural en nuestro organismo, originados como productos del metabolismo. Los radicales libres son inestables y altamente reactivos, pero su reactividad puede ser contrarestada por medio de los antioxidantes, los cuales pueden actuar a diferente nivel, pueden disminuir la concentración de oxígeno, prevenir la formación de la reacción en cadena por secuestramiento de los radicales de iniciación, unión a los iones metálicos catalizadores y descomposición de los productos primarios de oxidación, previenen la unión a proteínas y la mutación del ADN y el daño a tejido (Shahidi, 2000). Además de su actividad antioxidante, presentan actividad antimutagénica y anticancerígena y juegan un papel muy importante en la salud debido a que se han asociado con la reducción de enfermedades crónicas-degenerativas (Rui Hai, 2004).
El consumo de compuestos fenólicos en la dieta está afectado por los hábitos y preferencias del consumidor. Las principales fuentes de compuestos fenólicos son frutas, vegetales, cereales y leguminosas. Se ha estimado que el consumo diario de compuestos fenólicos en personas que comen varias raciones de fruta y vegetales al día es de 1 g. La Academia Nacional de Ciencias de EU recomienda el consumo de al menos 5 raciones de frutas o vegetales diarios para un buen funcionamiento del organismo y para la prevención de enfermedades crónicas degenerativas. Las catequinas son compuestos fenólicos flavonoides presentes ampliamente en plantas comestibles como la soya y especialmente en el té (Ho y col, 1992; Huang, M. y Ferraro, 1992; Dreosti, 1996). Se ha reportado que las catequinas inhiben la generación de tumores y algunos tipos de cáncer. (Conney y col, 1992; Wang y col, 1992; Chung y col, 1992; González de Mejía y col, 1999).
Contrario a la recomendación, en países de América Latina se observan cambios en los patrones de consumo y en la actualidad se ha incrementado el consumo de alimentos de origen animal, productos ricos en grasa y azúcares y al mismo tiempo, la disminución de la ingesta de cereales, frutas y algunos vegetales (Bermudez y Tucker, 2003). De tal manera que el consumo de compuestos fenólicos es cada vez menor y para algunos sectores de la población resulta inaccesible el consumo de frutas debido a sus condiciones socioeconómicas. Se ha descrito que la semilla de frijol contiene diferentes compuestos fenólicos, contenidos principalmente en la cascarilla y que su color está determinado por la presencia y concentración de polifenoles tales como flavonoides glicosilados, taninos condensados y antocianinas (Takeoka y col, 1997; Beninger y col, 1999; 2003; Choung y col, 2003; Romani y col, 2004; Salinas-Moreno y col, 2005). Y se han descrito diferentes propiedades antioxidantes, anticancerígenas y antimutagénicas en diferentes cultivares de frijol. (González-De Mejía y col, 1999; Cardador-Martínez y col, 2002; Beninger y col, 2003; Aparicio-Fernández y col, 2006). De tal manera que se está considerando al frijol como una buena fuente de compuestos fenólicos en la dieta, tomando en cuenta que es un alimento de costo accesible y que se tiene bien incorporado a los hábitos tradicionales de alimentación.
Taninos condensados
Los taninos son producto de la condensación de fenoles simples y tienen una variedad de estructuras moleculares. Ellos están generalmente divididos en proantocianidinas hidrolizables y condensadas (polimeros de flavan-3-oles) (Haslam 1989). Los taninos son compuestos biológicamente activos y pueden tener efectos nutricionales benéficos o adversos. Los taninos condensados, compuestos fenólicos predominante en semillas leguminosas, se encuentran ampliamente en lentejas, granos de soya coloreados y frijoles comunes (Elias y col, 1979; Vidal-Valverde y col, 1994; Troszynska y col, 1997, 2002; Wang y col, 1998; Takahata y col, 2001; Beninger y Hosfield, 2003; Amarowicz y col, 2004). Están localizados principalmente en la testa y juegan un papel importante en el sistema de defensa de las semillas que están expuestas a daño oxidativo debido al medio ambiente. (Troszýnska y col, 2002).
Los taninos son compuestos fenólicos de peso molecular intermedio (más de 30,000 Da), son moléculas altamente hidroxiladas y pueden formar complejos insolubles con carbohidratos y proteínas, son los responsables de la astringencia en los alimentos debido a la precipitación de las enzimas de la saliva. Se clasifican en dos grupos: hidrolizables y no hidrolizables o condensados. Los primeros constan de unidades de ácido gálico que por condensación dimérica forman ácido hexahidroxidifénico (galoil) que se esterifica como poliol, contienen principalmente 18 unidades de glucosa que puede condensarse a otra molécula galoil y así formar polímeros de alto peso molecular, además pueden ser hidrolizados por acción química o enzimática. Los no hidrolizables, llamados también proantocianidinas, son polímeros de alto peso molecular y estructuralmente más complejos, formados por unidades de catequina (flavan-3-ol) con una molécula leucoantocianidina (flavan-3,4-diol) como precursor, condensados entre el carbón 4 del heterociclo y el carbón C6 y C8 de 18 unidades adyacentes (Parr y Bolwell, 2000). En los alimentos se encuentran predominantemente los taninos condensados, mientras que los hidrolizables sólo en cantidades traza. Una gran variedad de alimentos de origen vegetal contienen taninos, tés, vinos, frutas y granos (manzanas, plátanos, uvas, ciruelas, peras, duraznos, fresas, sorgo, mijo, haba, cebada, chícharos, algarrobo, y otras leguminas, entre las que destaca por su importancia alimentaria el frijol común).
Además de los efectos negativos de los taninos en la precipitación de proteínas ó en la inhibición en forma no competitiva de la actividad enzimática de celulasa, pectinasa, amilasa, lipasas, enzimas proteolíticas, ß-galactosidasa, así como enzimas microbianas que participan en la fermentación de cereales, también los taninos pueden reducir la biodisponibilidad de iones metálicos como Fe, Ca y Zn y de vitamina B12 y afectar la mucosa del tracto gastrointestinal alterando la excreción de ciertos cationes, proteínas y aminoácidos esenciales endógenos (Chung y col, 1998). Otro efecto negativo asociado al consumo de alimentos ricos en taninos es la incidencia de cánceres del esófago, hígado, etc. Al investigar este efecto en animales de laboratorio utilizando extractos de taninos (fruto del betel y té de hierbas) se observó el desarrollo de tumores, lo que sugirió el posible efecto carcinogénico; sin embargo, otros reportes indicaron que la actividad carcinogénica puede estar relacionada a componentes asociados a taninos, más que a ellos en sí ya que se han visto asociaciones negativas entre el consumo de té y la incidencia de cáncer (Chung y col, 1998), esto debido a que dichos compuestos han presentado efectos anticancerígenos, antimutagénicos y antimicrobianos (Chung y col, 1998; Parr y Bolwell, 2000).
Los efectos antes mencionados se deben al carácter antioxidante de los taninos que protege a los componentes celulares del daño oxidativo al reducir el nivel de radicales libres, así como la peroxidación y la inhibición de compuestos inductores de tumores. Además presentan gran efectividad contra bacterias, hongos, levaduras y virus por la formación de complejos con enzimas o sustratos indispensables para los microorganismos. También presentan un mecanismo de toxicidad que actúa en las membranas inhibiendo el sistema de transporte electrónico o la formación de complejos insolubles con nutrientes y iones metálicos, reduciendo así la disponibilidad y por tanto la capacidad de sobrevivencia de los microorganismos.
Los taninos son los principales componentes de la cascarilla de frijol, han sido reportados en todos los colores de semilla, desde el negro, rojo, café, amarillo, crema e inclusive en el blanco; sin embargo, no está muy clara la relación entre el contenido de taninos y la actividad antioxidante de éstos. Inicialmente se asociaba una mayor actividad en los frijoles negros y más coloridos, contradictorio a lo reportado por Beninger y col, (2003) que encuentra la mayor actividad antioxidante en frijol blanco.
Es necesario incrementar los estudios en lo que respecta al papel que los taninos juegan en la alimentación ya que por un lado ofrecen beneficios preventivos a la salud, anticarcinógenos o antimutágenicos y por otro lado, pueden estar involucrados en la promoción de cáncer o actividad antinutricional, seguramente la dosis es la que marca el destino final o la acción.
Antocianinas y Antocianidinas
Las antocianinas constituyen uno de los mayores grupos de pigmentos naturales y son responsables de muchos de los colores de frutas, vegetales y flores (Rivas-Gonzalo, 2003; Strack y Wray, 1993). En años recientes numerosos estudios han sido llevados a cabo para caracterizar los perfiles de las antocianinas de diferentes productos naturales, entre ellos los frijoles (Phaseolus vulgaris), principamente para usar este tipo de compuestos fenólicos como una alternativa a los colorantes sintéticos usados en la industria alimenticia (Harbone y Grayer, 1988; Hong y Wrolstad, 1990). Dichos compuestos son una atractiva alternativa debido a su alta solubilidad en agua (Macz-Pop y col, 2006), la cual facilita su incorporación en diferentes productos; sin embargo, presentan inconvenientes en cuanto a la estabilidad debido a que en solución son afectadas por la luz, los cambios de pH y especialmente por su combinación con dioxido de azufre utilizado como conservador en los alimentos (Brouillard, 1982; Coutalte, 1986; Harbone y Grayer, 1988).
Las antocianinas integran una larga familia de flavonoides incluyendo cerca de 4000 miembros, son por mucho las moléculas mas bioactivas que llevan consigo los efectos fisiológicos más fuertes que ningún otro compuesto vegetal, son pigmentos de tejidos epidermales que imparten el color rojo, azul y morado a las plantas y a los alimentos, las principales fuentes son las frutas y vegetales rojos y morados (arándanos, zarzamoras, betabel, etc.), así como el vino tinto (Clifford, 2000).
De acuerdo al pH las antocianinas pueden estar en forma no colorida o colorida y se encuentran en forma de mono y diglucósidos principalmente. Las antocianinas y las antocianidinas (agliconas de las antocianinas) han despertado el interés de los científicos, mostrando principalmente estudios "in vitro" de los efectos benéficos para la salud. Existen muchos reportes en los cuales se demuestran propiedades antinflamatorias, vasotónicas y antioxidantes de las antocianidinas y su respectiva aglicona. (Cardador, Loarca y Domah, 2002; García, de Pascual-Teresa, Santos-Buelga y Rivas-Gonzalo, 2004; Tsuda y col, 1994; Wang y col, 1997, Clifford, 2000). Ellas además pueden jugar un papel importante en la prevención de enfermedades degenerativas como el cáncer, Alzheimer o enfermedades cardiovasculares (Markham y Bloor, 1998).
La dosis recomendada de ingesta de antocianinas es de 180 a 215 mg diarios (Clifford, 2000). Sin embargo, para la mayor parte de la población Mexicana estas fuentes no están disponibles, por lo que se sugiere que 100 g de frijol negro puede aportar altas cantidades (340 mg) de antocianinas en la dieta (Clifford, 2000).
La presencia de antocianinas en frijol sólo ha sido descrita para frijol negro y rojo (Takeoka y col, 1997; Beninger y col, 2003; Choung, 2003; Romani y col, 2004). Inicialmente sólo se habían identificado malvidina 3-glucósido, petunidina 3-glucósido y delfinidina 3,5-diglucósido, extraídas de frijol negro. Sin embargo con el desarrollo de técnicas y equipos más eficientes se ha logrado identificar en frijol negro cultivado todas las agliconas de las antocianinas (antocianidinas) como la delfinidina, petunidina, cianidina, malvidina, pelargonidina, y peonidina (Takeoka y col, 1997; Romani y col, 2004; Salinas-Moreno y col, 2005).
Las antocianidinas tienen una solubilidad limitada en agua, son rápidamente destruidos por álcalis y son fotolábiles. Además tienen un tiempo de vida muy corto en relación con sus derivados glicosilados. Debido a esta inestabilidad las antocianidinas aparecen raramente en la naturaleza (Dao, Takeota, Edwards y Berrios, 1998) y hasta este momento no se ha descrito la presencia de estos compuestos en otros productos o en ninguna otra fuente natural.
Figura 1. Estructura de las antocianidinas (1-5)
Muchos autores han determinado y cuantificado las antocianidinas en diferentes productos. Siempre se han analizado las antocianidinas por hidrólisis ácida del material base ya que nunca aparecen naturalmente en los alimentos solamente en sus derivados glicosilados (Merken, Mermen y Beecher, 2001; Nyman y Kumpulainene, 2001).
En 1998 Dao y col, determinó que las agliconas de la delfinidina, petunidina y malvidina en una solución metanólica ácida desaparecen completamente después de 48 horas a temperatura ambiente, o después de cuatro días en refrigeración. La estructura casi plana de las antocianidinas con una deslocalización electrónica extendida, contribuye a la posible formación de muchos complejos moleculares estables.
Hasta el momento se han caracterizado alrededor de 600 antocianidinas, de las cuales la cianidina y la delfinidina son las más interesantes. (NSN 2000. 5(6):231-4). Estudios recientes han señalado que las cianidinas encontradas en muchas fuentes frutales presentan "una función de potente antioxidante in vivo" en animales japoneses. (Tsuda, 2000). Otra fuente afirma que la cianidina es cuatro veces más poderosa que la vitamina E. (Rice-Evans, 1995)
En el caso de los estudios realizados en animales se señala que las cianidinas protegen la membrana celular lipídica de la oxidación de una amplia variedad de sustancias dañinas (Tsuda, 1998).
Investigadores franceses utilizaron antocianinas sobre aortas animales y norepinefrina, que constriñe los vasos sanguíneos y demostraron que la delfinidina relaja la aorta en un 89% mientras que otra antocianina llamada malvidina fue inefectiva. Los investigadores concluyeron que la delfinidina puede estar relacionada con la reducción de casos de mortalidad por cuestiones cardiovasculares, por medio de la ingesta de vino, frutas y vegetales en la dieta (Andriambeloson, 1998).
En el laboratorio también se ha encontrado que las antocianinas inhiben algunos tipos de células tumorosas. La cianidina y la delfinidina inhiben el receptor de factor de crecimiento epidérmico en células cancerosas, mientras que malvidina es menos efectiva (Meiers, 2001).
Después de la ingestión de las antocianinas, las antocianidinas podrían ser el metabolito inmediato. Esto es debido a que la enzima B-glucosidasa encontrada en las bacterias intestinales puede hidrolizar fácilmente a las antocianinas (glicósidos) a antocianidinas (agliconas) (Tsuda y col, 1994).
Las antocianidinas más comunes presentes en plantas superiores son cianidina, delfinidina, malvidina, pelargonidina, peonidina y petunidina, las cuales se encuentran distribuidas en la naturaleza en un 50, 12, 12, 12, 7 y 7%, respectivamente (Kong y col, 2003).
Se dice que el número de grupos hidróxilo y metóxilo en el anillo B de las antocianidinas influencian fuertemente la inhibición del crecimiento de líneas celulares de cáncer (Kong y col, 2003).
Las antocianidinas en comparación con las antocianinas inhibieron preferencialmente el crecimiento de líneas celulares de carcinoma de vulva humano A431, estando sobrexpresado el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Meiers y col, 2001).
En Estados Unidos se realizaron pruebas de antocianinas y antocianidinas sobre líneas de células de cáncer humano, las cuales fueron, AGS (estomago), HCT-116 (colon), MCF-7 (seno), NCI H460 (pulmón), y SF-268 (Sistema Nervioso Central) a 12.5-200 ug/mL. Las antocianinas probadas no inhibieron la proliferación celular de las líneas celulares probadas a 200 ug/mL. Sin embargo, las antocianidinas si mostraron actividad inhibitoria en la proliferación celular (Kang, 2003).
La delfinidina, cianidina y petunidina inducen apoptosis de las células HL-60 detectadas por cambios morfológicos y fragmentación del DNA, mientras que la pelargonidina no muestra dicha inducción de apoptosis (Hou y col, 2003).
La pelargonidina inhibió el crecimiento celular de AGS, HCT-116, NCI H460, MCF-7 y SF-268 en un 64, 63, 62, 63, y 34% respectivamente, a 200 ug/mL. Igualmente a 200 ug/mL, la cianidina, delfinidina y petunidina inhibieron el crecimiento de las células de cáncer de seno en un 47, 66 y 53%, respectivamente (Zhang y col, 2005).
La pelargonidina también ha demostrado que tiene la propiedad de proteger al aminoácido tirosina del altamente reactivo oxidante peroxinitrilo. (Tsuda, 2000) Se cree que la nitración del peroxinitrito de los residuos de tirosina de enzimas y proteínas es la principal causa del daño en el cerebro en enfermedades neurodegenerativas y traumas cerebrales. La tirosina nitrada bloquea los sitios receptores del nervio del factor de crecimiento previniendo el nuevo crecimiento neural e inhibiendo el reparo. Es previniendo esta nitración de la tirosina que la antocianina pelargonidina puede ayudar a proteger contra enfermedades neurológicas (Joseph, 1999).
Las antocianinas también tienen propiedades antinflamatorias que evitan el daño provocado al colágeno del sistema nervioso. Con esta habilidad protegen tanto los vasos sanguíneos largos como los pequeños del daño oxidativo derivado de múltiples efectos. Existen varias vías en que las antocianinas realizan esta protección, una es neutralizando las enzimas que destruyen el tejido conectivo, otra es porque su capacidad antioxidante previene el daño que los oxidantes puedan hacer al tejido conectivo. Experimentos con animales han mostrado que la ingesta de suplementos con antocianinas efectivamente previenen la inflamación y subsecuentemente el daño a los vasos sanguíneos (Bertuglia y col, 1995).
A pesar de la importancia del consumo de frijol en el mundo, los datos relacionados con la composición de antocianinas de estas leguminosas es escaso. El primer trabajo en este respecto fue elaborados por Feenstra en 1960 (Mazza y Miniati, 1993), describiendo la presencia de los 3 – glicosidos corresponidnetes de malvidina, petunidina, delfinidina y el 3, 5 – diglucosido de delfinidina en frijol Phaseolus vulgaris L. Otros autores reportan resultados similares, pero detectando cantidades pequeñas de otras antocianinas, como los 3 – monoglucosidos y 3, 5 – diglucosidos de cianidina y pelargonidina (Takeota y col, 1997). La mayor parte de los estudios coinciden indicando que las principales antocianinas son siempre delfinidina 3 – glicosido (Choung, y col, 2003; Romani y col, 2004). Hay importantes diferencias dependiendo de la variedad analizada, como por ejemplo en Phaseolus lunatus L., la principal antocianina es peonidina 3 – glicosido, seguido de peonidina 3 – rutinosido (Yoshida y col, 1996).
Una característica importante de la planta de frijol es que sus raíces cuentan con la propiedad de interactuar con microorganismos benéficos de la rizósfera del suelo, que le permiten a la planta en desarrollo obtener más fácilmente los nutrientes necesarios, aún en suelos pobres. Dentro de la población de microorganismos que participan en este evento se encuentran hongos y bacterias, entre las que destacan las bacterias fijadoras de nitrógeno y las promotoras del crecimiento (PGPRs) y los hongos micorrícicos arbusculares.
Las PGPR´s representan una amplia variedad de bacterias del suelo, que al ser crecidas en asociación con una planta hospedera estimulan el crecimiento de dicha planta. Actualmente el término biofertilizante permanece poco claro, pero comúnmente se refiere al uso de microorganismos del suelo para incrementar la disponibilidad e ingesta de nutrientes minerales para las plantas. El modo de acción de las PGPR´s como biofertilizantes es ayudando directamente a proveer nutrientes a la planta hospedera, o indirectamente por influencia positiva en el crecimiento de las raíces o por brindar otras relaciones simbióticas benéficas. No todas las PGPR´s son biofertilizantes. Muchas estimulan el crecimiento de las plantas ayudándolas a controlar a los organismos patógenos. (Whipps, 2001; Zehnder y col, 2001).
La manera en la cual un PGPR mejora los niveles nutricionales de la planta hospedera puede ser categorizada en cinco áreas: (1) fijación biológica de N2, (2) incremento de la disponibilidad de nutrientes de la rizósfera, (3) inducción del incremento de la superficie de área de la raíz, (4) mejorando otras simbiosis benéficas en la planta hospedera y (5) por combinación de los diferentes modos de acción (Vessey, 2003).
Dentro de los efectos de los biofertilizantes PGPR´s es común ver que se produzca un sinergismo o se promuevan los efectos benéficos de una tercera parte de los microorganismos de la rizósfera. En estos casos, cuando los PGPR´s logran esa relación planta-simbionte se les da el nombre de bacterias "ayudantes". La vasta mayoría de estudios que investigan a los PGPR´s como ayudantes de otras relaciones planta-simbionte incluyen tanto la simbiosis entre leguminosas y rizobia o la simbiosis entre planta y hongo (Vessey, 2003).
Los biofertilizantes de PGPR´s algunas veces mejoran indirectamente el crecimiento de la planta al estimular la relación entre la planta hospedera y los hongos rizosféricos benéficos del suelo, como lo son los hongos micorrícicos arbusculares (AM). Al igual que los PGPR´s. estos hongos AM son bien conocidos por ayudar a mejorar la ingesta de varios nutrientes del suelo (especialmente fósforo) (Bethlenfalvay, 1993; Marschener, 1998; Ness y Vlek, 2000; Tobar, 1994). Existen estudios que señalan el hecho de que una coinoculación entre estos hongos con algunos PGPR´s produce un incremento en la relación entre la planta y el simbionte fúngico (Vessey, 2003).
Se mencionó anteriormente que un biofertilizante es definido como una sustancia que contiene microorganismos vivos que cuando son añadidos a las semillas, a la superficie de la planta, o al suelo, se coloniza la rizosfera o el interior de la planta y promueve el crecimiento por incremento del aporte o disponibilidad de nutrientes primarios de la planta hospedera. Esta definición está basada en la lógica del término biofertilizante es un diminutivo del término fertilizante biológico. Como la biología es el estudio de los microorganismos vivos, un biofertilizante debe contener organismos vivos los cuales incrementen el nivel de nutrientes de la planta hospedera mientras exista una asociación con la planta. Esta definición separa el término biofertilizante con el de fertilizante orgánico, el cual contiene compuestos orgánicos los cuales directamente o por descomposición, incrementan la fertilidad del suelo (Vessey, 2003).
Tampoco el término biofertilizante debe ser usado para referirse a la composta, fertilizantes a base de suplementos orgánicos químicos, etc, Como se define, los biofertilizantes deben contener microorganismos vivos, los cuales promueven el crecimiento de la planta mejorando el nivel de nutrientes en la planta. Sin embargo, no todos los biofertilizantes serán PGPR´s. Existen hongos rizosféricos como los hongos micorrícicos arbusculares (Bethlenfalvay, 1993) y Penicillium bilaii (Vessey y Heisinger, 2001) ampliamente conocidos por promover efectos de crecimiento en las plantas incrementando los niveles de nutrientes de la planta hospedera.
Estudios recientes han reportado que esto tipos de interacciones producen un aumento en la concentración de ácidos fenólicos en tomate (licopeno y caroteno) y albahaca (ácidos rosmarínico y caféico) los cuales son una buena fuente de antioxidantes naturales (Toussaint, y col, 2007).
Respuesta Fisiológica de las plantas a la colonización Micorricica
Arbuscular
Como ya hemos mencionado anteriormente, las plantas interactúan con una gran variedad de microorganismos los cuales pueden tener un efecto perjudicial o benéfico (directo o indirecto) sobre su crecimiento y desarrollo. La asociación mutualista entre las plantas superiores y los hongos formadores de micorriza arbuscular mejora el crecimiento de la planta simbiótica particularmente bajo condiciones poco favorables de crecimiento (Gerdemann, 1964; Kotari y col, 1991; Suramanian y col, 1995; Ruíz-Lozano y Azcon, 1995). Bajo condiciones de baja fertilidad en el suelo, el efecto positivo de la micorriza arbuscular está basado principalmente en el aumento de la asimilación de nutrimentos preponderantes de fósforo (Gerdemann 1964; McArthur y Knowles, 1993; Gavito y Varela, 1995), aunque la respuesta significativa de crecimiento de plantas con alta disponibilidad de nutrimentos indica el involucramiento de mecanismos fisiológicos no nutricionales.
En los últimos años se ha incrementado el número de reportes referentes a que la colonización micorrícica arbuscular puede (independientemente del estado de fósforo en la planta hospedera) aumentar la tasa de transpiración, la conductancia estomacal y la tasa fotosintética (Ruiz-Lozano y Azcon, 1995).
Brown y Bethlenfalvay (1987) evaluaron la fotosíntesis de plantas de soya (Glycine max L. cv. hobbit) en respuesta a diferentes condiciones de simbiosis (i) MA, (ii) Bacterias fijadores de nitrógeno, (iii) MA + bacterias fijadoras de nitrógeno y (iv) control (sin MA ni bacterias fijadoras de nitrógeno) pero suplementado con N y P para compensar la tasa de crecimiento. Los cuatro tratamientos registraron valores estadísticamente iguales de biomasa seca, pero las plantas con micorriza registraron mayor tasa fotosintética y área foliar y menor concentración de fósforo en el follaje, asociando estos valores con la nutricion fosforada (o la presencia de hongos MA).
Un año más tarde, los mismos investigadores (utilizando los mismos tratamientos), evaluaron la eficiencia fotosintética en las plantas con micorriza y vieron un efecto aditivo del hongo MA y la bacteria fijadora de N en la fijación de CO2.
Bethlenfalvay y col. (1989) evaluaron la respuesta fisiológica, morfológica y nutricional de sistemas Glycine max – Bradyrhizobium inoculados con aislados micorrícicos de tres zonas climáticas árida (AR), semiárida (SA) y una zona mésica (ME) y un control sin hongo micorrícico, observando diferencias consistentes entre el tratamiento inoculado con el aislado AR y el resto de los tratamientos. La fotosíntesis y la actividad del nódulo fue mayor en todos los tratamientos con micorriza y únicamente el tratamiento inoculado con el aislado AR registró mayor eficiencia fotosintética en base al uso del agua que el tratamiento control.
Fay y col. (1996) evaluaron el efecto de MA sobre el crecimiento y fotosíntesis de cebada sembrada bajo cinco niveles de fósforo (50, 100, 200, 400 y 800 mg P/kg). El porcentaje de infeccion MA fue bajo y su valor disminuyó a medida que se incrementó el nivel de fósforo aplicado. La fotosíntesis y la eficiencia en el uso de N y P fueron mayores en las plantas con micorriza fertilizadas con el nivel más bajo de fósforo.
Ruiz-Lozano y Azcon (1995) evaluaron el efecto de dos hongos MA (Glomus fasciculatum y Glomus deserticola) y un control sin MA (pero suplementado con P) y tres niveles de humedad sobre la fotosíntesis en plantas de lechuga (Lactuca sativa L.). G. fasciculatum incrementó significativamente la fotosíntesis y la eficiencia en el uso del agua, G. deserticola fue más eficiente para asimilar nutrimentos como N, P y K.
La simbiosis MA es reconocida por sus múltiples efectos positivos sobre el crecimiento de las plantas y su importante contribución en el mantenimiento de la fertilidad del suelo, la mayor y más rápida asimilación de nutrimentos (McArthur y Knowles, 1993), el aumento de la tolerancia al estrés hídrico de plantas colonizadas (Subramanian y col, 1995), la protección contra fitopatógenos (Sharma y col, 1992), mejoramiento de la estructura del suelo (Tisdall y col, 1997), la expresión de genes (Murphy y col, 1997) y la modificación en el contenido de proteínas y del perfil de polipéptidos (Arines, et al, 1993) son los mecanismos por medio de los cuales la simbiosis MA modifica (positivamente en la mayoría de los casos) el comportamiento fisiológico de las plantas colonizadas, sobre todo bajo condiciones poco favorables para su crecimiento y desarrollo.
Para la realización de este proyecto se eligieron los materiales de frijol comercial mas consumidos en la República Mexicana donde se determinó que la demanda de frijol en México depende de las raíces culturales y regionales, destacándose la siguiente tendencia:
En el noroeste, los frijoles claros.
En el norte, el frijol pinto.
En el centro, el flor de mayo y flor de junio.
En el sur, el frijol negro.
(Sagarpa, 2004)
Es por lo anterior que los cinco materiales comerciales elegidos fueron los frijoles Peruano, Texano, Flor de Mayo, Negro Jamapa y Negro Michigan, los cuales fueron adquiridos en un centro comercial y cuya marca es de las mas consumidas por la población.
Peruano
Proveniente de los estados de Nayarit, Sonora y Sinaloa. Es un frijol grande, de forma oval, muy grueso y color amarillo pálido. Se vende principalmente en Jalisco y Nuevo León.
Pinto Texano
Es un frijol grande, de forma oval, de color beige y con muchas manchas color café, viene de Chihuahua, Durango y Zacatecas.
Flor de Mayo
Se cultiva en Zacatecas y Guanajuato, de tamaño mediano a grande, su forma va de oval a romboide abultado, es de color beige claro con manchas lilas, es el segundo frijol claro preferido en el país.
Negro Jamapa
Proviene de Nayarit, es pequeño, de forma oval y aplanado, es de color negro opaco, y es de los preferidos en la Ciudad de Mexico
Negro Michigan
Regularmente viene de Zacatecas y Durango o de Estados Unidos, es un frijol de tamaño mediano, de forma oval, abultada y su color es negro brillante, se consume principalmente en la ciudad de México, el sureste y el Golfo.
Las semillas de frijol fueron sembradas bajo 3 tratamientos diferentes. El primero recibió condiciones normales en su siembra. El segundo se inoculó con una bacteria promotora del crecimiento (PGPR) y el tercero se inoculó con un hongo micorrícico arbuscular (HMA), posteriormente se determinó la producción del frijol, el peso y la longitud de la semilla, analizando el efecto de cada inoculación.
Cepas microbianas
1) Bacteria Promotora del crecimiento (PGPR): Bacillus subtilis
2) Hongo Micorrícico Arbuscular (HMA): Glomus mosseae
Tratamientos
Para cada material comercial de frijol se utilizaron 45 macetas con una capacidad de 5 litros y el suelo con el que se rellenaron fue una mezcla de arena/limo previamente bromurada en una proporción 3:1, Se necesitaron 15 macetas en cada tratamiento (frijol-control, frijol-Bacillus y frijol-Glomus), siendo en total 3 tratamientos por material comercial de frijol.
1) Cada una de las 75 macetas destinadas al tratamiento con la bacteria promotora del crecimiento Bacillus subtilis, se inocularon con 10ml de una infusión PDA (Papa-Dextrosa-Agar) de estas bacterias con una concentración de 10-7 UFC/ml.
2) Las 75 macetas utilizadas para el tratamiento con hongo micorrícico fueron inoculadas con 100gr de suelo con esporas de Glomus moseae con una concentración de 13 esporas por gramo de suelo.
3) En el caso de las 75 macetas utilizadas como control, estas no recibieron ningún tratamiento antes de la siembra de los frijoles.
Los riegos fueron constantes de 2 a 3 veces por semana
Siembra-Cosecha
Dentro del invernadero, cada maceta de una manera azarosa se sembró con 3 semillas de cada material de frijol en los 3 diferentes tratamientos (15 repeticiones cada uno) y cada maceta fue etiquetada debidamente. Después solo se dejaron 2 plantas de frijol por maceta.
El riego de agua se realizó tres veces por semana a partir de la germinación de la semilla.
A los 30 días desde la siembra, las macetas inoculadas con la bacteria Bacillus subtilis fueron reinoculadas bajo las mismas especificaciones del día de la siembra.
A los 90 días se aplicó una dosis de fertilización con la solución Long Ashton con 11 ppm de fósforo para las macetas inoculadas con hongo micorrícico Glomus mosseae y 22 ppm de fósforo para las inoculadas con Bacillus subtilis y la plantas control. Ésta misma fertilización se repitió a la semana siguiente, fortaleciendo a las plantas en su etapa de floración.
Producción total de frijol
Al término de la cosecha de cada planta, se cuantificó la totalidad de vainas y frijoles obtenidos en cada variedad comercial de frijol, posteriormente se determinó el peso de la producción total.
Peso de frijoles cosechados
Se determinó el peso de 100 semillas de cada variedad de fríjol utilizando una báscula analítica Sartorius tipo 1574, posteriormente se determinó la longitud de las semillas.
Longitud de la semilla
El 10 % de la producción total de cada material comercial obtenido fue separado para determinar la longitud de la semilla de frijol, dichas semillas se tomaron de una manera azarosa y la medición correspondiente fue realizada con ayuda de un Vernier Mitutoyo Digital.
Procesamiento de la semilla
Para llevar a cabo los análisis posteriores fue necesario almacenar las semillas a una temperatura de 4 oC. Después fueron secadas durante 36 horas a una temperatura de 37 oC y a continuación se prosiguió a moler las semillas de frijol, en un molino Analytical Mill A-10 Tekmar. La harina de cada material comercial de frijol fue cernida en un tamiz # 40 y se mantuvo en refrigeración hasta su análisis, protegiéndola de la luz.
B.1 POLIFENOLES
Obtención de los extractos para el análisis de fenoles totales
Para llevar a cabo la extracción de los compuestos fenólicos totales se llevó a cabo lo siguiente, se pesaron 200 mg de harina de cada muestra de frijol en tubos Eppendorf, se les adicionó 1 mL de metanol al 80 % y se dejaron en agitación a 80 rpm, durante toda la noche. Después se centrifugaron las muestras a 13,000 g durante 10 min. y el sobrenadante fue separado. El residuo sólido fue resuspendido de nuevo en 1 mL de metanol 80 % y se mantuvo en agitación por dos horas más y se centrifugó de nuevo. Los dos extractos obtenidos en cada muestra se combinaron y se protegieron de la luz. Posteriormente se almacenaron a 4 °C hasta su análisis.
Determinación de fenoles totales
Para llevar a cabo la extracción de los compuestos fenólicos totales se realizó lo siguiente, se pesaron 200 mg de harina de cada muestra de frijol en tubos Eppendorf y se adicionó 1 mL de metanol 80 %, después las muestras de dejaron en agitación a 350 rpm, durante toda la noche (8 horas). Transcurrido este tiempo los tubos fueron centrifugados a 12,500 g durante 15 min a una temperatura de 4 oC y el sobrenadante fue separado. El residuo sólido fue resuspendido de nuevo en 1 mL de metanol 80 % y se mantuvo en agitación por dos horas más y se centrifugó de nuevo. Los dos extractos obtenidos en cada muestra se combinaron y se protegieron de la luz. Posteriormente se almacenaron a 4 oC hasta su análisis.
La determinación de los fenoles totales en cada muestra de harina de frijol, se llevó a cabo por triplicado de acuerdo al método de Folin-Ciocalteu descrito por Singleton y Rossi en 1965. Para esto se tomaron 50 µL del extracto total (obtenido siguiendo las indicaciones del párrafo anterior) y se le adicionaron 200 µL de agua desionizada y 250 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu (50 % v/v). Esta mezcla se agitó vigorosamente y después de 3 min se adicionaron 500 µL de Na2CO3 (7.5 % w/v) y de nuevo se agitó vigorozamente. Después las muestras fueron incubadas a 45 °C por 15 min y al concluir este periodo de tiempo, las muestras se centrifugaron 5min y posteriormente se midió la absorbancia a cada muestra a una longitud de onda de 760 nm. Estas determinaciones fueron realizadas mediante el uso del espectrofotómetro Beckman DU 640. Para llevar a cabo los cálculos se preparó una curva de calibración con ácido gálico y otra de (+) catequina y la concentración fue expresada en miligramos equivalentes de ácido gálico o catequina por gramo de harina de frijol, respectivamente.
Determinación de taninos condensados
La determinación de los taninos condensados al igual que la determinación de los fenoles totales, se realizaron por triplicado, pero en este caso la metodología utilizada fue la propuesta por Deshpande y Cheryan en 1987, llamado el método de la vainillina-HCl. Para llevar a cabo dicho método se comenzó con la extracción de dichos compuestos de la manera que se describe a continuación. A 100 mg de cada muestra de harina de frijol se le adicionó 1 mL de metanol acidificado al 1 %, manteniendo una agitación constante durante 8 h. Al concluir este tiempo las muestras se centrifugan a 13,000 g durante 10 min.
Después se tomaron 166 µL de dicho extracto y se le adicionaron 834 µL del reactivo de vainillina al 0,5 %. Después se agitó vigorosamente y enseguida se incubó a 30 °C durante 20 min. La absorbancia fue leída a 500 nm usando un espectrofotómetro Beckman DU 640. Con el fin de corregir la interferencia de los pigmentos naturales del frijol, fue necesario preparar un blanco elaborado con cada muestra de harina de frijol junto con todos los reactivos descritos, menos con el reactivo de vainillina. También se preparó una curva de calibración de (+) catequina para realizar los cálculos y el contenido de taninos fue expresado como miligramos equivalentes de (+) – catequina por gramo de harina de frijol.
Determinación de antocianinas totales
En el caso de la determinación de las antocianinas totales, estas se realizaron por triplicado mediante el método descrito por Abdel-Aal y Hucl en 1999. Para esto se obtuvo un extracto etanólico a partir de 100 mg de harina de frijol donde se adicionaron 5 mL de etanol-HCl 1 N (85:15 v/v) precedido por una agitación vigorosa. El pH de esta solución obtenida se ajustó a pH 1 con HCl 4 N. La mezcla fue agitada durante toda la noche y posteriormente se centrifugó por 15 min a 13,000 g. El sobrenadante se introdujo en un matraz volumétrico de 10 mL y se aforó con etanol acidificado y por último se midió la absorbancia a una longitud de onda de 535 nm. Para realizar los cálculos de cada muestra se utilizó el coeficiente de extinción molar (25,965 cm-1 M-1) y el peso molecular de la cianidina 3 – glucósido (C3G) (449,2) y los resultados fueron expresados como miligramos de cianidina 3 – glucósido por gramo de harina.
Determinación de antocianinas por HPLC
Los análisis de HPLC fueron realizados usando un equipo Hewlett Packard Serie 1050 de longitud de onda variable. Software Agilent Chem Station for LC3D 1990 – 2003 y una columna de separación EPS C – 18 (7 x 53 mm) Rocket GRACE/ALLTECH. El solvente A fue agua con ácido fórmico al 5 % y el solvente B fue acetonitrilo con ácido acético al 5 %. El volumen de inyección fue de 20 ul con un flujo de 1 mL/min a una absorbancia de 220 nm. Para la elución de las antocianidinas el gradiente lineal fue:
La detección de los compuestos se efectuó en base a los tiempos de retención de cada estándar utilizado.
Figura 2. Cromatograma típico obtenido por HPLC por una mezcla de estándares de antocianidinas
La concentración de cada antocianidina determinada se obtuvo en base a la curva de calibración obtenida para cada estándar.
Extracción e hidrólisis de antocianinas por HPLC
Para llevar a cabo la extracción de las antocianinas se siguió el protocolo descrito por Romani y col. (2004). Dichos extractos se obtuvieron a partir 500 mg de cada harina de frijol a los cuales se les adicionó 15 mL de metanol (70 %), dicha mezcla tuvo que ajustarse su pH a 2 con ácido fórmico y después fue puesta en agitación a 80 g durante 3 h. Este proceso se realizó tres veces sobre la misma muestra y todos los extractos fueron combinados y evaporados a sequedad con ayuda de un rotavapor, el residuo finalmente se resuspendió en 2 mL de H2O/CH3CN/MeOH/HCOOH (45:22,5:22,5:10 v/v/v/v).
Después de terminados los pasos anteriores se realizó la hidrólisis de las muestras para evitar la presencia de mezclas de glucósidos de antocianinas, Para esto se siguió el método de Takeoka y col. (1997) donde se señala que a 1 mL del extracto se le adiciona 1,0 ml de HCl 2N y se coloca en un baño de agua hirviendo por 60 min. y enseguida se enfrían los tubos en baño de hielo. Estos pasos fueron seguidos al pie de la letra y las antocianinas se extrajeron dos veces con 2 mL acetato de etilo (Baker) y se llevaron a sequedad en un rotavapor. Después se resuspendieron en 1 mL de ácido fórmico al 10 % para finalmente, centrifugar dicho extracto a 13,000 g durante 10 min. y se inyectó rápidamente en el HPLC para ser analizado.
B.2 PROTEÍNA SOLUBLE TOTAL
Extracción
Para llevar a cabo la extracción de proteína soluble total se pesaron 50 mg de harina de cada muestra y se disolvieron en 1ml de buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,2 (preparado a partir de Tizma-HCl SIGMA 1 M, pH 8,0 T-2694).
Se agitó cada muestra con vortex y después las muestras fueron colocadas en baño de ultrasonido por 70 min, el agua del baño estuvo en recirculación constante a una temperatura entre 39 – 41 oC y las muestras fueron mezcladas con vortex cada 10 min. Se hicieron dos extracciones independientes para cada muestra.
Pasados los 70 min, todos los tubos fueron centrifugados a 18000 g por 30 min a 8 oC. Después el sobrenadante fue separado.
Ensayo en Microplato para Proteina DC
Para llevar a cabo la determinación de proteína soluble total presente en cada muestra, fue necesario realizar una curva de calibración estándar de proteína. El reactivo utilizado fue Albúmina de suero bovino para electroforesis con una concentración mínima de 98 % (BIO-RAD 500-0116/CAS 9048-46-8)
Dicha curva de calibración se realizo pesando 15 mg de Albúmina diluyéndola en 10 ml de agua desionizada (1500 ug/ml) y se hicieron las diluciones correspondientes en agua desionizada para obtener soluciones con concentraciones de 1200 ug/ml, 900 ug/ml, 600 ug/ml, 300 ug/ml, 100 ug/ml, 30 ug/ml y 10 ug/ml.
Después se procedió al tratamiento de cada muestra, para esto cada una se diluyó a una concentración 1:100 (5 ul muestra + 495 ul de agua desionizada) y a partir de esta dilución se tomaron 5 ul cada muestra y cada solución estándar y fueron puestos en orden dentro de un plato de microtitulación limpio para su análisis posterior.
Cuando la última muestra fue depositada en el microplato, inmediatamente que se añadieron 25 ul del Reactivo A en todos los pocillos (Reactivo A para ensayo de proteína DC, BIO-RAD). Terminada la adición de dicho reactivo inmediatamente se añadió el Reactivo B de la misma manera en cada uno de los pocillos. (Reactivo B para ensayo de proteína DC, BIO-RAD). Se agitó el microplato suavemente y después de 15 min se determinó la absorbancia de cada uno de los pocillos a una longitud de onda de 630 nm en el equipo ELx 808IV Ultra Microplate Reader (BIOTEC Instruments) (Urbana, Illinois). Dicho análisis se realizó por triplicado.
Determinación del peso molecular de las proteínas por medio de SDS- PAGE
Para llevar a cabo la determinación del peso molecular de las principales proteínas presentes en cada muestra de harina de frijol, se utilizó la electroforesis SDS-PAGE, para esto fue necesario el uso de geles con una concentración en gradiente de 4 – 20% de poliacrilamida, dodecil-sulfato de sodio (BIO-RAD).
De cada muestra se aplicaron 50 ug de proteína en el gel. Para esto fue necesario utilizar los resultados de la cantidad total de proteína soluble presente en cada extracto y a partir de ellos se hicieron los cálculos correspondientes para conocer el volumen de carga.
Las siglas asignadas a cada material de frijol son las siguientes, NMC, negro Michigan control, NMB, negro Michigan-Bacillus, NMG, negro Michigan-Glomus, NJC, negro Jamapa-control, NJB, negro Jamapa-Bacillus, NJG, negro Jamapa-Glomus, FMC, Flor de mayo-control, FMB, Flor de mayo-Bacillus, FMG, Flor de mayo- Glomus, PC, Peruano-control, PB, Peruano-Bacillus, PG, Peruano-Glomus, TC, Texano-control, TB, Texano-Bacillus, TG, Texano- Glomus.
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