Producción de Frijol en México (página 3)

A partir de esto se tomaron solo 10 ul del extracto diluido (50 ug de proteína) y se mezclaron con 10 ul de buffer de carga preparado a partir de 950 ul de buffer Laemmli (BIO-RAD) mezclado con 50 ul de 2 – mercaptoetanol con pureza mínima de 98 % (SIGMA).

Dichas mezclas (muestra-buffer de carga) de cada muestra se agitaron con vortex e inmediatamente se introdujeron en agua hirviendo durante 4 min, pasado este tiempo se volvieron a agitar con vortex y se centrifugaron unos segundos (aproximadamente 5 seg), terminado este procedimiento, los 20 ul totales de cada muestra fueron cargados en los geles junto con estándares de peso molecular. Los estándares utilizados fueron, Kaleidoscope (estándar de Polipéptidos, BIO-RAD) y el estándar Broad Range biotinilado para SDS-PAGE (BIO-RAD), de estos, solo se utilizaron 5 ul de cada uno para cada gel.

El buffer que se añadió dentro de la cámara electroforética fue realizado a partir de 100 ml de buffer 10x Tris/Glicina/SDS diluidos en 900 ml de agua desionizada. El voltaje aplicado fue de 200 volts durante 30 min.

Pasado este tiempo el gel fue separado de la cámara de electroforesis e introducido en solución fijadora de péptidos preparada con 50 % agua desionizada, 40 % de metanol y 10 % acido acético, aquí los geles permanecieron sumergidos durante 30 min en agitación suave.

Terminado dicho periodo la solución fijadora fue desechada y después se les añadió a los geles solución Coomassie (Bio Safe, BIO-RAD) donde permanecieron tiñéndose durante toda la noche con agitación suave.

A la mañana siguiente, la solución de Coomassie fue desechada y después se les añadió a los geles solución para desteñido, dicha solución fue preparada con 90 % agua desionizada y 10 % de acido acético. Aquí permanecieron los geles durante 20 min y después se desecho la solución y los geles se lavaron con agua desionizada por 3 veces. Los geles permanecieron dentro del agua antes de ser analizados en el equipo Kodak Image 440 (Urbana, Illinois) donde fueron fotografiados y analizados. Los geles fueron elaborados por triplicado.

Los patrones electroforéticos de las diferentes muestras fueron comparados considerando la presencia e intensidad de las proteinas. Los resultados obtenidos fueron analizados estadisticamente con ANOVA, representando con las letras a, b y c las diferencias encontradas.

Todos los análisis realizados en este trabajo se procesaron utilizando el software STATGRAPHICS Versión 5.1 y se realizaron los análisis de varianza correspondientes.

• Resultados

Nuestro estudio realizado en invernadero se llevó a cabo mediante la siembra de cinco materiales genéticos de frijoles comerciales ampliamente consumidos en la República Mexicana (Texano, Flor de Mayo, Negro Jamapa, Negro Míchigan y Peruano); cada uno fue sembrado en suelo de arena y limo (3:1) bajo tres tratamientos distintos. De las plantas control y las inoculadas con Bacillus subtilis y Glomus mosseae se hicieron 30 repeticiones de cada uno para cada frijol utilizado, obteniendo 450 plantas distribuidas azarosamente dentro del invernadero. Después de tres meses se llevó a cabo una fertilización con solución Long Ashton a todas las plantas, repitiéndose dicha aplicación ocho días después. Ambas aplicaciones tuvieron una concentración de fósforo de 11 ppm para el tratamiento con Glomus y 22 ppm para el tratamiento con Bacillus y 22 ppm para las plantas control.

Cabe mencionar que las plantas más verdes, gruesas, altas y fuertes fueron obtenidas en el tratamiento con Glomus (datos no mostrados). Posteriormente se cosecharon las vainas, se secaron y los frijoles se colectaron, este material se proceso para las determinaciones posteriores.

Tabla 1. Efecto agronómico de microorganismos benéficos del suelo (G: Glomus mosseae y B: Bacillus subtilis) en cinco frijoles comerciales (T, Texano; FM, Flor de Mayo; NJ, Negro Jamapa; Negro Michigan; P, Peruano) consumidos en la República Mexicana. Promedios con error estándar y ANOVA; n = 30. NS = No significativo, * = Significativo en un nivel de 5%, ** = Significativo en un nivel de 1% y *** = Significativo en un nivel de 0,1%.

La cantidad de vainas por planta no presentó diferencias significativas en cuanto al tipo de frijol, pero si se observaron diferencias altamente significativas en las plantas tratadas con Bacillus y Glomus, observándose un incremento de número de vainas con respecto al control hasta de un 166% en el tratamiento con Glomus.

Al determinar la cantidad de frijoles por vaina se observaron diferencias significativas tanto en el tipo de frijol como en el tratamiento aplicado, obteniéndose un incremento en el número de frijoles por vaina en los tratamientos con Bacillus subtilis y Glomus moseae con respecto a las vainas obtenidas en las plantas control.

En cuanto a la producción en número de frijoles por planta, se obtuvieron diferencias significativas entre tratamientos, observándose un incremento máximo de 130% en el tratamiento con Bacillus y del 343% en el tratamiento con Glomus.

En el caso de la longitud de la semilla no se obtuvieron diferencias significativas ni por el tipo de frijol, ni por el tratamiento recibido; sin embargo, entre sus valores se distinguen los frijoles Flor de Mayo y Peruano que oscilan entre los 12 y 13 mm con respecto al frijol Texano; cuyos valores se encuentran entre los 10 y 11 mm y a los frijoles negros cuyas longitudes están entre los 8 y 9 mm.

En cuanto al peso unitario de la semilla de cada material genético de frijol, fue significativamente diferente en cuanto al tipo de tratamiento aplicado, el tratamiento con Glomus fue el que obtuvo los valores más elevados en todos los frijoles.

En el rendimiento económico, de la misma manera que en el peso unitario, se obtuvieron diferencias significativas en base al tratamiento brindado a la planta, sobresaliendo Glomus con valores entre 131 – 467% con respecto al tratamiento control.

Por otro lado, una muestra de los frijoles colectados de cada uno de los tratamientos se molió para determinar la concentración de proteína y de diferentes compuestos polifenólicos de carácter nutracéutico. Entre los que se consideraron los fenoles totales de los grupos del ácido gálico y las catequinas, así como los taninos y las antocianinas. Los resultados obtenidos se encuentran expresados en la tabla 2.

Tabla 2. Efecto de microorganismos benéficos del suelo (G: Glomus mosseae y B: Bacillus subtilis) en la concentración de compuestos nutracéuticos y proteínas (mg/g) en cinco frijoles comerciales (T, Texano; FM, Flor de Mayo; NJ, Negro Jamapa; Negro Michigan; P, Peruano) consumidos en la República Mexicana. Promedios con error estándar y ANOVA; n = 3. NS = No significativo, * = Significativo en un nivel de 5%, ** = Significativo en un nivel de 1% y *** = Significativo en un nivel de 0,1%.

La concentración en milígramos por gramo en la harina de frijol de fenoles del grupo del ácido gálico (GAE)/g y de antocianinas presentes en la Tabla 2, no presentaron diferencias significativas entre los materiales genéticos analizados, ni entre los tratamientos utilizados. En el caso de los fenoles totales del grupo de las catequinas se obtuvieron diferencias altamente significativas entre los materiales genéticos de frijol, sin embargo, los tratamientos con Bacillus y Glomus no tuvieron ningún efecto sobre la concentración de catequinas.

Los taninos sólo presentaron diferencias significativas en cuanto al tipo de frijol a un nivel de confianza de 95%, mostrando el frijol peruano los valores más bajos.

En los frijoles Texano y Negro Míchigan se observó un ligero incremento en la concetración de taninos en los tratamientos con Bacillus.

Para la concentración de proteínas se encontraron diferencias significativas en los diferentes materiales genéticos de frijol y en sus tratamientos. Sin embargo, en los materiales inoculados con Bacillus y Glomus hubo disminuciones en el contenido de proteina por gramo, en rangos entre 4 – 27% y 4 – 50%, respectivamente, con excepción del frijol Texano, donde el tratamiento con Bacillus generó un aumento de 8% en la concentración de proteina.

Al analizar el contenido de estos compuestos expresados en miligramos por frijol (Tabla 3), observamos que la concentración de fenoles totales del grupo del ácido gálico y las antocianinas no presentan diferencias significativas entre los materiales genéticos estudiados; sin embargo, para las concentraciones de fenoles totales del grupo de las catequinas, los taninos y las proteínas, existen diferencias significativas a un nivel de confianza por encima del 95%

Tabla 3. Efecto de microorganismos benéficos del suelo (G: Glomus mosseae y B: Bacillus subtilis) en la concentración de compuestos nutracéuticos y proteínas (mg/frijol) en cinco frijoles comerciales (T, Texano; FM, Flor de Mayo; NJ, Negro Jamapa; Negro Michigan; P, Peruano) consumidos en la República Mexicana. Promedios con error estándar y ANOVA; n= 3. NS = No significativo, * = Significativo en un nivel de 5%, ** = Significativo en un nivel de 1% y *** = Significativo en un nivel de 0,1%.

En cuanto a los tratamientos, las concentraciones de fenoles totales del grupo del ácido gálico y las antocianinas presentan diferencias significativas del 95 y 99%, respectivamente, obteniendo un incremento máximo de 50% en la concentración de ácido gálico en el tratamiento Glomus.

En el caso de las antocianinas, los tratamientos con Bacillus y Glomus no generaron incrementos en los frijoles Texano y Flor de Mayo. Sin embargo, en los frijoles Negro Jamapa, Negro Michigan y Peruano, estos tratamientos produjeron incrementos en la concentración de antocianinas hasta del 70%.

En los fenoles totales del grupo de las catequinas, los taninos y las proteinas no se observaron diferencias significativas ente los tratamientos. Sin embargo, se observaron ligeros incrementos entre los resultados obtenidos en los tratamientos con Glomus y Bacillus.

Tabla 4. Efecto de microorganismos benéficos del suelo (G: Glomus mosseae y B: Bacillus subtilis) en la concentración de compuestos nutracéuticos y proteínas (mg/planta) en cinco frijoles comerciales (T, Texano; FM, Flor de Mayo; NJ, Negro Jamapa; Negro Michigan; P, Peruano) consumidos en la República Mexicana. Promedios con error estándar y ANOVA; n= 3. NS = No significativo, * = Significativo en un nivel de 5%, ** = Significativo en un nivel de 1% y *** = Significativo en un nivel de 0,1%.

Al analizar el contenido de los compuestos nutracéuticos y las proteínas en miligramos por planta (Tabla 4) observamos que la concentración de antocianinas no presentan diferencias significativas entre los materiales genéticos de frijol estudiados, pero para las concentraciones de fenoles totales del grupo del ácido gálico y catequinas, los taninos y las proteínas existen diferencias significativas con niveles de confianza superiores al 95%.

En cuanto a los tratamientos de cada material, todas las variables analizadas presentan diferencias altamente significativas, donde destacan los resultados obtenidos en el tratamiento con Glomus.

Los resultados obtenidos con Glomus señalan que la concentración de fenoles totales aumenta de 2,2 a 5,8 veces, los taninos de 2,2 a 5,1 veces, las antocianinas hasta 5,3 veces y las proteinas de 2,3 a 4,4 veces con respecto a sus controles.

En cuanto a los valores obtenidos con el tratamiento Bacillus se encontró que las concentraciones de fenoles totales aumentan hasta de 2,9 veces, los taninos hasta 5,6 veces (excepto en Negro Jamapa), las antocianinas hasta el doble (en los frijoles Flor de Mayo y Negro Michigan) y las proteinas hasta 2,3 veces (excepto Negro Jamapa y Negro Michigan).

Para cuantificar el contenido de diferente antocianidinas se realizaron análisis por el método de HPLC obteniendo los resultados presentes en la Tabla 5.

Tabla 5. Efecto en la concentración de las antocianidinas: cianidina, delfinidina, petunidina y pelargonidina (mg/g) por microorganismos benéficos del suelo (G: Glomus mosseae y B: Bacillus subtilis) en cinco frijoles comerciales (T, Texano; FM, Flor de Mayo; NJ, Negro Jamapa; Negro Michigan; P, Peruano) consumidos en la República Mexicana. Promedios con error estándar y ANOVA; n=3. NS = No significativo, * = Significativo en un nivel de 5%, ** = Significativo en un nivel de 1% y *** = Significativo en un nivel de 0,1%.

La determinación de la antocianidina cianidina resultó positiva en los frijoles Texano, Flor de Mayo, Negro Jamapa y Negro Michigan. Al analizar la concentración en miligramos por gramo de harina de frijol se obtuvieron diferencias significativas en cuanto al material genético estudiado en un nivel de confianza de 99,9% y en la interacción entre frijol y tratamiento en un nivel de confianza de 99%.

Aunque no exisiten diferencias entre los tratamientos, en los niveles de cianidina se observó un ligero aumento en los frijoles Texano y Flor de Mayo en los tratamientos con Bacillus y Glomus, mientras que hay una ligera disminución en los frijoles Negro Jamapa y Negro Michigan.

La delfinidina y petunidina se encontraron unicamente en los frijoles Negro Jamapa y Negro Michigan y no se presentaron diferencias significativas entre sus resultados; sin embargo, se observó una tendencia a aumentar la concentración de petunidina en los frijoles Negro Jamapa – Bacillus y Negro Michigan – Glomus.

En cuanto a la pelargonidina, esta fue encontrada en los frijoles Texano y Flor de Mayo, encontrando diferencias altamente significativas según el tipo de material genético pero no encontraron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos.

Tabla 6. Efecto en la concentración de las antocianidinas: cianidina, delfinidina, petunidina y pelargonidina (mg/frijol) por microorganismos benéficos del suelo (G: Glomus mosseae y B: Bacillus subtilis) en cinco frijoles comerciales (T, Texano; FM, Flor de Mayo; NJ, Negro Jamapa; Negro Michigan; P, Peruano) consumidos en la República Mexicana. Promedios con error estándar y ANOVA; n=3. NS = No significativo, * = Significativo en un nivel de 5%, ** = Significativo en un nivel de 1% y *** = Significativo en un nivel de 0,1%.

Al analizar la concentración de cianidina en miligramos por semilla de frijol, se encontraron diferencias altamente significativas entre los materiales, los tratamientos y las interacciones entre frijol y tratamiento. La concentración más alta de cianidina se encontró en el frijol Flor de Mayo – Glomus, siendo 3,5 veces mayor con respecto al control. En el caso de los frijoles Flor de Mayo – Bacillus, Texano – Glomus, Texano – Bacillus y Michigan – Glomus, los incrementos fueron del doble con respecto a sus controles. Sin embargo, de manera contraria en el frijol Negro Jamapa – Bacillus, Negro Jamapa – Glomus y Negro Michigan – Bacillus ambos tratamientos mostraron disminuciones en la concentración de cianidina.

La delfinidina y petunidinas se encontraron unicamente en los frijoles Negro Jamapa y Negro Michigan y no presentaron diferencias significativas entre sus concentraciones.

La pelargonidina fue encontrada en los frijoles Texano y Flor de Mayo encontrando diferencias altamente significativas entre los materiales pero no entre sus tratamientos.

Tabla 7. Efecto en la concentración de las antocianidinas: cianidina, delfinidina, petunidina y pelargonidina (mg/planta) por microorganismos benéficos del suelo (G: Glomus mosseae y B: Bacillus subtilis) en cinco frijoles comerciales (T, Texano; FM, Flor de Mayo; NJ, Negro Jamapa; Negro Michigan; P, Peruano) consumidos en la República Mexicana. Promedios con error estándar y ANOVA; n=3. NS = No significativo, * = Significativo en un nivel de 5%, ** = Significativo en un nivel de 1% y *** = Significativo en un nivel de 0,1%.

Al analizar la concentración en miligramos de cianidina obtenida en la producción total de la planta se encontraron diferencias significativas entre los materiales, los tratamientos y la interacción frijol – tratamiento, obteniendo niveles de confianza de 99, 99,9 y 95%, respectivamente.

Los resultados obtenidos en la tabla 7 señalan como el tratamiento con Glomus en el frijol Flor de Mayo aumenta hasta 15 veces la concentración de cianidina con respecto a su control. Así mismo, los frijoles Texano – Glomus y Negro Michigan – Glomus aumentaron la concentración de cianidina 5 y 6 veces, respectivamente. Los aumentos en la concetración de cianidina observados con Bacillus fueron de 5 veces en el frijol Flor de Mayo, mientras que en el frijol Texano – Bacillus se duplicó.

La delfinidina y la petunidina obtuvieron diferencias entre los tratamientos con niveles de confianza de 99 y 95 %, respectivamente; sin embargo, la delfinidina producida por las plantas de frijol Negro Jamapa y Negro Michigan presentó disminuciones en el tratamiento con Bacillus pero generó aumentos en el tratamiento con Glomus de 159 y 429%, respectivamente.

La petunidina encontrada en los frijoles Negro Jamapa y Negro Michigan, presentó un aumento en la concentración de 33 y 100% en los tratamientos Bacillus y Glomus, a diferencia del frijol Negro Míchigan, donde se presentó una disminución de 25% en el tratamiento con Bacillus, pero un aumento de 6 veces con el tratamiento Glomus.

En cuanto a la pelargonidina, esta obtuvo diferencias significativas entre los materiales, los tratamientos y la interacción frijol – tratamiento con niveles de confianza de 99,9, 99 y 95%, respectivamente. En los frijoles Texano y Flor de Mayo se encontraron aumentos en el tratamiento con Bacillus de 4 y 207%, respectivamente y de 141 y 530% en el tratamiento con Glomus.

Los geles obtenidos por SDS-PAGE para determinar el peso molecular de las proteínas de los materiales de frijol se presentan en las figuras 3 y 4.

Figura 3. Fotografía gel SDS-PAGE. La concentración de proteina que se cargó en cada carril fue de 50 ug. Los marcadores utilizados fueron el Kaleidoscope Polipeptide Std y Biorad Broad Range. Las siglas asignadas a cada material de frijol son, NMC, negro Michigan control, NMB, negro Michigan-Bacillus, NMG, negro Michigan-Glomus, NJC, negro Jamapa-control, NJB, negro Jamapa-Bacillus, NJG, negro Jamapa-Glomus, FMC, Flor de mayo-control, FMB, Flor de mayo-Bacillus.

Figura 4. Fotografía gel SDS-PAGE. La concentración de proteina que se cargó en cada carril fue de 50 ug. Los marcadores utilizados fueron el Kaleidoscope Polipeptide Std y Biorad Broad Range. Las siglas asignadas a cada material de frijol son, FMG, Flor de mayo- Glomus, PC, Peruano-control, PB, Peruano-Bacillus, PG, Peruano- Glomus, TC, Texano-control, TB, Texano-Bacillus, TG, Texano- Glomus.

Los patrones electroforéticos de las diferentes muestras fueron comparados considerando la presencia e intensidad de las proteinas. Figuras 5 y 6.

Figura 5. Detección de las bandas principales encontradas en cada muestra. La detección se realizó con el densitómetro presente en el equipo Kodak Image 440 (Urbana, Illinois). Los marcadores utilizados fueron el Kaleidoscope Polipeptide Std con rango entre 36,4 y 3,8 kDa y Biorad Broad Range con rango entre 200 y 6,5 kDa. Las siglas asignadas a cada material de frijol son, NMC, negro Michigan control, NMB, negro Michigan-Bacillus, NMG, negro Michigan-Glomus, NJC, negro Jamapa-control, NJB, negro Jamapa-Bacillus, NJG, negro Jamapa-Glomus, FMC, Flor de mayo-control, FMB, Flor de mayo-Bacillus.

Figura 6. Detección de las bandas principales encontradas en cada muestra. La detección se realizó con el densitómetro presente en el equipo Kodak Image 440 (Urbana, Illinois). Los marcadores utilizados fueron el Kaleidoscope Polipeptide Std con rango entre 36,4 y 3,8 kDa y Biorad Broad Range con rango entre 200 y 6,5 kDa. Las siglas asignadas a cada material de frijol son, FMG, Flor de mayo- Glomus, PC, Peruano-control, PB, Peruano-Bacillus, PG, Peruano- Glomus, TC, Texano-control, TB, Texano-Bacillus, TG, Texano- Glomus.

Tabla 8. Peso molecular de las bandas encontradas en los geles SDS-PAGE en cada uno de los cinco materiales genéticos comerciales de frijol.

Los patrones electroforéticos de las diferentes muestras fueron comparados considerando la presencia e intensidad de las proteinas. Los resultados se obtuvieron por medio del análisis estadístico ANOVA. Las letras a, b y c representan las diferencias significativas entre los frijoles y sus tratamientos.

Análisis del perfil electroforético de proteinas extraidas en cada material de frijol en sus diferentes tratamientos

En los geles presentados en las figuras 5 y 6 se observan las similitudes y las diferencias de los perfiles de proteínas presentes en cada material genético de frijol, observando 13 bandas en los frijoles Flor de Mayo y Peruano, 12 bandas en el frijol Texano y 11 bandas en los frijoles negros Michigan y Jamapa.

El análisis estadístico ANOVA señaló que las intensidades en 9 de 13 bandas presentes en el frijol Peruano, son mayores y diferentes significativamente a las que presentan el mismo peso molecular en los demás materiales. Estas proteinas son las de PM = 109, 89, 50, 32, 27, 23, 10.5, 7.5 y 3 kDa. Sin embargo sólo la banda # 20 de PM = 3, presentó un aumento en la intensidad observada en los tratamientos con Bacillus y Glomus.

En el caso de la intensidad de las bandas presentes en el frijol Texano, sólo existieron valores superiores y con diferencias significativas en 4 de las 12 bandas presentes. Sin embargo, no existieron diferencias entre los tratamientos.

El frijol Flor de Mayo presentó disminuciones con diferencias significativas en los tratamientos con Bacillus y Glomus en 9 de sus 13 bandas, estas son las proteinas de PM = 113, 89, 83.5, 63.5, 50, 39, 17, 10,5 y 1 kDa. En las 4 bandas sin mencionar, no existieron diferencias significativas en ninguno de los 3 tratamientos.

La intensidad de la banda de PM = 17 kDa en el frijol Negro Jamapa, presentó diferencias significativas superiores a las observadas en los frijoles Negro Michigan y Flor de Mayo. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos. Por otra parte, la intensidad en las bandas de PM = 27 y 10.5 kDa presentaron una disminución en los tratamientos con Bacillus y Glomus. En la banda de PM = 39 kDa la intensidad del tratamiento control fue igual a la obtenida en el tratamiento con Glomus, pero ambos superaron significativamente la intensidad obtenida en el tratamieto con Bacillus.

Los resultados obtenidos en el frijol Negro Michigan señalan que el tratamiento con Glomus presenta valores superiores y diferentes significativamente en 8 de sus 11 bandas. Lo anterior se observa en las bandas de PM = 113, 89, 63.5, 39, 27, 17, 10.5 y 1 kDa, donde sólo la banda de PM = 1 tuvo una intensidad significativamente mayor a la obtenida en los frijoles Negro Jamapa y Flor de Mayo.

• Discusión

Las variables agronómicas determinadas en nuestro estudio muestran los efectos producidos en plantas y semillas de frijol comercial por medio de la inoculación con Bacillus subtilis y Glomus mosseae.

En los materiales de frijol, las variables que presentan diferencias significativas son el número de frijoles por vaina y el número de frijoles por planta, debido a que estas características varían en cada material; sin embargo el número de vainas por planta, la longitud de la semilla, el peso unitario y el peso de la producción total mantienen los mismos valores entre los materiales estudiados ya que los frijoles comerciales deben mantener características de producción similares para cubrir con la demanda conservando el mismo margen de ganancia a los productores.

El número de vainas por planta, frijoles por vaina, frijoles por planta, peso unitario y peso de producción total presentaron diferencias ampliamente significativas en cuanto al tratamiento aplicado debido a que los microorganismos benéficos del suelo (Bacillus subtilis y Glomus mosseae) permiten a la planta en desarrollo obtener más fácilmente los nutrientes necesarios aún en suelos pobres. (Vessey, 2003). Estudios realizados por Mena-Violante (2006), Baset (2005) y Kaya (2003) observaron efectos similares en chile ancho, plátano y sandía, respectivamente, aumentando la calidad y el rendimiento en las cosechas.

El tratamiento con Bacillus generó ligeros aumentos en las variables mientras que el tratamiento con Glomus duplicó el número de vainas, triplicó el número de frijoles y quintuplicó el peso de la producción total. La diferencia de respuesta entre ambos tratamientos se debe a que Glomus aumenta el área de superficie de la raiz permitiendo a la planta absorber mayor cantidad de nutrientes que el tratamiento con Bacillus.

También en ambos tratamientos los frijoles presentaron una forma más esférica y voluminosa que los obtenidos en los tratamientos control (datos no mostrados). Los mejores resultados los obtuvo el frijol Flor de Mayo en ambos tratamientos.

Al analizar la proteína y las variables nutracéuticas en los frijoles en unidades de mg/g no existen diferencias entre los tratamientos en las concentraciones de fenoles totales (ácido gálico y catequinas), taninos y antocianinas pero si existen en la concentración de proteínas; sin embargo, sólo el frijol Peruano con Bacillus aumentó su concentración en un 8%. En los demás materiales con Bacillus y Glomus la concentración de proteína disminuyó de manera contraria a lo obtenido por Achakzai (2003), donde obtuvo un incremento de proteína de 1,5% en semillas de soya inoculadas con Rhizobium.

Lo anterior puede deberse a que la ruta metabólica en la planta de frijol se enfocó principalmente a producir almidones en lugar de proteína, pues posiblemente la cantidad de nitrógeno añadida al suelo no fue suficiente para cubrir las necesidades de las plantas inoculadas y aumentar la concentración de proteína en las semillas.

Si expresamos los resultados en unidades de mg/frijol se demuestran diferencias significativas entre los tratamientos en los fenoles totales del ácido gálico y las antocianinas. La concentración de fenoles totales del ácido gálico aumentó en los materiales crecidos con Bacillus y Glomus mientras que las antocianinas aumentaron principalmente en los frijoles negros en el tratamiento con Glomus, esto debido a que los tratamientos con microorganismos mejoraron el volumen de la semilla generando una mayor área de superficie y por lo tanto, una cascarilla mas grande que los frijoles control, aumentando así la concentración de polifenoles, ya que los compuestos fenólicos en el frijol se encuentran principalmente en la cascarilla y su color está determinado por la presencia y concentración de estos compuestos (Takeoka y col, 1997; Beninger, y col, 1999; Choung y col, 2003). El frijol que presentó aumentos en ambos compuestos fue el frijol Negro Michigan en el tratamiento con Glomus generando aumentos en la concentración de fenoles totales del ácido gálico y antocianinas de 45% y 70%, respectivamente.

En los datos obtenidos en unidades de mg/planta existen diferencias significativas entre los tratamientos en todas las variables analizadas. El tratamiento con Bacillus disminuyó la concentración de taninos en el frijol Negro Jamapa, las antocianinas en los frijoles Texano, Negro Jamapa y Peruano y la concentración de proteína en los frijoles Negro Jamapa y Negro Michigan. Sin embargo, el tratamiento con Glomus generó aumentos en la producción de fenoles totales, taninos, antocianinas y proteinas en todas las plantas; esto debido a que la asociación mutualista entre planta y hongo micorrícico arbuscular mejora el crecimiento de la planta simbiótica particularmente bajo condiciones poco favorables de crecimiento (Gerdemann, 1964; Ruíz-Lozano y Azcon, 1995) donde el efecto positivo de la micorriza se basa principalmente en el aumento de la asimilación de nutrimentos (Gerdemann, 1964; Gavito y Varela, 1995). El tratamiento con Glomus generó el mayor aumento en la concentración de fenoles totales, taninos y proteínas en el frijol Flor de Mayo, mientras que en los frijoles negros Jamapa y Michigan esto sucedió en la concentración de antocianinas.

Existen reportes que avalan la presencia de delfinidina, cianidina, petunidina y pelargonidina en la testa de las semillas de frijol común (Rocha-Guzmán y col, 2007). En nuestros materiales se encontró que estas antocianidinas son específicas en cada frijol. La cianidina en los frijoles Texano, Flor de Mayo, Negro Jamapa y Negro Michigan. La delfinidina y petunidina en los frijoles Negro Jamapa y Negro Michigan y la pelargonidina en los frijoles Texano y Flor de Mayo. En el frijol Peruano no se detectó ninguna de ellas.

Aunque los tratamientos con Bacillus y Glomus presentan ligeros incrementos en la concentración de antocianidinas en unidades de mg/g, no existen diferencias significativas entre los tratamientos en ninguna de ellas (cianidina, delfinidina, petunidina y pelargonidina); sin embargo, la concentración de cianidina en unidades de mg/frijol si presenta diferencias significativas entre los tratamientos. En el frijol Texano con Bacillus el aumento fue de 100%, en Texano con Glomus 148%, en Flor de Mayo con Bacillus 120%, Flor de Mayo con Glomus 250% y en Negro Michigan con Glomus 76%, mientras que los frijoles Negro Jamapa (Bacillus y Glomus) y Negro Michigan (Bacillus) presentaron disminuciones.

El hecho de que el nivel de antocianinas totales en los frijoles negros aumentara en los tratamientos con Bacillus y Glomus pero al analizar la cianidina por HPLC se disminuyó la concentración con respecto al control, puede ser debido a que los aumentos se presentaron en otros compuestos no determinados en nuestro estudio.

Al analizar los resultados en base a la producción de frijol por planta, se obtienen diferencias significativas entre los tratamientos en las cuatro antocianidinas determinadas. Las diferencias se encontraron en su mayoría en los tratamientos con Bacillus y Glomus, destacando una vez más el hongo micorrícico Glomus mosseae por generar los mejores resultados en todos los materiales. En cambio, el tratamiento con Bacillus generó aumentos de cianidina y pelargonidina en los frijoles Texano y Flor de Mayo pero en los frijoles negros disminuyó la concentración de cianidina, delfinidina y petunidina.

Con lo anterior se corrobora que aún cuando las condiciones del suelo son pobres, Glomus además de ayudar a la planta a generar aumentos en la producción de vaina y semilla, también genera mayor concentración de polifenoles; sin embargo al no contar la planta con un suministro de nutrientes en el suelo durante la etapa de producción de semilla, es posible que en la etapa de coloración de la testa (cubierta de los frijoles), no se alcanzaron los valores obtenidos en las semillas control, ya que en las plantas control la producción de vaina y follaje es muy baja y el resto del desarrollo va enfocado a esas pocas semillas (su contenido protéico) y a la generación de polifenoles en la testa, a diferencia de las plantas inoculadas con Glomus las cuales se enfocan hacia la generación de follaje y nuevas vainas con mayor número de frijoles.

El perfil electroforético de proteínas extraídas de los frijoles mostró variación en el número de bandas encontradas y entre sus pesos moleculares, observando 13 bandas en los frijoles Flor de Mayo y Peruano, 12 bandas en el frijol Texano y 11 bandas en los frijoles negros Michigan y Jamapa, ésto debido a que cada frijol presenta sus diferencias nutrimentales al igual que nutracéuticas; sin embargo, existen coincidencias en algunas de ellas, por ejemplo todas presentan la banda mas intensa con PM= 50 kDa conocida como faseolina, ésta comprende alrededor del 40% de la proteína total en la semilla (Ma y Bliss, 1978) (Aswathi, 1993) y es una de las principales proteínas de las leguminosas para la nutrición humana. Las bandas correspondientes a las subunidades de la faseolina se encuentran en el rango de 43-53 kDa (Carbonaro, 2006) y además se observan proteínas dentro del rango del grupo de las lectinas como las fitohemaglutininas (55-65 kDa), arcelinas (31-40 kDa) e inhibidores de a-amilasa (15-18 kDa) (Bernal y col, 2006).

El análisis estadístico ANOVA señaló que las intensidades en 9 de 13 bandas presentes en el frijol Peruano, son mayores y diferentes significativamente a las que presentan el mismo peso molecular en los demás materiales. Estas proteínas son las de PM = 109, 89, 50 (faseolina), 32 (arcelina), 27, 23, 10.5, 7.5 y 3 kDa. Sin embargo en 12 bandas no se obtuvieron diferencias entre los tratamientos, sólo la banda de PM = 3 presentó un aumento en la intensidad en los tratamientos con Bacillus y Glomus.

En el caso de la intensidad de las bandas presentes en el frijol Texano, sólo existieron valores superiores y con diferencias significativas en 4 de las 12 bandas presentes sin encontrar diferencias significativas entre los tratamientos.

Las intensidades obtenidas en el frijol Flor de Mayo presentan disminuciones con diferencias significativas en los tratamientos con Bacillus y Glomus en las proteínas de PM = 113, 89, 83.5, 63.5 (fitohemaglutinina), 50 (faseolina), 39 (arcelina), 17 (inhibidor de a-amilasa), 10,5 y 1 kDa lo que coincide con la cuantificación de proteína total, donde se presentó una disminución en estos tratamientos. En las 4 bandas sin mencionar no existieron diferencias significativas entre los tratamientos.

La intensidad de la banda de PM = 17 kDa en el frijol Negro Jamapa, presentó diferencias significativas superiores a las observadas en los frijoles Negro Michigan y Flor de Mayo. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos. Por otra parte, la intensidad en las bandas de PM = 27 y 10.5 kDa presentaron una disminución en los tratamientos con Bacillus y Glomus. En la banda de PM = 39 kDa (arcelina) la intensidad del tratamiento control fue igual a la obtenida en el tratamiento con Glomus, pero ambos superaron significativamente la intensidad obtenida en el tratamiento con Bacillus.

Las intensidades de las bandas obtenidas en el frijol Negro Michigan señalan que el tratamiento con Glomus presenta valores superiores y diferentes significativamente en 8 de sus 11 bandas. Lo anterior se observa en las bandas de PM = 113, 89, 63.5 (fitohemaglutinina), 39 (arcelina), 27, 17 (inhibidor de a-amilasa), 10.5 y 1 kDa, donde sólo la banda de PM = 1 tuvo una intensidad significativamente mayor a la obtenida en los frijoles Negro Jamapa y Flor de Mayo.

La comparación entre intensidades mostrada anteriormente sólo da idea de la concentración y las posibles proteínas presentes en los materiales. Es necesario realizar múltiples pruebas para determinar de manera exacta que proteínas se encuentran en cada material y cual es su concentración, por lo que estos datos no son concluyentes.

• Conclusiones

Los tratamientos con Bacillus subtilis y Glomus mosseae generaron aumentos en la producción de vainas y frijoles, así como semillas de mayor peso. El tratamiento con Glomus presentó los mejores resultados en todos los materiales, principalmente en los frijoles Flor de Mayo y Negro Michigan; se obtuvo la mayor producción de frijoles en el primero con un aumento de 343% y la mayor cantidad de frijoles por vaina en el segundo con un aumento de 48%.

La concentración de fenoles totales, taninos y antocianinas en unidades de mg/g no presentaron diferencias entre los tratamientos, solamente las proteínas (g/100g); sin embargo, sólo el frijol Texano con Bacillus generó aumentos en la concentración en un 8%.

Las concentraciones de fenoles totales (del grupo de las catequinas), taninos y proteinas en unidades de mg/frijol no presentaron diferencias entre los tratamientos, solamente los fenoles totales (del grupo del ácido gálico) y las antocianinas. El frijol Negro Jamapa con Glomus obtuvo los mejores resultados de fenoles totales (del grupo del ácido gálico) con un aumento de 50% y el frijol Negro Michigan con Glomus obtuvo los mejores resultados de antocianinas con un aumento de 70%.

Las concentraciones de fenoles totales, taninos, antocianinas y proteinas producidas por planta presentaron diferencias significativas entre los materiales y los tratamientos. Glomus destacó por generar mayores aumentos que Bacillus en todos los materiales. El frijol Flor de Mayo obtuvo los mayores incrementos, estos fueron de 478% en fenoles totales, 415% en taninos y 280% en proteínas. El frijol Negro Michigan con Glomus obtuvo la mejor concentración de antocianinas con un aumento de 429%.

Las concentraciones de las antocianidinas: cianidina, delfinidina, petunidina y pelargonidina en unidades de mg/g no presentaron diferencias entre los tratamientos. Sólo la cianidina presentó diferencias significativas al analizar las concentraciones en unidades de mg/frijol, el mejor resultado lo obtuvo el frijol Flor de Mayo con Glomus con un aumento de 250% con respecto al control.

Al analizar las antocianidinas en unidades de mg/planta todas obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos. Los valores más elevados los obtuvo el tratamiento con Glomus, destacando el frijol Flor de Mayo por generar un aumento de 1429% en la cianidina y de 530% en la pelargonidina. En el frijol Negro Michigan el aumento fue de 429% en la delfinidina y 540% en la petunidina.

Los materiales de frijol estudiados presentaron proteínas de diferentes pesos moleculares, destacando el frijol Flor de Mayo y Peruano por presentar el mayor número de bandas (13). Las bandas más intensas obtenidas en los geles de SDS-PAGE las obtuvo el frijol Negro Michigan en el tratamiento con Glomus en 8 de las 11 bandas obtenidas.

• Perspectivas

Al analizar de una manera práctica nuestros resultados podemos visualizar una futura aplicación de dichos conocimientos sobre el campo mexicano ya que de esta manera se ofrece una opción más económica para mejorar las cosechas de forma natural y amigable con el medio ambiente. El uso de biofertilizantes como los utilizados en este experimento le permiten a la planta obtener una mejor absorción de agua por la raíz a causa de los hongos micorrícicos (en este caso Glomus mosseae), disminuyendo el consumo de agua (Subramanian y col, 1995) y evitando el uso de plaguicidas y/o pesticidas (Sharma y col, 1992). Se obteniene así una semilla más segura, que no provoca daños en el suelo, ni en la planta que la debiliten y contaminen a las vainas y al ecosistema.

Sin embargo, aún queda la interrogante del efecto de los microorganismos sobre las rutas metabólicas de cada planta que la inducen a generar estos resultados, dando pauta hacia una nueva vía de investigación que podría enfocarse en realizar la inoculación de microorganismos en el suelo junto con diferentes concentraciones de nutrientes inofensivos para el medio ambiente. Analizando si existen aumentos en la cantidad de nutrientes y compuestos nutracéuticos en los frijoles biofertilizados con respecto a los controles se podría obtener una mayor producción, mejores rendimientos y un alimento más nutritivo y de mejor carácter nutracéutico.

Además sería interesante realizar un experimento en campo con un nuevo tratamiento que incluya la inoculación del hongo micorrícico y la bacteria promotora del crecimiento y analizar si existen efectos sinérgicos que potencien los efectos observados en los tratamientos por separado. Además se conocería la respuesta de los cultivos inoculados ante los factores del medio ambiente.

En los materiales colectados se podrían analizar a profundidad las proteínas presentes en cada frijol y la degradación de los compuestos nutracéuticos en el proceso de cocción del frijol y por exposición a la luz solar.

Con lo anterior se podría determinar que tipo de biofertilizantes y nutrientes deben aplicarse a cada cultivo para generar mejor calidad en la semilla y mayor rendimiento en la cosecha. También se conocerían los benefícios nutracéuticos y nutricionales especificos de cada variedad comercial para dirigir su consumo en base a las necesidades de cada individuo, dando conocimiento de la ingesta diaria recomendada y las especificaciones en el proceso de cocción de la semilla. De esta manera se obtendría el mayor beneficio en el consumo de estos valiosos íconos de la alimentación mexicana.

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Autor:

Jorge Arturo Barajas Moreno

jorgearturobarajasmoreno[arroba]hotmail.com