Debido a la incapacidad de los retrovirus para invadir las células que no se dividen, se han estudiado otros sistemas de cesión que no tengan esta limitación. Un ejemplo importante es el adenovirus, un virus con DNA con doble filamento utilizado a menudo en las preparaciones de vacunas. Igual que el retrovirus, el adenovirus puede aceptar un inserto que no supere los 7 u 8 Kb de longitud. Antes de su empleo en terapia génica se han de manipular los adenovirus para que tengan una replicación diferente.
En la actualidad se están utilizando adenovirus en estudios en los que el gen CFRT normal es administrado, por un método en aerosol, a las células epiteliales que revisten los pulmones (terapia génica in vivo). Se espera que este tratamiento logre alterar la actividad de los canales del cloro en los pacientes con fibrosis quística. Un inconveniente de los adenovirus es que no se integran en el DNA de la célula huésped.
Por lo tanto, finalmente se pierden, originando una expresión del gen transitoria y la necesidad de reintroducción del vector.
4.2.1.3 Terapia génica en enfermedades no hereditarias
Por ejemplo en el tratamiento del melanoma maligno se ha insertado ex vivo un gen codificador de factor de necrosis tumoral (TNF: tumor necrosis facto) en linfocitos que infiltran tumores. Aunque el TNF es toxico administrado por vía sistémica, se espera que los linfocitos que infiltran tumores, que tienen como objetivo natural los melanomas, dirijan de forma específica el TNF hacia los tumores y los destruyan.
La terapia génica se esta ensayando también en el tratamiento de la artritis reumatoide y su objetivo consiste en bloquear los efectos inflamatorios de la interleucina (IL-1). Se inserta un gen codificador de la proteína antagonista del receptor IL-1 (IRAP) en las células sinoviales que revisten las articulaciones, limitando así la inflamación causada por IL-1.
La terapia de células somáticas consiste en la alteración únicamente de las células somáticas especificas y, por lo tanto, difiere poco en principio de muchos otros tipos de intervención medica (P. Ej. los transplantes de medula ósea). En cambio, la terapia génica germinal implica la alteración de todas las células del cuerpo, incluyendo las que originan a los gametos. Por lo tanto, este tipo de terapia génica no solo afectaría al paciente sino también a todos sus descendientes.
La terapia de línea germinal se desarrollo por primera vez en ratones en 1983, cuando se introdujeron con éxito copias del gen de la hormona del crecimiento humano en embriones de ratones mediante microinyección (el gen se inserta directamente ene. Interior del embrión utilizando una pequeña aguja). En la minoría de embriones en los que se integró el gen también se produjo una modificación de los gametos y el gen de hormona del crecimiento humana se transmitió a las sgtes. Generaciones (los ratones alcanzaban un tamaño anormalmente grande).
Aunque en principio la terapia de línea germinal es posible en los seres humanos plantea importantes problemas. En primer lugar, los embriones inyectados suelen morir y algunos desarrollan tumores y malformaciones. En segundo lugar, incluso en un trastorno autosómico dominante, la mitad de los embriones serán genéticamente normales.
Si fuera posible distinguir los embriones genéticamente normales (P. Ej. mediante diagnósticos por PCR de productos fecundados in vitro), seria más fácil implantar los embriones normales que alterar los anormales. Por ultimo, existen numerosas cuestiones éticas asociadas con la alteración permanente de la herencia genética humana. Por estos motivos, parece improbable que la terapia de la línea germinal humana sea útil o deseable.
Existe una gran esperanza para pacientes afectados por alguna enfermedad puedan ser tratados por terapia génica, por la cual, se le sustituye un gen defectivo por un gen normal. Aún así, los obstáculos que supone la terapia génica son muy importantes.
Se necesita mucha información sobre la patología molecular de un desorden genético, antes de que los investigadores puedan decidir si este desorden es factible a la terapia génica, y si es así, también habría que tener en cuenta diferentes asuntos sociales y éticos.
El gen en cuestión debe ser clonado y además debe existir una manera segura de introducir el gen en las células. Los primeros experimentos en los que células tratadas genéticamente o manipuladas, y fueron introducidas en pacientes humanos comenzaron en 1.989, y las primeras pruebas clínicas sobre terapia génica, para las eficiencia de adenosina desaminasa, comenzaron el Septiembre de 1.990.
A continuación discutiremos las técnicas de terapia génica empleadas en las diferentes enfermedades humanas así como sus problemas y resultados.
Se han utilizado muchos experimentos en los que se usaron cultivos celulares para encontrar un camino eficiente para introducir genes humanos en células sin que sufran reordenamientos u otras alteraciones que puedan afectar a la expresión génica, es decir, que el gen introducido sea estable.
El gen para la fibrosis quística (CF) era un objetivo importante para la terapia génica. In vivo se habían descrito anormalidades en la conductancia en los canales de cloro, y una línea celular CF- expresaba el mismo defecto. Esta línea celular se utilizó en ensayos que intentaban estudiar la actividad del gen CF introducido en la célula. Uno de los vectores que más se han utilizado en la lucha contra la fibrosis quística ha sido el vector retroviral. Un ADNc para el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) era construido por el solapamiento de tres clones ADNc, y un ADNc completo era clonado en un vector retroviral.
Las células CF- eran infectadas por un vector retroviral que llevaba un gen CFTR, y la célula con el provirus integrado eran seleccionadas por su resistencia al G418. Las células expresaban el gen CFTR. Los datos más interesantes procedían de las medidas del grado de funcionamiento de los canales para el cloro.
El flujo aniónico de las células en respuesta a una estimulación por la adenilato ciclasa proporciona una conductancia para el cloro semejante. En ausencia de un determinado estimulador de la adenilato ciclasa, el flujo aniónico de las células CF- y de las células CF- que contienen el gen CFTR introducido se pierde. Si se le adiciona este determinado activador de la adenilato ciclasa, el flujo aumenta rápidamente en células CF- con CFTR , pero en las células CF- el flujo permanecía bajo. Se utilizaron técnicas electrofisiológicas para determinar si la conductancia para el cloro influía en ese flujo aniónico.
Estos experimentos mostraron que las corrientes de cloro se detectaban únicamente en las células CF- con CFTR. Significativamente, la respuesta de las células CF- con CFTR es comparable con las respuestas traqueales humanas normales y alienta la esperanzas de que la terapia génica para la fibrosis quística , usando vectores retrovirales directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de aerosoles, sea posible.
5.2 Fibroblastos de la piel utilizados en terapia génica
Un tipo de células que sirve como vehículo para transferir genes son los fibroblastos de la piel. Estas células han sido usadas en pacientes afectados de mucopolisacaridosis, que es una enfermedad hereditaria que se caracteriza por la deficiencia de enzimas lisosomiales.
Los fibroblastos se obtienen fácilmente crecen bien en cultivo, y pueden ser infectadas eficientemente con vectores retrovirales. Por ejemplo, las células de un paciente afectado por la enfermedad de Gaucher (deficiencia de glucocerebrosidasa) eran infectadas con un vector retroviral que contenía un ADNc de la glucocerebrosidasa. Los niveles de enzima en las células infectadas alcanzó el nivel de las células normales.
En el caso de la deficiencia de adenosina desaminasa, los fibroblastos de la piel infectados con un retrovirus que llevaba un ADNc de ADA producía más ADA que las células normales. Los investigadores calculan que se necesitan más de 4x10e8 fibroblastos tratados genéticamente para producir efecto terapéutico en pacientes.
Una cuestión importante sería conocer si los fibroblastos de la piel podrían sintetizar y secretar gran cantidad de una proteína que no es un producto normal de esa célula. Por ejemplo, ¿podría un fibroblasto de la piel tratado genéticamente ser usado para producir el factor IX en pacientes con hemofilia B?
Los fibroblastos humanos son infectados in vitro por un vector retroviral basado en un MoMLV, que contiene un ADNc del factor IX dirigida por un promotor intensificador de un citomegalovirus. Por radioinmunoensayo se determinó que estas células infectadas producían gran cantidad de factor IX. Este factor IX es completamente funcional e indistinguible del factor IX original del plasma.
Como conclusión, los últimos avances a la hora de perfeccionar las técnicas tanto en el cultivo de células de la piel como de producir vectores estables y fiables para expresar e introducir información genética en estas células, unidos a la relativa facilidad con que estos cultivos son transplantados , hacen suponer que, en años venideros, la piel será uno de los primeros y más atractivos sistemas para corregir enfermedades mediante terapia génica, contribuyendo así a la revolución de los métodos terapéuticos que esta nueva disciplina, sin duda, introducirá en la Medicina.
5.3 Terapia génica aplicada a hepatocitos
Otro tejido diana para la terapia génica es el hígado . Un gran número de enfermedades metabólicas hereditarias afectan al hígado, y el transplante de hígado ha sido utilizado para tratar estas enfermedades y otras como son la hipercolesterolemia y hemofilia. Estas técnicas se han desarrollado a partir de aislamiento y cultivo de hepatocitos.
Ejemplos de la utilización de estos hepatocitos es el estudio y tratamiento por terapia génica de la hipercolesterolemia en humanos. Esta es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), y aquellos pacientes que son homocigóticos para la mutación del gen de LDLR generalmente mueren por un ataque al corazón antes de los 20 años.
En este experimento los vectores retrovirales que llevan el gen para el LDLR humano se usan para infectar cultivos de hepatocitos. Se obtenían líneas celulares que eran capaces de degradar las lipoproteínas de baja densidad a un nivel más o menos normal. Hasta ahora este experimento sólo se ha utilizado en cultivos celulares ¡, aunque es uno de los más seguros a probar en individuos.
Un experimento que se quiere hacer en humanos y que ahora sólo se hace en ratones es transferir los genes alfa-1 antitripsina humanos (hAAT) y el gen beta-galactosidasa de E. coli a hepatocitos.
5.4 Linfocitos modificados genéticamente
Un sistema de entrega a células de melanomas malignos está siendo utilizada en experimentos clínicos. Los linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs) son linfocitos que se infiltran el tumores sólidos y que pueden matar células tumorales si se administran junto a la interleuquina 2 (IL-2),que es un factor decrecimiento de linfocitos. Cuando los TILs eran aislados de melanomas malignos, estimulados en su crecimiento en un cultivo tisular con IL-2, y se inyectaban de nuevo al paciente, en ocasiones producían la regresión del melanoma.
Para intentar conocer como los TILs trabajan in vivo, es importante conocer cuantos de los TILs transplantados sobreviven y si alcanzan los tumores. Una estrategia que se ha desarrollado para seguir los TILs inyectados al paciente es marcarlos con retrovirus. La primera vez que se hizo este experimento en células humanas genéticamente modificadas se utilizó un vector retroviral que llevaba el gen de resistencia a la neomicina.
Antes de que los experimentos clínicos comenzaran, se ha visto que los TILs eran eficientes y establemente infectadas con un vector, que eran muy resistentes al G418 y de que la integración retroviral no alteraba la característica de crecimiento de las células. Cinco pacientes fueron tratados con estos TILs. Se le retiró al tumor a cada paciente y los TILs se hicieron crecer en un cultivo con interleuquina-2 .
Las células infectadas con un vector retroviral en los que los genes gag, pol y env fueron sustituidos por el gen para la resistencia a la neomicina. El porcentaje de las células en las que el neogén se había integrado establemente era del 1-11%. Los pacientes recibieron al menos 10e11 TILs que procedían de sus propios tumores. Muestras de sangre tomadas en días siguientes fueron sometidas a la PCR, y se vio que los TILs modificados genéticamente que contenían el neogén estaban presentes en tres pacientes. Sesenta días después sólo se detectaba en dos pacientes. Aún así, se encontraron células que contenían el neogén en muestras de tejido tumoral, pero no está claro si estas células tomaron este neogén por suerte o por transferencia de un vector.
La conclusión que se sacó, es que los TILs son útiles para tratar células tumorales, pero todavía no se ha comprobado el rendimiento que puede sacarse de esta facultad ya que los resultados son contradictorios según diferentes pruebas.
5.5 Utilización de células hematopoyéticas en la expresión de células en animales
De la misma manera que el retrovirus actúa como un vector para transportar un gen a una célula, la célula puede ser considerada como un vector en el siguiente paso del proceso, que es transportar el gen al cuerpo del paciente.
¿Qué requisitos deben cumplir estas células? Deben ser fáciles de obtener, crecer bien en cultivo y de soportar la infección retroviral. Después de la infección, la célula vector debería ser fácil de devolver al paciente y debería continuar viva por varios meses, preferentemente por el bien del paciente. Las células de la médula poseen algunas de estas características. La médula contiene células stem que pueden dar lugar a todas las células de la serie hematopoyética. La infección de estas células stem hace que aparezcan diversas que contengan el gen terapéutico.
También se han utilizado las células de la médula para tratar enfermedades hematopoyéticas, en otras palabras, las técnicas para reconstruir la médula de los pacientes se está trabajando intensamente. Uno de los mayores inconvenientes de usar células de la médula como vectores celulares, es que tienen dificultad de producir altos niveles de expresión del gen introducido.
En uno de los experimentos, el gen intacto de la beta-globina humana con secuencias adyacentes en 3' y 5' son usadas en la construcción de retrovirus. El retrovirus que lleva el gen de la beta-globina se inyectaba en las células de la médula y posteriormente se vio que eritrocitos que procedían de estas células medulares llevaban beta-globina funcional.
5.6 Deficiencia de adenosina desaminasa (inmuno deficiencia combinada grave)
Se debe a un trastorno autosómico recesivo. Su deficiencia origina una disfunción intensa en las células T y B , que provoca la muerte de los pacientes antes de los dos años de edad por infección masiva. Se comenzó a estudiar su tratamiento por terapia génica en 1.990 para una mutación en el gen adenosina desaminasa. Los niños aquejados de este mal eran incapaces de iniciar una respuesta inmunitaria ante las infecciones y estaban abocados a una vida muy limitada, ( "niños burbuja"). Sin una especial atención morían irremediablemente.
Dos niños de cuatro y nueve años con deficiencia de ADA están recibiendo terapia génica. De los niños se aíslan linfocitos T, a los que se les introduce un gen ADA normal usando un vector retroviral, y son devueltos a los pacientes. Los niños han estado recibiendo células con genes corregidos cada uno o dos meses durante un año y estos niños mostraron mejoras clínicas significativas.
Ahora son capaces de iniciar una respuesta inmunitaria y se ha producido una importante decreción del número de infecciones. El niño de menor edad, que ha sido tratado por más tiempo, puede llevar una vida completamente normal. Estos resultados son muy esperanzadores, y si la terapia génica en células stem de la médula avanza, no será necesario un injerto continuo de células modificadas.
Actualmente, el tratamiento preferido es el transplante de médula ósea de un donante HLA idéntico, que puede producir una curación completa aunque conlleva una alta morbilidad . Pero menos de un 30% de los pacientes tienen un hermano HLA idéntico.
La sustitución enzimática no consigue una restitución completa y produce otros efectos tóxicos. Un tratamiento sustitutorio consiste en inyectar el enzima ADA combinada con polietilenglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad. Pero es un tratamiento muy caro, ininterrumpido y de eficacia inconstante.
Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace ya más de cuatro años ensayos clínicos de transferencia génica de ADA hacia los linfocitos T periféricos, previamente tratados in vitro. Aunque algunos pacientes experimentaron una notable mejoría clínica e inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los índices de la función inmunitaria.
En opinión de algunos, ni en este pionero ensayo ni en otros existen evidencias inequívocas de que el tratamiento genético ha producido beneficios terapéuticos . Los riesgos de posible mutagénesis insertiva de genes relacionados con el cáncer, después de repetidas transferencias retrovirales, no se han visto confirmadas hasta el momento . Pero los modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos clínicos en Italia y Países Bajos.
Según sus autores, en uno de estos últimos ensayos la transferencia genética había funcionado y se había conseguido la reconstitución inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo también inyecciones rutinarias de ADA sintética, y estos tratamientos convencionales podrían ser responsables en buena parte de su buena salud.
5.7 Transferencia de mioblastos usada para tratar la distrofia muscular Duchene
Los mioblastos son las células stem del músculo esquelético. Durante el desarrollo, los mioblastos se fusionan para formar fibras musculares multinucleadas. Un pequeño número de mioblastos no se fusionan y forman células individuales, llamadas células satélite, que se sitúan entre las membranas de las fibras musculares y de la matriz extracelular que cubre las fibras musculares.
Las células satélite poseen la habilidad de fusionarse con otras células satélite y fibras musculares para tomar parte en la regeneración muscular. Los mioblastos se convierten así en las células vector ideal para transportar genes a las fibras musculares.
Un obstáculo en la terapia génica de la DMD es que el gen y su ADNc son muy grandes. Esto se ha conseguido superar por la construcción con un ADNc completo para la distrofina, que se puede expresar en células. Dos ADNc biblióteca ( A y B ) fueron construidos en los cuales la reversotranscriptasa fue directamente a comenzar la síntesis de las primeras cadenas de ADN en dos puntos del ARN mensajero de la distrofina.
Estos puntos se especificaron por suplantar dos primers que hibridaban por la mitad (biblioteca A) o con el extremo 3' (biblioteca B) del ARN mensajero. Estos clones contenían 78Kb. del extremo 5' del gen y 8 Kb. fueron aisladas del extremo 3' de la biblioteca A y B respectivamente. Estos clones fueron solapados en 18 Kb. y se ligaron a una porción de un sitio de restricción para dar un ADNc completo. Esto se clonó en un vector SV40 y se transfectó por electroporación en células COS.
Usando anticuerpos para la distrofina demostraron que se producía una molécula correcta de distrofina en las células COS, y estudios inmunofluorescentes demostraron que se localizaba en la membrana celular. Aunque estos experimentos demuestran que genes grandes como el de la distrofina pueden ser manipulados in vitro, pero puede pasar mucho tiempo hasta que esta terapia pueda tener aplicaciones clínicas.
5.8 Terapia génica en la cura del cáncer
El diagnóstico del cáncer a nivel molecular permitirá un pronóstico más preciso; pero aún podemos llegar más lejos utilizando una terapia génica que tiene como finalidad la destrucción selectiva de la célula tumoral. La pérdida del oncosupresor p53 puede ser corregida introduciendo una copia sana en la célula neoplásica; la sobreexpresión del oncogén k-ras también puede suprimirse introduciendo el gen k-ras antisentido que inactive su expresión o bloquee sus ARNs.
Los retrovirus permiten introducir genes, potencialmente suicidas, en el seno de un tumor ya que infectarán e insertarán su ADNc en células en división; los adenovirus, aunque no integren en el huésped pueden permanecer activos el tiempo suficiente para destruir el tumor. También es posible introducir en el tumor o en el organismo genes inmunoestimulantes, como la interleuquina (IL2) , que potencialmente protege de distintos tipos de cáncer y de sus recidivas.
Las inmunotoxinas son el resultado de acoplamiento de toxinas muy letales (como la diftérica o la ricina) a anticuerpos monoclonales específicos de carcinomas, constituyendo las denominadas bombas biológicas, puesto que son como proyectiles letales dirigidos contra células tumorales. Por último , la terapia génica permite elaborar vacunas a partir de las propias células tumorales de un paciente por manipulación ex vivo y reinserción en el organismo de partida.
Dentro del campo de las aplicaciones de la terapia génica en el hombre, se puede considerar el cáncer como el área más importante y de más rápida expansión.
5.8.1 Sustitución de oncosupresores defectuosos por ingeniería genética
Las propiedades neoplásicas de numerosos cultivos celulares pueden revertirse con frecuencia, al insertar una copia normal de un oncosupresor como pueden ser rb, dcc o p53. Es muy posible que la introducción de p53 en un tumor que carezca de la función de este gen, pueda restaurar la normalidad tisular.
Se están realizando ensayos clínicos en los que se depositan broncoscópicamente en las inmediaciones de un tumor de pulmón , retrovirus que llevan una copia intacta de p53. La eficacia de esta terapia se verá incrementada si en vez de hacer llegar al tumor un único oncosupresor, se elaboraran "lotes génicos" de varios oncogenes y oncosupresores que simultáneamente corrijan las alteraciones acumuladas en las células del tumor.
Un único vector que porte varios oncogenes/oncosupresores o una mezcla de vectores que contenga cada uno un tipo de oncogenes/oncosupresores son las dos modalidades con las que se especula en la actualidad.
5.8.2 Inhibición molecular de la expresión de oncogenes
Tanto los tumores sólidos como las leucemias y linfomas exhiben activación mutacional o sobreexpresión de oncogenes u oncosupresores mutados ; la malignidad de las células podría desaparecer impidiendo la expresión de los oncogenes y oncosupresores por administración de pequeños oligodesoxinucleótidos complementarios a los ARNs mensajeros y ADNs correspondientes.
Debemos aclarar, sin embargo, que este tipo de tratamiento difiere sustancialmente de las terapias genéticas tradicionales. En la mayoría de los tratamientos genéticos, se suministran genes enteros y sanso para sustituir las versiones que faltan o que son defectuosas e incapaces de dirigir la síntesis de una proteína necesaria. Los oligonucleótidos no pueden producir proteínas. Su virtud radica en la capacidad para bloquear la expresión de genes existentes.
Los oligonucleótidos antisentido son la primera de las nuevas medicinas genéticas que han llegado a la etapa de ensayo clínico. De su potencialidad terapéutica se sospechó ya a principios de los 80, cuando se descubrió que ciertos microbios, además de fabricar ARNs mensajeros, también producían de forma natural ARN antisentido.
La explicación más lógica para este comportamiento parecía ser que el organismo utilizaba las moléculas antisentido como forma de regular la expresión génica. Si el ARN antisentido se empareja con su molécula complementaria de ARN mensajero, cabe pensar que bloqueará la maquinaria celular encargada de traducir en proteínas la cadena con sentido.
Las células vegetales y animales emplean a veces la estrategia antisentido para controlar la expresión génica. Con la ayuda de las técnicas del ADN recombinante crearon genes que producían versiones antisentido de ciertos ARN mensajeros seleccionados. Cuando se introducían esos genes en las células se comprobaba que, en efecto, ocasionalmente se conseguía disminuir la producción de la proteína cifrada por la cadena de ARN que era blanco del antisentido.
Los resultados sugerían la posibilidad de diseñar moléculas antisentido que funcionasen a la manera de drogas e impidiesen selectivamente la traducción. Sin embargo, para utilizarlas como tales drogas, había que enviarlas al interior de las células del cuerpo, y hacerlo de una forma fácil y eficaz. En la mayoría de los casos, lo mejor sería administrar pequeños fragmentos de antisentido sintéticos, en vez de genes enteros.
La construcción del primer oligómero surgió en 1.978, reconocía el ARN mensajero del virus del sarcoma de Rous y disminuía su replicación en la célula lo que indicaba que había bloqueado la producción de proteínas víricas.
Dos consideraciones a la hora de fabricar un oligonucleótido son: primero, los oligonucleótidos sin modificar portan una carga negativa en la cadena del grupo fosfato. Las moléculas dotadas de carga suelen tener dificultades para atravesar las membranas celulares, que no están cargadas.
La mayoría de los investigadores daban por supuesto que los oligómeros con muchas cargas serían incapaces de entrar eficazmente en las células. En segundo lugar, las células poseen numerosas enzimas que degradan el ADN foráneo. Cabía pensar entonces en una pronta degradación de los oligómeros que consiguiesen entrar en las células.
Para ello reemplazaron un átomo de oxígeno de cada grupo fosfato por un grupo metilo (-CH3 ). Convertían así los fosfatos cargados negativamente en unidades sin carga: los metilfosfonatos. De esa manera los oligonucleótidos entraban mejor en las células y resistían el ataque enzimático. Pero al eliminar las cargas, los oligómeros se volvían hidrofóbicos y se hacían insolubles en soluciones acuosas, esta falta de solubilidad puede dificultar la producción en masa.
Otra alternativa a los metilfofonatos era intercambiar un átomo de oxígeno de los grupos fosfato por un átomo de azufre cargado negativamente. Estos oligómeros fosfotiolados son conocidos como oligos S, que son solubles en agua, fáciles de producir y resistentes a la degradación enzimática.
Los oligonucleótidos antisentido pueden bloquear la traducción al menos de dos maneras. Obstaculizan la "lectura" normal del ARN con sentido y, además, al unirse al ARN mensajero estimulan a una enzima (ribonucleasa H) que corta, y por tanto destruye, al ARN mensajero que participa en la unión.
Los oligonucleótidos son muy caros y la estabilidad de los compuestos debe mejorarse. Habrá que elaborar métodos más idóneos para introducirlos en las células en las cantidades adecuadas.
Una nueva estrategia genética está basada en los llamados tríplices, que son oligonucleótidos sintéticos que actúan igualmente pero a nivel del ADN, en este caso una tercera banda se acomoda entre las dos existentes en el surco mayor de la forma B del ADN. Hoy sabemos que los oligonucleótidos suelen unirse a una de las cadenas de la doble hélice, y sólo a las bases púricas de esa cadena mediante uniones de tipo Hoogsteen. Así, los oligonucleótidos son capaces de unirse a la región de control del gen diana, para impedir que los factores de transcripción iniciasen dicho proceso.
Hasta el momento in vitro, han tenido éxito oligonucleótidos contra ras, p53, myc, myb, bcr-abl, bcl-2 y contra el factor de crecimiento semejante a la insulina.
Se encuentran en fase clínica la utilización de oligonucleótidos contra el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que va asociado al desarrollo de tumores cerebrales malignos (glioblastomas). En la fase preclínica, se introdujeron in vitro moléculas de ARN antisentido en células tumorales procedentes de un glioblastoma de rata, estas células se inyectaron en ratas genéticamente idénticas con tumores cerebrales. Los tumores desaparecieron incluso en ratas con tumores extendidos a otras partes del cuerpo. Las células introducidas desencadenaron una respuesta inmunológica estimulando células T citotóxicas que erradicaron el tumor o los tumores a la vez que protegieron al organismo de la aparición de nuevos microtumores.
En las pruebas clínicas, son células del propio paciente las que se modifican ex vivo con la introducción del ARN antisentido. Se ha elegido ARN en vez de ADN para el bloqueo del ARN mensajero de IGF-1 porque los híbridos ARN-ARN son más estables que los ADN-ARN.
La inhibición de la expresión del oncogén ras se puede conseguir in vitro con la inserción en la células tumorales de genes que transcriban un ARN mensajero antisentido, complementario al ARN mensajero normal del oncogén ras. Estos antigenes eliminan específicamente la producción del producto ras anormal a nivel de ARN mensajero por hibridar con él, impidiendo así que sean sustrato de traducción por los ribosomas celulares. El mayor problema de esta terapia génica es asegurarse de que todas las células tumorales reciben el oligonucleótido antisentido, ya que cualquiera que escape tendrá una ventaja proliferativa sobre las otras y prevalecerá induciendo de nuevo el tumor.
El segundo método de bloqueo del oncogén ras actúa a nivel de proteína. La proteína Ras ocupa una posición importantísima en la transmisión deseñales para que la célula responda a los factores de crecimiento. Las mutaciones Ras producen una transmisión continua de señales de proliferación independientemente de la presencia de los factores estimulantes.
Tanto la proteína Ras normal como la mutada precisan de una transformación o maduración que las convierta en proteínas biológicamente activas y esta modificación consiste en una farnesilación, es decir, la adquisición de un grupo farnesil que permitirá a la proteína anclarse en su lugar habitual de la membrana celular, desde donde transmite la señal de proliferación. La farnesil transferasa es la enzima que normalmente facilita el grupo farnesil; así, inhibidores de la enzima impedirán que Ras adquiera su forma biológicamente activa.
El compuesto CBBX (cisteína, 2 Benzodiacepinas y un aminoácido variable) es muy buen inhibidor de la farnesil transferasa y parece inocuo para las células. Células transformadas en cancerosas por haberles introducido un gen ras mutado, se incubaron en presencia del compuesto CBBX, impidiéndose de modo muy eficiente la farnesilación y observándose un crecimiento típico de células normales no cancerosas. La inhibición no ha de ser total puesto que las células necesitan una cierta cantidad de Ras para funcionar correctamente; además hay otras proteínas que han de farnesilarse para adquirir su capacidad funcional. Es necesario controlar muy bien las dosis para que se inhiba la enzima lo suficiente para impedir un crecimiento incontrolado, pero permitiendo el resto de las funciones de la célula.
La inhibición de oncogenes en células tumorales in vitro es un requisito imprescindible para su utilización in vivo. En animales de experimentación (ratas) estas técnicas han logrado la desaparición de tumores experimentales sin aparición de recidivas o secuelas de otro tipo.
5.8.3 Inserción tumoral de vectores suicidas: expresión constitutiva o selectiva
Los vectores suicidas que se emplean para erradicar tumores son preferentemente retrovirus defectivos en los que los genes propios del virus ( gag, pol y env) han sido sustituidos por un gen de selección (neo) y por otro gen capaz de inducir su propia muerte. Un ejemplo de gen suicida es el gen de la timidina quinasa (tk) del Herpes simplex (HS), que al expresarse en la célula tumoral confiere sensibilidad al antibiótico antiherpético ganciclovir. La quinasa del Herpes no es tan estricta como su homóloga celular y fosforila análogos de la guanina (ganciclovir o aciclovir), que pueden así ser insertados e incorporados en la molécula del ADN paralizando la replicación y provocando la muerte celular.
Solamente aquellas células que hayan adquirido la quinasa del Herpes incorporarán células en división, característica diferencial de las células tumorales que se desarrollan en tejidos especializados, las cuales normalmente ya no se dividen. El cerebro adulto es uno de los órganos en los que no hay divisiones celulares en condiciones normales. El sistema se ha puesto a punto en la rata, donde pueden ser inducidos tumores cerebrales malignos por inyección directa de células neoplásicas.
Los retrovirus portadores del gen tk del HS se introdujeron en las células murinas empaquetadoras que poseen en su genoma un retrovirus defectivo. Este retrovirus defectivo es poseedor de los genes que se eliminaron del retrovirus para convertirlo en vector ( gag, pol y env ), pero carece de una región imprescindible para el empaquetamiento de la partícula; estas células murinas se convierten entonces en fábricas de retrovirus terapéuticos y se denominan células productoras.
La introducción en el seno de un tumor cerebral de células productoras origina un gran número de retrovirus que infectarán lógicamente las células próximas del tumor. Al cabo de unos días, en los que cada vez más células tumorales adquieren el retrovirus terapéutico, se inicia el tratamiento de la rata con el ganciclovir, que , efectivamente es capaz de provocar el suicidio de todas las células tumorales .
En humanos, el mismo tratamiento de tumores cerebrales malignos por terapia génica con retrovirus portadores del gen tk del Herpes, se encuentra en la actualidad en fase de ensayos clínicos; el tratamiento del enfermo con ganciclovir produce en algunos casos la disminución del tumor tratado. Tratamientos similares se están aplicando también a otros tipos de tumores, como melanomas cutáneos o cánceres de ovario.
Una variante más versátil y selectiva se podría conseguir añadiendo al gen suicida un promotor de células tumorales. Se conocen algunos genes que se expresan preferentemente en determinados tumores, en muchos de estos casos se han aislados los promotores y se han acoplado enzimas que confieren un efecto suicida.
Un promotor específico de un tipo de tumores impediría que la enzima suicida se expresara en cualquier otra célula distinta a la neoplásica, aunque pudiera ser infectada por el retrovirus terapéutico por encontrarse en fase proliferativa. Se prevee su uso clínico en un futuro próximo para hepatomas, melanomas, cánceres de mama y cánceres de páncreas.
5.8.4 Inmunotoxinas para combatir el cáncer
Con el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales surgió la idea de elaborar inmunotoxinas para el tratamiento del cáncer acoplando anticuerpos tumorales específicos a toxinas mortales. Estas inmunotoxinas se unirían y matarían células neoplásicas. Se les denominó bombas biológicas o balas mágicas, ya que funcionan como proyectiles dirigidos para hacer blanco en células cancerosas. Problemas de toxicidad en las aplicaciones terapéuticas pusieron de relieve que simplemente pegando un anticuerpo a una toxina no se curaría el cáncer.
Aunque no se han resuelto todos los problemas originales, se puede decir que las inmunotoxinas actuales están muy mejoradas y ya se están realizando ensayos clínicos que permitirían muy pronto evaluar el alcance de esta tecnología en la cura del cáncer. Para eliminar un cáncer humano todas las células neoplásicas deben quedar expuestas a suficiente cantidad de inmunotoxina como para provocar su destrucción sin causar daños adicionalesen las células normales. Esto requiere una alta especificidad, estabilidad del compuesto, penetrabilidad en la célula diana y efecto celular letal.
La estructura de la inmunotoxina empezó siendo la inmunoglobulina G (Ig G) completa unida a la toxina por un puente disulfuro. Una vez ya en el interior de la célula el puente disulfuro se reduce liberando la toxina. Un paso adelante lo constituyó la sustitución de toda la molécula de Ig G por una parte de ella. El tratamiento de la Ig G con algunas proteasas, como la "pepsina" o la "ficina", genera fragmentos heterodímeros (Fab')2 y Fab' unidos entre sí por puentes disulfuro. Cada dímero está formado por una cadena pesada (H) y una ligera (L) unidas por un puente disulfuro por la parte constante. Los fragmentos Fab' se pueden unir directamente a toxinas por medio de enlaces disulfuro creados como consecuencia de la reducción de (Fab')2.
La ventaja de Fab frente a la inmunoglobulina G entera es su menor tamaño, lo cual facilita notablemente la penetración en la célula. Los conjugados toxina-Fab' pueden crearse bien por ingeniería genética fusionando a nivel de ADN las regiones que codifican por cada parte, o bien por medio de un enlace químico que una las dos partes in vitro.
Las partes variables de Fab', unidas por un puente disulfuro y que constituyen las Fv-Tx. Sólo se pueden obtener por ingeniería genética fusionando a nivel de ADN las regiones codificantes correspondientes, pero son algo inestables. La inclusión de un péptido de conexión estabilizador en las moléculas recombinantes (Fv cs-Tx) ha solucionado este problema.
La especificidad la da el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son más específicos que los polivalentes, por estar dirigidos contra una pequeña parte específica de la proteína (epitopo) y no contra su totalidad.
Los anticuerpos deberían estar dirigidos contra las partes específicas de las proteínas que estuvieran en los tumores normales. Por ejemplo, los anticuerpos auténticamente específicos de carcinomas deberían reconocer las formas mutadas de las moléculas que controlan el crecimiento celular pero en sus versiones normales. En la mayoría de los casos no se consigue una especificidad tan precisa y la mejor aproximación son los anticuerpos cuasi-específicos que reaccionan con antígenos que se expresan predominantemente en determinados carcinomas y muy poco en las células normales.
Otros requisitos para que la inmunotoxina sea eficiente son :
- Que el antígeno esté en la superficie de la célula , de ahí que se utilicen receptores o carbohidratos de membrana.
- Que el complejo antígeno-anticuerpo se interne eficazmente al citoplasma celular por endocitosis.
Las toxinas que más se utilizan son la ricina, la toxina diftérica y la exotoxina de Pseudomonas. Las tres matan la célula inhibiendo la síntesis de proteínas a nivel de los ribosomas. Son muy eficientes, necesitándose muy pocas moléculas para inactivar todos los ribosomas celulares. Sus genes han sido clonados, caracterizados y parcialmente alterados para mejorar sus propiedades tóxicas. El mayor inconveniente de las toxinas es que pueden reaccionar indiscriminadamente con cualquier célula causando toxicidad inespecífica. Se han conseguido delecciones génicas que eliminan una pequeña región de ADN responsable de la interacción toxina-célula; ello disminuye notablemente la toxicidad inespecífica evitando que toxinas conjugadas o aisladas, puedan causar la muerte de otros tipos celulares.
El efecto antitumoral de la toxina es mucho más rápido ( unos siete días ) que el desarrollo de una respuesta inmunológica seria. Aún no disponemos de la inmunotoxina perfecta que permita matar todas las células tumorales sin producir efectos más o menos deletéreos en el resto del organismo.
La causa principal de estos decepcionantes resultados es que las inmunotoxinas no llegan realmente a todas las células tumorales, particularmente en los tumores sólidos. Los motivos de esta inaccesibilidad son varios: poca vascularización del tumor, una gran presión del fluido intersticial en los nódulos tumorales, presencia de membranas basales envolviendo el epitelio tumoral y ocultamiento de los posibles antígenos antitumorales que deberían exhibirse en las membranas de las células neoplásicas. Todo esto contribuye a que la efectividad de las inmunotoxinas no haya alcanzado aún las espectativas esperadas.
5.8.5 Incremento de la inmunogenicidad tumoral y vacunas contra el cáncer
Ciertas moléculas producidas en la célula tumoral pueden convertirse en antígenos de rechazo. Las células tumorales producen al menos dos tipos de antígenos que pueden ser reconocidos por las células T citotóxicas:
Los productos de los oncogenes, es decir, proteínas aberrantes distintas a las originadas por los protooncogenes y exclusivas de células tumorales.
Antígenos tumorales formados por los productos de genes embrionarios que no se expresan en las células normales de adultos.
Claramente la habilidad para crear respuestas contra antígenos propios específicos de tejido puede ser de gran utilidad para el tratamiento de cánceres derivados de órganos no esenciales como la próstata, pero por otra parte los antígenos específicos de tejido pueden crear problemas de autoinmunidad, que deben ser superados.
Recientemente se han utilizado vacunas tumorales para el tratamiento de pacientes con tumores sólidos. Las estrategias empleadas han sido variadas y los resultados inconsistentes. Sistemáticamente células tumorales irradiadas se mezclaban con diversos coadyuvantes, como el bacilo de Calmette-Guerín, para estimular la respuesta inmunológica. La inclusión de coadyuvantes no pareció incrementar la acción mediada por las células T, pero en algunos casos las células tumorales irradiadas mostraron un rechazo inmunológico. Desgraciadamente, en la mayoría de los casos la magnitud de la respuesta fue pequeña, y no se consiguió erradicar tumores ya establecidos.
5.8.6 Perspectivas de la terapia génica y molecular
Todos los tratamientos de terapia génica que se han descrito están más indicados para cánceres de tipo metastático que primario; dado que aún hoy no se conoce el alcance de la curación, es preferible que los pacientes hayan agotado otros métodos de curación y que los riesgos de la terapia génica sean menores de los derivados de la evolución de la propia enfermedad.
Hay muchos problemas pendientes : cómo transferir de manera estable y eficiente a tumores in vivo; cómo evitar los riesgos de infección vírica en pacientes y operadores; cómo generalizar los tratamientos de terapia génica,…
La eficiencia de toda esta tecnología en la cura de una de las mayores "plagas" de nuestra sociedad es aún ínfima para el número de trastornos que se ocasionan y a su especial rapidez y avance de la enfermedad. La solución por tanto no es enfocar la respuesta a un único tratamiento terapéutico, sino combinar con diferentes técnicas (quimioterapia, radioterapia, tratamientos farmacológicos de última generación, terapia génica,….) las habilidades de éstos, y preparar mediante estudios detallados y específicos la mejor respuesta al caso. Así, que aún hoy tras décadas de estudio y lucha por curar esta enfermedad , y aunque estos avances resulten ser esperanzadores solo nos cabe preguntarnos si será la respuesta definitiva a tanto tiempo de espera y en muchos casos de impotencia y resignación.
5.9 Terapia génica en infección por HIV
La terapia génica para el HIV está destinada a realizar muchos propósitos. Los propósitos son proteger células no infectadas residuales y eliminar células infectadas. Pero lo que más se intenta es reducir la infección en personas infectadas y evitar la expansión del virus a través de la población.
Haremos un breve repaso del ciclo infectivo del virus a través de estos esquemas:
5.9.1 Objetivos potenciales de la terapia génica para infección por el HIV
La mayoría de los procesos del ciclo viral tiene puntos vulnerables que pueden ser desvaratados con métodos genéticos.
Algunos aspectos como son la transcripción y translación son llevadas a cabo por la maquinaria de la célula hospedadora es probable que la inhibición significativa pueda llevar a la muerte celular. Procesos específicos del virus son utilizados como puntos de arranque: la entrada en la célula, la transcripción inversa, o la integración. La interacción entre los ARN tat y rev con proteínas es un punto claramente vulnerable al igual que el empaquetamiento del ARN genómico.
5.9.2 Inmunización por proteínas del HIV
La expresión in vivo de una proteína viral puede ser utilizada como una vacuna genética para atacar al virus. Usando sistemas con virus influenza en modelos animales han demostrado la eficacia de esta vacuna genética, en la cual una inyección directa de ADN plasmídico puro que codifica proteínas virales lleva a una expresión persistente de los genes virales.
En infección por HIV es importante conservar regiones del virus genómico como inmunogénico porque el virus posee gran habilidad de mutación y de evitar respuestas neutralizantes. Se ha visto que en pacientes con SIDA que la evasión de la respuesta inmune contra epitopos específicos de las células T citotóxicas pueden ocurrir incluso en porciones relativamente conservadas del HIV, como es el gag. La entrega de genes virales junto a genes que codifican moléculas inmunoestimulatorias, como la molécula B7/BB1, es otro desarrollo potencial.
El pg160, proteína precursora de la envuelta expresada en células singénicas, está siendo utilizada para inducir respuestas inmunitarias humorales y celulares en ratones.
Una vez que células que desarrollan la inmunidad expresan la proteína inmunogénica probablemente serán destruidas por contener un virus transcipcionalmente activo. La gran proporción de células infectadas albergando un virus latente persistirá y proveerá un pozo del que emergerán mutantes capaces de evitar la respuesta inmunitaria.
Es por esto por lo que la inmunización con proteínas del HIV sigue siendo muy difícil por no decir casi imposible, al menos con la tecnología actual. Además hay que sumar el hecho de que es un virus con una elevada tasa de mutación, con lo cual la creación de inmunidad para un tipo de producto génico puede verse inútil si el virus cambia por mutación.
5.9.3 Inhibición mediada por interferón
ADNs copia de interferones han sido clonados e insertados en vectores para su expresión constitutiva o inducible en células diana. El tratamiento con interferón induce algunas proteínas celulares una de las cuales ( RBP 9-27 ) aparentemente interactúa con la estructura en bucle del ARN que codifica rev y puede inhibir la expresión de proteínas gag-rev dependientes.
5.9.4 Destrucción autolítica de células infectadas
Se han desarrollado varias estrategias para que células infectadas por HIV se autodestruyan. La subunidad A de la toxina diftérica (DT-A) está codificada por un gen que puede ser utilizado como un gen suicida inducible. Sólo una pequeña molécula de DT-A puede ser suficiente para matar a una célula. Otros genes letales que se usan incluyen a la timidina quinasa de HSV (tk) , que es inocua al menos que en el medio haya ganciclovir o aciclovir. En caso de la presencia de estos compuestos, que pueden ser fosforilados por la tk ( como ya dijimos en su aplicación en el cáncer ), la célula muere. Otros resultados prometedores se han obtenido usando in vitro la toxina quimérica CD4 de Pseudomonas que mata células que producen el pg120 del virus.
Esta forma de terapia tiene inconveniente que reside en la interacción tat-LTR. El LTR del HIV es un promotor muy promiscuo , que es activado por un gran número de proteínas además de tat, incluyendo factores transcripcionales como los de los citomegalovirus. Hay un control limitado de la expresión del gen suicida inducible por tat, y la destrucción de la célula puede ocurrir bajo otras circunstancias que no sean la infección por HIV.
5.9.5 Interferencia directa con procesos virales
La interferencia en la replicación viral se puede hacer por interrupción de procesos virales como son la entrada en la célula, o más fácilmente, en la salida, aquí el ADN del provirus no es un objetivo práctico.
Para aumentar la posibilidad de inhibición antes de la integración del HIV probablemente se necesite la producción constitutiva de genes antivirales.
– La interferencia se puede realizar por varios métodos . Uno de ellos es la modificación de la molécula CD4. Bloqueando la molécula CD4 para que el pg120 viral no pueda adsorberse sobre él es una proposición esperanzadora. In vitro se ha visto también que células mutantes para el CD4 no reconocen la glicoproteína de la envoltura del HIV por lo que son resistentes ante la infección del virus. Otra manera sería inyectar grandes cantidades de CD4 en la sangre, pero se ha visto que la dosis requerida para que sea detectable en el plasma, es más alta de lo esperada.
Otros se realizan utilizando terapia basada en nucleótidos, de los que hay tres clases de ARN antivirales y que son: el ARN antisentido, los ribozimas y el ARN decodificante.
– El ARN antisentido para el LTR de HIV es entregado por un vector AAV, y produce una reducción superior al 90% de las replicación del HIV. Estas moléculas antisentido necesitan estar presentes en más número que su secuencia diana, lo que dificulta su producción y eficacia.
– Sin embargo, los ribozimas, como se regeneran después de cada interacción catalítica no se requieren en gran cantidad. Los ribozimas anti-HIV expresados establemente en células HeLa-CD4+ pueden inhibir la replicación del HIV. Este mismo efecto se produce en blancos que posean la integrasa RT y las regiones tat y env.
5.9.6 Estrategias centradas en proteínas
Proteínas mutantes pueden a veces interferir en la funciones normales. Esto se conoce como fenómeno transdominante negativo , en el que un pequeño número de proteínas mutantes pueden interferir en los efectos de una gran cantidad de proteínas normales. Las proteínas más utilizadas para este experimento son las proteínas tat y rev.
También se ha visto que en mutantes dominantemente negativos de la proteína de la envoltura puede inhibir la producción de HIV, y mutantes dominantemente negativos en el dominio de unión a CD4 pueden reducir la cantidad de CD4 y disminuir la producción del virión.
5.9.7 Secuestro en trans de proteínas
En teoría se pueden secuestrar algunas proteínas estructurales del virus. El secuestro de una envoltura viral por un CD4 que contiene una señal de retención del retículo endoplasmático, se ha podido ver en varios experimentos . Cadenas sencillas de anticuerpos se han desarrollado para secuestrar la proteína de envoltura en el retículo endoplasmático. La co-transfección de cadenas sencillas de anticuerpos específicos para pg120, también reduce los niveles de partículas HIV infecciosas, sin afectar al nivel de producción de la proteína gag.
Estas metodologías son particularmente sensibles al acercamiento de la terapia génica y parece probable que dentro de los próximos 5-10 años una combinación de terapias, incluyendo agentes farmacológicos y agentes de terapia génica, puedan ser usados en concierto para minimizar la propagación del HIV dentro de un individuo afectado y de este modo prolongar su vida libre de enfermedad. Una vacuna basada en la terapia génica es también una seria posibilidad. El HIV por si mismo puede paradójicamente llegar a ser una valiosa arma terapéutica y la terapia génica del SIDA puede llegar a ser el campo pionero para el desarrollo de acercamientos similares a otros agentes infecciosos.
VI. TERAPIA GÉNICA: PERSPECTIVAS FUTURAS Y CONSECUENCIAS
Datos económicos indican que los costes de los primeros años de transplantes cardiacos son unos 90.000$ por paciente (dólares de 1.983) en los EEUU, sería razonable preguntarse si la terapia génica será otra tecnología cara a medio plazo. Si se emplea en transplantes de médula ósea, en la terapia génica humana será trabajada intensamente y supondría unos considerables costes iniciales.
Pero aún cuando nadie asigna un valor económico en el mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes curados, lo más seguro es que algún día la terapia génica costará considerablemente menos que la hospitalización repetitiva por enfermedades como la anemia falciforme o la fibrosis mística. En breve, para pacientes que sufran alguna enfermedad genética causado por el defecto en un gen, la terapia génica se puede convertir en un método de cura bastante costoso.
En un futuro más lejano, las perspectivas para la terapia génica en humanos todavía no están claras . Pero si se rompiese el eslabón entre el transplante de médula ósea y la terapia génica, ésta se podría aplicar a un círculo de pacientes más extensos.
Por ejemplo, si vectores específicos para un particular tipo de célula diana se pudiera desarrollar, la combinación vector/gen, quizá pueda ser administrada de forma intravenosa. A este nivel, si alguna vez se alcanza, la medicina estará en el umbral de una nueva era para el tratamiento de más de 3.000 desórdenes genéticos que afecten a nuestra especie.
- CUESTIONES ECONÓMICAS
El rango potencial y la versatilidad de la terapia génica han sido perfilados en puntos anteriores de este trabajo. Esta es una nueva forma de intervención terapéutica a un nivel molecular, con aplicaciones en muchas áreas del tratamiento médico que engloba desde la corrección de un locus individual de un defecto génico heredado por inmunización, tratamiento de enfermedades infecciosas hasta el cáncer. Esta es también una nueva farmacología.
Mientras muchos fármacos corrientes persiguen modificar procesos endógenos por la aplicación de novedosos, compuestos artificiales, la terapia génica reparte un agente biológicamente activo muy específico a un sitio determinado y a la vez con la posibilidad de permanentes, transitorios o inducibles estados de la expresión.
Como un nuevo fármaco debe ser testado en el contexto de la herencia. La heredabilidad requiere dos funciones: primero, la transmisión de la información de generación en generación, y segunda, la expresión de la herencia.
Transmisión y expresión están separadas a nivel molecular, y , en organismos multicelulares, a nivel celular. La determinación celular va seguida por la diferenciación en un estado temprano que separa irreversiblemente el linaje somático de los portadores potenciales de información a la siguiente generación: las células de la línea germinal.
La expresión del gen terapéutico puede ser afectada transitoriamente por el uso de vectores que no se integran o por células diana con una vida biológica limitada. Si, como es normal, la expresión es requerida a largo plazo, deberemos usar vectores que se integren o autoreplicativos. Estos son más difíciles de distribuir y controlar.
El material genético en un cromosoma está influido directamente por partes del genoma cercanas y distantes que actúan en cis y trans. Esto no es una sorpresa ya que uno de los mayores problemas con la transferencia génica como práctica corriente es la expresión a largo plazo del gen transducido cuando la transferencia se produce en secuencias mínimamente contextuales. La familia del gen de la globina lo ilustra bastante bien.
El control de la expresión depende de cuatro regiones distantes aguas arriba reconocidas por su hipersensibilidad ADNasa I y se les llamó regiones para el control del locus (LCRs). Aún con estas regiones incluidas la transferencia del gen de la globina era imprescindible ya que se podía reorganizar de diferentes maneras.
¿Cómo podemos solventar este problema? En principio se comenzó a "limpiar" la construcción de motivos de interferencia extraños por escaneo de las secuencias del vector que actuaban como señales cis, las cuales podrían ser las responsables de las distintas formas de reorganizar, y se intentó posteriormente eliminarlos sistemáticamente por delección o por mutación puntual dirigida.
La sustitución por un gen anormal o no funcional por recombinación homóloga es una segunda posibilidad, y teóricamente, la forma ideal de terapia génica. Hasta ahora esto se ha ido practicando sucesivamente en líneas celulares o en células stem embrionarias de animales. La confianza que nos proporciona los procesos celulares endógenos para la recombinación son insatisfactoriamente bajos. Sin embargo, desde hace años se conocen enzimas que catalizan la escisión e inserción de material genético por reconocimiento de una secuencia nucleotídica particular, esto es lo que se está usando en la transferencia de genes eucarióticos.
El sistema mejor conocido es el sistema cre/loxP de los bacteriófagos. La enzima cre reconoce una secuencia oligonucleotídica particular y corta una pieza de material genético existente entre dos de esas secuencias, y después ligará los extremos del material genético cortado. Las secuencias que cortan las enzimas se llaman loxP. Introduciendo sitios loxP se crean sitios de inserción y delecciones específicas en células stem embrionarias.
Una tercera posibilidad es intentar transferir una unidad genética grande que contenga el gen y todo la unidad llevará asociada regiones de control junto a genes accesorios en un formato auto replicativo. A esto se le llama cromosoma artificial , y que nos supera las limitaciones en el tamaño del ADN que puede ser transportado a base de vector. Esto se ha demostrado utilizando vectores YAC (cromosoma artificial de levadura) para crear ratones transgénicos. Los cromosomas artificiales también evitan los problemas en el control del sitio de integración del ADN exógeno. Los centrómeros y telómeros de levadura parece que no son funcionales en células de mamíferos por lo que el objetivo más corriente sería la producción de vectores de cromosomas artificiales que lleven los centrómeros y telómeros que combinen la habilidad de transportar grandes piezas de ADN (varios cientos de kilobases), con la capacidad de segregación con un cromosoma independiente en sincronía con el genoma del hospedador en la célula en división.
Por último, varios sistemas están siendo explorados para el reparto de hormonas, factores de coagulación, anticoagulantes, y otros agentes terapéuticos. Cuando sus genes estén introducidos dentro de fibroblastos o células del endotelio vascular, sus productos pueden ser detectados en sangre durante diversos períodos de tiempo.
Estudios recientes en ratones sugieren que mioblastos pueden ser particularmente ventajosos como células diana para el reparto de proteínas recombinantes. Transferencia génica in vitro seguida por el reinjerto de las células está siendo explorado para restaurar funciones de enfermedades crónicas del sistema nervioso. Si se consigue probar como efectivo tales técnicas de implantación combinadas con los genes transfectados podrían ofrecer un nuevo camino de tratamiento para desórdenes crónicos tales como el Parkinson o la enfermedad de Alzheimer.
En otoño de 1.998, French Anderson uno de los pioneros de la terapia génica propuso una solicitud de aprobación de un protocolo para el estudio de la terapia génica in útero. Anderson se propone tratar dos enfermedades genéticas muy graves; la alfa-talasemia, enfermedad fatal de la sangre, debida a un defecto del gen de la hemoglobina, y una deficiencia inmunitaria grave, SCID (Severe Combined Inmune Deficiency), resultado de la carencia de un gen esencial, el del enzima adenosina desaminasa (ADA).Se propone ensayar el metido en fetos portadores de estas anomalías genéticas, cuyas madres hayan decidido abortar. Sólo después de la interrupción del embarazo podrán los investigadores verificar la eficacia del tratamiento.
Todavía se necesitarán de dos a tres años de trabajo en vectores y de ensayos en el animal para que estos proyectos sean técnicamente aceptables. Si la terapia génica in útero se revela eficaz, el principal problema ético que, con el tiempo, suscitará este tipo de intervención en el feto será el riesgo de modificación de las células del grupo germinal, precursoras de las células sexuales y, por tanto, del patrimonio genético que se transmite a la descendencia.
Ahora bien, la prohibición de la terapia goza de consenso. El proyecto de convención de bioética del Consejo de Europa, por ejemplo, excluye tal posibilidad. Incluso del RAC (Recombinant Advisory Committee), órgano del National Institutes of Health (NIH).
- PERSPECTIVAS FUTURAS
- CONSECUENCIAS DE LA TERAPIA GÉNICA
La modificación del material genético de una célula afecta tanto a la célula como a sus descendientes. Hay un gran debate de los peligros potenciales del uso de un tratamiento que diseña deliberadamente cambios genéticos que son potencialmente propagables.
Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones genéticas de la línea germinal. Se cree que los riesgos de estos tratamientos. Pero, ¿cuáles son estos riesgos?
Todas las integraciones cromosómicas, aparte de los cambios homólogos, poseen el potencial de alteración de locis endógenos fortuitos y por lo tanto producir mutagénesis, que puede derivar en oncogénesis.
Si realizamos la terapia génica en células somáticas nosotros no transmitiremos los genes manipulados en esas células somáticas a las futuras generaciones pero alteramos la línea genética del individuo. La intervención directa en las células somáticas difiere del tratamiento médico convencional sólo en que aquí hay una clara y directa conexión entre la terapia y la selección genética.
En el caso de síndromes causados por locis dominantes el conjunto completo de genes está representado por los individuos afectados. Su éxito reproductivo por lo tanto influye directamente en el tamaño de este conjunto en la siguiente generación. Si los individuos llevan alelos no reproductivos, la frecuencia del gen en la población está mantenida por que ocurran nuevas mutaciones.
En las enfermedades genéticas ligadas al sexo, recesivo en la mujer y dominante en el hombre. Como el número de afectados es mucho mayor (todos los machos que lleven el alelo se verán afectados) la influencia del éxito de la terapia en la frecuencia génica será también mayor.
La modificación deliberada de la línea germinal tendría efecto sobre la estructura de la población sólo por una transformación genética a gran escala o alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta ventaja selectiva. Un hecho preocupante sería la introducción de resistencia a una enfermedad patógena. Si sólo "los elegidos" son protegidos de la enfermedad podría existir la posibilidad de un gran cambio genético en la población ¿Sería la terapia génica en la línea germinal realmente necesaria?
La terapia génica somática, tiene un efecto directo sobre el paciente individual pero alguna transformación génica de la línea germinal puede sólo tener efectos sobre la descendencia aún no nacida. Esto por lo tanto no afectará al paciente que está siendo tratado. Con las posibilidades de investigación de prenatales de la preimplantación tanto como de la donación de esperma y óvulos y adopción es muy difícil ver como la intervención deliberada en la línea germinal puede ser éticamente justificable. No obstante esta idea será más profundizada en el siguiente apartado, sobre la ética en la terapia génica.
OROZCO OROZCO, E. y P.,GARIGLIO VIDAL, (1999). Genetica y biomedicina molecular. Mexico D.F. Edit. Limusa S.A. pp 111-118.
S. KLUG, W. y M.,R. CUMMINGS. (1999). Conceptos de genetica. Madrid. Prentice Hall. 5ta Edic. pp 6-8, 495-498.
J.F. GRIFFITHS, A. y otros. (2000). Genetica moderna. Madrid. Mc Graw Hill. pp. 5, 73-75, 361-364.
B. JORDE, L. y J., C. CAREY. (1999). Genetica medica. Madrid. Doyma Libros S.A. pp. 1-5, 226-230.
http://www.geocities.com/ResearchTriangle/Lab/2513/cardiacos.htm
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http://www.ua.es/fgm/divgen/genetica/consuelo/cual_es_la_importancia.htm
http://www.medspain.com/ant/n1_oct98/genetica.htm
http://www.geocities.com/HotSprings/Villa/3479/notisex_16.htm
http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/tergen-2.htm
http://aragoneria.com/boreas/articulos/terapiagenica1.htm
Rómulo Aycachi Inga
Bach. En Biología
Tema: Fotosíntesis – Biología General – Botánica
Setiembre 2004
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