Incidencia de síndrome diarreico agudo por rotavirus en menores de 3 años (página 2)
Enviado por Juan Pablo Macias Fernandez
Introducción
Aunque la mortalidad por enfermedad diarreica ha disminuido significativamente en las últimas décadas, la diarrea sigue siendo un problema global de salud pública con un mayor impacto en países en vías de desarrollo en donde esta enfermedad constituye una de las principales causas de morbi-mortalidad infantil. La OMS estima que en el mundo ocurren aproximadamente 1100 millones de episodios diarreicos al año y cinco millones aproximadamente de fallecimientos infantiles por esta causa. De estos, el Síndrome diarreico Agudo por Rotavirus constituye uno de los agentes etiológicos virales más importantes de la diarrea infantil en todo el mundo siendo responsable por 1 de cada 20 muertes infantiles en el mundo en vías de desarrollo.
2En América latina se indica que el síndrome diarreico por rotavirus es responsable de 75.000 hospitalizaciones y 15.000 muertes anuales, explicando del 10 – 20% de muertes asociadas con gastroenteritis.
En nuestro país, el síndrome diarreico agudo de carácter infeccioso ocupa el séptimo lugar de entre las diez principales causas de mortalidad infantil (ver anexo- cuadro 1), según datos ofrecidos por el CIE-10 durante el año 2003. No se conoce ningún estudio aplicado de investigación Nacional en la determinación del síndrome diarreico agudo por rotavirus.
Con el presente trabajo se procedió a la realización de un estudio de carácter descriptivo retrospectivo en base a las historias clinicas de los pacientes menores de tres años ingresados en el Departamento de Pediatría del Hospital Verdi Cevallos, que aportaron datos clínicos y de laboratorio sobre la incidencia del síndrome diarreico agudo por Rotavirus, los cuales se obtuvieron mediante el instrumento creado para esta investigación y que se aplicaron en las historias clínicas y estudios de laboratorio que llevaron al diagnóstico, sobre una población base de aproximadamente 131 niños. Una vez establecidos los datos, se trató de agruparlos de acuerdo a la edad pediátrica, sexo, y lugar de procedencia al cual pertenecieron los pacientes. Los datos así obtenidos fueron analizados y tabulados mediante el uso de programas de computadora para establecer las respectivas frecuencias y porcentajes.
Gracias a la información recolectada, se trató de generar una estimación estadística real de la presencia o no de esta patología en los niños de nuestra población manabita durante el periodo de Enero-Junio del año 2005.
Justificación El presente trabajo se lo realizó para recompensar en forma recíproca los conocimientos, actitudes y años de estudios otorgados por la muy prestigiosa Escuela de Medicina de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Técnica de Manabí, la cual ha viabilizado todas las facilidades necesarias para la formación de nuevos médicos; así mismo, se lo elaborará como requisito previo a la obtención del título de Doctor en Medicina y Cirugía.
Los resultados de este estudio, servirán para que las autoridades sanitarias tengan un conocimiento significativo y real sobre la morbi-mortalidad del síndrome diarreico agudo por rotavirus en nuestra población infantil manabita, que afecta principalmente a los países en vías de desarrollo como el nuestro, para que por medio de ello, se puedan generar en el futuro medidas preventivas congruentes con la realidad local que beneficien tanto a los niños como a sus familias.
Para realizar este estudio de investigación, se contó con los recursos materiales bibliográficos, estadísticos, económicos, metodológicos y de especialistas pediátricos, necesarios para el desarrollo y ejecución del mismo.
CAPITULO 2
DEFINICION Y DELIMITACIÓN El Síndrome diarreico agudo por Rotavirus es una enfermedad caracterizada por diarrea aguda grave asociada o no con vómitos que pueden producir deshidratación, el choque y la muerte. Constituye una enfermedad democrática dado que infecta a todos los niños, tanto ricos como pobres.
La principal ruta de transmisión de los rotavirus es la vía fecal-oral, aunque también se ha especulado que el contacto persona a persona, el contacto con secreciones respiratorias, y/o el contacto con superficies contaminadas pudieran ser fuentes de transmisión, ya que los altos índices de infección por este virus en los primeros tres años de vida en todo el mundo son independientes de las condiciones higiénicas y sanitarias.
En Manabí, no se conocen estudios o casuísticas sobre Síndrome diarreico agudo por rotavirus. Es por lo expuesto anteriormente, se propone el siguiente problema científico:
¿Cuál es la incidencia de síndrome diarreico agudo por rotavirus en menores de 3 años ingresados en el hospital Verdi Cevallos Balda durante Enero – junio 2005? Objetivos OBJETIVO GENERAL Determinar la incidencia de síndrome diarreico agudo por rotavirus en los niños menores de tres años ingresados al área de hospitalización pediátrica durante enero a junio del 2005.
OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Identificar la incidencia del síndrome diarreico agudo causado por rotavirus.
2. Establecer algunos factores biológicos y demográficos asociados al problema:
• Sexo • Grupo etario • Lugar de procedencia.
3. Determinar métodos diagnósticos: clínico y laboratorio.
CAPITULO 3
SINDROME DIARREICO AGUDO POR ROTAVIRUS 3.1 GENERALIDADES La diarrea aguda, actualmente sigue constituyendo un gran problema de salud pública en la mayoría de los países en desarrollo siendo causa de importante morbi- mortalidad durante la infancia, especialmente por su relación con la desnutrición y los altos costos que implica para los sistemas de salud por su alta demanda de atenciones ambulatorias y hospitalizaciones.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que cada año se presentan alrededor de 100 millones de episodios de diarrea aguda en niños menores de cinco años en países en desarrollo y 5 millones de muertes infantiles se deben por esta causa; esta, a su vez relacionada en el 50-70% de los casos con deshidratación.
Desde 1973 se identifico al rotavirus como uno de los agentes causante de diarrea más importantes de gastroenteritis en lactantes y niños pequeños; 3estimaciones de la Organización Mundial de la Salud indican que alrededor de 440.000 niños menores de 5 años mueren al año debido a la infección producida por rotavirus tanto en países desarrollados como en los países en vías de desarrollo, explicando en estos últimos el 10 – 20% de muertes asociadas con gastroenteritis infecciosa.
Los factores de riesgo para la presentación de esta entidad se asocian a deficiencias higiénicas que facilitan la transmisión fecal-oral, niños de guarderías, individuos que migran a países en vías de desarrollo o áreas insalubres. Otro grupo lo constituyen los niños inmuno-comprometidos en quienes la diarrea se prolonga, complicaciones y excreción prolongada, así como desnutrición severa.
3.2 HISTORIA Y ETIMOLOGIA En el año de 1929, Zahorsky describió la "enfermedad de vómitos invernales", la cual en su estudio de forma retrospectiva, probablemente correspondía en su mayor parte a gastroenteritis por rotavirus. Los rotavirus en humanos fueron inicialmente descritos en 1973 por Ruth Bishop y colaboradores en Australia, quienes encontraron la presencia de partículas virales al observar al microscopio electrónico biopsias de Intestino delgado de niños entre los 6 meses a 9 meses de edad que tenían diarrea aguda severa de origen no bacteriano. La literatura inicial les dio nombres como reovirus, orbivirus, duovirus y virus de la gastroenteritis infantil. Como resultado y en base a la morfología de estos virus, cuya apariencia al microscopio electrónico era la de una rueda de carreta antigua, estos virus fueron bautizados con el nombre de rotavirus, del latín rota, que quiere decir rueda.
Inicialmente resultó más fácil adaptar a crecer en cultivo de tejidos a varios tipos de rotavirus aislados de animales, a diferencia de los rotavirus aislados de humanos que resultaron ser difíciles de adaptar, por lo que el conocimiento de la bioquímica y la biología molecular de los rotavirus aislados de animales avanzó mucho más rápidamente. Sin embargo, los conocimientos que hemos adquirido en estas áreas estudiando a los rotavirus aislados de especies animales se han podido extrapolar, en general, a los rotavirus aislados de humanos. Dentro de las cepas de rotavirus más estudiadas se encuentran dos cepas provenientes de simio; el rotavirus SA11 (Simian Agent-11), aislado de un mono verde africano y el rotavirus RRV (rhesus rotavirus), aislado de un mono rhesus. La mayoría de la información es extrapolable, en lo general, a la gran mayoría de las cepas de rotavirus del grupo A. Desde entonces, estos virus han sido reconocidos como el principal agente etiológico de las gastroenteritis virales en las crías de un gran número de mamíferos (incluyendo al hombre), y de aves, y también se ha generado una gran cantidad de información sobre las propiedades biológicas y epidemiológicas de estos virus.
3.3 EPIDEMIOLOGÍA Si bien en las dos últimas décadas, la mortalidad infantil por diarrea en el mundo disminuyó de 4,6 millones de muertes anuales estimadas a 1,56 millones, el rotavirus sigue siendo considerado como la causa principal de gastroenteritis grave en la infancia en el mundo. Los investigadores aun no tienen un panorama completo del alcance real. La vigilancia hospitalaria ha sido irregular y los cálculos de la prevalencia mundial dependen de informes de más de 15 años de antigüedad. Pero, actualmente, los investigadores en muchas partes del mundo están intensificando sus esfuerzos para obtener un panorama actualizado de dicha prevalencia y de establecer mapas epidemiológicos sobre la distribución mundial de esta epidemia (ver anexo- figura 1). 4
Actualmente se considera, que el Síndrome diarreico agudo por Rotavirus, cobra la vida de más de 600.000 niños todos los años, más de 80% en los países en desarrollo, considerándose la principal causa de hospitalización y la única causa más importante de muertes por diarrea en los niños de hasta cinco años de edad en el mundo, siendo responsable de 75.000 hospitalizaciones y 15.000 muertes anuales en América Latina. En países en vía de desarrollo los rotavirus explican del 10 – 20% de muertes asociadas con gastroenteritis.
El Dr.Umesh Parashar et al, de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos, presentó y publicó durante el sexto simposio internacional sobre rotavirus, datos nuevos que sugieren que la cantidad de muertes anuales en relación con el rotavirus de niños menores de 5 años de edad alcanza 608.400 o 39% de las muertes a raíz de la diarrea. Esto es considerablemente superior al cálculo mundial anterior de 440.000 muertes infantiles o 22% de las muertes a raíz de diarrea dictadas anteriormente por la OMS. Si bien las cifras nuevas se basaron en un examen riguroso de los estudios publicados a partir de 2000, el cálculo anterior utilizó estudios llevados a cabo entre 1986 y 1999. El nuevo análisis comprendió 41 estudios, 18 de los cuales de países de ingresos bajos, y medianos, y cada uno con 100 pacientes como mínimo.
Determinó que 39% de los niños con diarrea grave estaban infectados por el rotavirus. En consecuencia, se calculó el número total de muertes en relación con el rotavirus en el orden de 39% del 1,56 millones de muertes infantiles anuales debido a la diarrea, o 608.400. Las explicaciones posibles para las tasas más altas en estudios más recientes, se debieron a el uso de mejores métodos de detección y la posibilidad de que la higiene y el saneamiento mejorados hayan reducido las diarreas bacterianas y parasitarias más que las diarreas víricas.
Además, se estableció que los distintos Centros de Salud en mayor y menor medida, ofrecen los controles de prevalencia adecuados de anticuerpos en sueros de los niños en casi todo el ámbito mundial, casi todos los niños están infectados por rotavirus en los 3 primeros años de vida, siendo su mayor incidencia entre los lactantes y pre- escolares (6 a 24 meses de edad). Se determinó que deacuerdo al sexo no existe un predominio claro, aunque estudios actuales propuestos en el sexto simposio sobre rotavirus revelaron una inclinación sobre el sexo masculino que el femenino.
Se ha identificado a rotavirus todo el año con incidencia mayor en otoño e invierno. Su mecanismo de transmisión es fecal oral, aunque también se ha postulado la vía respiratoria.
El periodo de incubación es de 1 a 3 días y su excreción de 8 a 15 días; el reservorio para la persistencia de rotavirus entre las epidemias invernales aun es desconocido. Actualmente se han identificado 7 grupos de rotavirus de la A-G, de los cuales sólo los grupos A, B y C se han asociado a gastroenteritis en humanos y la mayoría de las casos se han asociado a cepas del grupo A, basándose en la sero- tipificación la glicoproteína vp7 y vp4 que constituyen la hemoglutina del virus y la probable proteína de fijación. Los rotavirus son relativamente resistentes a los desinfectantes utilizados habitualmente para superficies duras y a los aspectos higiénicos para el lavado de manos, pero son inactivados por cloro y dióxido de cloro.
3.4 AGENTE ETIOLÓGICO Los Rotavirus pertenecen a la familia reoviridae. Los miembros de esta familia de virus presentan las siguientes características comunes:
a) Las partículas virales tienen una geometría icosahédrica b) No están envueltos por una membrana lipídica.
c) Tienen un genoma compuesto por segmentos de ARN de doble cadena.
d) El ARN genómico no es infeccioso per se en ausencia de las proteínas virales.
e) La partícula viral contiene todas las enzimas necesarias para la producción de sus ARNs mensajeros.
f) La replicación viral se lleva a cabo exclusivamente en el citoplasma de la célula.
3.5 ESTRUCTURA DE LA PARTICULA VIRAL 3.5 –a ESTRUCTURA MOLECULAR CONSTITUCIONAL Su tamaño aproximado es de 70 nm y tiene un aspecto exterior de una rueda de carreta antigua, su genoma viral consiste en 11 segmentos separados de RNA viral bacteriano de doble cadena. Cada segmento representa un gen que codifica una de las proteínas estructurales y no estructurales del virus. Estos segmentos se pueden separar por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con tinción de nitrato de plata, observando patrones electroforéticos característicos de RV. Estudios realizados recientemente, utilizando criomicroscopía electrónica y reconstrucción de imágenes, han permitido realizar análisis detallados de las características estructurales de la partícula viral ó virión, con una resolución de aproximadamente 26 Å.
Las partículas virales tienen aproximadamente 75 nm de diámetro, con una geometría icosahédrica. El virión maduro está compuesto por tres capas concéntricas de proteína que engloban al genoma viral. La capa externa del virión esta formada por 780 moléculas de la glicoproteína VP7. De esta capa lisa se proyectan 60 espículas de 12 nm de longitud constituidas por dímeros de la proteína VP4; la base de éstos dímeros de VP4 interacciona con la capa intermedia del virión. Esta capa intermedia, de aproximadamente 10 nm de grosor, consta de 260 unidades morfológicas constituidas por trímeros de la proteína VP6, esta proteína es la más abundante del virus, constituyendo aproximadamente el 50% de la proteína total del virión. La capa intermedia, a su vez, rodea a la capa más interna del virión o nucleocápside, que está formada por 60 dímeros de la proteína VP2, la cual engloba al genoma viral. Una copia de la proteína VP1 y una de VP3 están asociadas con la cara interna de la capa de VP2, y localizadas en los doce vértices del icosahedro, donde se ha propuesto que llevan a cabo su función de replicar y modificar los genes del virus. También dentro de esta nucleocápside se encuentran los once segmentos de ARN de doble cadena (ARNdc) que constituyen el genoma del virus. (Ver anexo figura 3) Los estudios de criomicroscopía electrónica han revelado que estos segmentos de ARN parecen estar también ordenados geométricamente dentro de la partícula, y se ha propuesto que de los aproximadamente 18,500 pares de bases (pb) que constituyen al genoma viral, cerca de 4,500 pb están organizados con una simetría que parece depender del ensamble icosahédrico de VP2, la cual al hacer contacto con los segmentos de ARN, induce en estos su organización. Tomando en conjunto todas estas observaciones, se ha sugerido que las proteínas VP1, VP2 y VP3 están involucradas en la organización del genoma dentro de la nucleocápside mediante interacciones ARN-proteína.
La existencia de cada una de las capas proteicas del virus, así como las interacciones que existen entre VP7 y VP4, y de estas proteínas con VP6, han sido corroboradas mediante la producción de pseudo-partículas virales, a través de la co-expresión de los genes que codifican para cada una de estas proteínas (VP2, VP6, VP4 y VP7), en sistemas de expresión heterólogos, como el sistema de células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes. Estos experimentos también han demostrado que las proteínas virales tienen la habilidad intrínseca de auto-ensamblarse.
Por criomicroscopía electrónica se ha observado que la partícula viral completa contiene 132 canales acuosos, que han sido clasificados en tres grupos (I, II y III) dependiendo de sus características de simetría y tamaño. Estos canales atraviesan a la partícula viral desde la capa externa hasta la nucleocápside. Aún no es claro el papel que juegan estos canales durante el ciclo de replicación del virus, sin embargo se ha propuesto que podrían estar involucrados en la entrada de los metabolitos necesarios para la transcripción del ARN dentro de la partícula de doble capa, así como de la salida de los transcritos virales. De hecho, recientemente al observar por criomicroscopía electrónica partículas virales activas en el proceso de transcripción, se ha encontrado que los ARN mensajeros (ARNm) virales salen de la partícula a través de los canales tipo I, que se encuentran localizados en los 12 vértices de la partícula icosahédrica, en los que también se localizan las proteínas VP1 y VP3.
3.5 –b ESTRUCTURA PROTEICA ** Proteínas de la nucleocápside Las proteínas que conforman la nucleocápside son VP1, VP2 y VP3. Como ya mencionamos, es en estas partículas donde se lleva a cabo la replicación del ARN viral. La actividad responsable de esta función, la ARN polimerasa dependiente de ARN, forma complejos con otras proteínas virales. Las proteínas que constituyen los complejos varían, dependiendo de si la función del complejo es la de sintetizar ARN de doble cadena utilizando como templado el ARNm (partículas replicativas), o si se trata de sintetizar ARN mensajeros a partir del ARN de doble cadena (partículas activas en transcripción).
Recientemente se implementó un sistema libre de células para estudiar la replicación del genoma viral. Este sistema, que consiste en nucleocápsides que han sido "abiertas" por exposición a bajas concentraciones de sales a las cuales se les añade ARNm viral, para que sea transformado en ARNdc, ha sido bien caracterizado y ha sido utilizado para definir el papel de cada una de las proteínas involucradas, así como las regiones en los ARNm que son necesarias para que estos puedan ser replicados. También se ha implementado un sistema similar partiendo de la co- expresión de las proteínas virales (VP1, VP2 y VP3) en células de insecto. Estas tres proteínas se ensamblan de manera espontánea, y tienen actividad de replicarse si se les añade ARNm viral. Esto ha permitido determinar de manera más fina la importancia de cada una de las proteínas en la replicación del ARN. En estos sistemas se ha observado que el ARNm funciona eficientemente como templado para la síntesis del ARNdc, sin embargo, el ARNdc viral no sirve como templado para la síntesis de ARNm, lo que es consistente con la observación de que los requerimientos estructurales, o las proteínas requeridas para la transcripción (síntesis del ARNm) son diferentes de los requerimientos para la replicación (síntesis de la cadena complementaria del ARNm). Los estudios realizados en este sistema de replicación, han demostrado que VP2, y no VP6, es esencial para la actividad de replicación de la partícula. Estos resultados indican también que las partículas que forman la nucleocápside, o un subgrupo de estas proteínas, tienen la función tanto de replicasas, como de transcriptasas.
VP1. (Ver anexo-figura3) A pesar de que aún no existe evidencia directa para afirmar cual de las proteínas virales de la nucleocápside es la ARN polimerasa dependiente de ARN, la proteína VP1 (de 1088 aminoácidos), producto del gen 1 es la más probable, por las siguientes razones:
I. La secuencia de la proteína contiene regiones que tienen homología con motivos conservados entre la ARN polimerasas dependientes de ARN de otros virus.
II. VP1 está presente en partículas virales transcripcionalmente activas, y se puede entrecruzar con el ARNm, utilizando luz ultravioleta como agente entrecruzador.
III. VP1 es componente común de las partículas virales con actividad de ARN polimerasa (transcriptasa o replicasa). Además los complejos de VP1-VP2 co- expresados en células de insecto tienen la propiedad de sintetizar ARNdc in vitro a partir de ARNm viral.
VP2. (Ver anexo-figura3) El producto del gen 2, VP2, de 881 aminoácidos, es la proteína más abundante de la nucleocápside, y constituye la capa más interna del virus. Cuando esta proteína se expresa por si sola con el sistema de baculovirus se ensambla en partículas similares a las nucleocápsides, lo que sugiere que VP2 no depende de otros productos virales (ARNs o proteínas) para formar este tipo de partículas. VP2 es capaz de unirse a ARNs de cadena sencilla o doble, aunque tiene una mayor afinidad por los ARNs de cadena sencilla, función que podría estar relacionada con el empaquetamiento de los ARNs virales dentro de la nucleocápside.
En experimentos de reconstitución utilizando proteínas purificadas, se ha encontrado que aunque muy probablemente VP1 es la ARN polimerasa viral, esta requiere de VP2 para realizar su función.
VP3. (Ver anexo-figura3) Esta proteína, de 835 aminoácidos, es codificada por el segmento de ARN 3, es una proteína básica, y al igual que VP1 existen muy pocas copias de este polipéptido por virión. A VP3 se le ha atribuido la actividad de guanilil-transferasa del ARN viral por las siguientes observaciones:
I. Tiene una alta afinidad por ARN de cadena sencilla y no se une al ARN de doble cadena.
II. Su secuencia contiene motivos estructurales que se han encontrado en otras guanilil-transferasas.
III. Une GTP de modo covalente en una reacción reversible. Dado que esta actividad es necesaria para la síntesis de los ARNs maduros, pero no para los ARNdc, VP3 debe de ser un componente esencial de los complejos de transcripción y no de los complejos replicativos. De hecho, como ya mencionamos, los complejos de VP1-VP2 producidos en el sistema de baculovirus recombinante, son capaces de replicar ARNm.
** Proteínas de la capa intermedia La capa intermedia del virus esta formada por la proteína más abundante del virión, VP6, codificada por el gen 6 (color azul intermedio – anexo figura 3). Esta proteína, de 397 aminoácidos, juega un papel muy importante en la estructura del virión dado que interacciona tanto con la proteína VP2, hacia el interior de la partícula, como con VP4 y VP7 en la capa externa del virión. VP6 forma espontáneamente trímeros y es muy estable; esta característica y el hecho de que contiene determinantes antigénicos (o epítopes) conservados entre diferentes cepas de rotavirus, son la razón de que VP6 sea el blanco antigénico principal en los ensayos de diagnostico inmunológico para los rotavirus. Los epítopes de VP6 que son conservados entre todas las cepas de rotavirus del grupo A son llamados epítopes de grupo. En esta proteína también se han identificado otros epítopes, llamados epítopes de subgrupo, los cuales han sido utilizados como marcadores epidemiológicos para clasificar diferentes cepas dentro del grupo A.
Aparentemente el papel de VP6 en esta función es principalmente estructural, a través de mantener la conformación apropiada, o la organización del complejo transcripcional en la nucleocápside viral.
Recientemente se resolvió la estructura cristalográfica de esta proteína. Sabemos que la unidad estructural de VP6 es un trímero, y que en este trímero existen un sitio de unión al ion calcio, y un sitio de unión al ion zinc, aunque aún no es claro cual es la función de estos iones en la partícula viral. Esta proteína es hidrofóbica y altamente antigénica e inmunogénica.
** Proteínas de la capa externa La capa más externa del virus esta formada por las proteínas VP4 y VP7, que son las proteínas responsables de los primeros contactos con la célula huésped y por lo tanto tienen funciones que determinan la infectividad del virus, tales como:
A. La determinación del rango de huésped del virus B. La unión y la penetración del virus a la célula, C. Son las principales inductoras de anticuerpos neutralizantes.
VP7 (color amarillo exterior anexo figura 3). Es la segunda proteína más abundante en el virión y es codificada por el segmento de ARN 7, 8, o 9 dependiendo de la cepa de rotavirus que se analice. Esta proteína es altamente inmunogénica y es muy buena inductora de anticuerpos neutralizantes, que son serotipo específicos; Por estudios bioquímicos se conoce que VP7 es glicosilada co-transduccionalmente a medida que se inserta en el lumen del Retículo endoplasmático y la señal para esta inserción se encuentra contenida en el péptido señal presente en el extremo amino de VP7. La proteína VP7 es retenida en la membrana del RE, sin embargo no contiene la secuencia típica de retención en RE, lo que ha sido motivo de estudio para determinar la señal que le permite a esta proteína mantenerse como proteína residente en el RE.
Aún no se ha determinado ninguna función en la que VP7 participe directamente durante las primeras interacciones del virus con su célula huésped. Sin embargo, VP7 puede afectar la expresión de diferentes fenotipos y las propiedades antigénicas de VP4. Esto probablemente es el resultado de la interacción íntima de VP4 y VP7 en la superficie del virión.
También se ha observado que fenotipos, como la capacidad de formar placas, el tamaño de placa, y la especificidad de unión al receptor, que son características especificadas por VP4, son afectados por el fondo genético y dependen del origen parental de ambas proteínas de la capa externa.
VP4 (Pedículo exterior rojo anexo- figura 3) Es la otra proteína de capa externa y es codificada por el segmento de ARN 4. Esta proteína, de 776 aminoácidos tiene funciones esenciales en el ciclo de vida del virus, incluyendo la unión al receptor y la penetración a la célula. Por lo tanto, las propiedades de esta proteína son determinantes importantes del rango de huésped, virulencia, tropismo, e inducción de inmunidad protectora. Esta proteína tiene varios dominios funcionales, los cuales se discuten a continuación:
La infectividad de los rotavirus se incrementa, y muy probablemente depende, del tratamiento del virus con tripsina. Este tratamiento proteolítico resulta en el rompimiento específico de VP4 (776 aa) en dos polipéptidos de menor peso molecular, llamados VP8 (aa 1-131) y VP5 (aa 247 a 776). El corte de VP4 no afecta la unión a la célula, y más bien ha sido asociado con la entrada del virus al citoplasma celular, por penetración directa. El mecanismo por el cual el corte con tripsina activa la infectividad viral se desconoce aún, sin embargo, se ha propuesto que la penetración del virus puede ser iniciada por los extremos recién generados por el corte con tripsina o por un posible cambio conformacional de VP4 a consecuencia del corte con esta proteasa.
Algunas cepas de rotavirus de origen animal tienen la capacidad de aglutinar eritrocitos, y esta aglutinación es mediada por la interacción de VP4 con el ácido siálico (AS) presente en la superficie de los eritrocitos.
VP4 contiene dos puentes di-sulfuro intramoleculares, uno entre las cisteínas en VP8, y otro entre las cisteínas en VP5. El puente di-sulfuro en VP5 se encuentra conservado en todas las cepas de rotavirus, mientras el puente di- sulfuro en VP8 no se encuentra en la mayoría de las cepas de origen humano. La relevancia biológica de estos puentes no se ha demostrado aún.
La proteína VP5 tiene la capacidad de unirse específicamente a la superficie de las células, y esta interacción se da con la integrina a2b1, a través de la secuencia DGE presente en la posición 308-310 de VP5.
En VP5 existe una región hidrofóbica la cual comparte homología con el dominio de fusión de la proteína E1 de los virus Sindbis y Semliki. Esta región tiene la actividad de permeabilizar liposomas in vitro, sin embargo su funcionalidad in vivo aún no ha sido demostrada.
Proteínas no estructurales Las proteínas no estructurales de rotavirus, NSP1 a NSP6, son codificadas por los segmentos 5, 7, 8, 10 y 11, respectivamente. Como su nombre lo indican estas proteínas no forman parte de la estructura del virión. Son sintetizadas en el citoplasma de la célula durante la infección y tienen funciones relacionadas con el control de la síntesis de proteínas celulares y virales, con la replicación del genoma, con el empaquetamiento de los genes virales y con la maduración de la partícula viral en el interior de la célula, aunque aún no se define completamente el papel de cada una de ellas en estas funciones. (Anexo figura 3) 3.5-c RESUMEN DE LA ESTRUCTURA VIRAL En resumen, los rotavirus no contiene envoltura y principalmente consisten por su importancia para el desarrollo de la enfermedad, en una cápside externa (dos proteínas vp4 y vp7) y un core (nucleocápside).
*** La cápside externa, esta estructurada por la proteína VP4 que está involucrada en una variedad de funciones como virulencia, aglutinación de glóbulos rojos y la penetración del virus a la célula. Por su parte, la VP7 es responsable de la unión inicial del virus a la célula blanco. Ambas proteínas de superficie contienen determinantes antigénicos, que representan blancos inmunológicos importantes e inducen respuesta inmune humoral y celular.
La respuesta humoral (anticuerpos) tiene la capacidad de neutralizar la infectividad del virus tanto in vitro (cultivo de tejidos) como in vivo (animales experimentales).
La especificidad de estos anticuerpos para neutralizar diferentes cepas de rotavirus ha sido usada para clasificarlos en varios serotipos. Se ha propuesto nombrar G a los serotipos de VP7 (por glicoproteínas) y P a los serotipos de VP4 (por proteína sensible a proteasa). Basados en VP7 se han identificado a la fecha 14 serotipos diferentes de rotavirus del grupo A, de los cuales nueve infectan al humano (G1 a G4, G6, G8 a G10 y G12), aunque sólo cuatro de ellos (G1 a G4) son los responsables de la mayoría de las infecciones.
*** El core o nucleocápside, está formado por 4 proteínas vp1 vp2 vp3 y vp6 (que constituyen el 50% de la masa viral y el 80% del core viral) y de 6 proteínas no estructurales (NS53, NS34, NS35, NS28, NS26 y NS12) también son producidas durante la infección final.
Con base en las características antigénicas presentes en la proteína VP6 de la cápside interna se pueden clasificar en:
a) Grupos de A – G, de los cuales, los tres primeros se han reportado en humanos y animales, mientras que de la D a la G solo se han detectado en animales.
b) Subgrupos denominados I y II, de los cuales el I se ha encontrado tanto en humanos como en animales y se asocia con un patrón electroforético corto, en tanto que el subgrupo II sólo se presenta en humanos y se asocia con un patrón electroforético largo.
Los rotavirus del grupo A son los principales agentes de diarrea infecciosa aguda, tanto en los niños como en los animales jóvenes (ver anexo cuadro 2) 3.6 CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS Y FUNCIONALES DE LA PARTICULA VIRAL Existen dos tipos de partículas virales con diferentes características estructurales y funcionales:
a. La partícula completa, que contiene las tres capas proteicas, es también llamada TLP (Triple-Layered Particle); esta es la partícula infecciosa ya que la presencia de la capa externa formada por las proteínas VP4 y VP7 le permite unirse y penetrar a su célula huésped.
b. La partícula que contiene dos capas proteicas o DLP (Doble-Layered Particle); esta partícula no es infecciosa, pero es activa transcripcionalmente.
c. Las partículas que contienen una sola capa de proteínas, o nucleocápsides, que tienen la actividad de replicar al genoma viral.
Además de tener diferentes actividades biológicas, estas partículas tienen diferentes propiedades fisicoquímicas. Entre estas vale la pena mencionar el hecho de que tienen diferentes densidades, lo que nos permite separarlas mediante gradientes de cloruro de cesio. También, dada su diferencia en tamaño, estos tres tipos de partículas pueden ser separadas mediante electroforesis en gel de agarosa.
Las partículas de rotavirus son relativamente estables. Las partículas virales son funcionales en un rango de pH de 3 a 9, y el virus es estable por meses a 40C, y aún a 200C cuando se mantiene en 1.5mM de calcio. La partícula completa mantiene su integridad y su infectividad cuando es tratada con solvente orgánico tales como éter, cloroformo o freón, lo que refleja la ausencia de lípidos en su estructura. Pero pierde su infectividad al ser tratada con desinfectantes tales como formalina, cloro, betapropiolactona y etanol al 95%, quizás por la perdida de la capa externa.
3.7 GENÉTICA DEL ROTAVIRUS 3.7-a GENOMA El genoma de los rotavirus está constituido por once segmentos de ARN de doble cadena, (ARNdc) cuyos tamaños varían de aproximadamente 660 pb del gen más pequeño, hasta aproximadamente 3300 pb para el gen más grande. Esta diferencia de tamaños permite que estos segmentos al ser separados electroforéticamente presenten un patrón característico, típico y único para los rotavirus, lo que ha sido la base para desarrollar un método diagnóstico para estos virus. En general el patrón electroforético, o electroferotipo, consiste de un grupo de cuatro segmentos de ARN de alto peso molecular; 5 segmentos de tamaño mediano (5 a 9) que incluyen un triplete muy característico formado por los segmentos 7, 8 y 9; y los dos segmentos más pequeños.
Como ya se ha mencionado, el genoma viral desnudo (en ausencia de las proteínas de la cápside) no es infeccioso, ya que para transcribirse, este genoma necesita de una ARN polimerasa que pueda utilizar ARN como molde. Esta polimerasa no se encuentra en las células, por lo que el virus debe de proveer esta actividad para garantizar su replicación.
Los ARN mensajeros (ARNm) de rotavirus contienen la estructura de CAP en su extremo 5', pero a diferencia de la mayoría de los ARNm celulares, no tienen poli(A) en su extremo 3'. En general, la secuencia nucleotídica de los genes virales es rica en A/T (58-67%). Cada segmento de ARN codifica por una proteína viral, excepto el gen 11 el cual contiene dos marcos abiertos de lectura, los cuales codifican dos proteínas virales. En la mayoría de los casos la traducción de los ARNm comienza en el primer codon de inicio.
Como mencionamos anteriormente, el genoma de estos virus se puede rearreglar, esto es que cuando una célula es co-infectada por dos cepas distintas de rotavirus, la progenie viral resultante de esta co-infección es una población de virus que contiene diferentes combinaciones de los diferentes genes parentales. La animación 2 ilustra una analogía a este proceso de rearreglo génico comparándolo con un juego de barajas. Este tipo de rearreglos génicos entre rotavirus de diferentes cepas es posible gracias a las secuencias consenso que comparten todos los segmentos del genoma viral y es una fuente de variabilidad génica de esta familia de virus.
También, recientemente se ha reportado que en las regiones no traducidas de los mensajeros de los rotavirus existen señales de replicación que actúan en cis. Entre estas, se ha definido una señal promotora mínima, esencial para la síntesis de la hebra negativa de ARN (que es la hebra de ARN complementaria al mensajero o hebra positiva) durante la replicación del genoma, la cual esta formada por los últimos siete nucleótidos del extremo 3'. Se han identificado otras dos regiones adicionales, que funcionan como reguladores positivos, ya que en presencia de estas secuencias se obtiene un nivel optimo de síntesis de los ARNm virales; estas secuencias consisten de aproximadamente 25 nucleótidos, inmediatamente "río arriba" de la región promotora del extremo 3' y de al menos 10 nucleótidos en el extremo 5' del ARNm.
3.7-b ASIGNAMIENTO GÉNICO Que proteína es codificada por cada segmento de ARN viral? Esta pregunta se abordó inicialmente mediante la traducción in vitro de cada uno de los ARN mensajeros virales y/o analizando las proteínas producidas por virus rearreglados provenientes de coinfecciones con dos cepas de virus diferentes. Los primeros asignamientos génicos completos se llevaron a cabo con el rotavirus de simio SA11.
En la figura 3 de los anexos se muestra este asignamiento. Las proteínas estructurales del virus, es decir aquellas que conforman la partícula viral, se denominan con el prefijo VP (Viral Protein).
Seis de los genes virales, los genes 1, 2, 3, 4, 6, y 9 codifican por las proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 y VP7, respectivamente. Los 5 genes restantes (segmentos 5, 7, 8, 10 y 11) codifican por las seis proteínas no estructurales, las que se denominan con el prefijo NSP (Non Structural Protein). Estas proteínas, que no forman parte del virión, se sintetizan en la célula durante el ciclo replicativo del virus y tienen funciones que discutiremos más adelante.
Algunas de las proteínas virales sufren modificaciones post- traduccionales, tales como glicosilación, fosforilación, o cortes proteolíticos. Estas modificaciones alteran el peso molecular aparente de las proteínas, por lo que los pesos moleculares que se pueden predecir en base al número de aminoácidos que contiene cada proteína, no correlaciona en algunos casos con el peso molecular observado para una proteína dada.
3.8 TRANSMISIÓN La principal ruta de transmisión de los rotavirus es la vía fecal-oral, aunque también se ha especulado que el contacto persona a persona, el contacto con secreciones respiratorias, y/o el contacto con superficies contaminadas pudieran ser fuentes de transmisión, ya que los altos índices de infección por este virus en los primeros tres años de vida en todo el mundo son independientes de las condiciones higiénicas y sanitarias. También se han descrito brotes en guarderías y residencias de ancianos. La infección es especie-específica (RV-humano); ya que la transmisión de rotavirus entre el hombre y animales no ha sido documentada, en investigaciones aleatorias realizadas en epidemias de diarrea por RV que se presentaron en Australia, EE.UU., Israel, Japón, Tailandia y Brasil entre 1974 y 1993, caracterizadas por manifestaciones clínicas severas, en niños menores de 5 años de edad; se encontró que algunas de las cepas infectantes tuvieron una marcada homología genética mayor del 90% con cepas provenientes de gatos, perros, cerdos, vacas y caballos (Ver anexo cuadro 3).
La presencia de RV de animales en estas epidemias presupone que la transmisión interespecies de este agente puede estar ocurriendo de manera natural y pudiera estar participando en forma importante en la evolución de los RV. Sin embargo, a pesar de la alta homología genética con las cepas aisladas en animales, la transmisión de una especie a otra no se ha podido comprobar en la naturaleza.
3.9 INMUNIDAD Los estudios sobre inmunidad protectora a raíz de la infección por rotavirus o de las vacunas contra el rotavirus ayudan a los científicos a comprender la gama completa de respuestas biológicas de la protección contra la infección. Ruiz-Palacios describió las respuestas inmunitarias asociadas más estrechamente con la protección contra las infecciones subsiguientes. Señaló que, de manera contraria a la mayoría de las infecciones víricas sistémicas como parotiditis o sarampión, en la cual una infección única protege plenamente contra la reinfección futura, son necesarios varios episodios de rotavirus antes de que un niño esté protegido completamente.
Con cada infección adicional por rotavirus disminuye la gravedad de los síntomas y aumenta la inmunidad. Los científicos están en condiciones de usar el nivel de anticuerpo que se encuentra en membranas mucosas, IgA, como una medida de penetración de las vacunas, es decir, para determinar si un lactante vacunado fue infectado por la cepa y desarrolló una respuesta inmunitaria.
Los investigadores aún analizan las proteínas del rotavirus que obtienen la respuesta inmunitaria humana más fuerte y si esas respuestas son homotípicas (eficaces contra solo una cepa del virus) o heterotípicas (efectivas contra más de una cepa vírica). El Dr. Harry Greenberg, de la Universidad de Stanford, analizó los conocimientos disponibles sobre la respuesta inmunitaria al rotavirus. Hizo notar que una respuesta inmunitaria dirigida al menos a dos proteínas víricas, VP4 y VP7, produce ambas formas de inmunidad. Mencionó que "el tipo de inmunidad que se tiene cuando ha y protección depende del tipo de anticuerpo que se ha generado". También facilitó nuevos datos preliminares de la Dra. Mary Estes que indican que incluso otra proteína del rotavirus, NSP4, provoca una respuesta inmunitaria en los ratones. No obstante, esto no se ha estudiado aún en los seres humanos.
También se ha determinado que ciertas secciones del sistema inmunitario intervienen en la lucha contra el rotavirus. Si bien las células T contribuyen a la eliminación de una infección, las células humanas B son fundamentales para superar el rotavirus. Pero a fin de atacar el virus, las células B primero deben llegar al sitio de la infección en el intestino. Greenberg describió en un trabajo reciente como ha identificado algunas de las moléculas y los receptores que ayudan a las células B a localizar su blanco: la integrina ±4 2 seg.
Respiración
Tranquila
Rápida
Profunda
Ingestión de Líquidos
Toma normal
Toma ávidamente
No bebe
Extremidades
Calientes
Frías
Pálidas o azules
Estado
Neurológico Normal Irritabilidad Apático o somnoliento Sintomas: Fiebre Si No Tº centígrados.
Dolor abdominal Si No TECNICA DE LABORATORIO Inmunocromatografía o Elisa de heces fecales Positivo Negativo
ANEXO DE CUADROS CUADRO 1 DIEZ PRINCIPALES CAUSAS DE MORTALIDAD INFANTIL EN EL AÑO 2003
CUADRO 2
CUADRO 3
CUADRO 4 MECANISMOS POTENCIALES POR LOS QUE EL ROTAVIRUS PRODUCE DIARREA
CUADRO 5 GRADO DE DESHIDRATACIÓN SEGÚN ESTIMACIÓN CLINICA (Cuadro de datos de la OMS con modificación de las Categorías de datos por Fortín y Parent)
Si el niño está semi-comatoso o muy irritable añadir 3.
TIPO VALORACIÓN Deshidratación leve 0-3 puntos Deshidratación Moderada 4-8 puntos Deshidratación Severa 9-17 puntos
ANEXO DE FIGURAS
Figura 1 Distribución global de las 600.000 a 800.000 muertes anuales que causa la diarrea por rotavirus en la población pediátrica según el CDC de los Estados Unidos 2003.
Figura 2
Rotavirus.
Figura 3
Asignaciones codificantes del virión del rotavirus en relación a las proteínas localizadas en la estructura del rotavirus-Imagen 3D Genome Segments (segmentos de genoma): Separación de los once segmentos confirmados del genoma rotaviral. Encoded proteins(proteínas codificantes): Presentación de la separación de las posibles proteínas intracelulares sintetizadas mediante técnicas de laboratorio en base al segmento genético del cual fueron decodificados .La proteína estructural (VP) y la proteínas no estructurales son sintetizadas en la célula infectada.
Viron Schematic (esquema del virión): Presentación de las localizaciones de varias proteínas estructurales del virión de rotavirus. Se observa los arreglos de las proteínas en base a tres concéntricas capas y la localización del VP1/VP3 y la localización y constitución de las 5 puntas vértices de la estructura icosahédrica Reconstruction (reconstrucción): Reconstrucción en tridimensional del virión a una resolución de 23 A mediante un modelo computarizado. El esquema de color indica la localización de varias proteínas.
Figura 4 PATOGENIA DEL ROTAVIRUS.
PROTEINA NSP4 ESQUEMA DEL CONTACTO DE ESTA PRIMERA PROTEINA ENTEROTOXIGÉNICA VIRAL
FIGURA 5 FISIOPATOLOGIA DEL ROTAVIRUS INTERACCION INICIAL DEL VIRUS EN LAS CRIPTAS DEL EPITELIO DEL INTESTINO DELGADO
(OBSERVESE AL ROTAVIRUS IMPREGNADO DE COLOR AZUL) FIGURA 6 FISIOPATOLOGIA DEL ROTAVIRUS
DISTRIBUCION Y FOCALIZACION DEL ROTAVIRUS EN LAS CRIPTAS INTESTINALES A NIVEL DE POSIBLES SITIOS PRODUCTORES DE LACTASA (OBSERVESE AL ROTAVIRUS IMPREGNADO DE COLOR AZUL) FIGURA 7 TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA
FIGURA 8 TECNICA DE RADIOINMUNOENSAYO
FIGURA 9 INMUNOELECTROMICROSCOPÍA
FIGURA 10 HIBRIDACIÓN CON SONDAS
FIGURA 11 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA.
1= Primer paso. Mezcla de reacción 5= Desnaturalización
2= Desnaturalización 6= Hibridización y extensión
3= Hibridización y extensión 7= ADN duplicado
4= ADN duplicado
FIGURA 12 CULTIVO DE ROTAVIRUS A MANERA DE CONGLOMERADOS.
LA OBSERVACIÓN SE REALIZA CON MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
Dedicamos este trabajo a todas y cada uno de los individuos de las nuevas generaciones que directa o indirectamente deseen conocer esta investigación para fundamentar y ajustarlos a sus propios estudios, de esa manera estaremos satisfechos del esfuerzo hecho, así como también deseamos que vuestros trabajos sirvan a otros a lo largo de la linea del tiempo y ello siga contribuyendo en un sin fin de avance y tecnología para nunca extinguir el progreso de nuestra humanidad. Nuestra dedicatoria especial a nuestro Padre Dios, nuestros padres que con tanto amor y esmero estimularon nuestro crecimiento como personas tanto de forma física, espiritual y moral; a nuestra segunda casa, la Escuela de Medicina de la Universidad Técnica de Manabí, que sin ella no hubiésemos tenido las direcciones y guías que con esmero y dedicación terminaron en la culminación de nuestra carrera y a nuestra tercera casa El Hospital Dr. Verdi Cevallos Balda de nuestra ciudad Portoviejo, Institución de Salud que contribuyó a pulir nuestras enseñanzas para aplicar nuestros conocimientos en salud y transmitirlos y utilizarlos de forma adecuada, cuidadosa y correcta en la curación de nuestros hermanos y hermanas de nuestra población Manabita.
Los Autores.
A Dios.
A Nuestros Padres, Hermanos y demás familiares. A la Universidad Técnica de Manabí.
A las personas que nos apoyaron e incentivaron a continuar con nuestro trabajo.
A todos y cada uno de nuestros profesores y Doctores que han contribuido para nuestros conocimientos y actitudes.
Al Hospital Dr. Verdi Cevallos Balda de Portoviejo quien nos abrió sus puertas para nuestro aprendizaje.
A los Señores médicos tratantes del área de Hospitalización pediátrica del Hospital Verdi Cevallos Balda de Portoviejo.
Al Personal del Departamento de Estadística del Hospital Verdi Cevallos Balda de Portoviejo.
A los Señores Miembros del Tribunal de Tesis.
Los Autores.
CERTIFICACIÓN DEL DIRECTOR DE TESIS
Certifico que este trabajo de Tesis titulado INCIDENCIA DE SÍNDROME DIARREICO AGUDO POR ROTAVIRUS EN MENORES DE 3 AÑOS INGRESADOS EN EL HOSPITAL VERDI CEVALLOS BALDA DURANTE ENERO – JUNIO 2005, ha sido dirigido, asesorado supervisado y realizado bajo mi dirección en todo su desarrollo, y dejo constancia de que es original de los autores Juan Pablo Macias Fernández y Yandri Delgado Mantuano.
Dra. Melania Alcívar
DIRECTORA DE TESIS CERTIFICACIÓN DEL TRIBUNAL DE REVISIÓN Y EVALUACIÓN
Nosotros los miembros del tribunal de Revisión y Evaluación indicamos y certificamos que el trabajo de tesis Titulado: INCIDENCIA DE SÍNDROME DIARREICO AGUDO POR ROTAVIRUS EN MENORES DE 3 AÑOS INGRESADOS EN EL HOSPITAL VERDI CEVALLOS BALDA DURANTE ENERO – JUNIO 2005 se realizó con el cumplimiento de todos los requisitos estipulados por el reglamento General de Graduación de la Universidad Técnica de Manabí.
Dr. Manuel Cabrera Dra. Betsabhé Pico PRESIDENTE DE TESIS MIEMBRO DE TRIBUNAL Lcda. Julia Espinel ASESORA METODOLÓGICA DECLARACIÓN DE AUDITORIA Juan Pablo Macias Fernández y Yandri Alexander Delgado mantuano, Egresados de la Escuela de Medicina perteneciente a la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Técnica de Manabí, declaramos que el presente trabajo de investigación titulado"INCIDENCIA DE SINDROME DIARREICO AGUDO POR ROTAVIRUS EN MENORES DE 3 AÑOS INGRESADOS EN EL HOSPITAL VERDI CEVALLOS BALDA. ENERO-JUNIO 2005", es de auditoria propia y como tal será protegido por las leyes establecidas en el Estado Ecuatoriano de derecho tal como se establece en los Artículos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de la Ley de Propiedad Intelectual, por lo tanto la falta de los permisos correspondientes o su mal uso será penalizado por la ley; así mismo se asume todas las consideraciones y responsabilidades que correspondan al mismo.
Portoviejo, Noviembre del 2005
Juan P. Macías Fernández Yandri A. Delgado Mantuano
UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE MEDICINA Titulo: "INCIDENCIA DE SINDROME DIARREICO AGUDO POR ROTAVIRUS EN MENORES DE 3 AÑOS INGRESADOS EN EL HOSPITAL VERDI CEVALLOS BALDA. ENERO-JUNIO 2005" PROYECTO PREVIO A LA OBTENCION DEL TITULO DE DOCTOR EN MEDICINA Y CIRUGIA.
Portoviejo, Noviembre del 2005.
Integrantes:
Macías Fernández Juan Pablo. Delgado: Mantuano Yandri Alexander.
Directora de tesis:
Dra. Melania Alcivar Garcia.
Autor:
Macías Fernández Juan Pablo.
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