Diferenciación molecular de serovares de leptospira sp usando un ensayo de pcr basado en el elemento repetitivo Rep1 (página 2)

Taxonomicamente las leptospiras se pueden clasificar por métodos serologicos como el CAAT (Prueba de aglutinación cruzada y absorción) en la que el taxón básico s el serovar en la que los anticuerpos son dirigidos contra los lipopolisacaridos leptospirales.

Recientemente se han realizado pruebas moleculares para poder clasificar genomaespecies con una clasificación de 17 especies (32).

En el Perú la leptospirosis esta distribuida en especial en la región nororiental del país como Loreto y San Martín (8).

Debido a la importancia de esta zoonosis bacteriana surge la necesidad del uso de antimicrobianos efectivos contra la bacteria patogénica Leptospira sp así como el uso de técnicas de identificación efectivas para el diagnostico. En la actualidad existen técnicas como el MAT (Prueba de Microaglutinacion) el cual es usado como el método de referencia, para esta prueba se necesita de una batería antigénica en constante mantenimiento lo cual implica un riego en el manejo de la misma, además el uso de MAT esta confinado a pocos laboratorios referenciales por la infraestructura necesaria. Otra técnica de amplio uso es la prueba de ELISA de mucha ayuda como prueba tamiz, pero carece de la capacidad de caracterizar serovares de Leptospira sp. Es importante mencionar que tanto MAT como ELISA por ser pruebas serologicas requieren un tiempo mínimo de 7 días para la formación de anticuerpos, esta es su principal desventaja para emplearlas durante un diagnostico temprano (casos agudos) donde el tiempo de identificación del agente etiológico es importante. (2).

El uso de pruebas moleculares resuelve el factor tiempo, además de presentar en algunos casos mayor especificidad y sensibilidad en comparación a las pruebas serologicas. (22)

Entre las desventajas del uso de pruebas moleculares como RFLP, PCR-IS1500 (Secuencia de inserción), RAPDs están: alto costo (RFLP), falta de reproducibilidad (RAPDs), así como la incapacidad para discriminar a nivel de serovares (IS 1500), (14-15); esto ultimo epidemiológicamente importante ya que reportes previos sugieren una diferente actividad virulenta de los serovares circulantes durante un brote (20). En tal sentido la prueba de Rep 1 PCR se presenta como una alternativa a los métodos moleculares actuales, ya que entre sus ventajas están: su costo semejante al de una prueba de PCR convencional, la utilización de un solo primer, la capacidad de discriminar entre serovares obtenidos de un aislamiento a trabes de un patrón de bandas, presentándose como una prueba complementaria a la tipificación serologica y la utilización de antisueros.

El objetivo del presente trabajo es lograr la identificación de los serovares mas relevantes epidemiologicamente a trabes del una prueba de PCR-Rep1.

Marco teórico

ANTECEDENTES

Las espiroquetas pertenecientes a la familia Leptospiraceae fueron primero descubiertas en 1914 por Inada y Cols en Japón, posteriormente Noguchi estudio los microorganismos que Inada aisló de pacientes con ictericia, observando una similar morfología con espiroquetas saprofitas aisladas aproximadamente al mismo tiempo en los Estados Unidos. Las espiroquetas saprofitas fueron aisladas por Wolbach y Binger de agua estancada y fueron llamadas Spirocheta biflexa, mientras que Inada llamo a su aislamiento Spirocheta icterohemorrhagia. Al estudiar los aislamientos japoneses Noguchi encontró diferencias morfológicas entre todos los géneros de espiroquetas conocidas y decidió en 1917 crear un nuevo género de espiroquetas llamado Leptospira (9). En la actualidad los aislamientos se realizan de sangre, tejidos aguas u otros reservorios contaminados, el medio mas óptimo para el aislamiento de Leptospira es el medio semisólido EMJH.

Las pruebas moleculares para identificación de Leptospira sp son relativamente modernas que aun precisan más estudios sobre su efectividad y utilidad. Entre las mas utilizadas tenemos: Marcado con sondas de ADN, hibridación de ARN con marcaje radioactivo y PCR con mayor efectividad en muestras de orina (7). La importancia de diferenciar entre los numerosos serovares de Leptospira ha llevado a muchos investigadores a ensayar múltiples métodos moleculares. Zuerner en 1997 propuso una diferenciación comparando un método de hibridación (Southern Blot) y con un ensayo de PCR (5). Anteriormente en Francia, Perolat y su grupo habían evaluado los métodos de ribotipificacion, AP-PCR y MRSP pero sin conseguir mayor diferenciación a nivel de serovares (4). Los métodos de identificación basados en hibridación de DNA como Southern Blot permiten identificar la homologia o heterogeneidad dentro de un serogrupo, así como conocer las relaciones genomicas entre las cepas de Leptospiras (3).

El LSSP-PCR es una de las últimas técnicas usadas llevando a cabo una re-amplificación en condiciones de baja astringencia para obtener patrones de bandas que permitan discriminar más allá del nivel de especies. (10).

Estudios en diferentes especies de eubacterias sugieren la existencia de secuencias de DNA repetitivas que fueron descritas utilizando los métodos de PCR y la hibridización por Slot blot. Entre estos se han estudiado oligonucleótidos como: secuencias repetitivas palindromicas extragenicas (REP), o elementos íntergénicos repetitivos enterobacteriales de consenso (ERIC), estas secuencias obtenidas a trabes de amplificación por PCR, producen patrones de bandas a trabes de un gel de agarosa. Estas bandas han mostrado fingerprints inequívocos de diferentes especies de eubacterias (6).

Los métodos en los que se usan elementos repetitivos para la diferenciación de Leptospiras han dado mejores resultados, en combinación con digestión con endonucleasas de restricción (1).

Un estudio reciente en el que se realizo una búsqueda de regiones repetitivas permitió desarrollar un método de análisis del numero de repeticiones en tandem multi-locus variable (MLVA), encontrando seis regiones muy informativas para la diferenciación de algunos serovares de Leptospira interrogans (11).

Generalidades

1.-TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN

Las Leptospiras pertenecen a familia Leptospiraceae, segunda familia del orden Spirochaetales. En los últimos años y gracias a la utilización de nuevas herramientas y métodos de clasificación, se han reconocido varias especies del género Leptospira.

Clasificación taxonómica y especies de Leptospira sp. (28)

División: Procariontes

Clase: Schizomicete

Orden: Spirochaetales

Familia: Leptospiraceae

Géneros:

Leptospira Leptonema Turneria

Otros géneros relacionados

Familia: Spirochaetaceae

Género: Cristispira

Spirochaeta, Brachyspira, Brevinema, Anguilina, Serpulina, Treponema, Borrelia

Especies de Leptospira

Patógenas y Saprofitas

L. interrogans 2

L. borgpetersenii

L. noguchii

L. santarosai

L. alexanderi 1

L. kirschneri

L. meyeri

L. fainei

L. Weilii

L. inadai,

L. Biflexa 3

L. wolbachii

L. parva

1 Fue descrita recientemente, pero su capacidad patogénica no está clara todavía. Sus estados patogénicos no han sido esclarecidos.

2 Más de doscientos cincuenta serovariantes agrupadas en veinticinco grupos

3 Sesenta y tres serovariantes agrupados en treinta y ocho serogrupos (No patógena para humanos inmunocompetentes).

1.1 CLASIFICACIÓN SEROLÓGICA

Antes de 1989, el género Leptospira fue dividida en dos especies, L. interrogans, que incluye todas las Leptospiras patógenas y/o de vida parasitaria, y L. biflexa, especie en la que se agrupan todas las saprofitas aisladas del medio ambiente (22). A pesar de que esta denominación es la que se ha estado utilizando durante varios años, fue oficialmente admitida en 1986. Las dos especies pueden ser diferenciadas por cualidades culturales L. biflexa crece a 13º C en presencia de 225ug/mL de 8-azoguanina, mientras que L. interrogans es negativa para ambas propiedades (22).

Los seroprupos no poseen taxonómica propia ni se encuentran definidos, pero tienen importancia epidemiológica (22).

El serovar es el taxón básico. Dentro de cada especie de Leptospira, se incluyen uno o más serovares, que se diferencian entre si por su composición antigénica (2). La definición de serovar fue formulada por primera vez en 1954 por Wolff y Broom, y no fue únicamente por clasificación sistémica, sino para su aplicación práctica y la descripción de la relación entre hospedero-parásito. La clasificación actual utiliza lo que estos dos autores dejaron planteado acerca de la determinación de los serogrupos y serovares (20). Por razones prácticas, los serovares relacionados antigenicamente se clasifican bajo el mismo serogrupo. Esta forma de clasificación es referida como la clasificación clásica u oficial y esta basada en las técnicas de aglutinación cruzada tras absorción utilizando el método de aglutinación microscópica (CAAT). (22)

1.2 Clasificación Alternativa

La aparición de nuevos métodos de clasificación e identificación de Leptospira, responde a la necesidad de encontrar métodos más fiables y de menos subjetividad que el método clásico que además está considerado como lento y difícil de estandarizar (18). Aunque se recomienda que el sistema de clasificación taxonómica siga basándose a nivel de serovar, otros métodos opcionales para la identificación y clasificación han sido desarrollados como: anticuerpos monoclonales, patrones a partir de fragmentos de restricción, sondas de ADN, estudios de actividad aminopeptidasa, microscopia electrónica, etc (25).

Diagnóstico

2.1.-DIAGNÓSTICO EPIDEMIOLÓGICO

En aquellos cuadros compatibles con Leptospirosis en humanos, se debe considerar los siguientes aspectos: Síntomas clínicos, edad, sexo, dirección, ocupación, antecedentes y lugar de exposición (contacto con animales,y fuentes ambientales), factores climáticos: precipitación, temperatura, inundación, desastres naturales, fecha de inicio de síntomas, fecha del diagnóstico. (22)

2.2.-DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Tiene un carácter presuntivo y se realiza fundamentalmente a través de los signos y síntomas que presenten los humanos como ictericia, anorexia, dolor de cabeza, vómitos, mialgia, dolor abdominal, náuseas, tos, hepatomegalia, limfadenopatia y diarreas. Además las lesiones anatomopatológicas características de la enfermedad aportan una gran ayuda (21).

2.3.-DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Las técnicas bacteriológicas son las más complejas, pero son las que brindan resultados más confiables, confirmando a trabes del aislamiento y la identificación del microorganismo.

Los métodos serologicos se pueden dividir en: técnicas indirectas, que detectan anticuerpos contra las leptospiras y las técnicas directas encaminadas a la detección de leptospiras o sus antigenos. (22)

2.3.1 MÉTODOS DE DIAGNOSTICO

TECNICAS INDIRECTAS

Prueba de Microaglutinacion (MAT)

Es el método serológico de referencia a la hora de evaluar otras pruebas para el diagnóstico de Leptospirosis. Se emplea para detectar anticuerpos en sueros de sospechosos o enfermos (humanos y animales) donde el suero del paciente sospechoso y enfermo reacciona con antígenos vivos de leptospiras de 10 días de crecimiento en medio líquido EMJH enriquecido, y es el más utilizado cotidianamente (19).

El MAT fue ideado por Martin, en 1917 y en 1918, Martin y Pettit lograron describir el fenómeno de aglutinación y "lisis" con suero (20). Desde entonces, el método ha sido modificado y mejorado por Schüffner y Mochtar, 1926;Borg-Peterson y Fagroeus, 1949; Wolff, 1954; Carbrey, 1960; Galton , 1965;Cole , 1973; Sulzer y Jones, 1973. Ellos trataron de estandarizar factores como: tiempo y temperatura de incubación, el punto de corte de la concentración de antígeno y la fecha de siembra.

En la actualidad, para obtener una adecuada sensibilidad, se recomienda utilizar serovares representativos de todos los serogrupos presentes en un lugar determinado. El título de anticuerpos del suero será la dilución más alta en la cual encontramos 50 % de aglutinación. En seres humanos para este método se considera lo siguiente:

En caso de una sola muestra, el título serológico = 1:800 confirma el diagnóstico. Los títulos comprendidos entre 1:50 y 1:800 deben ser interpretados en el marco de la situación clínico-epidemiológico del paciente. Para las muestras pareadas, 1:1600 o más es confirmatorio. (22)

A pesar de ser la prueba más recomendada y extendida, presenta una serie de desventajas: no distingue anticuerpos vacunales de los de infección (17), resulta difícil su estandarización ya que su valoración es subjetiva, requiere el mantenimiento de cultivos de leptospiras y no siempre detecta a los animales infectados, en especial cuando el serovar implicado es hardjo, que presenta como característica ser poco antigénico. (30) 9

ELISA

Las limitaciones del MAT han obligado a los científicos a emplear otra técnica que ayude a la detección de anticuerpos en otras condiciones. La prueba de ELISA es capaz de detectar IgM durante la primera semana de la enfermedad (16) y la detección tardía de IgG que permite diferenciar infecciones recientes de pasadas La detección de anticuerpos específicos IgM con una sola muestra es confirmatoria de una infección reciente por leptospiras. (24).

Aglutinación macroscópica:

Se desarrolló para evitar los problemas derivados del mantenimiento de cepas vivas de leptospiras en el laboratorio. Pocos autores la recomiendan debido a su falta de sensibilidad y porque no es capaz de determinar el serovar (31)

Hemoaglutinación indirecta (HA):

Es una prueba serológica género-específica de alta sensibilidad que utiliza eritrocitos de ovejas o del grupo sanguíneo O humano. A pesar de que siempre se ha considerado de utilidad, no ha llegado a desplazar al MAT y de hecho, se utiliza de manera paralela a él. (23)

TÉCNICAS DIRECTAS

La demostración de la presencia de Leptospiras, o sus componentes en la sangre, tejidos y/o leche de animales y humanos con signos clínicos es de gran valor diagnóstico.

Observación en microscopio de campo oscuro: Este método se realiza para la observación de leptospiras en los fluidos orgánicos. Es difícil debido al gran número de artefactos que, por su parecido con las leptospiras, pueden crear confusión. Además precisa que esten presente un gran número de microorganismos en las muestras. (22)

Inmunofluoresencia:

Es adecuada para la detección de leptospiras. Su mayor desventaja es que requiere la producción de antisueros policlonales de buena calidad y se requiere microscopio de fluorescencia. (19)

Métodos de Diagnostico Molecular

La relevancia de la identificación de los serovares de Leptospira sp estimulo el desarrollo de técnicas moleculares, entre las mas utilizadas tenemos: Marcado con sondas de ADN, hibridación de ARN con marcaje radioactivo y PCR con mayor efectividad en muestras de orina (7). La importancia de diferenciar entre los numerosos serovares de Leptospira ha llevado a muchos investigadores a ensayar múltiples métodos moleculares. Zuerner en 1997 propuso una diferenciación comparando un método de hibridación (Southern Blot) y con un ensayo de PCR (5). Anteriormente en Francia, Perolat y su grupo habian evaluado los mètodos de ribotipificacion, AP-PCR y MRSP pero sin conseguir mayor diferenciación a nivel de serovares (4). Los métodos de identificación basados en hibridación de DNA como Southern Blot permiten identificar la homologia o heterogeneidad dentro de un serogrupo, así como conocer las relaciones genomicas entre las cepas de Leptospiras (3).

El LSSP-PCR es una de las últimas técnicas usadas llevando a cabo una re-amplificación en condiciones de baja astringencia para obtener patrones de bandas que permitan discriminar más allá del nivel de especies. (10).

Estudios en diferentes especies de eubacterias sugieren la existencia de secuencias de DNA repetitivas que fueron descritas utilizando los métodos de PCR y la hibridización por Slot blot. Entre estos se han estudiado oligonucleótidos como: secuencias repetitivas palindromicas extragenicas (REP), o elementos íntergénicos repetitivos enterobacteriales de consenso (ERIC), estas secuencias obtenidas a trabes de amplificación por PCR, producen patrones de bandas a trabes de un gel de agarosa. Estas bandas han mostrado fingerprints inequívocos de diferentes especies de eubacterias (6).

Los métodos en los que se usan elementos repetitivos para la diferenciación de Leptospiras han dado mejores resultados, en combinación con digestión con endonucleasas de restricción (1).

Un estudio reciente en el que se realizo una búsqueda de regiones repetitivas permitió desarrollar un método de análisis del numero de repeticiones en tandem multi-locus variable (MLVA), encontrando seis regiones muy informativas para la diferenciación de algunos serovares de Leptospira interrogans (11).

Materiales y métodos

Tabla 1

Serovares referenciales del Instituto Nacional de Salud Lima-Perú

1. Cepas de Leptospira sp.

Se trabajo con parte del cepario del Laboratorio de Zoonosis Bacteriana del Instituto Nacional de Salud, entre ellas cepas referenciales utilizadas para tipificación y en el MAT (Tabla 1), además de aislamientos provenientes de diferentes regiones del país. Se realizo un pasaje de las cepas tomando 1 ml de un cultivo conservado por 30 días y se inoculo en 5ml de medio EMJH (Medio Ellinghausen y McCullough modificado por Johnson y Harris) y se incubaron a 28ºC por aproximadamente 8 días hasta que alcanzaron una

densidad celular de 108 células /ml medido por espectrofotometría a 420 nm.

2. Extracción de DNA

Se compararon dos métodos de extracción de DNA: El primero basado en la extracción por afinidad usando mini columnas de silica con el kit Qiamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Holanda), el segundo método una variación de la extracción usando Guanidina Isotiocianato (GET-0.6gr/ml).La cantidad de DNA fue medido por espectrofotometría a 260 nm y la calidad del producto con la relación 260/280.

2.1. Extracción de DNA usando GET

– Se sembraron 500uL de cultivo fresco de 8 diàs de incubaciòn para los 25 serovares de Leptospira sp. en 5ml en medio EMJH y se incubaron a 28ºC hasta alcanzar una densidad de 108 células /ml por 19 diàs.

– Se cosecharon, las células, centrifugando a 8000 rpm por 15 minutos a 4 grados centígrados, luego se elimino el sobrenadante.

– Se resuspendió el sedimento en 1 ml de buffer TE 1X (Tris-HCl 10mM; EDTA pH 8.0 1mM), para lavar las células. Se centrifugo a 14000 rpm por 10 minutos a 4 grados centígrados. Se elimino el sobrenadante

– Se resuspendió el sedimento en 100ul de solución TE 1X conteniendo lizosima 50mg/ml, y se incubo a 37 ° C por 10 minutos.

-Se adiciono 500ul de solución GET, se agito suavemente y se incubo por 5 minutos a temperatura ambiente.

-Luego se adiciono 250 ul de acetato de amonio 7,5M helado, se agito por inversión hasta homogenizar y se coloco en hielo por 10 minutos.

– Se añadió 500 ul de cloroformo alcohol isoamilico (24:1 V/V) y se mezclo suavemente por 5 minutos mediante inversión, se centrifugo a 14000 rpm por 10 minutos y se transfirió cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo.

-Se agrego 500 uL de etanol absoluto helado se invirtió el tubo hasta observar la formación de una nube de ADN por deshidratación. Este ADN deshidratado fue extraido cuidadosamente con una pipeta Pasteur evitando su ruptura.

-Se coloco en un tubo nuevo y se lavo 2 veces con etanol 70% el cual fue eliminado mediante aspiración con pipeta Pasteur, se dejo secar por 5 minutos a 42 grados centígrados.

– Al final el ADN se resuspendió en 100uL de buffer TE 1X. y se incubo a 65º C por 10 minutos.

– El DNA fue conservado a -20º C

2.2. Extracción de ADN utilizando el Kit Qiamp DNA Mini Kit (QIAGEN)

– Se sembraron 500uL de cultivo fresco de 25 serovares de Leptospira sp. en 5ml en medio EMJH y se incubaron a 28ºC hasta alcanzar una densidad de 108 células /ml

– Se cosecharon, las células, centrifugando a 8000 rpm por 15 minutos a 4 grados centígrados, luego se elimino el sobrenadante

– Se resuspendio el sedimento en 1 ml de buffer TE 1X (Tris-HCl 10mM; EDTA pH 8.0 1mM), para lavar las celulas. Se centrifugo a 14000 rpm por 10 minutos a 4 grados centígrados. Se elimino el sobrenadante.

– Se resuspendió en 200uL de buffer TE 1X

– En un tubo de microcentrifuga de 2ml se agrego 20 ul de proteinasa K

– Se coloco 200uL de las células cosechadas

– Se coloco 200 ul de Buffer AL y se homogeniza en el vortex por 20 segundos.

– Se incubo a 56º C x 10 minutos en Baño maría.

– Se agrego 200 ul de etanol absoluto.

– Se transfirió la muestra a las mini columnas de silica previamente preparada con un tubo colector.

– Se centrifugo a 8000 rpm x 1 minuto. El tubo colector es reemplazado con uno limpio y se agrego 500ul de buffer AW1 a la minicolumna para el primer lavado.

– Se centrifugo a 8000 rpm x 1 minuto. El tubo colector es reemplazado con uno limpio y se agrego 500ul de buffer AW2 a la minicolumna para el segundo lavado.

-Se centrifugo x 3 minutos a 13000 rpm. El tubo colector es reemplazado con un tubo de mcirocentrifuga nuevo y se agrego 180 ul de buffer AE, para la elusión .

-Se centrifugo a 8000 rpm x 1 minuto. El DNA fue conservado a -20º C

3. Amplificación por PCR para evaluar la eficiencia del método de extracción de DNA

Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Perkin Elmer 9600. La reacción de PCR se realizo con 1.5mM MgCl2, Buffer de PCR 1X (proporcionado con la enzima), 0.2uM dNTPs, 1U de Ampli Taq DNA polimerasa (Applied Biosystems),20uM de primer (5´GCG –GAC-TCA-TAC-CCG-CT 3´) (Primer diseñado por Barocchi para amplificar secuencias repetitivas de una librería genomica de L.interrogans serovar copenhageni strain L1-130) en un volumen final de 50ul. El ciclaje fue el siguiente: Denaturacion inicial 94°C por 10 minutos, seguido por 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50 °C por 1,5 minutos y 72° C por 4 minutos y una extensión final de 72 °C por 7 minutos. Los productos de amplificación fueron resueltos en un gel de agarosa al 1.5% a 90 voltios por 60 minutos en una cámara Biorad. El gel fue teñido con bromuro de etidio y visualizado en un transiluminador UV.

4.- Optimización de las condiciones del PCR – Rep1.

Componentes de la reaccion

Se evaluaron las siguientes condiciones de PCR para un volumen final de 50uL: Taq Polimerasa(0.5,1.5,2y2.5U), DNA( 50ng, 100ng,200ng,275ng,300ng,550ng,600ng,1100ng y 1200ng) ,inones de Magnesio (1,5mM, 2mM, 2,5 mM y 3mM) Temperaturas de hibridación en un termociclador en gradiente (46.5º, 47.7º, 49.1º, 51.4º, 52.3º C)

Limite de detección

El límite de detección fue obtenido determinando la mínima concentración de DNA posible para obtener un patrón de bandas capaz de proporcionar diferenciación y que sea reproducible a través de sucesivas repeticiones del método. Se realizo diluciones sucesivas de 10-1 hasta 10-7

Sensibilidad de la prueba

La sensibilidad de la prueba se evaluó con la formula

[(PA/N+)x100] (Sachse,2003)

Donde:

PA = Resultados positivos obtenidos por el PCR Rep1

N+ = Numero de muestras positivas con el Método de Referencia

Reproducibilidad

La reproducibilidad del método se evaluó a través de los patrones de bandas obtenidos por cada serovar y que la información proporcionada sea reproducible a través de tres repeticiones del ensayo.

Especificidad

Se realizo un ensayo de especificidad utilizando DNA de otras cepas bacterianas durante el ensayo con Rep1: Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Pseudomona sp, ,Shigella sp,Bartonella baciliformes,y de otros organismos relacionados con el diagnostico referencial de Leptospirosis como Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax y Virus del dengue.

5. Aplicación de PCR-Rep1 para los serovares referenciales de Leptospira del INS

Se procedió a realizar el PCR-Rep1 con las condiciones optimizadas utilizando el primer Rep1 5´GCG –GAC-TCA-TAC-CCG-CT 3´, las condicones de temperatura fueron 94C° por 5 minutos, 94C° por 30 segundos, 49.1C° por 1.5 minutos y 72C° por 4 minutos con un tiempo de extensión final de 7 minutos por 35 ciclos, se utilizo el DNA de 25 serovares referenciales del Laboratorio de Zoonosis Bacteriana del Instituto Nacional de Salud. Los patrones de bandas obtenidos sirvieron para obtener el patrón general para cada serovar del cepario referencial. Frente a este patron se compararan los subsiguientes resultados. Para un óptimo resultado respecto a la resolución de bandas se utilizo la agarosa de alta resolución Nusieve

6.-Tipificación de serovares por MAT

Se realizo una prueba de microaglutinacion para confirmar la identidad de los serovares utilizados en el PCR REP1, Los cultivos obtenidos fueron enfrentados con su respectivo antisuero en diluciones dobles sucesivas comenzando en 1/100 hasta 1/102400.

a) Tamizaje

-Se preparo diluciones separas de suero 1:50,1:100 y 1:200 en un volumen final de 1.5ml con PBS en un tubo de dilución.

-Se distribuyo la microplaca en 8 columnas para dilución de suero y 23 filas para antigenos.

-Se agrego 50ul a cada pocillo de las diluciones 1:50,1:100 y 1:200 seguidos cada uno por un control respectivo (50ul PBS y 50ul antigeno).

-Se agrego 50 ul de antigeno (23 serovares) a cada pocillo correspondiente parta las 3 diluciones (1:50,1:100 y 1:200).

-Se coloco la microplaca sobre un skaker y se roto a una revolución de 500rpm durante 4 segundos para que la muestra de suero y antìgeno se mezclen adecuadamente.

-Se cubrió la microplaca con papel platino e incubar por 2 horas a 30 °C.

b) Titulaciòn

-Todos los serovares mostraron una reacción de 4+ a un titulo de 1:400 por tanto se procedió a titular.

-Se preparo una placa de microtitulaciòn, se rotulo el código de los serovares en las filas y se anotaron las diluciones del suero de 1/100 hasta 1/102400 en las columnas.

-Se diluyo el suero 1/25 con PBS para un volumen final 1ml.

-Se agrego en la primera columna 50ul del suero diluido 1/25 .

-Se mezclo el suero diluido 1/25 con 50ul de PBS, se extrajo 50ul y se vertió en la 2 columna se mezclo con 50ul de PBS se extrajo 50ul y se vertió en la 3 columna y se coloco 50ul de PBS y así sucesivamente hasta una dilución de 1/ 102400.

-Se agregar 50ul de antigeno a cada columna.

-Se agrego 50ul de antigeno puro en la última columna como control.

-Se coloco la microplaca en un shaker y se roto a 500rpm durante 4 segundos.

-Se cubrió la placa con papel platino y se incubo por 2 horas a 30°C.

c) Lectura

-Utilizando una micropipeta multicanal se extrajo 15ul de mezcla antigeno-suero y 15ul de control y se traspaso a una lámina porta-objeto.

–La lectura se realizo un microscopio de campo oscuro con objetivo 10X,sin cubre objetos.

-Se observo el grado de aglutinación de cada antigeno en relación con el antigeno control según tabla 2.

Tabla2.-

7. Evaluación del poder de la prueba con diferentes aislamientos de Leptospira sp

Para investigar si la prueba puede servir para diferenciar serovares de Leptospira sp a partir de muestras biologicas, se realizo el PCR-Rep1 con el DNA de 20 de muestras diferentes: Cinco muestras de agua, cinco de sangre, cinco de orina y cinco de riñónes de roedores silvestres.

8. Evaluación de la inhibición en las muestras de Agua, Sangre, Orina y Tejido en Riñón

Se diluyo 1 volumen de DNA de una muestra positiva para PCR en 3 volúmenes de muestra problema (Agua, Sangre, Orina y Riñón) y se procedió a realizar el PCR REP1. Se obtuvo un indicador de porcentaje de inhibición.

9. Analisis de Datos

Las curvas y gráficos fueron procesados en EXCEL Se realizo un dendograma a partir de los patrones de bandas obtenidos con el programa Gel Compare.

Resultados

1 Crecimiento Bacteriano

Las características de crecimiento en medio EMJH para los diferentes serovares de Leptopira que se utilizaron para la prueba fueron diferentes. Estos cultivos fueron usados para la extracción y purificación de DNA. El grafico 1 muestra la evolución del crecimiento de cada serovar a los 4,12 y 19 días. Se midió la concentración de Leptospiras por campo de lectura en un microscopio de campo oscuro a 400X.

Se observo que los mayores valores de lectura se obtuvieron a los 12 días de incubación para la mayoría de serovares, algunos serovares como bratislava presentaron altas concentraciones (380 por campo) (Grafico1). Por otro lado, otros serovares presentaron un crecimiento más lento por ejemplo el serovar celledoni.

Es claro el patrón de crecimiento diferente para cada serovar, mientras que algunos mantienen la tendencia a seguir creciendo, otros por el contrario como el serovar djasiman muestra una tendencia a disminuir su población en función al tiempo (Grafico 1). Se tomaron para la extracción de DNA los cultivos con 19 días de incubación ya que en este tiempo la mayoría presentaron una adecuada densidad poblacional, que fue corroborada en las lecturas al espectrofotómetro correspondientes a mayores de 108 células /ml (Tabla2).

2. Tipificación de serovares por MAT

Se realizo una prueba de microaglutinacion para confirmar la identidad de los serovares utilizados en el PCR REP1, Los cultivos obtenidos fueron enfrentados con su respectivo antisuero en diluciones dobles sucesivas comenzando en 1/100 hasta 1/102400. La tabla 3 muestra que todos los serovares reaccionan con su respectivo antisuero en títulos mayores a 1/6400 excepto javanica y hardjo que reaccionaron a 1/3200. Los serovares cynopteri y varillal necesitaron mayor dilucion después del titulo 1/51200. Corroborando la alta seroreactividad del serovar varillal.

3. Extracción de Ácidos Nucleicos

Se evaluaron dos métodos de extracción de ADN, una modificación de los métodos basados en la lisis con buffer de isotiocianato de guanidina (GET). Este método ha dado buenos resultados en la extracción de ADN de otras bacterias, como Staphylococcus y Mycobacterium (Calderon, comunicación personal) produciendo buenas cantidades de DNA intacto. El otro método es el recomendado con el Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen GMBH, Germany) y esta basado en la lisis y extracción con un buffer que contiene proteinasa K y la purificación es llevada a cabo en minicolumnas de silica. Se midió la concentración de ADN en un espectrofotómetro UV a 260nm. En la Tabla 4 se observa que por el método con GET se obtuvo la mayor cantidad de ADN (l60ng/ul), ademas el radio de las lecturas 260/280 es de 1.6 lo cual indica un buen índice de pureza. Por otro lado con el método de Qiagen la mayor concentración de ADN fue de 110ng/ul y el radio 260/280 de 1.5. Para evaluar la integridad del ADN se hizo una corrida electroforetica, donde el ADN obtenido por el método de Qiagen dio un ADN mas integro, los patrones de bandas obtenidos de la amplificación con el ADN extraido con el kit de Qiagen fueron de mejor calidad y mayor definición. (Fig 1 ). Se obtuvo amplificación en todas las muestras de ADN extraidas por Qiagen, mientras que por el método con GET generaron patrones de bandas 17 de los 24 serovares a los que se extrajo ADN. (Fig 2 ).

Tabla 3:

Medida de la concentración de células por espectrofotometría a 420nm. 19 días de crecimiento

* Aislamiento peruano probable nuevo serovar

Tabla 4:

Titulacion de Serovares de Leptospira sp con sus antisueros homologos "MAT"

Tabla 5: Cuantificación de DNA extraído por métodos Qiagen y GET

4. Amplificación con PCR Rep1 del ADN extraído por los métodos de QIAGEN y GET

Para evaluar la utilidad de los métodos de extracción de ADN se realizo una amplificación por PCR Rep1. De los veinticuatro serovares que se extrajo ADN mediante el kit de Qiagen, 23 mostraron amplificación, obteniéndose un patrón de bandas bien definido, el serovar que no amplifico fue panama, (Fig 1). En contraste por el método GET se obtuvo patrones de bandas en 17 de los 24 serovares a los que se extrajo ADN, algunos carriles presentan un smearring en el track de corrida (Fig 2), lo que hace suponer una degradación de ADN. Algunas muestras presentan bandas débiles (Las celdas 9 y 15 en gel A; y celdas 2, 7,8 y 10 en gel B) debido posiblemente a la presencia de poco ADN integro en la muestra. (Importancia de la integridad del DNA para el ensayo)

5. Optimización de las condiciones de ensayo para el PCR Rep1

Optimización en la concentración de iones Magnesio

Se evaluaron diferentes concentraciones de iones magnesio para la reacción de PCR Rep1: 1,5mM, 2mM, 2,5 mM y 3mM, rangos escogidos siguiendo las indicaciones del fabricante de la enzima. Los ensayos realizados con las concentraciones de 1,5 mM y 2mM no mostraron amplificaciones optimas cuantitativamente ni cualitativamente (Fig 4) Por el contrario las reacciones con concentraciones de 2.5mM y 3mM presentaron una mejor amplificación, (figuras 5 y 6) siendo la mas optima la reacción con 3mM de magnesio como lo muestra la figura (6) por presentar un mejor patrón de bandas y con una menor cantidad de bandas inespecíficas con respecto al patrón generado en la reacción con 2.5mM. Se puede apreciar claramente la diferencia entre los serovares bratislava y canicola.

6.-Concentración de enzima

Diferentes concentraciones de enzima fueron probadas para ver su efecto sobre el PCR-Rep1. Se probaron 0,5U, 1,5U y 2U y 2,5U Unidades de enzima en reacciones de 50uL de volumen de reacción. Los ensayos realizados a bajas concentraciones de enzima 0,5U y 1,5U muestran baja intensidad en las bandas amplificadas así mismo no hay un patrón de bandas que permita diferenciar entre diferentes serovares. Por el contrario las reacciones con 2U y 2,5U mostraron patrones de bandas más definidos y con mayor información para diferenciar entre serovares. Finalmente se decidió usar la enzima a 2,5U por relacionarse a una mejor discriminación en el PCR- Rep-1.

7.-Concentración de ADN

Se evaluaron las siguientes cantidades de ADN 50ng, 100ng, 200ng, 275ng, 300ng, 550ng, 600ng, 1100ng y 1200 ng en un volumen de reacción de 50ul.

8.-Temperatura de hibridación

La temperatura de hibridación del primer es importante para una adecuada amplificación y obtención de un patrón de bandas útil para el ensayo para Se utilizaron los serovares bratislava y hardjo que se encuentran la especie Leptospira interrogans a medida que se incremento la temperatura de hibridación se fue obteniendo un menor numero de bandas en ambos serovares siendo la temperatura optima 49,1o Celsius (Fig 3)obteniéndose un menor numero de bandas inespecíficas que temperaturas menores y un patrón de banda claro respecto a temperaturas mayores a 49,1o C, obteniéndose bandas a 500 , 750 y 1400 pares de bases para ambos serovares pero lo relevante es que se pudo discriminar entre estos serovares tan relacionados por una banda de 1200 pb solo presente en el serovar hardjo.

9.-Obtención del patrón de bandas de las cepas referenciales con el PCR Rep1

Las cepas referenciales de Leptospira sp. Utilizadas para la prueba del MAT en el Laboratorio de Zoonosis Bacteriana sirvieron de patrón para la aplicación del PCR-Rep1 La figura 10 muestra el patrón de bandas obtenido:

a)Todos los serovares de L.interrogans presentan una banda especie especifica de aproximadamente 400pb a excepción de los servares ictero y copenhagenhi (carril 4 y 5) los cuales son prácticamente indiferenciables observo que el serovar tarassovi difiere totalmente de los demás serovares que encuentran en esta especie teniendo mayor similitud con el serovar javanica (L.borgpetersenii)debido a las bandas a 800,1250,1800,2900y3000 pb ,así también se observo que todos los demás serovares que se encuentran en la especie L .interrogans muestran una banda característica de aproximadamente 400pb.Los serovares (australis,bratislava y mankarso) mostraron patrones de bandas similares de" 400,900, pb", no pudiendo ser diferenciados, también los serovares (icterohaemorrhagiae ,copenhageni, hardjo y djansiman) mostraron patrones similares entre ellos de" 300 y600" ,no pudiendo ser diferenciados. Sin embargo existió una diferencia clara entre los serovares (mankarso, icterohaemorrhagiae, cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae, canicola y wolffi).

b.) L.borgpetersenii.-Se observo una diferencia clara dentro de los serovares ballum (700,850,900,1350,1400,1500,3000,4000 y 5500 pb) y javanica (850,1350,1500 y 4000 pb) en esta especie.

c.)Los serovares de las demás especies en estudio, L. weilii ( sv celledoni 600, 875,1600 y 2000 pb), L.kirscheni (sv grippotyphosa 400 y 1200 pb), L.santarosae (sv georgia 2725 pb), L.alexanderi ( sv borincana 1100 y 3000pb), L.biflexa (Patoc 700,875 y 1725 pb) y mostraron diferentes patrones de bandas interespecies.

10.-Sensibilidad del PCR REP1.-La sensibilidad de evaluó por la siguiente formula:

[(PA/N+)x 100] (Sachse, 2003)

Donde:

PA: El numero de resultados positivos obtenidos por el PCR Rep1

N+: Es el numero de muestras positivas con el Método Referencial (MAT)

Para nuestro ensayo se obtuvo 16 serovares diferenciados por el PCR Rep1 frente a las 22 cepas referenciales tipificadas por MAT obteniendo un 72.7% de sensibilidad para el ensayo.

11.-Reproducibilidad.-

En la figura 11 se muestran los resultados para evaluar la reproducibilidad del ensayo donde se observa que luego de realizar la prueba por triplicado la mayoría de serovares presentan el mismo patrón, a excepción de las replicas para el serovar Bratislava que presentan diferencias entre ellas (celdas 5-7) mientras que un a replica del serovar hardjo muestra diferencia (celda 17). en el carril. La reproducibilidad fue media en función del numero de muestras que presentan concordancia después de tres replicas y el numero total de muestra evaluadas después de tres replicas. Se obtuvo un 88,9% de reproducibilidad.

12.-Especificidad.

Se evaluó la especificidad del ensayo para lo cual se obtuvo DNA de algunos patógenos que presentan sintomatología clínica muy similar a Leptospirosis y que encajan dentro del enfoque de síndrome febril , importante para el diagnostico diferencial, asi como otros agentes bacterianos (Siete en total). El PCR REP1 no presento especificidad ya que presentaron amplificación 5 muestras de DNA de Pseudomonas aeruginosa, Bartonella sp, Plasmodium vivax, Salmonella sp y Shigella sp (Fig 12). Estos resultados muestran que la prueba no puede ser usada para la detección y tipificación a partir de muestras de biológicas (sangre, tejidos, etc.). Quedando la tipificación solamente a partir de cultivo de Leptospira sp.

13.-Limite de detección.-

Se evaluó la capacidad del ensayo para amplificar y dar un patrón de bandas definido. Para esto se realizaron diluciones seriadas de una muestra de DNA extraído de un cultivo de 108 células. La concentración de la muestra de DNA fue de 110ng/ul. En la figura 13 se muestra que el límite de detección para el PCR- Rep1 fue hasta 10-1. .Se observo que a mayor dilución comenzaban a aparecer mas bandas inespecíficas teniendo un limite de detección correcto hasta una dilución de 10-1 ,esta dilución equivale a 11ng/ul(Fig 13 ), las inespecificidades deben ser debido a que a mayor dilución del ADN los reactivos como Cloruro de Magnesio como la Enzima estarán en exceso esto hará de que la enzima en exceso con el cofactor Mg se pegue a lugares inespecíficos los cuales generan amplicones que a posteriori en el tiempo competirán por la enzima y cofactor con los amplicones de la secuencia blanco correcta generando una disminución de la eficiencia en el PCR, sin embargo se observo un amplicon tenue en la dilución 10-6.

14.-Evaluación del PCR REP1 a partir de muestras de agua, sangre, orina y tejido (riñon de roedor).- Se realizo un PCR REP1 con muestras de DNA para evaluar la utilidad del ensayo con muestras biológicas. Se corrieron cinco muestras de DNA extraído de sangre positivas a la prueba de Lepto-PCR; cinco muestras de DNA extraído de aguas positivas; cinco muestras de orina positivas y cinco muestras positivas de DNA extraído de riñón de roedores, para evaluar el patrón de bandas. Se observo que en todas las muestras existió ADN degradado sin embargo las muestras de agua y de tejido en el riñón mostraron un patrón de bandas mas claro que en orina y sangre (Fig 14 y 15).

Ensayo PCR-Rep1 de muestras de ADN extraidas con el metodo de Qiagen.(Metodo optimo de extracción) Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

A: Celdas: 1. Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2. sv. australis, 3. sv. autummalis,

4. sv. ballum, 5. sv. bataviae, 6. sv. canìcola, 7. sv. celledoni, 8. sv. cynopteri, 9. sv. djasiman, 10. sv. grippotyphosa, 11. sv. icterohaemorrhagiae, 12. sv. javanica, 13. sv. georgia, 14. sv. pomona, 15. sv. pyrogenes.

B: Celdas 1. Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2. sv. wolffi, 3. sv. tarassovi, 4. sv. bratislava,

5. sv. borincana, 6. sv. canicola, 7. sv. copenhageni, 8. sv. hardjo, 9. sv. varillal, 10. sv. patoc, 11. sv. panama, 12. control positivo, 13. control negativo

Fig 2.- Ensayo del PCR Rep1 por el metodo GET (Tiocianato de Guanidina).Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

A: Celda 1. Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv australis,3 sv autummalis, 4 sv ballum, 5 sv bataviae, 6 sv canicola, 7 sv celledoni, 8 sv cynopteri,9. sv djasiman , 10 sv grippotyphosa, 11 sv icterohaemorrhagiae, 12 svjavanica,13 sv georgia,14 sv pomona

B:Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas , 2 sv pyrogenes, 3 sv wolffi, 4 sv tarassovi, 5 sv bratislaval 6 sv borincana, 7 sv canicola, 8 sv copenhageni,9 sv hardjo, 10 sv varillal, 11 Patoc , 12 sv panama,13 Control +,14 Control –

M-(46,5)——(47,7)——(49,1)——(51,4)——-(52,3)—

Fig.3.-Temperatura de hibridación Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%, se utilizaron los serovares wolffi y hardjo (La celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, Celdas 2 y 3 a 46,5 C° , Celdas 4 y 5 a 47,7 C°, Celdas 6 y 7 a 49,1 C°(Temperatura optima),Celdas 8 y 9 a 51,4 C° ,Celdas 10 y 11 a 52,3 C°.

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Fig 4.- Evaluación de Cloruro de Magnesio 1.5mM y 2mM.Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas,2 sv australis, 3 ballum, 4 sv celledoni,5 sv pomona,6 sv bratislava,7 sv borincana,8 sv canícola, 9 Patoc, 10 Control+,11 Control -,celda 12 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 13 sv australis,14 sv ballum, 15 sv celledoni, 16 sv pomona, 17 sv bratislava, 18 borincana, 19 sv canícola,20 Patoc, 21 Control +, 22 Control –

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Fig 5.-Evaluación de Cloruro de Magnesio 2.5 mM Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5% .

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv canìcola, 5 sv canìcola,6 sv icterohaemorrhagiae, 7 sv copenhageni,8 sv wolffi,9 sv hardjo,celdas 10,12,13 y 14 Controles +,celda 11 control -)

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Fig 6.-Evaluación de Cloruro de Magnesio 3 mM (Concentración optima) .Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv canìcola, 5 canìcola , 6 sv icterohaemorrhagiae, 7 sv copenhageni, 8 sv wolffi, 9 sv hardjo,10 Control +,11 Control -, 12 sv ballum,13 sv borincana,14 Patoc)

M 2 3 4 5 6 7 8 9(0,5U) M 13 14 15 16 17 18 19 20 (1,5U)

Fig 7.-Evaluación de la Enzima 0,5U y 1,5 U. Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv icterohaemorrhagiae, 5 sv copenhageni, 6 sv wolffi, 7 sv hardjo, 8 Control +, 9 Control -, 12 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 13 sv australis, 14 sv bratislava, 15 sv icterohaemorrhagiae, 16 sv copenhageni, 17 sv wolffi, 18 sv hardjo, 19 Control + 20 Control –

M 2 3 4 5 6 7 8 9(2U) M 13 14 15 16 17 18 19 20(2,5U)

–

Fig 8.- Evaluación de Enzima a 2U y 2,5 U(Valor optimo).Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv icterohaemorrhagiae, 5 sv copenhageni, 6 sv wolffi, 7 sv hardjo, celda 8 control +, celda 9 control-, 12 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 13 sv australis, 14 sv bratislava, 15 sv icterohaemorrhagiae, 16 sv copenhageni, 17 sv wolffi, 18 sv hardjo, 19 control +, 20 control –

Fig 9.- Evaluación de Concentración de ADN.Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

A: Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv balum(50ng), 3 sv borincana(300ng), 4 Patoc(275ng), celda 5 control +, celda 6 control -, 7 sv balum(100ng) (Cantidad de acido nucleico optimo), 8= borincana(600ng).

B: Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas ,2 Patoc (550ng), celda 3 control +, 4 control -, 5 sv balum(200ng), 6 sv borincana(1200ng), 7 Patoc(1100ng), celda 8 control +)

TABLA 6.-Cantidad de ácidos nucleicos a volumes 5ul,10ul y 20ul .-Se recomienda usar 100ng de muestra de ADN siendo la cantidad mínima de ADN en la que se muestra una buena amplificación.

Fig 10.- Estandarización del PCR Rep1.-Las muestras fueron corridas en agarosa Nusive al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv australis, 3 sv bratislava, 4 sv icterohaemorrhagiae, 5c sv copenhageni, 6 sv mankarso, 7 sv autummalis, 8 sv bataviae, 9 sv canìcola, 10 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas , 11 sv cynoptei, 12 sv pomona, 13 sv pyrogenes, 14 sv djasiman, 15 sv tarassovi,16 sv wolffi, 17 sv hardjo,18 sv ballum,19 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas,

20 sv javanica,21 sv celledoni, 22 sv grippotyphosa, 23 sv georgia, 24 sv borincana, 25 Patoc, 26 panama, 27 sv varillal, 28 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, celda 29 control +

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig 11.Repetibilidad- Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 al 4 sv australis, 5 al 7 sv bratislava, 8 al 10 sv icterohaemorrhagiae, ll al13 sv copenhageni, 14 al 16 sv wolfii, 17 al 19 sv hardjo,celda 20 control +,celda 21 control -, 2 al 7 Serogrupo Australis, 8 al 13 Serogrupo Icterohaemorrhagiae, 14 al 19 Serogrupo Sjeroe.

A

M 2 3 4 5 6 7 8

FIG12.-Especificidad: Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

A:Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 Pseudomonas aeruginosas , 3 Bartonella sp, 4 Plasmodium falciparum , 5 Plasmodium vivax , 6 Virus Dengue, 7 Salmonella sp,8 Shigella sp.

B

B: Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, celda 2 control -,celda 3 control + sv copenhageni ,celda 4 control + sv hardjo.

TABLA 7

Patógenos referenciales utilizados para la prueba de especificidad para el PCR Rep1

Fig.13.- Limite de detecciòn.Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas, 2 sv cynopteri, 3 al 9 diluciones sucesivas de 10-1 (Limite de detecciòn optimo) hasta 10-7, celda 10 control (+) sv canìcola.

En el límite de detección se utilizo el serovar cynoptery

Fig 14.- Evaluación del PCR REP1 a partir de muestras de agua, sangre y orina .Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas , 2 al 6(Muestras de agua), 7 al 11 (Muestras de sangre), 12 al 16(Muestras de orina) , 17( Marcador)

Fig 15.- Evaluación del PCR REP1 a partir de muestras de tejido (riñon de roedor) y muestras inhibitorias de en agua, sangre, orina y riñon.

Las muestras fueron corridas en agarosa al 1.5%.

Celda 1 Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder Fermentas , 2 al 6 (Tejido de riñón), 7 y 8(Muestra inhibitoria de agua), 9 y 10(Muestra inhibitoria de sangre), 11 y12 (Muestra inhibitoria de orina), 13 y 14(Muestra inhibitoria de tejido de riñon), 15 y 16(muestras positivas serovar javanica y panama respectivamente) ,Celda 17 Control – , 18 Marcador.

Realización del Dendograma

Figura 16

Discusión

–El crecimiento en medio EMJH (Medio Ellinghausen y McCullough modificado por Johnson y Harris) de los serovares fue variable en los 19 días evaluados algunos tuvieron tendencia a crecer (Serovar borincana) y otros a disminuir (Serovar djasiman) esto posiblemente se deba a la diferente capacidad de aprovechar los nutrientes entre serovares (27) (Fig 1).

– La mejor calidad de DNA se obtuvo con el kit QIAGEN (QIAamp DNA Mini Kit ) por mostrar una mayor integridad del ADN que se relaciono con una mejor obtención de patrones de bandas en el PCR Rep1, aunque los mayores valores en cantidad de acido nucleico y calidad en ácidos nucleicos se obtuvo con el método GET Ácido ng/ul=160ng/ul y factor de calidad 260/280 de Acido Nucleico=1,6 respectivamente , es posible que en el Método GET existiera degradación a de ADN y la presencia de trazas relevante de ARN (29).

-Las condiciones de optimización del Rep 1-PCR fueron: Temperatura de hibridación fue 49°C ,utilizando esta temperatura se mostraron amplificaciones de bandas similares a las reportadas por Barocchi cuando uso 50°C como temperatura de hibridación (2) (Fig 3), concentración optima de Cloruro de Magnesio 3mM(Fig 5 y 6),Enzima 2,5 U(Fig 7 y 8), 100ng de ADN para un volumen final de 50 ul de reacción (Fig 9).Estas condiciones variaron respecto a las evaluadas por Barocchi,incrementando la concentración de Magnesio a 3mM y de enzima a 2,5 U generando patrones de bandas definibles y claras para las condiciones evaluadas en este trabajo de investigación(2), sabemos que la concentración de Enzima está relacionada con la concentración de Cloruro de Magnesio por ser un cofactor de la proteína así al aumentar la sal se pensó que una mayor Unidad de enzima ayudaría a marcar con mayor diferencia las bandas discrimatorias entre serovares conociendo los factores adversos del aumento de las Unidades de la enzima como las inespecificidades.Es posible que la presencia de proteínas en las muestras de ADN demandara una mayor concentración de iones de magnesio y de enzima para optimizar el PCR-Rep1(Fig.6).

-En el desarrollo para evaluar diferenciación de serovares por el PCR Rep 1 no se observo una total diferenciación entre serovares por ejemplo en la especie L. interrogans existió similitud entre los serovares (australis,bratislava y mankarso ) en las bandas de 400 y 900 pb, asi el serovar tarassovi difiere totalmente de los demás serovares que encuentran en esta especie teniendo mayor similitud con el serovar javanica (L.borgpetersenii)debido a las bandas a 800,1250,1800,2900y3000 pb . También los serovares (icterohaemorrhagiae ,copenhageni , hardjo y djaniman) mostraron patrones similares entre ellos de" 300 y600" ,no pudiendo ser diferenciados, para L.borgpetersenii se observo una diferencia clara dentro de los serovares(ballum y javanica) en esta especie ,así los serovares de las demás especies en estudio, L. weilii (600,875,1600 y 2000 pb),L.kirscheni (400 y 1200 pb),L.santarosae (2725 pb) ,L.alexanderi (1100 y 3000pb),L.biflexa (700,875 y 1725 pb) y L.noguchi (825 y 1725 pb) mostraron diferentes patrones de bandas ínter especies, en presente trabajo se pudo corroborar lo observado por Barocchi en la que los serovares icterohaemorrhagiae ,copenhageni mostraron similares bandas(2),Otras pruebas moleculares se realizaron para poder diferenciar serovares del genero Leptospira ejemplo de ello son PCR IS 1500,IS 1533(6,13), PCR VNTR (Numero de Repeticiones Variables dispuestos en Tamden)(33),RAPD(Amplificación de ADN Polimorfico al Azar) (26) en contraste el ahorro de tiempo y dinero por el empleo del PCR Rep1 en el que se uso un solo primer coloca a esta técnica ventajosa frente a las pruebas moleculares mencionadas anteriormente , el PCR Rep1 logro la diferenciación entre los serovares de mayor importancia epidemiológica como: mankarso, icterohaemorrhagiae, cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae ,canicola y wolffi

(L.interrogans),javanica y ballum(L.borgpetersenii), L. weilii ,L.kirscheni ,L.santarosae ,L.alexanderi ,L.biflexa y L.noguchi (Fig 2 y 10). La importancia del presente PCR-Rep1 deriva de que características clínicas y epidemiológicas son usualmente asociadas a serovares y serogrupos de Leptospira (33).

–Se obtuvo una sensibilidad del 72.7% respecto al método referencial MAT donde en el MAT no se diferencio el serovar cynopteri del Var-100 posiblemente debido a la similitud de Lipopolisacaridos (22).

– En la prueba de reproducibilidad se observo algunas variaciones tenues en los serovares bratislava y hardjo pudiendose ajustar esta prueba de reproducibilidad con sutiles variaciones en la cantidad de enzima y concentración de Magnesio.

-El PCR REP1 no fue especifico para el genero Leptospira ,la prueba tuvo reacción cruzada con Pseudomonas aeruginosas, Bartonella sp, Plasmodium vivax, Salmonella sp y Shigella sp (Fig12), 5/7 muestras evaluadas 72% aproximadamente lo importante es hacer notar cierta similitud respecto a los patrones de bandas de Shigella sp ( entre 250 y 500pb,500 y 750 pb,750 y 1000pb,1500 y 2000 pb y 2500 y 3000pb) con los serovares australis,canìcola y wolffi aunque este patron de bandas es único para Shigella sp puede tender a confusión para una persona inexperta , así también existe un patron de varias bandas en Bartonella sp(500pb,2000y2500pb y 3000 y 3500 pb) que se debe de tomar en cuenta, de esto la relevancia de la Ficha Epidemiológica y el historial del organismo de donde se toma la muestra así como correr las muestras de ADN en un gel amplio y utilizar agarosa de amplia resolución como la NUSIVE en este tipo de pruebas Epidemiológicas Moleculares.

–El limite de detección se determino en una dilución de 1/10(11ng/ul) este limite es relativamente bajo pero se tiene que tener en cuenta que este tipo PCR donde se requiere un patron de bandas claro es de esperar que la dilución no sea muy alta.

-La prueba de inhibición mostró el siguiente orden de mayor a menor inhibición orina, sangre ,tejido de riñón y agua, los posibles inhibidores serian urea(Orina),lactoferrina y grupos hemo(Sangre),grupos hemo y urea (Tejido de Riñón ) e iones y nucleasas (Agua)(Fig 15 del carril 7 al carril 14). El orden de prioridad para la toma de muestra debería ser:Agua, Tejido de Riñón, Sangre y Orina estos resultados sugieren la presencia de nucleasas en las muestras de esto que es importante que la muestra se procese en forma rápida y con el protocolo adecuado para cada tipo de muestra para evitar la degradación de ADN . Se observo inhibición en todas las muestras evaluadas sin embargo donde se observo mayor inhibición fue en el orden siguiente en forma decreciente orina, sangre, tejido de riñón y agua, además se observo que existieron patrones de bandas que no corresponden a ningún patrón de bandas estándar para los serovares estudiados.