Diferenciación molecular de serovares de leptospira sp usando un ensayo de pcr basado en el elemento repetitivo Rep1 (página 3)

-En el dendograma(Figura 16) se pudo observar en forma mas fácil las relaciones que fueron observas en el gel de electroforesis en el ensayo de PCR-Rep 1( Figura 10)se mostró las relaciones entre los serovares bratislava,mankarso y australis (L. interrogans) y icterohaemorrhagiae ,copenhageni, hardjo y djansiman (L. interrogans) se observo también la estrecha relación entre los serovares djaniman y hardjo pertenecientes a las especies L.interrogans,también se pudo observar la estrecha relación entre los serovares ballum y javanica que se encuentran en la especie L.borgpetersenii ,otro caso peculiar fue en el que se observo el patrón de bandas en el serovar tarassovi que se encuentra en la especie L.interrogans sin embargo mostró un patrón de bandas diferentes a esta especie por el ensayo PCR Rep 1(Fig 10) .

Conclusiones

-Se observo que existe variabilidad en el crecimiento bacteriano en medio EMJH (Medio Ellinghausen y McCullough modificado por Johnson y Harris) respecto a cada serovar posiblemente debido a su diferente capacidad metabólica.

-El mejor método de extracción de ácidos nucleicos fue con el Kit QIAGEN observándose una mejor calidad en el patrón de bandas en el PCR Rep 1.

-Las mejores condiciones de optimización para el PCR Rep 1 fueron: Temperatura de hibridación 50°C , Magnesio 3mM,enzima 2,5 Unidades , y 100ng de acido nucleico para un volumen final de 50 ul de reacción .

-Se obtuvo una sensibilidad del 72.7% respecto al método referencial MAT

-El PCR Rep1 1 logro la diferenciación entre los serovares de importancia epidemiológica como: mankarso, icterohaemorrhagiae, cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae, canicola y wolffi.

(L.interrogans), ballum y javanica (L.borgpetersenii), L. weilii, L.kirscheni, L.santarosae, L.alexanderi, L.biflexa y L.noguchi.

Este trabajo ayudara así a discriminar los posibles reservorios para el genero Leptospira por ejemplo se conoce que los serovares icterohaemorrhageae y copenhageni están asociados a ratas domesticas, canìcola al perro, pomona a cerdos y Leptospira biflexa saprofita, este conocimiento es de vital importancia en el control de un brote.

– El PCR Rep1 no fue especifico para el genero Leptospira generando patrones de bandas también en: Pseudomonas aeruginosas, Bartonella sp, Plasmodium vivax, Salmonella sp y Shigella sp

-El límite de detección para el PCR Rep1 fue de 10-1(11ng/ul) .

-En la evaluación de inhibición en el PCR Rep 1 en las muestras de orines mostraron un claro factor de inhibición respecto al PCR Rep1.

Recomendaciones

-Se recomienda el uso del Kit QIAGEN para extracción de ácidos nucleicos, así como preparar alícuotas para el uso de ácidos nucleicos y guardarlos a –20 C( se debe tener especial cuidado en la integridad del ADN en este tipo de PCR ya el primer tiene varias secuencias blancos a lo largo del genoma.

-Se recomienda el uso de Tips romos para colocar el ADN en los tubos de reacción para mantener su integridad.

-Se recomienda preparar el Mix de reacción para el PCR-Rep1 en un tubo único sin el solvente H2O que será agregado por separado en cada tubo de reacción. Así la enzima deberá ser agregada al mix directamente sin otra manipulación previa para mantener su integridad.

– Se recomienda utilizar la siguientes condiciones de optimización para el PCR Rep 1, temperatura de hibridación 50°C, Magnesio 3mM, Enzima 2,5 Unidades ,100ng para un volumen final de 50 ul de reacción

-Se recomienda el uso de la Agarosa NUSIVE 3:1, CAMBREX al 1.5% a 90 voltios por 60 minutos en cámaras electroforeticas amplias y con posillos de 20 ul de capacidad de siembre como mínimo esto se debe a que se debe separar lo mas posible las bandas que se muestran en un PCR –Rep1.

-Se debe dar relevancia a la Ficha Epidemiológica y el historial del organismo de donde se toma la muestra debido a que no existe especificidad en el PCR Rep1 y podría amplificarse a otros patógenos.

-La muestra para el uso del PCR Rep1 debe procesarse en forma rápida y con el protocolo adecuado para cada tipo de muestra para evitar la degradación de ADN así se puede realizar una dilución de 10-1 de la muestra de ADN para disolver inhibidores como la urea en la orina.

Referencias bibliográficas

1.-.Savio M.L ,Rossi C, Fusi P,Tagliabue S,Pacciarini M.L.(1994) Detection and Identification of Leptospira interrogans serovares by PCR coupled with restriction endonuclease analysis of amplified DNA.Journal of Clinical Microbiology.Vol No .Pgs 935-941.

2.-Barocchi Michele A., Ko Albert I, Ramos Suzana, Tucunduva Marcos, Galvao Metermayer.( 2001).Identification of New Repetitive Element in Leptospira interrogans Serovar Copenhageni and Its Application to PCR-Based Differentiation of Leptospira Serogroups.Journal of Clinical Microbiology.Pgs191-195.

3.-Van Eys G.J.J.M.,Gerritsen M.J.,Korver H.,Schoone G.J.S,Kroon C.C.M,Terpstra W.J.(1991). Characterization of Serovars of the Genus Leptospira by DNA Hybridization with Hardjobovis and Icterohaemorrhagiae Recombinant. Probes with Special Attention to Serogroup Sejroe. Journal of Clinical Microbiology..Pgs 1042-1048.

4.-Perolat Philippe ,Merien Fabrice ,Ellis William A.,Barantom Guy.(1994).Characterization of Leptospira Isolates From Serovar Hardjo by Ribotyping,Arbitrarily Primed PCR and Mapped Restriction Site Polymorphisms.Journal of Clinical Microbiology.Pgs 1949-1957.

5.-Zuerner Richard L,Bolin Carole A.(1997).Differentiation of Leptospira interrogans Isolates by IS 1500 Hybridization and PCR Assays.Journal of Clinical Microbiology.Pgs 2612-2617.

6.-Versalovic James ,Koeuth Thearith ,Lupski James R.(1991).Distribution of Repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Oxford.University Press .Vol.19.N.24.Pgs:6823-6831.

7.-Zuerner Richard L,Alt David ,Bolin Carole A .(1995).IS 1533-Based PCR Assay for Identification of Leptospira interrogans Sensu Lato Serovars.Journal of Clinical Microbiology .Pgs.3284-3289.

8.-Cespedes Manuel, Ormaechi Melvi, Condori Patricia, Balda Lourdes, Glenny Martha.(2003).Prevalencia de Leptospirosis y Factores de Riesgo en Personas con Antecedentes de Fiebre en la Provincia de Manu, Madre de Dios, Peru. Revista Peruana de Medicina Experimental de Salud Publica 20(4).

9.-Beran George.(1994).Hanbook of Zoonoses.Second edition .Pgs:245-264.

10.-Assuncao Marluce,Caballero Otávia,Vago Annamaria,Harskurl Rudy,Romancha Álvaro,Pena Sérgio,Simpson Andrew,Koury Matilde.Low –Stringency Single Specific Primer PCR for Identification of Leptospira . (2003).Journal of Medical Microbiology .(52) Pgs:127-135.

11.-Slack Andrew,Dohmt Micheal,Sygmonds Meegan,Smythe Lee.(2005).Development of a Multiple-Locus Variable number of Tandem repeat Analysis(MLVA)for Leptospira interrogans and its application to Leptospira interrogans serovar Australis isolates from Far North Queensland,Australia.Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials-Biomed Central .Pgs:1-32.

12.-Bharti Ajay,Nally Jarlath,Ricaldi Jessica,Matthias Michael,Diaz Monica,Lovett Michael,Levett Paul,Gilman Robert,Willig Michael,Gotuzzo Eduardo,Vinetz Joseph.Leptospirosis :a zoonotic desease of global importance.(2003).THE LANCET.Infections Diseases.Pg:757-771.

13.-Majed Z.,Bellenger E.,Postic D.,Pourcel C.,Baranton G.,Picardeu M..Identification of Variable-Number Tamden-Repeat Loci in Leptospira interrogans Sensu Stricto.(2005).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:539-545.

14.-Baranton G. ,I.G.Old.The Spirochetes:A different way of life.(1995).Institute Pasteur.

15.-Corney B. G.,Colley J.,C. G. Graham.Simplified analysis of pathogenic Leptospiral serovars by random amplified polymorphic DNA fingerprinting.(1997).Journal Mediccal Microbiology.Pgs:927-932.

16.-Adler, B., Murphy, A. M., Locarnini, S. A. and Faine, S.. Detection of specific anti-leptospiral immunoglobulins M and G in human serum by solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (1980). J. Clin. Microbiol. 11:452-457.

17.-Surujballi Om,Mallory Maria.Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection of Leptospira interrogans Serovar Pomona Antibodies in Bovine Sera.(2001).Clincal and Diagnostic Immunology .Pgs:40-43

18.-Ellis, W.A., Thiermann, A.B., Montgomery, J., Handsaker, A., Winter, P.J. y Marshall, R.B.. Restiction Endonuclease Analysis of leptospira interrogans serovar hardjo isolates from cattle. (1988).Res. Vet. Sci, 44:375-379.

19.-Ellis, W.A.. Leptospirosis as a cause of reproductive failure. (1994)Vet. Clin. North. Am., Food Anim. Pract. 10:463-478

20.-Hartskeerl, R., Smith, H., Korver, H., Goris, M. and Terstra, W. International Course on Laboratory Methods for diagnosis of Leptospirosis. (2000) Royal Institute. Amsterdam, Holland.

21. – Pope V, Johnson R., Effect of heat or formalin treatment of

Leptospires on antibody response detected by immunoblotting. (1991).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:1548-1550

22.-Levett, P. N. Leptospirosis. (2001) Clinical. Microbiology.Pgs:296-326.

23.-Effler Paul,Domen Harry,Bragg Sandra,Aye Tim,Sasaki David.Evaluation of the Indirect Hemagglutination Assay for Diagnosis of Acute Leptospirosis in Hawaii.(2000).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:1081-1084

24.-Smith C.R., Ketterer P.J., McGowan M.R. and Corney, B.G.. A review of laboratory techniques and their use in the diagnosis of Leptospira interrogans serovar hardjo infection in cattle. (1994) Aus. Vet. J. 71, 290-294.

25.-Yan, K. T., W. A. Ellis, D. P. Mackie, M. J. Taylor, S. W. McDowell,

J. M. Montgomery. Development of an ELISA to detect antibodies to

a protective lipopolysaccharide fraction of Leptospira borgpetersenii serovar

hardjo in cattle. (1999) Vet. Microbiol. 69:173–187.

3284–3289.

26.-Ramadass P.,Meerarani S.,Venkatesha M.,Senthilkumar A.,Nachimuthu K..Charecterization of Leptospiral Serovares by Ramdomly Amplified Polymorphic DNA Fingerprinting.(1997)International Journal of Systematic Bacteriology .Pgs:575-576.

27.- Fairbrother J. Effects of products of autolysis of tissue and urine on the viability, morphology, and antigenicity of Leptospira interrogans serovar pomona.(1985).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:189-194

28.- Broadly reacting precipitating and agglutinating antigen of leptospirae.

Myers D, Coltorti E. Broadly reacting precipitating and agglutinating antigen of leptospirae.(1987).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:580-590

29.-Molzym. Innovative CCT chemistry and SAM binding matrix – a combination matching highest demands on RNA preparation.(2006).Accedido el 5 de Enero del 2007.Viable en:

30.-Lefebvre Rance,Thiermann Alex,Foley John.Genetic and Antigenic Differences of Serologically Indistinguishable Leptospires of Serovar hardjo.(1987).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:2094-2097

31.-Brandao Angela,Camargo Eide,Silva Emilson,Silva Marcos,Abrao Rui.Macroscopic Agglutination Test for Rapid Diagnosis of Human Leptospirosis.(1998).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:3138-3142.

32.-Bharti Ajay,Nally Jarlath,Ricaldi Jessica,Matthias Michael,Diaz Monica,Lovett Michael,Levett Paul,Gilman Robert,Willig Michael,Gotuzzo Eduardo,Vinetz Joseph.Leptospirosis :a zoonotic desease of global importance.(2003).THE LANCET.Infections Diseases.Pg:757-771.

33.-Majed Z.,Bellenger E.,Postic D.,Pourcel C.,Baranton G.,Picardeu M..Identification of Variable-Number Tamden-Repeat Loci in Leptospira interrogans Sensu Stricto.(2005).Journal of Clinical Microbiology.Pgs:539-545.

Anexos

Autor:

Jess Rojas Jaimes