Diferenciación molecular de serovares de leptospira sp usando un ensayo de pcr basado en el elemento repetitivo Rep1

Resumen

Se desarrollo el método PCR-Rep1 para diferenciar serovares de Leptospira sp, para ello se optimizaron condiciones de PCR. Se tomaron 25 serovares referenciales del cepario del Laboratorio de Zoonosis Bacteriana del Instituto Nacional de Salud para la optimización del ensayo, y 20 muestras positivas por PCR convencional (Cinco de aguas, cinco de sangre, cinco de orina y cinco de tejido (riñón de roedores) para evaluar el poder de la prueba. Se evidencio que la mejor extracción y purificación de ADN fue usando el kit Qiamp DNA Tissue de QIAGEN. Las condiciones optimas para el PCR Rep1 fueron: Temperatura de hibridación: 49,1°C Cloruro de Magnesio: 3mM, Enzima: 2.5 Unidades ,200uM dNTPs, 2uM Primer y 100 ng de ADN para un volumen final de 50 ul.

El PCR Rep1 permitió la diferenciación entre serovares de diferentes especies patógenas de importancia epidemiológica como: L. interrogans, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirscheni, L. santarosae, L. alexanderi, L. biflexai y L.noguchi. El ensayo mostró una sensibilidad del 72.7% con respecto al método referencial MAT. La reproducibilidad fue de 88,9%. La prueba mostró ser inespecífica, se observo amplificación en DNA de otros agentes etiológicos como Pseudomonas aeruginosa, Bartonella sp, Plasmodium vivax, Salmonella sp y Shigella sp.

El poder de la prueba fue evaluado con muestras de agua, sangre, orina y tejido; se observo una inhibición en la muestra de orina. No se obtuvo un patrón de bandas diferenciable entre las muestras.

El PCR Rep1 optimizado permitió diferenciar serovares de relevancia epidemiológica como: mankarso, icterohaemorrhagiae, cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae canicola y wolffi de L .interrogans; ballum y javanica de L. borgpetersenii; asi como diferenciar entre las especies L. weilii, L. kirscheni, L. santarosae, L. alexanderi, L. biflexa y L. noguchi, mientras que algunos serovares no pudieron ser diferenciados.

El PCR-Rep1 provee un método rápido y poco costoso comparado a otras pruebas moleculares y serologicas para la identificación de serovares de Leptospira sp y puede ser usado para la caracterización de aislamientos durante un brote epidémico.

Palabras claves: Zoonosis bacteriana, leptospirosis, serovar, PCR Rep1.

ABSTRACT

The development of Rep1 PCR for differentiating serovares in Leptospira sp, implied the standardize the conditions the Rep1 PCR . 25 serovares referential of National Institute of Health –Lima –Perù were took and 20 samples (5 in water, 5 in blood,5 in urine,5 tissue in kidney),the better method of extraction for DNA was using the kit Qiamp QIAGEN, thus the better conditions for Rep1 PCR were for temperature of hybridization 49.1°C, 3mM Mg, 2,5 U Enzyme , 200uM dNTPs, 2uM Primer and 100ng DNA in a final volume of 50 ul of reaction.The Rep1 PCR has differentiated between serovares patogens of main species :L.interrogans, L..borgpetersenii: L. weilii ,L.kirscheni ,L.santarosae ,L.alexanderi ,L.biflexa y L.noguchi.The Rep1 PCR has shown a sensibility of 72.7% respect to the referential method MAT,88,9% of reproducibility ,in the specify the Rep1 PCR has had cross reactions with Pseudomonas aeruginosas, Bartonella sp, Plasmodium vivax, Salmonella sp y Shigella sp 5/7 samples evaluates =72% of unspecific .Respect to the inhibition evaluated in the samples in water, blood, urine and tissue in kidney have seem a hard inhibition in the samples in the urines.

The Rep1 PCR could differentiated between serovares the main epidemiologic interest: mankarso, icterohaemorrhagiae, cynoptery, pomona, pyrogenes, tarassovi, autummalis, bataviae ,canicola and wolffi (L.interrogans), ballum and javanica (L.borgpetersenii), L. weilii ,L.kirscheni ,L.santarosae ,L.alexanderi ,L.biflexa y L.noguchi.The Rep1 PCR could not differentiated within the serovares australis,bratislava,mankarso (L.interrogans)same happened within serovares icterohaemorrhagiae ,copenhageni , djansiman y hardjo(L. interrogans).

.The inhibition in the urines could be possible because the presence of urea.The Rep1 PCR provide a method faster and less expensive compared other methods molecular and serologic by classifying serovares in Leptospira by using in the cases like to outbreaks where the time and easily method is necessary.

Introducción

La "Leptospirosis" es una de las Zoonosis bacteriana distribuida ampliamente a nivel mundial y de mucha importancia en Salud Publica. Es causada por una espiroqueta patogénica del genero Leptospira presente en una gran variedad de mamíferos que actúan como reservorios, algunos de importancia en las zonas rurales y urbana por ejemplo ganado vacuno, porcino, caprino, canes, marsupiales y roedores los cuales presentan una alta probabilidad de transmitir la enfermedad al ser humano (8).

La bacteria Leptospira sp se encuentra en la familia Leptospiracia que incluye dos géneros Leptospira y Leptonema , Leptospira sp es una bacteria estrictamente aeróbica y presenta una gran movilidad (32).