Elaboración de concentrado para la rata proechimys de la espece chrysaeulus para su manutención en el laboratorio (página 4)

Partes: 1, 2, , 4

PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE LAS DIETAS

Las dietas para animales de laboratorio se pueden fabricar con distinta forma física de pendiendo del proceso al que se someta la mezcla de ingredientes:

• Molidas: alimento en forma de polvo más o menos fino.

• Granuladas: mezcla de harinas en agua formando una pasta, que posteriormente se somete a compresión y secado dándole distintas formas.

• Pellets: Pulverizado y moldeado en distintas formas. Se utilizan para roedores, cobayas y conejos.

• Expandidas: alimento a alta presión y temperatura a través de un molde. Se utilizan para gatos, primates y perros.

• Semihúmedas: alimentos enlatados o no para gatos y perros.

Cuadro 4-10. Necesidades estimadas de energía metabolizable en relación al consumo de alimento en diferentes fases del desarrollo de la rata

1Densidad energética de la dieta: 14.5 kJ/g.

En el caso de roedores, el pienso en forma de pellets es el más utilizado. Ofrece ciertas ventajas, ya que aparte de satisfacer la necesidad de roer de estos animales es fácil de manejar, almacenar y administrar, siendo mínimo el desperdicio cuando se lo comen. Presenta el inconveniente de que para añadir un nutriente o producto, se requiere moler dicho pienso, a fin de lograr la mezcla adecuada.

El pienso molido o en polvo no es muy adecuado para los roedores, que lo esparcen o tiran en grandes cantidades al comer. Al mismo tiempo, su manejo supone más tiempo y es más complicado, aunque permite añadir todo tipo de productos.

Las dietas semihúmedas o en gel se utilizan cuando se incorporan compuestos experimentales en polvo o muy tóxicos. Presentan el inconveniente de ser más susceptibles al desarrollo bacteriano que las secas, y por otro lado su peso y volumen son mayores por tener menor densidad calórica y nutricional, lo que dificulta indiscutiblemente su manejo y administración.

En general, el tipo de trabajo experimental determinará la presentación de la dieta a utilizar.

Ventajas e inconvenientes del tipo procesamiento

Molturación: favorece la actuación enzimática a nivel gastrointestinal, por lo que aumenta la digestibilidad.

Granulación: el producto resultante es más apetecible para roedores. Como apuntamos anteriormente, con este tipo de dietas hay menos desperdicios que con las molidas. Las altas temperaturas empleadas reducen la población microbiana. Se retardan los procesos de oxidación, por ser menor el área de contacto.

Expansión: produce una dureza aún mayor de los granulos (lo que hace que se deteriore menos por el almacenamiento) y una mayor destrucción de nutrientes termolábiles.

El contenido en microorganismos disminuye todavía más con este tratamiento.

FORMULACIÓN DE DIETAS PARA ANIMALES DE LABORATORIO

La formulación de dietas tiene como objetivo fundamental conseguir las concentraciones ideales de nutrientes que permitan hacer frente a las necesidades específicas de los distintos animales de laboratorio, teniendo en cuenta las pérdidas debidas a los procesos tecnológicos y de almacenamiento (estas pérdidas se deben evaluar mediante el análisis del pienso elaborado).

La elaboración de dietas de ingredientes naturales es compleja, ya que se parte de ingredientes con cantidades diferentes de nutrientes, y hay que tener en cuenta los nutrientes que aporta cada uno de los ingredientes naturales.

Los ingredientes se expresan como porcentaje en peso, debiendo tener la fórmula un valor del 100 % (véase Cuadro 4-3).

El análisis de los nutrientes de los distintos ingredientes nos indicará si hay o no necesidad de proceder a la adición de algunos de ellos (aminoácidos, grasa, sodio, calcio o fósforo). Finalmente, se añaden al pienso las premezclas de vitaminas y minerales, el denominado corrector mineralovitamínico (Cuadro 4-11).

En el caso de las dietas purificadas, la formulación no es tan compleja, al ser cada constituyente fuente de un único nutriente. Las fuentes comúnmente usadas son:

• Caseína o proteína de soja como fuente proteica.

• Aceites como fuente de grasa.

• Azúcar y almidón como fuentes de hidratos de carbono.

• Celulosa como fuente de fibra bruta.

• A todo ello se le añade la premezcla de vitaminas y minerales.

Con arreglo al tipo de formulación, se dividen en tres grupos: dietas de ingredientes naturales, purificadas y químicamente definidas.

Dietas de ingredientes naturales

En este tipo de dietas los ingredientes primarios provienen de fuentes naturales y se elaboran usando como elemento de base cereales sin refinar (avena, trigo, etc.). Se clasifican en dos grupos: fórmulas comerciales cerradas y fórmulas abiertas.

Fórmula cerrada

Su composición no es conocida. La mezcla de materias primas utilizadas es secreta, y es propiedad del fabricante de un determinado pienso comercial. En el etiquetado suele aparecer la composición en nutrientes desde un punto de vista cuantitativo (véase Cuadro 4-11).

En general, en su fabricación se suelen utilizar dos fuentes primarias de proteínas: una de origen animal (harina de pescado o subproductos lácteos) y otra de origen vegetal (soja, gluten de maíz). Como fuente lipídica se utilizan grasas animales a las que se añade cierta cantidad de aceites vegetales poliinsaturados que suministran los ácidos grasos esenciales necesarios. La fuente de HC se obtiene de mezclas de cereales (maíz, sorgo, arroz, cebada, trigo, avena). Como fuente fosfocálcica se utilizan el fosfato bicálcico y limestrone molido. Se suplementan con las vitaminas y los minerales restantes en forma de premezclas.

El uso de materias primas naturales hace que estas dietas cerradas presenten una notable variabilidad en el porcentaje de nutrientes, condicionada a su vez por la variabilidad intrínseca de los componentes naturales. Los factores de tipo ambiental (suelo, clima, prácticas de cultivo, etc.) y genéticos (variedad vegetales o razas animales) influyen en la composición de las materias primas utilizadas. Asimismo, los procesos tecnológicos y de almacenamiento también tienen su repercusión al variar de un fabricante a otro.

Cuadro 4-11. Relación de materias primas y otros elementos de una dieta estándar de

fórmula cerrada para roedores

COMPOSICIÓN NORMAL DE UNA DIETA

1. Materias primas

Trigo

Soja micronizada

Aceite de soja o manteca

Fosfato bicálcico

Clorhidrato de lisina

Antioxidante

Cebada

Pescado rico en proteínas

Sal

Carbonato cálcico

Aglomerante

2. Corrector tipo con la adición de los siguientes componentes

Minerales

Cobalto Manganeso

Vitaminas Vitamina A

Cobre

Cinc

Vitamina D3

Hierro

Selenio

Vitamina E

Yodo

Vitamina B12

Aminoácidos

Menacina

Tiamina

Riboflavina

Ac pantotenico

Piridoxina Felacina Niacina Biotina Colina

Por otro lado, los ingredientes no refinados de este tipo de dietas, como maíz, soja, carne, pescado, etc., pueden contener diferentes tipos y cantidades de pesticidas, micotoxinas y otros contaminantes. Esta elevada variabilidad entre diferentes partidas en el tipo y la cantidad de los componentes nutricionales y no nutricionales puede afectar a los resultados experimentales y disminuir la reproducibilidad de los mismos.

En las dietas comerciales de fórmula cerrada encontraremos, por tanto, diferencias de composición relacionadas con los diversos fabricantes y también con los distintos lotes o partidas dentro de una misma marca. Este hecho es aplicable incluso a las dietas de fórmula abierta.

Pueden darse errores debidos a cambios en las fuentes, en la calidad de los ingredientes o en los métodos de procesamiento. Por último, muchas veces los valores del etiquetado no coinciden con los datos obtenidos mediante el análisis químico correspondiente.

Estos datos ponen de manifiesto que el empleo de dietas de distintas marcas pueden modificar los resultados. En este sentido, a la hora de publicar los datos experimentales, se debe especificar la marca de la dieta utilizada y describir lo más correctamente posible su composición, ya que se puede concluir que no existe lo que se suele denominar «dieta estándar» para ninguna especie de animal de laboratorio, aunque en muchas publicaciones se pueda leer esta descripción. Los trabajos experimentales, ya clásicos de Baynen (1985, 1987) y Wise y Gilburt (1981) ponen en evidencia los diferentes tipos de variaciones descritas.

Fórmula abierta

En algunos casos se publica la composición en ingredientes. Estas dietas se conocen con el nombre de fórmulas abiertas. Tienen una composición conocida y pueden ser elaborados por los usuarios. Entre ellas, destacan la NIH-07, NTP-90, NTP-91, NTP-92 y NPT-2000 para roedores y conejos, descritas con detalle por el National Research Council (NRC) y el American Instiíute of Nutrition. Una dieta certificada debe aportar información de al menos 83 parámetros (véase Cuadro 4-3) y la determinación cuantitativa y cualitativa de posibles contaminantes abióticos y bióticos.

Desde 1988 se han venido formulando y evaluando diferentes tipos de dietas con objeto de conocer la influencia de la proporción de proteínas, grasa y fibra en la incidencia de enfermedades crónicas y de tumores. La composición de la dieta puede influir en el crecimiento, la aparición de enfermedades, las expectativas de vida, la aparición de tumores y la respuesta a tratamientos químicos.

En estudios a largo plazo realizados en la rata, se ha visto que entre las causas de mortalidad, posiblemente relacionadas con la dieta, se pueden incluir las nefropatías en machos, los tumores de mama en hembras y los tumores de adenohipófisis en ambos sexos.

Entre 1980 y 1994, la dieta no purificada de fórmula abierta NIH-07, rica en proteínas (24 % en peso), pobre en grasa y fibra (5 % y 3.5%, respectivamente) y con una relación Ca/P de 0.75, fue seleccionada como la dieta que habrá que utilizar para los estudios de toxicología y carcinogénesis en roedores dentro del National Toxicology Program (Estados Unidos). Esta dieta, quizás debido a su alta proporción de proteína y a su baja relación Ca/P, puede haber contribuido a las nefrocalcinosis, y a la gravedad de las nefropatías y otras lesiones encontradas en los estudios antes comentados.

Con los resultados obtenidos con esta dieta experimental, se formuló una nueva dieta (NTP-2000), de ingredientes naturales no purificados, aportando el maíz y el trigo el 60 % de éstos (Cuadro 4-12). Los estudios realizados con esta dieta, formulada con un 14.5 % de proteína, un 8.2 % de grasa, un 9.3 % de fibra y una relación Ca/P de 1/3, han puesto de manifiesto que es más adecuado que la NIH-07 para el crecimiento y el mantenimiento de ratas, ya que previene la nefrocalcinosis y parece disminuir la incidencia y gravedad de las lesiones asociadas a la dieta o a la edad.

El conocimiento cuantitativo y cualitativo de las materias primas utilizadas en la mezcla permite que se puedan fabricar, tomando como base estas fórmulas abiertas, dietas especiales en las que se ajusta la concentración en nutrientes a objetivos experimentales concretos y específicos.

Dietas purificadas

Estas dietas se formulan con una combinación de ingredientes naturales, productos químicos puros e ingredientes refinados. Las dietas purificadas solucionan las limitaciones de las dietas de ingredientes naturales, especialmente las relacionadas con la variabilidad de las diferentes partidas y la presencia de contaminantes.

Cuadro 4-12. Ingredientes y composición de las dietas no purificadas NTP-2000 y NIH-07

Tomado de Rao (1994 y 1996); +: incluido en la premezcla de minerales.

Al estar elaborado con cantidades definidas de ingredientes refinados, se minimizan la variabilidad encontrada en el tipo y cantidad de nutrientes y componentes no nutricionales entre las diferentes partidas de una dieta comercial, y las cantidades de contaminantes químicos contenidos en los ingredientes naturales. Sin embargo, hay componentes importantes de las dietas de ingredientes naturales que puede que no estén en las dietas purificadas, o puede suceder que el balance de los componentes en las dietas purificadas no sea el ideal.

La dieta purificada que se ha empleado con más frecuencia para estudios nutricionales y toxicológicos ha sido la AIN-76 (Cuadro 4-13), modificada por el American Institute of Nutrition, mediante el incremento de la concentración de vitamina K (diez veces), pasando a denominarse AIN-76A. Durante 16 años, estas dietas han sido ampliamente utilizadas por la comunidad científica, pero debido a problemas nutricionales y técnicos, la FASEB (Federation of American Societies for Experimental Biology) ha revisado su formulación, proponiendo nuevas dietas para el crecimiento, gestación, lactancia y el mantenimiento de roedores. La composición de la dieta semipurificada AIN-76 recomendada para el crecimiento y el mantenimiento de roedores durante el primer año de vida consiste en un 18.4% de proteína, un 5.0% de grasa, un 5.0 % de fibra, un 65 % de hidratos de carbono y 3.79 kcal/g de energía.

Cuadro 4-13. Diferentes tipos de dietas: AIN-93M y AIN-93G respecto a la AIN-76A

Las dietas formuladas han sido la AIN-93G (para el crecimiento, la gestación y la lactancia) y la AIN-93M (para el mantenimiento de los animales adultos) (véase Cuadro 4-13). Las diferencias más importantes de la AIN-93G respecto a la AIN-76A son las siguientes:

• Para incrementar la cantidad de ácido linoleico, se sustituyen 7 g de aceite de soja por 5 g de aceite de maíz, por cada 100 g de alimento.

• El almidón de maíz se sustituye por sacarosa.

• La cantidad de fósforo se reduce, para tratar de eliminar el problema de calcificaciones renales encontrados en la rata.

• La L-cisteína se sustituye por la DL-me-tionina como complemento de la caseína.

• Las cantidades de vitaminas E, K y B12 se aumentan, y se añaden oligoelementos a la mezcla de minerales (litio, vanadio, níquel, molibdeno).

En cuanto a la dieta de mantenimiento AIN-93M, en cada kg de alimento, se reduce la cantidad de grasa a 40 g y la de caseína, a 140 g. Estas dietas presentan frente a la de 1976 un balance más correcto de nutrientes esenciales, por lo que se consideran ideales, hasta la fecha, para estudios con ratas y ratones de laboratorio.

Dietas químicamente definidas

Se elaboran con fuentes químicamente puras de aminoácidos, mono o disacáridos y ácidos grasos o triglicéridos purificados. Los minerales se suministran mediante reactivos químicos, y las vitaminas empleadas son de una gran pureza. Las concentraciones en nutrientes de estas dietas son fijas en el momento de su elaboración, pero la disponibilidad puede verse mermada debido a oxidaciones o a interacciones entre los productos químicos utilizados.

Este tipo de dietas, ampliamente utilizadas, pueden plantear problemas derivados de la insipidez o de la textura (para su preparación es aconsejable moler los ingredientes lo más finamente posible).

Dietas carenciales y enriquecidas

A partir de dietas de fórmula abierta, purificadas o químicamente definidas, se pueden confeccionar dietas especiales en las que se ajusta la concentración en nutrientes a objetivos experimentales concretos y específicos, por ejemplo, estudiar el efecto de un aumento en los porcentajes de grasa saturada en la dieta sobre la fisiología cardiovascular. Estas dietas serán, por tanto, pobres (carenciales) o ricas (enriquecidas) en algún nutriente.

El problema que presentan estas dietas es que al variar el contenido de un macronutriente se puede ver afectado el consumo de energía o de otros componentes de la dieta. En un régimen de alimentación ad libitum, los animales de laboratorio tienden a consumir una cantidad constante de energía; por tanto, si la densidad calórica de la dieta se incrementa (aumento en el porcentaje de grasa), los animales consumirán menos alimento, lo que se traduce en un menor consumo generalizado de nutrientes y viceversa.

Cuando se utiliza este tipo de dietas en un experimento, hay que procurar que el consumo de los otros nutrientes de la dieta sea similar en el grupo experimental y en el control. En el caso de una dieta rica en grasa, habría que disminuir los hidratos de carbono tratando de que ambas dietas sean isocalóri-cas y, por tanto, no se vea afectada la ingestión global de proteínas, vitaminas y minerales. Sin embargo, no se pueden descartar ciertos aumentos en el consumo de la dieta grasa con respecto a la dieta control, por ser la primera más grata al paladar.

En el caso de dietas enriquecidas con fibra a costa de los carbohidratos, la densidad calórica disminuye, con lo que el consumo de esta dieta sería mayor al compararla con la dieta control, lo que nos llevaría nuevamente a cambios en el consumo de otros nutrientes. Este problema se puede minimizar modificando ligeramente la grasa para conseguir que las dietas sean isocalóricas.

Las dietas de ingredientes naturales comerciales suelen utilizarse mal cuando se usan para preparar dietas enriquecidas, ya que al añadir cantidades extras de un macronutriente, como grasa o azúcar, los demás nutrientes quedan diluidos por la adición realizada. La dieta control y la dieta problema tendrían porcentualmente cantidades diferentes de nutrientes. Este problema se puede minimizar si se añade a la dieta control un suplemento con el que se consiga la misma dilución de la dieta problema. Por lo general, las dietas comerciales contienen los nutrientes esenciales en exceso, lo que permite una dilución entre un 10-20 % sin que se produzcan desequilibrios importantes.

REGÍMENES ALIMENTICIOS

A la hora de alimentar a los animales de laboratorio y en función de los requisitos experimentales, se pueden elegir distintos tipos de regímenes en relación con la cantidad total ingerida o con los tiempos de ingestión.

Alimentación ad libitum

Este régimen alimenticio supone el libre acceso al alimento las 24 horas del día. Las ratas, ratones y conejos sometidos a este régimen consumen al menos el 80 % del alimento durante el período de oscuridad. La alimentación ad libitum (AL) es aconsejable en experimentos de corta duración, porque reduce el tiempo que hay que dedicar al mantenimiento de los animales. Asimismo, es el sistema usual en las colonias, tanto para la población reproductora como para los individuos destinados a experimentación, al menos hasta completar su crecimiento (valor K de la asíntota de crecimiento, en torno a las 8-10 semanas de edad para la rata). En experimentos de larga duración, la alimentación AL es considerada como la variable incontrolada más significativa que afecta al resultado final de los bioensayos con roedores (véase más adelante).

Alimentación restringida

Este tipo de régimen implica una restricción dietética moderada, con objeto de paliar o limitar la sobrealimentación, sin que se produzcan deficiencias en algún nutriente o ello suponga una desnutrición del animal.

El grupo de San Antonio del National Ins-titute on Aging (NÍA) ha desarrollado diferentes sistema de alimentación restringida (AR) para un amplio grupo de animales, incluidos los primates, analizando exhaustivamente sus ventajas e inconvenientes. Existen diferentes modalidades:

• AR moderada (ARM): se restringe en torno al 30 % de la ingestión diaria, desde las 6-8 semanas de edad (unos 12-14 g frente a los 17-20 g/día en AL para la rata.

• AR estricta (ARE): el animal recibe sólo entre un 50 y un 60 % del consumo máximo AL. Mediante este método se han mantenido ratas hasta los 36-40 meses de edad (fase senil), de incalculable valor para estudios relacionados con procesos degenerativos asociados al envejecimiento humano.

La alimentación restringida implica una mayor asistencia técnica, material y de espacio. En la alimentación AL a los animales se les suministra comida para varios días (se aconseja no más de 48 horas, eliminando los sobrantes antes del llenado de los comederos. En el caso de la AR, se les debe suministrar a diario (se aconseja en el mismo período horario) y deben ser alojados individualmente, ya que el alojamiento en grupo puede generar competencia y agresividad, con una desnutrición potencial de los individuos menos fuertes. En la actualidad, existen sistemas automáticos de control de acceso al alimento (Chronofeeder) que reducen en parte estos inconvenientes, al poder programar la cantidad y tiempo de alimentación según las necesidades experimentales.

Alimentación horaria o controlada

Se permite consumir a los animales toda la comida que quiera pero sólo durante períodos fijos al día. Este régimen de alimentación se utiliza en experimentos en los que hay que estudiar parámetros fisiológicos o bioquímicos en respuesta a la ingestión de alimento y compararlos con los niveles de los mismos en fase de ayuno, o bien en aquellos que requieren un estado nutricional muy controlado. El empleo de sistemas automáticos de acceso al alimento es ideal para este tipo de régimen.

Alimentación a la par

Consiste en tener un grupo control que ingiera la misma cantidad de alimento que el grupo problema, el cual tiene una alimentación restringida. El objetivo que se persigue es comprobar qué efectos son debidos al tratamiento que estemos aplicando al grupo problema y qué efectos son consecuencia de la restricción dietética. La cantidad consumida por el grupo tratado diariamente se tomará como medida para alimentar al día siguiente al grupo control. Este tipo de alimentación restringida supone, por tanto, un mayor trabajo y dedicación e implica al mismo tiempo el uso de jaulas individuales para evitar que los animales dominantes coman AL con perjuicio de los más débiles del grupo.

Alimentación ad libitum frente a restringida (importancia en estudios a largo plazo)

Desde el último decenio, se están generalizando los estudios a largo plazo, no sólo en el ámbito de la toxicología y farmacología, sino también en el de la investigación de algunos procesos fisiológicos (neurología) y bioquímicos (oxidación, radicales libres), considerando la variable edad como un factor clave en el análisis de los resultados. Frente a ello, los requisitos nutritivos de roedores maduros (sobre todo rata de las cepas Wistar, Fisher y Sprague-Dawley, mayores de 6 meses), utilizados en estudios a largo plazo, son prácticamente desconocidos. En muchos estudios se mantiene a los animales con las mismas dietas de crecimiento, en régimen AL, hasta edades superiores a los dos años, sin tener en cuenta las variaciones en las raciones nutritivas y la relación entre los requisitos energéticos del animal y la densidad energética de la dieta. Hasta ahora se ha tenido en cuenta el criterio lineal de que las necesidades energéticas están relacionadas con el peso metabó-lico, es decir, el peso corporal (kg075) estableciéndose el requisito de mantenimiento (RM) equivalente a 45 x peso corporal075 (véase Cuadro 4-10). Sobre esta base se está controlando el valor energético de las dietas, utilizando las hipocalóricas para animales de envejecimiento sometidos a ARM o ARE. Éste es el caso de la NTP-2000, con un 14.5 % de proteína, un 8.5 % de grasa y un 9.5 % de fibra, o de las dietas isocalóricas con modificación de la fuente y contenido de hidratos de carbono, en especial la sacarosa.

Otro aspecto es la reducción y control del consumo de alimento, mediante las diferentes modalidades de alimentación restringida controlada (ARC). La sobrealimentación se considera como una de las variables más incontroladas en bioensayos en general. En diferentes estudios de AR, se ha observado una disminución de las enfermedades degenerativas (nefropatías y cardiomiopatías), de los tumores relacionados con la nutrición (mamitis y otras neoplasias) y de la obesidad.

Igualmente, en la alimentación AL se observa un aumento del tamaño de diferentes órganos con respecto a los animales con AR, correlacionado con un aumento de las lesiones degenerativas o proliferativas del riñon, hígado, glándulas suprarrenales, pituitaria y tiroides, entre otros órganos.

Las poblaciones con ARC, en comparación con las alimentadas AL, presentan desde los 24 meses de edad, hasta un 40 % más de supervivencia y un incremento sustancial de la esperanza de vida, con un 60 % de la población superando los 36 meses de edad. Todo ello asociado a una disminución en la variabilidad intramuestral y entre laboratorios a la hora de los resultados. Actualmente se piensa que muchos de los beneficios proporcionados por la AR son controlados por el eje hipotálamo-hipófisosuprarrenal, mediante regulación hormonal.

La AR no produce cambios apreciables en los parámetros hematológicos y clínicos en general, con excepción de los triglicéridos y algunos parámetros bioquímicos. Se aprecian diferencias significativas en la capacidad de síntesis de proteínas o en los niveles de somatostatina.

Otro aspecto a considerar es la influencia de la alimentación restringida en las funciones inmunitarias de los animales de edad avanzada (especialmente roedores), que está siendo objeto de especial atención. Entre los beneficios debidos a la dieta restringida, se han citado la prevención de la esplenomega-lia, el mantenimiento de un mayor tamaño en las poblaciones de células T cooperadoras y T citotóxicas, y la preservación de la actividad celular del timo. Dos de los hallazgos más interesantes han sido el mantenimiento de una población de células T vírgenes, que asegura la persistencia de la capacidad de producción de interleucina 2, previniendo el declive de la inmunidad celular asociado al envejecimiento, y la preservación de la capacidad de proliferación de linfocitos T y B en respuesta a mitógenos, por citar tan sólo algunos de los estudios recientes al respecto.

Finalmente, se carece de información sobre las condiciones de bienestar de los animales mantenidos a largo plazo, y de los efectos secundarios de los procesos de envejecimiento en el estado general del animal. El sistema de ARC supone mantener al grupo experimental en jaulas individuales. Se sabe que el aislamiento o la privación social obligada, a largo plazo, produce cambios en las respuestas endocrinas, hormonales y diferentes parámetros fisiológicos. El aislamiento en el intervalo de 6-24 meses es también un protocolo usual en estudios de toxicología y cancerología, y puede modificar las expresiones de toxicidad esperadas.

CONSERVACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LAS DIETAS

Tanto la conservación como el control constituyen aspectos fundamentales de la garantía de calidad de las dietas y de su estandarización, con el objeto de asegurar que no sean un factor de distorsión de los resultados experimentales. En este apartado se analiza el tema de la conservación, almacenamiento y controles de calidad bromatológicos y microbiológicos a los que deben ser sometidas las dietas. La contaminación puede ser de origen abiótico (residuos de pesticidas, metales pesados), biótico (microorganismos, hormonas), o debida a los antibióticos. Un aspecto prioritario que se ha de evaluar es la presencia en los piensos o dietas de componentes naturales o artificiales con actividad hormonal, capaces de alterar la homeostasis o equilibrio hormonal de los animales expuestos. En general, los contaminantes pueden influir en los procesos fisiológicos o metabólicos y en el estado sanitario de los animales utilizados, y consecuentemente en los resultados esperados.

Almacenamiento de las dietas

El control debe empezar cuando el producto llega al centro de experimentación y antes de su aceptación definitiva. Los técnicos o investigadores deben:

• Asegurarse de que las condiciones de presentación de los alimentos en el momento de llegar a su poder sean óptimas (envasado correcto, ausencia de trazas de humedad, sacos en buen estado, fecha de fabricación o caducidad).

• Comprobar que las fórmulas que figuran en la etiqueta corresponden al pedido.

Se aconseja no aceptar partidas envejecidas y fabricadas con más de tres meses de antelación (menos tiempo en el caso de cobayos). Solamente está justificada la compra de cantidades considerables de pienso para experimentos de larga duración con la finalidad de adquirir un solo lote de fabricación y asegurarse de que no varían las concentraciones de nutrientes. Igualmente, se deben desechar envases rotos, con alto porcentaje de humedad, de olor extraño, enmohecidos y con excrementos de roedores.

Las dietas compuestas de ingredientes naturales se deterioran antes. Los piensos deben almacenarse siempre en sitios fríos o frescos (ideal en cámara fría). En los piensos granulados la estabilidad durante el almacenamiento depende en gran medida de las características ambientales (HR, temperatura de almacenamiento, grado de exposición al oxígeno atmosférico, pH del producto). Un nivel de humedad homogéneo es preferible a la existencia de «bolsas» con alto contenido de humedad. El calor y la humedad promueven la incubación de huevos y la aparición de diversos plagas (tenebriónidos o gusanos de la harina). Toda actividad metabólica origina la producción de agua, que incrementa el contenido de humedad, contribuyendo a acelerar el nivel de deterioro del sabor y contenido nutritivo de los alimentos almacenados. La estabilidad de los piensos es inversamente proporcional a su contenido en humedad, que ha de mantenerse por debajo del 15 %. Se aconseja el almacenamiento de las dietas sintéticas a bajas temperaturas en sacos opacos, realizando nuevas mezclas cuando se precise más pienso en experimentos de larga duración. Es esencial evitar la entrada de roedores y pájaros a los almacenes. Éstos deben disponer de mosquiteras, barreras antirroedores y estaciones de cebos en las proximidades, como barrera preventiva y detectora de la presencia de roedores foráneos.

La necesidad del control nutricional

Control sobre las especificaciones del etiquetado

El llamado análisis proximal de una dieta es necesario en dietas de fórmula cerrada basadas en dietas estándar de fórmula abierta, sometidas a variaciones imprevisibles por cambios en las materias primas, alteración en la aplicación de los correctores, o variaciones en la premezcla y la mezcla antes de la peletización o la extrusión. El objetivo es determinar posibles desviaciones sobre los valores aportados en las etiquetas de las diferentes partidas. Suponen el control del control que nos presentan las empresas productoras o abastecedoras.

Este control se debería realizar de manera rutinaria para garantizar la adecuada nutrición de los animales y evitar patologías o deficiencias en el crecimiento, desarrollo y tasa reproductora de la población. Igualmente, se hace necesario en estudios de tipo nutricional en los que estas dietas se utilizan como patrón o control, y sobre todo, en estudios de lexicología.

La calibración de las composiciones

Las fábricas productoras de dietas para animales de consumo y compañía que trabajan con normas ISO 9000 disponen de modelos de calibración de los piensos, que analizados con rapidez permiten determinar si las partidas fabricadas superan o no los niveles deseados. Eos análisis repetidos sirven como valores de referencia (patrón) o curvas de calibración para validar métodos de análisis rápidos en la misma fábrica, para el control de las desviaciones en el contenido en nutrientes de los distintos lotes de pienso. Para ello se analizan al menos 50 muestras de distintos lotes de piensos y se realizan en ellas 50 determinaciones de cada uno de los parámetros. El número total de muestras es de unas 10 000 (2500 por cada parámetro). La calibración mediante infrarrojos a partir de valores estándar se hace al menos para proteínas, grasas, hidratos de carbono, humedad y algún mineral diana como el Ca. Para posibles alteraciones en la aplicación del corrector se debe determinar alguna vitamina (vitamina A y tiamina, según Oller et al. 1989). Esto permite validar la composición en las diferentes partidas producidas, garantizando que la composición indicada en la etiqueta ha sido controlada experimentalmente antes de su distribución al usuario.

Probablemente, para dietas de animales de laboratorio (dado la baja producción) pocas empresas disponen de este sistema, con lo cual se deja al azar la composición real de estas dietas. Igualmente, el MAPA es muy laxo a la hora de exigir los controles y los intervalos de los valores de la etiqueta. Posiblemente, nadie realiza los análisis por partida que especifica en la etiqueta, cuyos valores son sospechosamente siempre los mismos.

El problema de la homogeneidad de las mezclas

Constituye uno de los problemas diana en la fabricación de piensos. Las plantas más modernas son capaces de producir pienso a la carta, sin solución de continuidad y en cantidades con un amplio margen de variabilidad. Existen casos de producción de más de 50 tipos diferentes de piensos de conejo, de manera rápida y controlada por ordenador. Sin embargo, esto puede originar problemas en la calidad de la mezcla. Existen los controles de verificación de la homogeneidad de la mezcla que utilizan como elemento diana los cloruros analizados mediante la técnica NIR (espectroscopia de reflectancia en infrarrojo cercano). Se toman al menos 10 muestras del punto más próximo de la mezcladora al que se puede acceder, y no se aceptan valores superiores al 10 % de coeficiente de variación (CV %) sobre el valor de una mezcla patrón.

Componentes que se han de controlar y métodos

Un análisis proximal incluye la determinación cuantitativa de al menos los siguientes parámetros:

• Humedad: muestra (4-5 g) sometida a 105 ± 2 °C en estufa hasta alcanzar un peso constante.

• Proteína bruta: determinación de nitrógeno total por el método de Kjeldahl.

• Extracto etéreo (grasa): tras digestión clorhídrica (hidrólisis con C1H). Método de Stold.

• Cenizas (minerales totales): por calcinación de 1-2 g de muestra a 450 °C en horno eléctrico.

• Vitaminas clave, como la A, E o D3: muestras saponificadas y extraídas con hexano y preparación de soluciones patrón de ambos componentes, determinando la cantidad exacta en sus respectivas disoluciones patrón mediante absorbancia por ultravioleta, por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Contaminantes abióticos

Las casas especializadas envían controles periódicos de este tipo de contaminantes con los niveles mínimos aceptados por las reglamentaciones internacionales (USP EPA, Federal Register, 1979, vol. 44, n.° 9, May 9). Su presencia se debe a una posible contaminación de las materias primas en los procesos de cultivo (utilización de pesticidas o herbicidas) y a los métodos de conservación y almacenamiento).

Tanto en animales de laboratorio convencionales de alta calidad como en SPF (speci-fic patoghenfree: libres de patógenos específicos) no se puede permitir la presencia, en sus dietas, de contaminantes abióticos. Por ejemplo, los residuos de DDT (dentro del intervalo 0-1 mg/kg) influyen en la actividad de ciertas enzimas microsomales hepáticas de la rata, modificando la respuesta del hígado a procesos experimentales. Detectar su presencia/ausencia es particularmente importante en estudios de inducción de inmunotoxicidad, inducción enzimática, y desarrollo y reproducción de toxicidades. Destacan por su importancia:

Residuos de plaguicidas organoclorados y organofosforados. La presencia de los primeros debe ser < 0.005 mg/kg de pienso y de los segundos, <0.01 mg/kg. La estimación de la proporción de pesticidas pasa por el análisis mediante espectrometría de masas, por ionización química p mediante trampa de iones (cromatografía en fase gaseosa). Un análisis completo supone la determinación de 13 organoclorados y 14 organofosforados diferentes. No obstante, se pueden determinar elementos diana sobre la base de familias o grupos con estructura química similar. Al menos se ha de analizar la presencia de malatión, PCP, dieldrina, lindano, heptacloro y DDT.

Minerales, normalmente pesados. Se determinan por mineralización por vía húmeda. La detección de metales pesados debe incluir al menos 12 tipos diferentes. Metales diana son el arsénico, cadmio, mercurio y plomo. Es importante la ausencia de nitratos y nitritos.

Antibióticos (penicilina G y otros). Se añaden a las materias primas para incrementar su conservación y evitar contaminaciones microbiológicas. En muchos casos su presencia se ha debido a la utilización de materias primas que llevaban mucho tiempo (¡incluso años!) almacenadas o procedentes de terceros países con inadecuados sistemas de almacenamiento y conservación. La empresa farmacéutica BIOKITS (comunicación personal) detecta su presencia en piensos de al menos cuatro casas comerciales, provocando desde la inhibición total del crecimiento de Treponema pallidum (Tp) en diferentes lotes de conejos, hasta la disminución de 0.8 x 109 Tp/conejo inoculado (valores normales de 1.5-2 x 109 Tp/conejo). En el caso de ensayos de antibióticos, no se puede aceptar la adición de estos elementos, por los efectos de alteración de la resistencia o sensibilidad del antibiótico ensayado (problemas de obtención de antígeno). Para una detección puramente cualitativa se utiliza un test colorimétrico similar al utilizado para detectar su presencia en la orina o el riñon. Su cuantificación exige métodos más complejos, como la HPLC.

Componentes naturales o artificiales con actividad hormonal. Se trata de detectar la presencia de fitoestrógenos, entre los componentes naturales, y de xenobióticos hormonales (pesticidas organoclorados, bifenoles, fta-latos y alquilfenoles) entre los contaminantes. Se ha definido el término genérico de disruptores endocrinos para designar al grupo heterogéneo de contaminantes con actividad hormonal. La presencia de los disruptores endocrinos en las preparaciones comerciales de alimentos puede tener un origen muy diverso: i) componentes naturales de los productos primarios empleados en la fabricación de los preparados; por ejemplo, soja y sus derivados; ii) contaminantes presentes en los vegetales, como residuos de pesticidas; iii) monómeros de plásticos empleados en la fabricación de los contenedores en que se conservan o esterilizan los alimentos (véase esterilización). El equilibrio de las hormonas sexuales —estrógenos y andrógenos— parece ser el más afectado, por lo que se ha hecho hincapié en los trastornos de la reproducción y en los efectos generales dependientes de los estrógenos.

Melazas. En alimentos destinados a determinadas especies (p. ej., el conejo) se añaden ingredientes que los hacen más sabrosos (derivados del procesamiento de la caña de azúcar y otros). Está demostrado que el uso de ingredientes que añaden sabor no incrementa significativamente el consumo de pienso por largos períodos en las especies comúnmente utilizadas en la investigación biomédica. Su necesidad se reduce cuando los piensos contienen un gran porcentaje de grasa. Determinados aditivos aromatizantes, como colorantes, hormonas y promotores del crecimiento, no pueden permitirse para animales de experimentación.

Otros elementos relacionados con la contaminación abiótica, son los estrógenos y las aflatoxinas producidas por hongos y levaduras del tipo B,, B2, G, y G2 (mínimo aceptado < 0.001 mg/kg). Otras micotoxinas producidas por hongos son las acratoxinas, la cerealenona y la esterigmatocistina. Su presencia se determina mediante cromatografía en fase iónica. Al menos se debe determinar la presencia/ausencia de aflatoxinas. Debido a su alta toxicidad, su presencia obligaría a desechar una partida de pienso.

Contaminantes bióticos

Estándares microbiológicos recomendados

Las dietas destinadas al consumo del animal de laboratorio, por su propia composición o por contaminación, constituyen de forma directa un medio de transmisión y cultivo de gérmenes específicamente patógenos, o que sin serlo, pueden originar alteraciones metabólicas y/o digestivas, e indirectamente repercutir sobre los bioensayos que se realizan con ellos. Con anterioridad al proceso de formación de pellets, ya sea por presión en seco o mediante vapor de agua, las harinas se someten a un preacondicionamiento con vapor a alta temperatura, que oscila entre los 50-90 °C, reduciendo la carga bacteriana de la mezcla a niveles inferiores al mínimo permitido. La extrusión de pellets con vapor de agua a presión elevada (8-9 bar) puede reducir hasta 2-4 veces el contenido bacteriológico total, pero aumenta la HR de los pellets, favoreciendo a largo plazo la formación de hongos, especialmente en el período estival.

Existen diferentes patologías en roedores que se pueden asociar a la carga microbiológica de la dieta. Hongos y levaduras producen alteraciones metabólicas y estrogénicas debidas a los metabolitos fúngicos derivados de sus micotoxinas; junto con los agentes no patógenos aerobios (coliformes y enteroco-cos), indican la humedad final del producto obtenido o su conservación en almacenes sin protección, por un período prolongado o en condiciones de temperatura y humedad inadecuadas.

Agentes patógenos de primer orden son Scilmonella, E. coü, Staphylococcus y Clostridium spp, dependiendo de sus sero-tipos. Un elemento importante de contaminación es Clostridium perfringens, responsable de toxiinfecciones alimentarias (esporas tipo A) y enteritis necrótica (tipo B), producida por enterotoxinas citoplasmáticas de los gérmenes en fase de esporas, con la circunstancia añadida de que las del tipo A son muy resistentes al calor. La tolerancia máxima se ha establecido en 102/g de producto, y su presencia indica fermentaciones anaerobias intensas al almacenar la materia prima en silos de gran tamaño, o mantener posteriormente el pienso en condiciones de humedad.

Se debe detectar la presencia de al menos: bacterias aerobias mesófilas (<1 x 106/g); coliformes (1 x 102/g); Escherichia coli (ausencia en 1 g); enterococos (<lx!02/g); Salmonella (ausencia en 25 g); Clostridium perfringens (1 x 10/g); estafilocos patógenos (DNAasa, coagulasa y termonucleasa, máximo 10 ufc/g) y hongos o levaduras (< 1 x x 102/g). En condiciones normales, no se suelen realizar los análisis correspondientes a Escherichia coli y enterococos, porque se considera que al investigar los coliformes (enterobacteriáceas lactosa+) y salmonelas (enterobacteriáceas sin lactosa") se cubre suficientemente la detección de gérmenes fecales.

Métodos y protocolos de esterilización de dietas

Es difícil encontrar un pienso en el mercado sin contaminación biótica, procedente en la mayoría de los casos de las materias primas. Un pienso en condiciones normales no suele presentar unidades formadoras de colonias (ufe), de coliformes, Salmonella y estafilocos (Cuadro 4-14); sin embargo, ninguno se libra de aerobios mesófilos, Clostridium y mohos o levaduras. Un pienso con valores superiores debe rechazarse, como es el caso de la muestra MP1-3 (ver Cuadro 4-14).

Otra cuestión es si en el caso de los animales de experimentación debemos estar tranquilos con los mínimos de ufe indicados anteriormente. Si la instalación es convencional y no dispone de barreras (véase Capítulo 5), se puede aceptar. Pero si disponemos de éstas y el objetivo es producir o mantener animales gnotobióticos o SPF (véase Capítulo 7), o bien se realizan estudios de microbiología o producción de ascitis, o tenemos inmunodeprimidos o algo similar, no es aceptable. En este caso es incuestionable el tratamiento del pienso por medio de calor (térmico) o por irradiación.

La exposición temporal a vapor a presión elevada o a radiaciones gamma son los métodos de esterilización más utilizados. La esterilización química mediante fumigación de óxido de etileno ha sido definitivamente desechada por el potencial peligro de toxicidad durante su manipulación y por la dificuitad de eliminar los residuos de óxido de la dieta.

Cuadro 4-14. Carga microbiológica de dieta control (MCI-3) y tratada térmicamente (MT) con diferentes valores de temperatura (°C) y tiempo (T°). Igualmente se indica la microbiología de una dieta altamente contaminada (MP1-3). En todos los casos se indica el valor medio (± DS). (Extraído de Zúñiga et al., 1999)

TMA: tasa máxima aceptada.

MC: muestra control, n = 6.

MP: muestra problema.

MT: muestra tratada térmicamente.

AMES: aerobios mesófilos; COLI: coliformes; SALM: salmonella; CLOS: Clostridium; ESTAFI: estafilococos;

MOH/LEV: mohos y levaduras.

Esterilización por calor: una esterilización eficaz por vapor exige la utilización del autoclave con presiones de vapor superiores a 1 atm y para que sea completa, los piensos deben someterse a temperaturas superiores a los 120 °C. Valores de 80 a 120 °C, se consideran pasteurización, capaz de destruir los organismos vegetativos y huevos de parásitos, pero no las esporas y alguna flora bacteriana. La destrucción de los contaminantes microbianos se produce cuando se libera el calor latente por condensación, después del vacío, garantizando el mantenimiento de la temperatura precisa durante el tiempo preestablecido, ya que es esencial la penetración completa del vapor en los pellets. Para conseguir estas condiciones, los piensos deben extenderse en capas inferiores a 3 cm de espesor, a fin de facilitar una distribución homogénea del calor.

En sí mismo es evidente que un proceso de esta naturaleza, diseñado para la aniquilación de microorganismos, pueda originar alguna destrucción de los componentes de la dieta.

Aparentemente no afecta al contenido de proteína cruda, pero sí puede afectar a su di-gestibilidad efectiva (DT), valor biológico (VB) y proteína neta utilizada (PNU = DT x x VB), debido a una sensible reducción en la disponibilidad de los aminoácidos metionina y lisina fundamentalmente. Por otra parte, la esterilización por calor puede afectar seriamente a las vitaminas termolábiles, fundamentalmente del complejo B, B,, B6, ácido pantoténico, ácido fólico y vitaminas A y C (Fig. 4-2). La composición del complemento mineral también es importante debido a posibles alteraciones del pH de la dieta, que a su vez pueden afectar a la pérdida de nutrientes. Se considera adecuado complementar las dietas esterilizadas con el doble de su contenido vitamínico para compensar posibles pérdidas.

Otra secuela de la esterilización por vapor es el «efecto de bronceado» (Millard), como consecuencia de la reacción entre los carbohidratos y los grupos amino de los aminoácidos. Se ha observado que esta reacción provoca diarrea y una reducción significativa de la retención de Ca, P, Mg y Cu en animales GF (germ-free: sin gérmenes), pero no en convencionales.

Finalmente, la alteración de la textura, color y sabor del alimento puede afectar a su consumo (palatabilidad), modificando a medio o largo plazo el normal crecimiento o desarrollo de los animales y sus índices de producción: menor peso al nacer, aumento del intervalo entre carnadas, y otros. La dureza de los pellets se ve incrementada en un 49-50 % en dietas esterilizadas a 121 ° C, en un ciclo completo de 2 horas, como consecuencia de la caramelización de los carbohidratos y el almidón.

Para obtener una esterilización completa, la temperatura de los piensos debe elevarse por encima de los 100 °C. Si se realiza en autoclave, la presión del vapor debe ser superior a una atmósfera. Para asegurar estas condiciones, los piensos deben extenderse en capas poco profundas (1.5 cm) envueltos en un material que permita la penetración del vapor (sacos de algodón, bolsas de nailon protegidas…).

Lo ideal es establecer el vacío antes de la admisión del vapor para facilitar su penetración en la masa total a tratar. Para un tratamiento eficaz y homogéneo, el pienso se dispone en capas de 2-3 cm en el interior de cajas de acero inoxidable perforadas (600 x 170x x 630 mm) con perforaciones de 2 mm, cargadas en el interior del autoclave. Se debe evitar la esterilización en el interior de los sacos de papel microperforados ante la posible liberación de monómeros tóxicos provenientes de los pegamentos utilizados para unir las diferentes capas de papel que los componen.

La pasteurización garantiza, a partir de los 105 °C (15' y 25' de secado), la pérdida del contenido microbiológico del pienso, incluidas las formas de mayor resistencia al calor (véase Cuadro 4-14). No obstante, las partidas de pienso sospechosas o en malas condiciones se deberían tratar a temperatura > 105 °C y < 121 °C, para garantizar la eliminación de toda fuente de contaminación sin necesidad de hacer un análisis microbiológico del pienso. En este sentido, se considera que 115 °C (tres prevacíos, 15-20' de esterilización, 25' de secado) es la temperatura más adecuada, cumpliendo sobradamente las expectativas de control de calidad microbiológica, sin producir alteraciones apreciables en el crecimiento y desarrollo de los animales de laboratorio sometidos a ensayado.

Por otra parte, las formas innovadoras de encapsulado de las vitaminas liposolubles y termolábiles (E y D3) les proporcionan una mayor resistencia al calor, lo que hace innecesaria la adición de vitaminas a las dietas para su esterilización, siempre y cuando ésta se realice a menos de 121 °C (Fig. 4-3). Esto permite tratar térmicamente las dietas usuales destinadas a los animales en mantenimiento y reproductores, suministradas por las casas comerciales, sin mermas apreciables en el crecimiento y productividad. Las alteraciones en la asimilación del nitrógeno, sobre todo en animales en fase de crecimiento, desaconsejan esterilizar a temperatura ≥ a 121° C.

Otro aspecto que se ha de considerar es que la exposición a temperaturas elevadas durante un tiempo breve es menos perjudicial para la integridad de los principios nutritivos que los tratamientos durante mucho tiempo a bajas temperaturas. Para ello, se necesitan autoclaves que obtengan un buen vacío antes y después del tratamiento con vapor, y se han de alcanzar al menos 134 °C durante 3'. Los aceites y las grasas no pueden esterilizarse eficazmente por medio del vapor. Deben tratarse con calor seco a 150 °C durante 30'.

Figura 4-3. A. Muestras de pienso sin esterilizar (superior derecha) y esterilizadas a diferente temperatura (130 °C superior izquierda, 115 °C inferior derecha, 120 °C inferior izquierda). B. Muestras de pienso en mal estado y sometidas a análisis microbiológicos. Se observa la formación de colonias de mohos y levaduras. (Fotos cedidas por J. M. Zúñiga.) (Véase pliego color.)

Esterilización por radiaciones ionizantes: el método de exposición a radiaciones ionizantes de tipo gamma utilizando como fuente 60Co es el más eficaz, debido al intenso poder de penetración de las radiaciones y a la escasa alteración que producen en el contenido nutritivo y la estabilidad de las dietas, observándose escasas alteraciones en su digestibi-lidad. La unidad de medida de la radiación es el gay (Gy); una dosis de 25 kGy a temperatura normal es la más adecuada para asegurar la esterilización de dietas de animales de laboratorio, aunque es preferible alcanzar dosis superiores (50 kGy) en el caso de animales gnotobióticos. El aumento de temperatura para estas dosis de radiación es de pocos grados y no hay actividad residual en los productos tratados. La radiación es, en general, menos perjudicial que el calor para los principios nutritivos de la dieta. En contraste, la presencia de humedad aumenta la posibilidad de pérdida de nutrientes porque la irradiación del agua incrementa los radicales libres que pueden originar cambios oxidativos.

En la actualidad, existen algunas instalaciones industriales destinadas a la radiación de múltiples productos, que pueden irradiar grandes cantidades de pienso. Su mayor y casi único inconveniente es el alto coste (un 50-80% más del precio original del pienso).

Una ventaja práctica de la radiación es su alto poder de penetración, lo que permite que paquetes gruesos sean esterilizados satisfactoriamente. Si la dieta va destinada a animales gnotobióticos, deben prepararse volúmenes de pienso en bolsas de plástico precintadas, siendo preferible hacer previamente el vacío en ellas, para de esta forma reducir los cambios oxidativos inducidos por las radiaciones. Impregnar la dieta en nitrógeno antes de ser precintada es una buena alternativa en dietas finamente molidas donde las oxidaciones inducidas por la radiación pueden crear problemas. El paquete con la dieta es entonces sellado en una segunda envoltura que puede quitarse inmediatamente antes de la introducción en el ambiente estéril del aislador (véase Cap. 7). Los paquetes con pienso son protegidos durante el transporte y la irradiación por cartones fuertes o sacos compatibles con el equipo mecánico de manejo y con la planta de irradiación.

BIBLIOGRAFIA

• RAO, GN.New nonpurified diet (NTP-200) for rodents in the national toxicology Program’s toxicology and carcinogenesis studies. J. Nutr 1997; 127:842S-846S

• ZUÑIGA M., Jesús et. Al. Ciencia y Tecnología en protección y experimentación animal. Ed. McGraw-Hill- Interamericana. Madrid (España). 2001. Pág. 109-153 Pág.

Articulos:

• Marshall, L.G. 1982. Evoltuion of South American Marsupials, In : Mares, M.A. & H.H. Genoways (Eds.). Mammalian biology of south american.Pygmat.Lab.Ecol.Univ. Pittsburg.6:231-272.
• www.ciens.ula.ve/~cires/recol-v3n1a07.pdf

DATOS DE LOS AUTORES

Carolina Avila

Alavaro Soler G.

Estudiantes de 6 semestres de biología de la Universidad del Tolima

Partes: 1, 2, 3, 4