Guía de trabajo práctico para estudiantes de segundo año de la carrera de medicina (página 2)
Enviado por Mar�a Espino Hern�ndez
17. No abandonar el laboratorio sin la debida autorización del profesor.
18. El incumplimiento de alguno de los aspectos relacionados, se considera una indisciplina.
Práctica de Laboratorio No. 1
Tema 2: Parasitología Médica
Título: Diagnóstico de laboratorio de protozoos intestinales y sanguíneos.
Objetivos:
Enumerar los diferentes productos patológicos que se requieren para el diagnóstico de los protozoos intestinales y sanguíneos.
Mencionar las características que deben cumplir las diferentes muestras para el diagnóstico de protozoos intestinales y sanguíneos, así como los métodos diagnósticos empleados en cada caso.
Observar al microscopio quistes de protozoos intestinales y formas parasitarias de Plasmodium.
Aspectos teóricos
Las enfermedades asociadas a protozoos tienen en la actualidad una elevada incidencia en la población mundial algunas de ellas acompañadas de una alta tasa de mortalidad, tal es el caso del paludismo y la tripanosomiasis africana, entre otras. Algunos protozoos intestinales como Giardia lamblia y Entamoeba histolytica son causa de mal nutrición, pérdida de peso y diarreas severas; otros, como Plasmodium sp, Trypanosoma sp y Leishmania producen afecciones cardíacas y del SNC, dañan las membranas mucosas, la piel y diferentes órganos de la economía.
Los ciclos de vida de los protozoos son muy variados y complejos. El conocimiento de éstos permite realizar una toma de la muestra en el momento adecuado con el fin de poder observar el agente biológico y con ello realizar el diagnóstico certero de la enfermedad. Demostrar e identificar el agente infectante se considera la regla de oro en el diagnóstico parasitológico.
Diagnóstico de los protozoos sanguíneos.
Dentro de los protozoos sanguíneos se destacan por su incidencia e importancia epidemiológica Plasmodium sp, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei y Leishmania donovanii.
a) Toma de la muestra: Es necesario tener en cuenta el período en el cual el parásito de acuerdo a su ciclo de vida, transita por la sangre (parasitemia) o se encuentra presente en determinados órganos y/o tejidos (sitios de inoculación) en los que produce lesiones características. Atendiendo a ello las muestras pueden ser:
Sangre periférica
Tejidos
LCR
Exudado de las lesiones
Aspirado del chancro inicial o del ganglio linfático
b) Métodos de diagnóstico: Pueden ser indirectos o directos. Los primeros se basan en la determinación de la respuesta inmune del organismo ante la infección parasitaria a través de pruebas inmunoserológicas y los directos se sustentan en la observación de las formas parasitarias. Los métodos directos son los más empleados. Estos pueden ser:
Examen en fresco de la sangre: se coloca una gota de sangre entre cubre y portaobjetos y se observa al microscopio con objetivo seco de 40x.
Frotis de la sangre: se extiende una gota de sangre sobre un portaobjeto, se seca al aire y se fija con metanol. Teñimos por el método de Giemsa y observamos al microscopio con objetivo de inmersión (100x).
Gota gruesa: se extiende una gota de sangre en un área del portaobjeto de 1cm2, se deja secar, se tiñe por el método de Giemsa y se observa al microscopio con objetivo de inmersión (100x).
Los métodos indirectos más utilizados son: ELISA, Inmunofluorescencia, Inmunoprecipitación, Fijación del complemento y Aglutinación.
Diagnóstico de protozoos intestinales:
Dentro de los protozoos intestinales se destacan por su interés clínico Entamoeba histolytica y Giardia lamblia.
a) Toma de la muestra: La muestra ideal son las heces las que deben ser colectadas preferiblemente en un recipiente de cristal o plástico correctamente lavado y seco. Deben ser además frescas (recién emitidas) y procesadas rápidamente en particular cuando queremos observar los trofozoítos de estos parásitos. De no ser posible el procesamiento inmediato se deben conservar por diferentes medios que pueden ser: refrigeración a 4oC, en formol al 5 ó 10 %, alcohol polivinílico (PVA) ó en una solución de Mertiolato-yodo-formol (MIF). La muestra debe ser recogida directamente sobre un papel limpio colocado en el suelo para evitar que se mezcle con la orina ya que las sustancias aquí presentes pueden dañar los trofozoítos. En los parasitismos es común que no se excreten constantemente las formas parasitarias, este fenómeno está estrechamente relacionado con el ciclo de vida del parásito y se conoce como fase de excreción negativa, por tal motivo se recomienda siempre indicar de tres a seis exámenes de heces con un periodo de dos a tres días entre uno y otro (exámenes seriados). En los casos de alta sospecha clínica de giardiosis se puede obtener también una muestra de aspirado duodenal o de biopsia duodenal para realizar el diagnóstico, siempre que los análisis de las heces hayan resultado negativos.
b) Métodos de diagnóstico:
Examen directo entre cubre y portaobjeto: Se coloca una pequeña porción de las heces en un portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o solución salina fisiológica, se coloca sobre la preparación una lámina cubreobjeto y se examina al microscopio con objetivo de 40x.
Métodos de concentración: Aumentan considerablemente la sensibilidad del diagnóstico. Utiliza una mayor cantidad de muestra (1 gramo aproximadamente) y se basan en la diferencia que pueda existir entre el peso específico de la sustancia en la cual se disuelve la muestra y las formas parasitarias. Basado en ello se han diseñado diferentes métodos, dentro de ellos el de Ritchie (solución formol-éter/acetato de etilo) es el más utilizado para el diagnóstico de los protozoos y por el cual se obtiene un concentrado de los quistes por un proceso de sedimentación.
Métodos indirectos: Los más utilizados son ELISA y aglutinación.
Problema: Usted tendrá en su puesto de trabajo un extendido de sangre teñido con Giemsa con formas parasitarias de Plasmodium sp., así como diferentes muestras de heces conservadas en formol que contienen quistes de protozoarios. Realizará el montaje para el exámen directo de las heces y observará al microscopio las diferentes formas parasitarias.
Reactivos y Materiales
Frotis de sangre periférica teñido con Giemsa.
Láminas portaobjetos y cubreobjetos
Microscopio óptico
Muestras de heces conservadas en formol
Aplicadores
Guantes
Lugol
Procedimiento
Para el exámen de las heces: (Guarde las medidas adecuadas de bioseguridad, colóquese los guantes antes de proceder)
a) Coloque en la lámina portaobjeto una gota de reactivo de lugol.
b) Con un aplicador tome una pequeña porción de heces y mezclela con la gota de lugol en el portaobjetos haciendo un pequeño círculo. (Utilice una lámina para cada muestra)
c) Coloque encima una lámina cubreobjetos.
d) Lleve la lámina al microscopio óptico y enfoque con objetivo de 10x. Al lograr una imagen nítida, pase al objetivo de 40x.
e) Observe detenidamente las características de los quistes observados y realice en su cuaderno un esquema de las diferentes formas parasitarias.
Para observar la lámina de sangre periférica:
a) Adicione sobre la preparación una gota de aceite de cedro.
b) Enfoque con objetivo de inmersión 100x
c) Realice en su cuaderno un esquema de las características de las formas de Plasmodium observadas.
Presentación de los resultados
– Realice un informe escrito de lo observado en cada una de las preparaciones.
Autopreparación
Consulte en su libro de texto, Microbiología y Parasitología Médica Tomo III, los siguientes capítulos:
Capítulo 76, Generalidades, los tema: Ciclo evolutivo, Proceso infeccioso parasitario, Fuentes de infección, Vías de entrada al hospedero y Diagnóstico clínico y de laboratorio de las enfermedades parasitarias (páginas 9, 11,12, 16 y 17)
Capítulo 78, Giardia lamblia (páginas 31-35)
Capítulo 84, Ameba (páginas 107-109)
Capítulo 88, Plasmodium (páginas 151-153 y 159-160)
Después proceda a responder las siguientes preguntas:
1. ¿Cuáles son las formas infectantes de Giardia lamblia y Entamoeba histolytica y cuáles son sus características más sobresalientes?
2. ¿Qué requisitos deben cumplir las muestras de heces para estudio parasitológico y en particular para la búsqueda de protozoos intestinales? ¿Qué otra muestra puede ser útil para el diagnóstico de la giardiosis?
3. Ante un paciente con sospecha clínica de paludismo, ¿Qué examen usted indicaría? ¿qué muestra sería necesaria para el estudio? Basado en el ciclo de vida de este parásito, ¿qué formas parasitarias pudiera encontrar en dicha muestra?
4. En un paciente con un cuadro de diarrea aguda en el que sospecha una amebiasis, resultó negativo el primer examen de las heces. ¿Considera usted este resultado concluyente? Fundamente su respuesta.
Práctica de Laboratorio No: 2
Tema 2: Parasitología Médica
Título: Diagnóstico de helmintos intestinales
Objetivos:
Mencionar los requisitos que debe cumplir la muestra de heces para el diagnóstico de infecciones por helmintos intestinales y los métodos de diagnóstico más frecuentemente empleados.
Observar al microscopio huevos y larvas de helmintos.
Observar las características macroscópicas de formas adultas de helmintos.
Aspectos teóricos.
Las helmintiasis afectan a una gran parte de la población mundial, en particular a aquellas personas que no guardan las condiciones higiénico sanitarias adecuadas; la defecación al aire libre, la ingestión de agua no potable para el consumo y de alimentos contaminados con tierra, el no lavado o el lavado incorrecto de las manos antes de ingerir alimentos, entre otras, constituyen muchas de las causas por las cuales las personas se infectan con estos parásitos.
Tal y como ocurre con los protozoos, los helmintos también poseen ciclos de vida variados y complejos y su conocimiento es importante toda vez que permite establecer las pautas tanto para el diagnóstico de laboratorio como para la prevención de estas enfermedades.
En los helmintos podemos observar tres formas parasitarias diferentes: el adulto, el huevo y la larva. Los helmintos adultos, de forma general, tienen una talla que permite ser observados a simple vista, sin embargo los huevos y las larvas son microscópicas. Por tal motivo, el diagnóstico de laboratorio en estos casos se basa tanto en la observación macroscópica de las muestras buscando las formas adultas del parásito, como en la observación microscópica en la búsqueda de huevos y larvas.
Diagnóstico de laboratorio
a) Toma de la muestra: La muestra generalmente son las heces y los requisitos para su obtención y conservación son los mismos que para el diagnóstico de los protozoarios. A diferencias de las infecciones por protozoarios, en estos parasitismos la diarrea no es un síntoma clínico común por lo que a veces a determinados pacientes se les hace difícil obtener la muestra. Es importante en estos casos aclarar que la muestra siempre debe ser obtenida por defecación espontánea ya que la utilización de laxantes y/o lavados intestinales incrementa el volumen de líquido y con ello la dilución de las formas parasitarias que puedan estar presentes en ella. Para el diagnóstico específico de Fasciola hepática, Ancylostoma duodenalis, Necator americanus y Strongyloides stercoralis la muestra de aspirado duodenal también puede ser útil en la búsqueda de huevos del parásito cuando los seriados de heces son negativos.
b) Métodos de diagnóstico: Al igual que para protozoos los métodos pueden ser directos e indirectos, siendo los directos los más recomendados.
Exámen directo entre cubre y portaobjeto: se coloca una pequeña porción de las heces en un portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o solución salina fisiológica, se coloca sobre la preparación una lámina cubreobjeto y se examina al microscopio con objetivo de 40x buscando huevos y larvas.
Métodos de concentración:
Método de Ritchie (ver clase práctica 1)
La Copa Cónica: está basado en la sedimentación y es el más utilizado para el diagnóstico de Fasciola dado el gran tamaño y peso de estos huevos.
Método de Faust: es una técnica basada en la flotación que emplea sulfato de zinc.
Método de Sheather: es un método común basado en la flotación que emplea una solución sobresaturada de azúcar, sal y formol.
Tamizaje de la heces: Consiste en hacer pasar las heces por un tamiz (colador) para observar parásitos adultos o fragmentos de ellos. Auxiliados con una lupa podemos identificar el agente por sus características macroscópicas.
Método de Graham o de la cinta adhesiva: Es un método especial para la identificación de huevos de Enterobius vermicularis, (también puede ser útil en el diagnóstico de Taenia sp). Consiste en aplicar un fragmento de cinta adhesiva transparente en la zona perianal del paciente, se retira y luego se coloca sobre una lámina portaobjeto para observar al microscopio los huevos característicos.
Método de Harada-Mori: Es una técnica empleada para el cultivo de larvas de nemátodos de interés clínico. Es un método útil para la diferenciación de ancylostomideos cuyos huevos son idénticos y es indispensable para el diagnóstico y seguimiento de las infecciones por Strongyloides stercoralis.
Método de la tinta china: Permite la diferenciación de las especies de Taenia a través del conteo de las ramas uterinas de los proglótides.
Problema: Usted encontrará en su puesto de trabajo diferentes vidrios reloj que contienen formas adultas de helmintos para la observación y descripción de sus características macroscópicas. Asimismo encontrará diferentes muestras de heces conservadas en formol las que contienen huevos y larvas de parásitos, procederá al montaje de las heces por examen directo y la observación posterior al microscopio.
Reactivos y materiales:
Guantes
Láminas portaobjetos
Láminas cubreobjetos
Aplicadores
Reactivo de Lugol.
Vidrios reloj con parásitos adultos.
Muestras de heces conservadas en formol
Procedimiento:
– Exámen directo de las heces:
a) Proceda de la misma forma que en la práctica anterior (Diagnóstico de protozoos intestinales) Recuerde guardar las medidas de bioseguridad requeridas, colóquese los guantes antes de comenzar a trabajar.
b) Observe detenidamente las características de los huevos y larvas. Realice un esquema de lo observado en su cuaderno relacionando cada uno de ellos con el parásito correspondiente
– Parásitos adultos:
a) Observe detenidamente los parásitos adultos contenidos en cada vidrio reloj y detalle cada una de sus características.
b) Realice las siguientes anotaciones en su cuaderno de trabajo: clasificación (si es Nematelminto o Platelminto y en este último caso si es Cestode o Trematodo), tamaño aproximado, diferencias entre hembra y macho, otras características distintivas.
Presentación de los resultados:
Confeccione un informe que recoja las observaciones macroscópicas y microscópicas realizadas.
Autopreparación:
Consulte en su libro de texto, Microbiología y Parasitología Médica Tomo III, los Capítulos siguientes:
Capítulo 95, Ascaris, (página 211-214)
Capítulo 96 Trichuris (página 217-219)
Capítulo 97 Acylostomas y Necator (páginas 221-224)
Capítulo 98 Strongyloides (página 229-231)
Capítulo 100 Enterobius (páginas 243-245)
Capítulo 112 Taenia saginata y Taenia solium (páginas 331-335
Capítulo 121 Fasciola (página 381-383 y 385)
Proceda luego a responder las siguientes preguntas:
1. Plantee las diferencias morfológicas fundamentales entre nematodos, cestodes y trematodos
2. ¿Cuál es el nematodo intestinal de mayor tamaño? ¿Cómo usted reconocería a simple vista la hembra de este parásito? ¿Qué características distintivas tienen sus huevos?
3. ¿Qué diferencias presentan las formas adultas de la hembra y el macho de Trichuris trichiura que permiten su reconocimiento? ¿Qué características tienen sus huevos?
4. ¿Para qué se utiliza el método de Graham?
5. ¿Qué características poseen los huevos de Enterobius vermicularis?
6. ¿Por que es necesario la tinción con tinta china de los proglótides, para la diferenciación entre T. solium y T. saginata?
7. En un paciente infectado por Fasciola hepática ¿qué forma parasitaria usted espera encontrar en las heces?, ¿qué características fundamentales poseen los huevos de este parásito?
Práctica de laboratorio 3
Tema 3: Bacteriología médica
Microscopía y coloraciones. Cultivo de los microorganismos.
Objetivos:
Realizar tinción de preparaciones por los métodos de Gram y Ziehl Neelsen.
Identificar al microscopio diferentes morfologías bacterianas y sus características tintoriales.
Observar las características del crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo
Aspectos teóricos
Durante el transcurso de una investigación bacteriológica la definición de la morfología y las características tintoriales de un microorganismo constituyen elementos claves para su identificación y el punto de partida para la realización posterior de pruebas fisiológicas y bioquímicas indispensables para la clasificación definitiva en género y especie.
El trabajo con microorganismos en el laboratorio se realiza en condiciones asépticas, tanto para evitar la contaminación de la muestra con los microorganismos ambientales como del investigador con la muestra. Es por esto que es necesario trabajar siempre en el entorno de la llama de un mechero bunzen, en un cuarto climatizado (cuarto de siembra) y en determinadas actividades bajo la protección de un gabinete de seguridad o flujo laminar.
Definición de las características morfológicas y tintoriales: Para definir las características morfológicas y tintoriales de una bacteria presente en una muestra lo primero es la preparación del frotis y la tinción posterior con colorantes apropiados.
Una de las técnicas de tinción más empleadas en Bacteriología es la Tinción de Gram. Este método, descrito por Christiam Gram en el año 1884, permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos (grampositivas y gramnegativas). Utiliza dos colorantes básicos (violeta cristal y safranina) una solución mordiente encargada de fijar el colorante violeta (lugol) y una solución decolorante (alcohol al 70%). Las bacterias Gram positivas retienen el colorante violeta cristal, por lo que se observan teñidas de color violeta, mientras que las gramnegativas se decoloran por la acción del alcohol y toman el segundo colorante (safranina) por lo que se ven de color rosado.
El fundamento de este método, se consideró hasta hace pocos años, estaba basado en la diferencia en la composición química de la pared celular de ambos grupos bacterianos, sin embargo, estudios más recientes han demostrado la participación de proteínas citoplasmáticas en esta respuesta.
Algunas bacterias no son capaces de teñirse por el método de Gram, para estos casos se utilizan métodos de tinción especiales. Uno de los más utilizados es el de Ziehl Neelsen para la identificación de micobacterias. Esta es una tinción diferencial que utiliza la fucsina fenicada como primer colorante, alcohol ácido como solución decolorante y el azul de metileno como colorante de contraste. Los géneros Mycobacterium, Nocardia y algunos actinomicetos resisten la decoloración por el alcohol ácido y permanecen teñidos con el primer colorante (rojo). Es por esto que se conocen como bacilos ácido alcohol resistente (BAAR). El principio de este método se basa en la alta proporción de ácidos micólicos (lípidos) presentes en la pared celular de estos microorganismos que los hace resistentes a la decoloración una vez teñidos por la fucsina. El resto de las bacterias sí se decoloran y se tiñen con el segundo colorante observándose de color azul.
Cultivo de los microorganismos: Los medios de cultivo son soluciones acuosas de diferentes sustancias nutritivas, necesarias para el crecimiento y la reproducción de los microorganismos. Estos son clasificados:
Según su estado físico en: líquidos, sólidos o semisólidos. La solidez de los medios se consigue por la adición de agar. El agar es una sustancia inerte, es decir, no es un nutriente ni tampoco interfiere con otros constituyentes del medio de cultivo.
Según su finalidad los medios se clasifican en:
Generales o universales: Garantizan el crecimiento de un elevado número de microorganismos. Ej. Agar nutriente, Agar sangre, Caldo cerebro–corazón, etc.
Enriquecimiento: Son medios complejos con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente exigentes). Ej. Caldo selenito, Caldo tetrationato de sodio, etc.
Selectivo: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ej. Agar SS, Agar Mc Conkey, Agar TCBS
Diferencial: Destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales del crecimiento en dichos medios.
Instrumentos de siembra: Los instrumentos empleados son:
Asa de alambre
Aguja de alambre
Hisopo
Pipeta
Espátula de Drigalsky
Jeringuilla
Métodos de siembra: La siembra de acuerdo a los propósitos, el instrumento utilizado y las características del medio donde se va a realizar el cultivo puede realizarse por:
Diseminación: se realiza de diferentes formas y con instrumentos variados dependiendo del objetivo que se persiga. Ejemplo: para obtener colonias aisladas en un medio de cultivo sólido se utiliza la diseminación por estrías, para lo que se emplea el asa de alambre. (Fig. 3.1)
- Picadura: se realiza con aguja de alambre, fundamentalmente en medios sólidos o semisólidos contenidos en tubos de cultivo.
A profundidad: También conocido como placa vertida. Es un método de siembra especial donde por lo regular el inóculo se mezcla con el medio de cultivo. (Fig. 3.2)
Incubación: Los medios de cultivo sembrados se colocan en incubadoras a la temperatura, humedad y concentración de oxígeno óptimas para el crecimiento. Las condiciones de incubación dependen de las características y del tiempo de generación del microorganismo. Las bacterias que comúnmente parasitan al hombre se desarrollan bien a temperaturas entre 35 y 37 oC en períodos de 18 a 24 horas.
Observación del crecimiento: Después de la incubación se observan las características del crecimiento del microorganismo y los cambios ocurridos en el medio de cultivo. En medios de cultivo en placas Petri pueden ser apreciados los caracteres de las colonias microbianas: color, borde (entero o festonado) brillo, superficie (lisa o rugosa) tamaño y producción de lisis de los glóbulos (éste último solo si el medio de cultivo empleado fuera Agar Sangre).
Problema: usted encontrará en su puesto de trabajo placas con cultivo bacteriano los que deberán identificar morfológicamente por la técnica de Gram definiendo forma, modo de agrupación y carácter tintorial del microorganismo, describirá además las características más sobresalientes observadas en los cultivos. Encontrará frotis elaborados a partir de una muestra de esputo para realizar tinción de Ziehl Neelsen.
Reactivos y materiales.
Asa de siembra
Portaobjetos
Colorantes para la tinción de Gram
Colorantes para la tinción de Ziehl Neelsen
Preparaciones para teñir por Ziehl Neelsen
Mechero bunzen
Aceite de cedro
Agua destilada estéril
Placas y tubos con cultivos.
Procedimiento.
Preparación del frotis a partir del cultivo:
1. Coloque sobre la lámina portaobjeto una gota de agua destilada estéril.
2. Esterilice el asa de siembra a la llama del mechero. (Fig. 3.3)
3. Arrastre una pequeña porción del cultivo bacteriano con el asa en condiciones asépticas.
4. Suspenda las células en la gota de agua sobre el portaobjeto.
5. Deje secar al aire.
6. Fije la preparación cortando con la lámina tres veces la llama del mechero (Fig. 3.4).
Tinción de Gram
Cubra el frotis con cristal violeta al 1%, espere 30 segundos y lave con agua corriente.
Cubra el frotis con lugol, espere 30 segundos y lave con agua corriente.
Cubra el frotis con alcohol etílico o alcohol acetona, espere 30 segundos y lave con agua corriente
Cubra el frotis con el colorante safranina, espere 30 segundos y lave con agua corriente.
Secar al aire.
Adicione una gota de aceite de cedro sobre la preparación y observe al microscopio con el objetivo de mayor aumento (100X).
Realice un esquema en su cuaderno de lo observado y anote las características morfológicas y tintoriales del microorganismo problema.
Tinción de Ziehl Neelsen
Cubra el frotis con fucsina y caliente el colorante sobre la lámina dándole calor a la lámina por debajo hasta que se observe la emisión de vapores. Espere 5 minutos y lave con abundante agua corriente.
Cubra la lámina con alcohol-ácido, espere 2 minutos y lave con agua corriente.
Cubra la preparación con azul de metileno, espere 30 segundos y lave con agua corriente.
Secar al aire.
Coloque sobre la preparación una gota de aceite de cedro y observe al microscopio con objetivo de inmersión (100X).
Anote en su cuaderno los resultados de la observación.
Definición de características culturales
Observe detenidamente los cultivos en las placas y determine las diferentes características de las colonias: tamaño, color, borde, superficie, aspecto, producción de hemólisis, etc.
Anote los resultados de lo observado en su cuaderno de trabajo
Presentación de los resultados:
Prepare un informe con los resultados obtenidos del trabajo realizado en el laboratorio de acuerdo a las indicaciones de su profesor.
Autopreparación
Revise en su libro de texto, Microbiología y Parasitología Médica Tomo I, los capítulos que a continuación se relacionan:
Capítulo 4, Microscopía y coloraciones (Pág. 20-28)
Capítulo 5, Características de las células procarióticas y eucarióticas (Pág. 29-36)
Capítulo 7 Cultivo y crecimiento de los microorganismos (Pág. 45-54)
Proceda después a responder las siguientes preguntas:
1. La coloración de Gram es una de las más utilizadas en Bacteriología, ¿en qué se fundamenta este método?
2. La tinción de Ziehl Neelsen se utiliza para la observación al microscopio de las micobacterias. ¿Cuál es el fundamento de este método de tinción?, ¿considera usted que si se omitiera el paso del calentamiento de la fucsina sobre la lámina, se obtendrían los mismos resultados? Fundamente.
3. ¿Qué se conoce como cultivo o siembra en Bacteriología? Cite ejemplos de medios de cultivo generales, diferenciales, selectivos y de enriquecimiento.
4. El agar es una sustancia inerte que aporta solidez a los medios de cultivo permitiendo el desarrollo de colonias aisladas. ¿Qué ventajas representa esto para el diagnóstico?
5. La tinción negativa es uno de los métodos empleados en el laboratorio de microbiología. Al respecto diga: ¿qué tipo de colorantes usted utilizaría en este caso?, ¿qué diferencias tiene este método con un método de tinción simple?
Clase práctica No 4
Tema III Bacteriología Médica
Título: Quimioterapia antimicrobiana. Métodos de respaldo al tratamiento antimicrobiano.
Objetivos:
Interpretar los mecanismos de acción de las drogas antimicrobianas y los mecanismos de resistencia desarrollados por las bacterias para contrarrestar su efecto.
Interpretar los resultados de un antibiograma por métodos de difusión y dilución de acuerdo a las categorías de susceptibilidad establecidas.
Aspectos teóricos
El descubrimiento de los antibióticos en el pasado siglo dio inicio a una nueva era en el tratamiento de las enfermedades infecciosas que estuvo marcada en la década de los años 20 por la obtención de la penicilina a cargo del notable científico Sir Alexander Fleming. La introducción de este antibiótico por primera vez en la clínica a inicios de la década del 40 y los subsiguientes descubrimientos de otras drogas con mecanismos y espectro de acción variados, permitió ganar una de las más importantes batallas libradas por el hombre en la lucha por la supervivencia.
Prácticamente desde los inicios en el uso de las entonces consideradas "drogas milagrosas" se evidenció la capacidad que tenían los microorganismos tanto para desarrollar mecanismos capaces de contrarrestar el efecto de estos fármacos, como de trasmitir tal característica a otros miembros de su progenie. Los mecanismos de resistencia desarrollados por las bacterias están estrechamente relacionados con el "blanco"o estructura de la célula sobre la que actúa un antibiótico o grupos de antibióticos en específico.
En la actualidad existen en uso más de un centenar de drogas pertenecientes a diferentes grupos y generaciones de antimicrobianos con capacidad variada para inhibir y matar microorganismos. Los mecanismos de acción de estos fármacos se agrupan generalmente en los siguientes:
1) Los que inhiben la síntesis de la pared celular
2) Los que inhiben la función de la membrana celular
3) Los que inhiben la síntesis proteica
4) Los que inhiben la síntesis de los ácidos nucleicos
Inhibición de la síntesis de la pared celular: Los antibióticos que actúan afectando la pared celular, tienen la capacidad de unirse a proteínas de la membrana citoplasmática bacteriana conocidas como PBP, siglas provenientes del inglés "penicilin binding protein" o lo que es lo mismo, proteínas de unión a penicilina. Estas, en su mayoría transpeptidasas, son las encargadas de transportar las pequeñas cadenas peptídicas que junto a las subunidades repetidas de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico conforman la estructura de enrejado característico del peptidoglucano, sustancia que aporta rigidez a la pared de la bacteria y que le permite garantizar su forma e integridad celular. La unión de la penicilina a esta enzima por su centro activo, impedirá a la transpeptidasa cumplir su función; como consecuencia se debilita la pared y la bacteria muere por lisis celular. Ejemplos de antibióticos que actúan por esta vía son todos los pertenecientes al grupo de los ÃY-lactámicos (antibióticos que se caracterizan por presentar en su estructura química un anillo ÃY-lactámico) que son los más abundantes y utilizados en la clínica. Entre los más conocidos podemos citar las penicilinas y todos sus derivados, además de otros como el ceporán, cefazolina y ceftriaxone, representantes de las cefalosporinas.
Inhibición de la función de la membrana celular: Los antibióticos que actúan a este nivel realizan función de detergentes o surfactantes, estos compuestos se adosan a la superficie externa de la membrana celular alterando su estructura y propiedades osmóticas. La unión de estos compuestos a la membrana se cree producen una reorientación de la estructura de mosaico fluido característico. Actúan por esta vía las polimixinas y los antifúngicos, fundamentalmente.
Inhibición de la síntesis proteica: Los fármacos que actúan impidiendo esta función tienen la capacidad de interactuar con el ribosoma bacteriano de forma selectiva en alguno de los eventos que ocurren a nivel de las subunidades 30S y/o 50S, interfiriendo de algún modo en la fidelidad de la lectura del código genético o por interferencia directa en alguno de los procesos de la síntesis proteica propiamente dicha. Una variedad de antibióticos actúan de esta forma entre los que se encuentran el cloramfenicol, la eritromicina, tetraciclina, kanamicina y gentamicina, entre otros.
Inhibición de la síntesis de los ácidos nucleicos: Por este mecanismo los antibióticos actúan alterando la estructura organizada de doble hélice del ADN bacteriano por bloqueo de la enzima ADN gyrasa o Topoisomerasa II afectándose el proceso de replicación y posteriores eventos de transcripción y traducción para la síntesis proteica. Ejemplos de antibióticos que actúan a este nivel son las quinolonas representadas por el ácido nalidíxico y la ciprofloxacina, entre otros así como también la rifampicina.
Mecanismos de resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos.
Se plantea que la resistencia de las bacterias a los antibióticos puede tener dos orígenes, uno genético y otro no genético. El no genético está relacionado con la aparición de resistencia debido a la pérdida del blanco de acción de una droga específica en la bacteria o por un proceso de inactivación (no multiplicación) que sufren algunas especies en determinados tejidos que infectan. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis tiene la capacidad de sobrevivir en los tejidos durante años sin multiplicarse después de causar un proceso infeccioso tiempo durante el cual se hace resistente al tratamiento. En cualquiera de estos casos la resistencia al fármaco no se transfiere a otras generaciones celulares y la susceptibilidad se recupera tan pronto el microorganismo comience nuevamente a multiplicarse o recupere la estructura perdida.
El mecanismo de resistencia genético, por su carácter heredable y transmisible horizontalmente incluso entre diferentes poblaciones microbianas, es el más importante y es el que desarrolla la bacteria como respuesta al ataque del agente antimicrobiano. Puede ser:
Cromosómico: cuando se produce una mutación en un locus que controla dentro del genoma la susceptibilidad a un medicamento dado.
Extracromosómico: cuando en el intervienen elementos no cromosomales conocidos como plásmidos los que pueden ser íntegramente transmitidos de una bacteria a otra por los diferentes procesos de intercambio genético (conjugación, transducción y transformación). De este modo la adquisición de uno solo de estos plásmidos R (plásmidos de resistencia) codifica en la bacteria resistencia para tantos antibióticos como información contenida tenga cada uno de ellos. Los transposones son pequeños segmentos de plásmidos R con capacidad de insertarse en cualquier sitio del genoma (mecanismo de transposición) que también codifican resistencia específica a diferentes fármacos.
Los mecanismos genéticos de resistencia a los antimicrobianos más comunes son los siguientes:
1. Inactivación enzimática
2. Modificación estructural del blanco o sitio de acción
3. Disminución de la permeabilidad a la droga
4. Desarrollo de bombas de eflujo activo
Inactivación enzimática: Es el más común. Las enzimas más conocidas son las denominadas ÃY-lactamasas desarrolladas por bacterias grampositivas y gramnegativas para inactivar a los antibióticos del tipo ÃY-lactámicos. La enzima es capaz de actuar sobre el antibiótico antes de que éste se una a las PBP que constituyen su blanco de acción Del mismo modo que son estos los antibióticos más utilizados en la clínica, en correspondencia con ello ya se han identificado más de 300 enzimas ÃY-lactamasas, que se diferencian en su perfil bioquímico y están destinadas a la hidrólisis de diferentes sustratos.
Modificaciones estructurales en los blancos o sitios de acción: La bacteria desarrolla un blanco estructural alterado incapaz de ser reconocido por el antibiótico específico. Ej. las bacterias resistentes a la oxacilina (penicilina capaz de resistir el efecto de las enzimas ÃY-lactamasas) eluden el efecto del antibiótico produciendo una modificación estructural de su blanco que son las PBP.
Disminución de la permeabilidad a la droga: Ante el ataque de determinados fármacos las bacterias pueden evadirlo por modificaciones en la permeabilidad de la membrana al medicamento. Por ejemplo, pérdida de poros de membrana especializados en el transporte de determinadas sustancias.
Desarrollo de bombas de eflujo activo: Diferentes microorganismos han creado esta defensa ante el ataque de un gran diversidad de fármacos. Producen proteínas especializadas en extraer el antibiótico del interior de la célula una vez que ha penetrado en el espacio periplásmico. Este mecanismo es extremadamente eficiente dado que la velocidad con que la bacteria saca de su interior el antibiótico es mayor que la velocidad con que éste penetra.
Resistencia cruzada: Cuando determinadas bacterias presentan resistencia a varios antibióticos que comparten parcial o totalmente un mismo mecanismo de acción, se dice entonces que existe resistencia cruzada.
Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos.
Tan pronto como fue introducido en la práctica clínica el uso de los antibióticos, surgió también la necesidad de implementar métodos de laboratorio capaces de medir el grado de efectividad de las diferentes drogas empleadas en el tratamiento de un proceso infeccioso específico.
La variedad de métodos y pruebas especiales destinadas al estudio de la susceptibilidad y respaldo al tratamiento antimicrobiano son muy variados y se han ido perfeccionando a través del tiempo con el propósito de hacerlos cada vez más eficientes y efectivos.
Antibiograma: Es la prueba en la cual enfrentamos un microorganismo a una concentración conocida de una droga antimicrobiana para evaluar su efecto midiendo el crecimiento microbiano a una temperatura y tiempo dados y comparándolo con un estándar de referencia. Los métodos se basan en la dilución o difusión del antibiótico en medios específicos en los que se cultiva el microorganismo y en todos los casos los resultados se interpretan a través de las siguientes categorías de susceptibilidad:
Susceptible (S) Significa que el microorganismo causante del proceso infeccioso debe responder exitosamente al tratamiento aplicado a las dosis habituales y por una vía apropiada.
Medianamente Susceptible o Intermedio: (MS o I) Significa que el microorganismo solo se inhibirá por la droga si se aplica una dosis máxima y por una vía parenteral. (Salvo excepciones, estos medicamentos no deben ser seleccionados para el tratamiento, sobre todo aquellos en los que la dosis terapéutica está muy cercana a los rangos de toxicidad).
Resistente: (R) Significa que el microorganismo no se inhibe por el antibiótico a las concentraciones sistémicas usualmente alcanzables por la droga cuando es aplicada por la vía y en las dosis adecuadas.
Métodos
a) Macrodilución en caldo: Fue el primero que se desarrolló y constituye el método de referencia. Se realiza en tubos de ensayo conteniendo un medio de cultivo líquido (caldo Mueller Hinton) y en el que se realizan diluciones sucesivas de un antibiótico partiendo de una concentración conocida. Posteriormente se inocula cada tubo con igual cantidad de un inóculo estandarizado del microorganismo de prueba. Se incuba durante 18-24 horas tiempo al cual se realiza la lectura a simple vista buscando turbidez indicadora de crecimiento microbiano. Lectura: se identifica el tubo con la menor concentración del antibiótico a la cual no se obtuvo crecimiento microbiano visible (ausencia de turbidez) o lo que es lo mismo, la concentración mínima inhibidora (CMI) que se expresa en &µg/mL (Figura 1) y los resultados se comparan con los estándares de referencia específicos que han sido internacionalmente normados para diferentes microorganismos o grupos microbianos. El laboratorio informa el valor de la CMI determinada para cada antibiótico acompañado de la categoría de susceptibilidad correspondiente. Ventajas: método más exacto. Desventajas: gran complejidad de realización y costo elevado.
Fig.4.1: Test de macrodilución en caldo. En los tubos donde hay menor concentración del antibiótico (tubos de la izquierda) aparece turbidez indicadora de crecimiento bacteriano. Contando de derecha a izquierda, la concentración de la droga contenida en el tubo ( 6 se correspondería con la CMI para ese antibiótico.
b) Microdilución en caldo: El mismo método llevado a microtécnica. Tiene como ventajas que emplea menor cantidad de recursos y se facilita su ejecución Se realiza en placas de microtítulo de fondo plano con tapa, destinadas para estos fines. Diferentes métodos automatizados utilizan como base esta variante y se considera el método ideal para monitorear el tratamiento antimicrobiano en el paciente grave. La lectura, informe del laboratorio e interpretación de los resultados se realiza de igual forma a la antes descrita.
c) Método de Bauer-Kirby: Es el internacionalmente recomendado para la práctica hospitalaria de rutina dada su sencillez y bajo costo, no obstante, está sujeto a múltiples errores técnicos razón por la que su realización requiere de un exhaustivo control de la calidad. Se realiza en placas de cultivo con Agar de Mueller-Hinton sobre las que se extiende el microorganismo de prueba con un hisopo de algodón estéril. Posteriormente sobre la superficie de la placa inoculada se colocan pequeños discos, comercialmente preparados, impregnados con concentraciones estandarizadas de los diferentes antibióticos y debidamente identificados. Las placas se incuban por un periodo de18-24 horas. Lectura: El antibiótico impregnado en el disco al hacer contacto con la superficie húmeda de la placa de agar difundirá en el medio impidiendo el crecimiento del microorganismo de prueba en correspondencia con su grado de susceptibilidad (halo de inhibición). Con una regla plana se mide en milímetros el halo obtenido en cada caso y se compara éste con los datos reflejados en las tablas de referencia para la interpretación de los resultados. Fig. 3 y 4. El Laboratorio informará el antibiótico acompañado de la categoría de susceptibilidad correspondiente.
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