Opciones para el bloqueo de la adhesión fimbrial de Escherichia coli

3. Etiopatogenia de las Infecciones de los Tractos Urinario y Gastrointestinal
4. Opciones terapéuticas ante las infecciones de los tractos urinario y gastrointestinal
5. Empleo de concentraciones subletales de antibióticos
6. Métodos inmunológicos: vacunas e inmunosueros
7. Efecto de extractos vegetales sobre la interacción fimbria-receptor
8. Bibliografía

Introducción

Las infecciones gastrointestinales constituyen un problema mundial. Anualmente se producen 1647 millones de casos de diarrea. En niños menores de un año el saldo asciende a 32 millones de muertes. La enfermedad diarreica aguda (EDA) provoca el 80% de los casos. E. coli enterotoxigénico (ECET) es el agente que con mayor frecuencia se asocia a esta etiología. Sólo, o acompañado de rotavirus, se ha aislado del 80 % de los pacientes de EDA – 650 millones de afectados y 500 mil muertos cada año-. Otros autores reportan aislamientos de ECET en el 20-60% de los pacientes que presentan esta enfermedad -tanto en niños como en adultos- en Africa, Asia e Iberoamérica (Agüero et al., 1985; Blanco y Blanco, 1993; Black, 1993; Valdespino et al., 1994; Barreto, 1997; Felder et al, 2001). Pese a que las diarreas agudas debidas a ECET se asocian a condiciones higiénico-sanitarias deficientes, propias de los países del tercer mundo, en los últimos años se han presentado brotes en países industrializados como Japón (Nishikawa et al., 1998; Mitsuda et al., 1998) y Estados Unidos (Roels et al.,1998; Felder et al, 2001).

En Estados Unidos, Canadá y Reino Unido, entre otros, el serotipo el O 157: H7, de esta especie, ha causado en los últimos tiempos un cuadro enterohemorrágico en humanos que puede ser fatal, sobre todo en niños y ancianos, cuando transita a síndrome urémico hemolítico (SUH). En esos países constituye la principal causa de diarrea sanguinolenta (15-41%) y el segundo o tercer patógeno, después de Salmonella y Campylobacter (Will 1995 a,b; Blanco et al., 1995; Barreto y Benítez, 2000). A esta variedad, que incluye un número amplio de serotipos, se le ha denominado E coli enterohemorrágica (ECHE) y es causa de zoonosis, por cuanto en la mayoría de los estudios desarrollados, entre otras causas, se ha asociado al consumo de alimentos de origen bovino con deficiente cocción. (Blanco y Blanco, 1993) y de otras especies (Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis-INPPAZ , 1996; Takeda, 1997; Barreto et al., 1998, 1999, 2000a). ECEH, al igual que ECET, necesita adherirse para colonizar, en este caso el intestino grueso; sólo así es que puede provocar los cuadros clínicos mencionados (Barreto, 1997; Barreto et al., 1998, 1999, 2000ª; Barreto y Benítez, 2000; Goosney et al., 2001; De Vinney et al., 2001).

ECET constituye un problema semejante en la salud animal. Por sólo mencionar un ejemplo, las pérdidas debidas a esta entidad en cerdos neonatos y jóvenes, sobrepasa el millón de pesos anualmente en el país (Wong et al., 1995, 1996) y un serio problema en países desarrollados (Anne Bertin, 1998; Wieler et al., 2001).

Las Infecciones del Tracto Urinario (ITU) también constituyen un problema de salud a escala mundial. Anualmente en Estados Unidos entre seis y siete millones de personas son atendidos debido a esta enfermedad y más de 100 000 son hospitalizados por pielonefritis aguda (Johnson, 1991). Las ITU constituyen la forma más común de las etiologías extraintestinales ocasionadas por E. coli que, a su vez, es la principal causa de la enfermedad.

A más de 100 años de su descubrimiento E coli figura entre los organismos vivos más estudiado y utilizado por el hombre. Pese a tan prolongada experiencia, inexplicablemente se mantiene entre los que con mayor impacto afectan su salud y la de un amplio rango de especies animales de indiscutible valor económico (Barreto, 1997; Barreto et al., 1998; Barreto y Campal, 2002)

Etiopatogenia de las Infecciones de los Tractos Urinario y Gastrointestinal

E. coli constituye la forma bacteriana bacilar, gramnegativa, anaerobia facultativa predominante en la flora intestinal del hombre y los animales. Sin embargo, de acuerdo a la teoría de la patogenicidad, existen determinadas particularidades que posibilitan el que ciertas cepas de esta especie, en otro ecosistema, venzan los mecanismos de defensa que son necesarios para controlarlas, y minimicen la competencia de la microflora normal (Orskov y Orskov, 1985, 1992; Gyles, 1992) como es el caso de las etiologías analizadas en esta revisión.

El proceso de infección en las ITU se ha demostrado que tiene lugar a partir de un prerrequisito esencial que es la adhesión bacteriana a receptores específicos del uroepitelio (Orskov y Orskov, 1992; Blanco et al., 1992; Blanco y Blanco, 1993). Si este paso se interrumpe, con ello se interrumpen los sucesivos en los que se produce la colonización, con las consecuencias que caracterizan a cada cuadro etiológico particular. En las ITU, producidas por E. coli, es conocido que las bacterias se adhieren típicamente a células periuretrales y uroepiteliales.

Estas cepas presentan apéndices de adhesión, denominados fimbrias, entre las que se encuentra el tipo P (E. coli P+). En el 70% de las pielonefritis agudas se aíslan cepas P+, mientras que en las bacteriurias asintomáticas sólo se presentan en un 28% (Brauner et al., 1985, 1987; Johnson, 1991).

En el caso de las cepas asociadas a EDA ocurre algo similar que posibilita, pese al peristaltismo intestinal, colonizar el intestino delgado (Barreto et al., 1993a). Brinton (1959) fue indiscutiblemente quien inauguró este campo. Él y sus seguidores demostraron que al igual que existía una relación antígeno–especie (Orskov y Orskov, 1992) algo similar ocurría entre los hospederos y el tipo de fimbria expresada por ECET. Así, los factores fibrilares presentes en las cepas patógenas al humano se designaron abreviadamente con la sigla CFA (Colonization Factor Antigen) y ya son varios los descritos (I-IV) aunque prevalecen los tipos CFA/I y CFA/II (Evans et al., 1975, 1978; Blanco y Blanco, 1993; Blanco et al., 1995; Barreto, 1997) sin que ello obedezca necesariamente a un comportamiento internacional (Barreto et al., 2000d; 2001).

En el caso de los animales se analizarán sólo dos especies: bovino y porcino. En el primer caso, los mayores aislamientos de ECET portan fimbrias F5 (también denominadas K99) y F41. Cepas con estas características también se han reportado en ovejas diarreicas (Wray, 1984; Blanco y Blanco, 1993). Otros factores fibrilares de colonización reportados en cepas de E. coli de origen bovino son ATT25 (actualmente F17), CS31A y F165, entre otras (Blanco y Blanco, 1993).

En cerdos los cuadros de EDA más comunes tienen lugar durante la primera semana de vida y luego, en los que suceden al destete. La fimbria más común en ambos casos es F4 (inicialmente designada como K88) que tiene varios subtipos (Guinee y Jansen, 1979; Blanco y Blanco, 1993). Fimbrias de los tipos F5, F6 (conocida como 987P) y F41 se han reportado en diarreas de neonatos, en tanto que el tipo F42 se aisló de cerdos con diarreas postdestete.

Otros factores fibrilares presentes en ECET de cerdos diarreicos son PCF141 y CS1541 (Wray, 1984, Barreto y Karadjov, 1985; Barreto, 1986, 1988; Djonne y Liven, 1988; Pernas et al., 1989; Navarro et al., 1989; Barreto et al.,1991; Bertah Velázquez et al., 1991; Blanco y Blanco, 1993; Wong et al., 1995, 1996; Anne Bertin, 1998; Wieler et al, 2001).

Las fimbrias o pelos (pilis), aunque no son un factor de virulencia exclusivo de E. coli, indiscutiblemente ha sido en esta especie en la que más se han investigado (Brinton, 1959; Blanco y Blanco, 1993) fundamentalmente en los tipos enterotoxigénicos y uropatógenos.

Según diversos autores, debido a esta preferencia y afinidad específica por los receptores celulares de los tejidos del hospedero susceptible, es que las infecciones intestinales y extraintestinales ocasionadas por E. coli constituyen un serio problema en el ámbito mundial (Wray, 1984; Blanco y Blanco, 1993; Johnson, 1991; Barreto et al., 1993ª; Barreto, 1997).

Opciones terapéuticas ante las infecciones de los tractos urinario y gastrointestinal

Durante años la principal opción terapéutica frente a estas etiologías ha sido la antibioterapia (Mediavilla et al., 1997). El uso excesivo de la antibioterapia ha demostrado que no sólo afecta al patógeno, también puede influir negativamente en la microflora normal del organismo. Esta alteración, en muchos casos, crea condiciones para el establecimiento y proliferación del propio patógeno o de otros microorganismos oportunistas.

Además, se presenta el fenómeno de la resistencia microbiana, acerca del cual Mediavilla et al. (1997) plantean: "Si se tiene en cuenta que el problema de la resistencia es el resultado de la capacidad innata de las bacterias de adaptarse al medio, esto no debería extrañarnos y además permite predecir que, por muy ingeniosos que seamos diseñando nuevos antimicrobianos, existen pocas posibilidades de evitar la aparición de gérmenes resistentes." Luego agregan: "Se están investigando nuevas alternativas a los antibióticos para la terapia antiinfecciosa, pero es más que probable que las bacterias acaben ganando también esta batalla. Por lo tanto, es más razonable actuar sobre el otro lado del problema, es decir, reducir la presión selectiva tan brutal que nosotros introducimos con el uso masivo de los antibióticos".

Un motivo para la diseminación de los genes de resistencia radica en su localización frecuente en plásmidos, los cuales tienen la capacidad de transferirse de una cepa bacteriana a otra mediante el proceso de conjugación, mecanismo que incluso puede ocurrir entre bacterias de diferentes géneros (Carter, 1989; Mediavilla et al., 1997; Barreto et al., 2000b).

Por todo lo expuesto, interferir el proceso de adhesión fimbrial pudiera considerarse como una posibilidad tentadora en la terapéutica de las ITU y las EDA, ya que se podrían tratar desde otra perspectiva en la que, no necesariamente, se precisa eliminar el microorganismo mediante los mecanismos clásicos (bactericidas o bacteriostáticos); tan sólo basta anular esta ventaja adaptativa. Al respecto se han ensayado diversas variantes:

1. Uso de concentraciones subletales de antibióticos (Padilla et al., 1988, 1991; Barreto et al., 1994)
2. Métodos inmunológicos (Wray, 1984; Kaper y Levine, 1988; Johnson, 1991; Levine et al., 1993; Idania Wong et al., 1995, 1996; Felder et al., 2001)
3. Empleo de extractos de plantas medicinales (Barreto et al., 1993 a,b; 1995a; 1997; 2002; Barreto y Campal, 2001)

Empleo de concentraciones subletales de antibióticos

La capacidad adhesiva de E. coli fimbriadas al uroepitelio, a enterocitos y a determinados hematíes, se ve influenciada negativamente por su previa exposición a concentraciones subinhibitorias de agentes antimicrobianos como ampicillina, gentamicina, sulfonamidas, trimetropina y tetraciclina; mientras que el ácido nalidíxico, es capaz de incrementar dicha adhesión ( Sandberg et al., 1979; Sandvorg-Eden et al., 1979; Vosbeck et al., 1979; 1982; Vainasen et al., 1982; Hales y Aymes, 1985; Stenqvist et al., 1987; Johnson, 1991; Barreto et al., 1994).

El equipo de Padilla et al. (1988) reportó la posibilidad de utilizar la gentamicina en concentraciones subletales para inhibir la expresión de la fimbria P en E. coli uropatógena. Posteriormente fueron estudiadas las quinolonas frente a Pseudomonas aeruginosa, que no pertenece a Enterobacteriaceae pero también posee factores fimbriales de adhesión (Novile et al., 1992). Barreto et al. (1994) utilizaron concentraciones subletales de gentamicina, cloranfenicol, kanamicina y estreptomicina para inhibir la expresión de K88ab, utilizando la cepa de referencia E. coli G7. El efecto inhibitorio constatado fue del 95%, 85%, 80% y 75%, respectivamente. Más adelante se pudo comprobar que, en sentido general, todos aquellos antibióticos bloqueadores de la síntesis proteica, al administrarlos en concentraciones subletales, inhibían la expresión fimbrial, tanto en el caso de P, como de los tipos K 88 y K99 (Padilla et al., 1991; Barreto et al., 1994) sin que en ello existiera la menor influencia del medio de cultivo (Barreto et al., 1995ª,b).

La utilización de antibióticos en concentraciones subletales, además de inhibir la expresión fimbrial, posee otras ventajas entre las que se encuentra el reducir los efectos adversos presentes en las dosificaciones convencionales (ototóxicos, nefrotóxicos, etc.). Sin embargo, esta variante presenta una gran limitante: la posibilidad de generar antibiorresistencia, limitante que ha vetado su aplicación in vivo. Su aceptación o no, la define la relación beneficio/riesgo, aspecto que ha acompañado a la aplicación in vivo de los antimicrobianos hasta la fecha. Si se tiene en cuenta lo planteado por Perfect (1996) ésta, realmente no es la mejor opción a seguir, máxime si la posibilidad de inducir antibiorresistencia es aún mayor que la generada por estos fármacos cuando se aplican en las dosis normales (Barreto et al., 2000).

Métodos inmunológicos: vacunas e inmunosueros.

Tanto en ECET como en las cepas productoras de ITU, independientemente de las diferencias de genotipo existentes, el proceso de infección tiene lugar a partir de ese paso imprescindible que es la adhesión bacteriana a receptores específicos de la mucosa intestinal o del uroepitelio (Orskov y Orskov, 1992; Blanco y Blanco, 1993; Barreto et al., 1993a; 2000b,c; 2001; Barreto y Campal, 2001). Esta adhesión, en el caso de las cepas uropatógenas portadoras de fimbria P, tiene lugar entre regiones terminales de estas adhesinas (subunidades PapG y PapF) y los receptores de carbohidratos a -D-Gal-(1-4)-b -D-Gal (llamados receptores Gal-Gal) que están ubicados en las células del uroepitelio (Johnson, 1991). Los receptores de CFA/I, la fimbria más generalizada en ECET aislados de humanos, son glicoconjugados que contienen ácido siálico, como es el caso del gangliósido GM2 (Wenneräs et al., 1990). Sin embargo, las sialoglicoproteínas también pueden enlazar la fimbria CFA/I (Neeser et al., 1988). Pieroni et al. (1988) aislaron una sialoglicoproteína de 26 kDa a partir de extractos de membrana de eritrocitos humanos que se une a bacterias portadoras de CFA/I y no a variantes CFA/I-.

La adición de CFA/I purificada reduce el enlace de las proteínas a bacterias CFA/I+ (Oro et al., 1990; Mol y Oudega, 1996). Los receptores para K88 no están perfectamente definidos y existen resultados contradictorios en los que se alude a glicoproteínas, en unos, y a glicolípidos, en otros. Lo cierto es que el disacárido Gal a (1-3)Gal constituye una parte significativa de este receptor (Mol y Oudega, 1996) y que biopreparados elaborados a partir de corteza de Eucalyptus sp., y otros extractos de plantas, que se discutirán más adelante, pueden alterar esta adhesión (Barreto et al., 1993a,c; 1995a; 1997; 2001a,b; Guerra et al., 1995; Prieto et al., 1995; Barreto y Campal, 2001).

En eritrocitos y células uroepiteliales de primates (Maccaca mulata, M. fascicularis) se han encontrado receptores para fimbrias P (Svenson et al., 1984). En una experiencia en la que se administró, a través de la uretra, E. coli P+ con suspensiones ricas en residuos Gal-Gal, se redujo la uretritis, respecto al grupo que recibió sólo la bacteria.

Los resultados de esta experiencia sentaron las bases para estudios en los que, utilizando estos receptores junto a seroalbúminas bovinas, para incrementar su poder antigénico, fueron sintetizados anticuerpos monoclonales (AcM) anti-receptores. Posteriormente, los mismos fueron inoculados en una especie heteróloga (M. fascicularis) para obtener anticuerpos antiidiotípicos que, mediante su arquitectura espacial, mimetizaran a los receptores Gal-Gal. Este estudio demostró que competían con los verdaderos receptores Gal-Gal al inocular E. coli P+ en los monos del grupo experimental, que no sufrieron daños renales (Kaack et al., 1993).

Esta línea enfoca el fenómeno de la adhesión fimbrial al nivel molecular, lo cual es una opción casi exclusiva de centros de investigación de alto desarrollo tecnológico. En este sentido, otra variante más halagüeña ha sido la elaboración de vacunas contra E. coli P+ para tratar las ITU.

Este camino, muy investigado en los ´90, ha encontrado como inconvenientes la diversidad antigénica de esta familia de fimbrias y el hecho de que en las vías altas y bajas de este tracto participen muy diversos atributos de adhesión, algunos no fibrilares. En las pielonefritis la fimbria P constituye el principal factor de colonización (Johnson, 1991; Johnson y Berggren, 1994).

Su presencia se ha determinado en la mayoría de los estudios clínicos, y mediante el cultivo de los microorganismos aislados en medios agarizados; también se ha establecido mediante aglutinación del receptor e inmunofluorescencia. Sin embargo, en las cistitis y bacteriurias su presentación es baja (Johnson, 1991; Johnson y Berggren, 1994).

La organización genética general de las fimbrias P de diferentes cepas es prácticamente idéntica (Johnson, 1991) y aunque son heterogéneas respecto al tamaño de las subunidades y a sus características antigénicas (Pere et al., 1988) la principal subunidad fimbrial, Pap A, es antigénicamente dominante.

Esta subunidad posee, en las diferentes serovariantes, un alto grado de homología aminoacídica en los extremos amino y carboxilo terminales, que la convierten en la opción más adecuada para una posible vacuna. Lamentablemente, Pap A no está relacionada con la adhesión (Johnson, 1991; Johnson y Berggren, 1994; Barreto y Campal, 2001).

En lo referente a ECET, su prevención mediante el desarrollo de preparados vacunales se ha limitado a la esfera veterinaria. Las vacunas elaboradas han sido muy diversas y comprenden desde biopreparados que contienen cepas atenuadas, extractos semipurificados de antígenos pertenecientes a cepas circulantes en una región dada, hasta las obtenidas mediante tecnología del ADN recombinante (Jayappa et al., 1984; Kaper y Levine, 1988; Levine et al., 1993; Wong et al., 1995, 1996; Wieler et al., 2001).

Estas últimas, entre las que se encuentran las que utilizan subunidades fimbriales, poseen toda una serie de ventajas con respecto a las convencionales, como son: la carencia de otros componentes celulares que no contribuyen a una respuesta protectora, así como de otras, como las endotoxinas, que inducen shock, alteraciones en la permeabilidad vascular y aborto en las hembras gestantes (Kaper y Levine, 1988; Levine et al., 1993; Wong et al., 1995). Una de estas vacunas, VACOLI, mediante su administración a cerdas gestantes, ha contribuido a una protección del 93 % en crías y a un 98 % en la etapa postdestete (Wong et al., 1995, 1996).

A pesar de los éxitos obtenidos en este sentido, los estudios sobre ECET de interés veterinario también han puesto de manifiesto que los anticuerpos desarrollados, luego de la vacunación de hembras gestantes y dirigidos contra fimbrias específicas, pueden prevenir la adhesión bacteriana y las diarreas en los recién nacidos, siempre que las cepas circulantes presenten dichas adhesinas.

No obstante, la amplia diversidad de fimbrias a expresar por ECET, de una parte, y la presión selectiva ejercida por estas vacunaciones, han conllevado al predominio de ECET con fenotipos fimbriales no contemplados en los biopreparados vacunales (Basulto, 2001; comunicación personal).

Otro elemento de interés, fruto de las investigaciones desarrolladas, es que la amplia diversidad de fimbrias contempladas en la serie de vacunas desarrolladas, no se encuentran expresadas con igual frecuencia en las ECET de diferentes áreas endémicas. Así, las ECET 987P+ se presentan con mayor frecuencia en Estados Unidos que en Europa (Moon y Bunn, 1993). En Cuba este comportamiento no ha sido estable (Barreto y Karadjov, 1985; Barreto, 1986, 1988; Bertah Velázquez et al., 1991).

En las ECET que afectan a humanos la diversidad de estas adhesinas fimbriales tal vez sea superior a la presente en las aisladas de animales.

Los numerosos estudios epidemiológicos realizados han demostrado que la frecuencia de su expresión, en muchos casos, está influenciada por las diferentes áreas geográficas (Binztein et al., 1991). En Tailandia y Bangladesh, dos de las áreas más afectadas por EDA en el planeta, prevalecen ECET CFA/I+, en tanto que cepas del tipo CFA/IV+ se aíslan como excepción. En México no hay diferencias en cuanto a su presentación (Svennerholm et al.,1989; Svenerholm, 1991). En Camagüey, Cuba, no son frecuentes cepas con fenotipos CFA/I y/o CFA/II (Barreto, 1997; Barreto et al., 1999; 2000a,d; 2001; Barreto y Campal, 2001).

Estas situaciones, y tal vez el hecho de que las EDA, en lo que al humano concierne, se consideran un problema del denominado Tercer Mundo, han limitado el desarrollo de vacunas que indiscutiblemente contribuirían a reducir la alta mortalidad anual en estos países (Barreto, 1997; Barreto et al.,1998; Barreto y Benítez, 2000).

Con respecto al campo veterinario, pese al gran número de vacunas recombinantes obtenidas para la prevención contra ECET fimbriadas, en algunos países desarrollados, a partir de los ´90, ha habido una tendencia a no utilizarlas y, en su lugar, aplicar la denominada "exposición intencional" (Otto, 1991; Mason, 1995).

Los inmunosueros, polivalentes y monovalentes, también han sido utilizados para el control de diarreas provocadas por ECET en animales, fundamentalmente en terneros. Pese a ello, su uso no ha tenido la aceptación y difusión de las vacunas (Trainin et al., 1981; Sherman et al., 1993).

Efecto de extractos vegetales sobre la interacción fimbria-receptor (novedad y aporte científico del trabajo)

La utilización de plantas medicinales, algunas de las mismas con un aval de siglos en su uso tradicional, responde a una tendencia actual en los países desarrollados. La identificación de principios activos presentes en las mismas posibilita el desarrollo de nuevas formas farmacéuticas más efectivas a las utilizadas en la terapia actual y permite el establecimiento de mecanismos de acción que justifican su acción terapéutica en las etiologías infecciosas (Abreu y Barreto, 1999).

En Europa y Norteamérica es muy común la utilización de Vaccinium mirtillus y V. macrocarpon Ait por su actividad sobre el Sistema Urinario. De esta última especie existen referencias sobre su acción en la interacción fimbrial de E. coli en ITU, tanto in vitro como in vivo (Sobota, 1984; Soloway, 1988; Schimidt y Sobota, 1988; Zafriri et al.,, 1989; Fox, 1989; Avorn et al., 1994; Walkers et al., 1997; Ahuja et al., 1998; Mediherb, 1999; Foo et al., 2000a, b).

En Cuba los primeros reportes sobre el uso de extractos de plantas, con relación al fenómeno de la adhesión fimbrial, están relacionados a estudios efectuados al Eucabev, producto antidiarreico elaborado a partir de corteza de Eucalyptus.

El mismo se enfrentó a las cepas de referencia G7 (08 K87, K88ab) y B44 (09 K30, K99) (Barreto et al., 1993a,b;1995a) luego de que decocciones del producto se utilizaran con éxito en el tratamiento de las diarreas agudas en diferentes especies animales y el humano (Bertha Velázquez et al., 1991) y que, en estudios microbiológicos, se comprobara que a las concentraciones utilizadas, carecía de acción bactericida o bacteriostática sobre ECET (Barreto et al., 1993c). El modelo experimental utilizado era muy sencillo, consistía en someter a las cepas fimbriadas a tres pases sucesivos, dos por medio de cultivo líquido y uno final en el mismo medio, pero agarizado.

El tipo de medio empleado, la temperatura de incubación y los tiempos entre cada pase estaban en dependencia de las condiciones óptimas para la expresión fenotípica de cada fimbria en particular. La presencia, o ausencia, de las mismas se confirmaba a partir del crecimiento en el medio agarizado, mediante la utilización de inmunosueros antifimbriales, o suspensiones de hematíes con receptores específicos para las mismas.

En los grupos experimentales, a los medios de cultivo se les sustituía un volumen de agua destilada por otro equivalente del extracto estéril a evaluar.

La inhibición de los factores K88ab y K99 (83,3% y 100%) luego del enfrentamiento a los extractos de Eucalyptus fue significativa (P<0,05). En el primer caso, la ausencia de fimbrias en las réplicas efectuadas fue el resultado de una combinación de modificaciones (46,15%) con variaciones genotípicas (53,8%).

En los ensayos con la cepa B44 la inhibición genotípica de K99 (85%) prevaleció (Barreto et al., 1993a). En este ensayo, al igual que en otro posterior (Barreto et al., 1995a) existía un punto débil, la aparición de variantes autoaglutinantes luego de los pases por los medios con algunos extractos. Los fenómenos de autoaglutinaciones se produjeron fundamentalmente en las réplicas efectuadas a la cepa G7. Este elemento enmascarador, dada la carencia de un microscopio electrónico, sembró la duda al respecto de si la fimbria K88ab se perdía o no. En ambos trabajos se utilizaron inmunosueros polivalentes anti-K88. Dada la mayor estabilidad de esta fimbria (Barreto et al. 1993a) era muy probable que persistiera luego de los tratamientos frente a E. saligna y E. citriodora. Algo si había quedado claro, el bloqueo de la expresión fimbrial estaba relacionado con la especie de Eucalyptus y la concentración de los extractos elaborados.

Ante la imposibilidad de aplicar técnicas de microscopía electrónica se diseñó un nuevo modelo en el que la presencia de K88ab se evaluó en paralelo con dos indicadores: un inmunosuero monoclonal 11/70 anti-K88ab (Ana Campal et al, 1992) y una suspensión de hematíes A en solución salina buferada (1:4) a pH 7,2 (Blanco y Blanco, 1993). El primero detectaba la subunidad predominante de la fimbria K88; mediante hemoaglutinación manosa-resistente (HAMR) se establecía la porción adhesiva de dicha fimbria. Con este sencillo esquema se pudo comprobar que en todas las variantes autoaglutinantes investigadas se había perdido la fimbria.

Esto es, se lograba el bloqueo de la expresión fimbrial de K88ab luego del enfrentamiento de G7 a medios con concentraciones subletales de E. saligna y E. citriodora (Barreto y Campal, 2001). Todos los extractos que afectaban la expresión de K88ab tenían un efecto similar sobre CFA/I, la fimbria más frecuente en ECET asociadas a EDA en humanos.

Este trabajo estableció, además, que la acción sobre la viabilidad bacteriana dependía de la especie de Eucalyptus, la concentración de los extractos y la especie o variedad bacteriana analizada. La tabla 1 resume los principales efectos de estas dos especies de Eucalyptus sobre E. coli G7.

A Achirantes aspera se le atribuyen las más diversas propiedades terapéuticas. Se ha reportado el uso de decocciones de esta planta para dolores abdominales y, asociado al bicarbonato de sodio, para el tratamiento de enfermedades gastrointestinales. Sus hojas se utilizan en diversas partes del planeta para combatir las diarreas.

Los extractos acuosos de las partes aéreas reducen significativamente la hipersecreción inducida por la toxina colérica en el intestino de ratones. El jugo de la planta entera se ha utilizado en casos de disentería (Roig, 1974; Sing y Anwar-Ali, 1989; Samuelson et al., 1991). A los extractos de hojas secas y semillas, realizados con hexano, se les ha atribuido una débil acción bactericida (Ikram y Haq, 1988) en tanto que a los extractos clorofórmicos de semilla se les confiere un efecto bactericida sobre E. coli (Samuelson et al.,1991).

Se ha reportado que las tinturas (menstruo al 70%) de hojas, tallos, semillas y de toda la planta, poseen efecto bactericida frente a cepas de E. coli enterotoxigénicas (K88ab+) y uropatógenas (P+). Sin embargo, en ese mismo estudio ninguna decocción presentó acción antibacteriana ante dichas cepas (Guerra et al., 1995). La población, de forma tradicional, utiliza esta planta para el tratamiento de las EDA e ITU en forma de infusiones, decocciones y extractos acuosos. En el trabajo de Guerra et al. (1995) muy sencillo, y sin el rigor de los desarrollados con Eucalyptus, se pudo constatar un efecto inhibidor de la expresión fimbrial con las decocciones de hojas.

Estos resultados fueron confirmados posteriormente en una experiencia similar (Barreto et al., 1997).

Tabla 1: Acción inhibitoria de los extractos de Eucalyptus (mg/mL) sobre E. coli G7 (Barreto y Campal, 2001)

Leyenda

N.D. = No determinado + = poseen ación inhibitoria – = no poseen acción inhibitoria

* = Datos reportados por Barreto et al. (1995)

Entre las plantas más utilizadas por la población para el tratamiento de las afecciones renales figuran: Lepidium virginicum L, Xanthium occidentale Bertol y A. aspera (Roig, 1974; Sing y Anwar-Ali, 1989; Fitomed II, 1993; Abreu y Barreto, 1999).

Estudios preliminares con cepas de E. coli P+ demostraron que las decocciones de estas plantas carecían por completo de efectos bactericidas o bacteriostáticos aunque, de forma variable, afectaban la expresión fimbrial (Mileydis Estévez et al., 1994; Guerra et al., 1995; Mayté Prieto et al., 1995; Barreto et al., 1997).

Estos ensayos, aunque interesantes por sus resultados, no contaron con la presencia de cepas de referencia y la expresión o ausencia de fimbrias P se estableció mediante HAMR (Blanco y Blanco, 1993). Los receptores Gal-Gal a nivel de eritrocitos, al igual que los presentes en el uroepitelio, reconocen las subunidades PapG y PapF, que sólo se adhieren a ellos cuando PapE también se ha expresado. PapA, la subunidad hegemónica, no se relaciona con la adhesión (Jonson, 1991). En estos ensayos es posible que se hayan producido alteraciones en la arquitectura fimbrial no apreciables por las limitaciones del sistema utilizado.

Teniendo en cuenta estas premisas, se procedió a una nueva experiencia (Barreto et al., 2000c) en la que se incorporó un inmunosuero anti-PapA. El mismo se utilizó en paralelo al ensayo de HAMR (Blanco y Blanco, 1993). Con el auxilio de la cepa de referencia E. coli ATCC25922 (P+) se efectuó un tamizaje para evaluar el bloqueo de la adhesión fimbrial a decocciones y tinturas elaboradas a partir de A. aspera, Lepidium virginicum L., Ageratum conyzoides L., Zingiber officinale Rosc., Curcuma longa L y Costus speciosus Smith. Sólo en el caso de C. longa no se inhibió la expresión fimbrial en ninguna de las variantes ensayadas. En una experiencia anterior se había demostrado otra forma de bloquear la adhesión y fue cuando, en lugar de enfrentar la cepa bacteriana a extractos de plantas, los mismos se aplicaron a las células portadoras de los receptores para fimbrias (Barreto et al., 1993c). Aunque en esa ocasión se trataba de receptores para K99, algo similar podía ocurrir con Gal-Gal. La realización de esta variante puso de manifiesto que varios de los extractos investigados, incluyendo la decocción de C. longa, bloqueaban dichos receptores y por ende, impedían la adhesión de E. coli P+. Los resultados de estas dos experiencias se resumen en la tabla 2.

Un equipo de investigadores norteamericanos ha reportado la inhibición irreversible de la fimbria P luego de efectuar dos pases sucesivos a la cepa JR1 en agar CFA con jugo del fruto de V. macrocarpon al 25% (Ahuja et al., 1998).

Microfotografías realizadas demuestran la pérdida total de la fimbria P en las preparaciones elaboradas. Los autores concluyen que estos resultados podían deberse a un desprendimiento de las fimbrias o a una inhibición en su expresión. Los resultados obtenidos con la cepa E. colí ATCC25922 (Barreto et al., 2000c) apoyan la segunda interpretación, máxime si se tiene en cuenta, además, los resultados obtenidos al enfrentar a E. coli G7 con extractos diversos de Eucalyptus sp. (Barreto y Campal, 2001). Como ya se ha expuesto, en experiencias anteriores se demostró que este bloqueo, en algunos casos, obedecía a la persistencia del inhibidor en el medio, en otras, sin embargo, se perdía la capacidad de expresar las fimbrias aún cuando se realizaran subcultivos en medios libres del inhibidor.

Estos resultados estaban determinados por la especie de planta utilizada y la clase de fimbria en cuestión (Barreto et al., 1993a, 1995ª,b, 1997; Barreto y Campal, 2001).

Tabla 2: Efecto de los extractos sobre la expresión fimbrial y sus receptores

Leyenda: + = adhesión positiva (fimbrias y receptores no alterados) – = no adhesión (no expresión fimbrial o receptores alterados)

Estos efectos bloqueadores de la adhesión pueden estar relacionados con diferentes efectos por parte de los extractos. Podrían estar asociados a metabolitos presentes en estas plantas que actúen como represores de los genes relacionados con las subunidades estructurales fimbriales o con los codificadores de las enzimas y proteínas asociadas a su transporte y fijación en la superficie celular. Pueden intervenir mecanismos similares a los descritos para determinados antibacterianos ensayados a concentraciones subletales (Padilla et al., 1991; Barreto et al., 1994).

Los genes pap no se encuentran aislados. En muchas cepas de E. coli uropatógenas se han visto asociados a otros genes codificadores de factores de virulencia como es el caso de las hemolisinas y otros tipos de adhesinas (Oto et al., 1990). A esta asociación de genes se les conoce con el término de "islas de patogenicidad" (Lee, 1996) que tienden a sufrir deleciones espontáneas, tanto in vitro como in vivo (Hacker et al., 1990).

Estas deleciones pueden afectar algunos genes codificadores de PapD, por ejemplo, que al nivel de los espacios periplasmáticos tiene la función de estabilizar las subunidades estructurales fimbriales durante su translocación hacia la membrana externa. Podría influir en PapC, que participa en el transporte de estas subunidades y su ensamblaje (Johnson, 1991).

Ahuja et al. (1998) centran su atención en el efecto de V. macrocarpon sobre la expresión fimbrial de P. Tanto en este trabajo, como en los posteriores en los que atribuyen este efecto a flavonoides presentes en la planta, obvian una parte importante del fenómeno de adhesión fimbrial: el papel de los receptores celulares, sí contemplados en nuestras experiencias. En este sentido, otros mecanismos que pudieran considerarse implicarían a metabolitos primarios o secundarios del vegetal sobre esta parte del complejo de adhesión.

Podría producirse una interferencia mediante su unión a los receptores, o a sitios próximos, de forma tal que imposibiliten estéricamente la interacción con los elementos de adhesión fimbrial. También es posible la existencia de análogos a los receptores celulares que compitan por la correspondiente fimbria. Desde esta óptica se puede plantear la existencia de toda una gama de variantes aún por demostrar y que justifican el por qué estas plantas interfieren la adhesión fimbrial de ECET y E. coli P+. Lamentablemente, para su demostración, se requiere de un nivel de equipamiento y de técnicas de punta a las que no tenemos un acceso inmediato. Lo expuesto hasta aquí, y que sometemos al criterio del tribunal especializados que se designe, constituye lo propuesto para una etapa de trabajo de más de diez años plenos de dificultades.

Cada resultado está avalado por técnicas sencillas pero, al mismo tiempo, precisas y reconocidas internacionalmente, que ponen de manifiesto una vía de acción terapéutica en plantas utilizadas para el tratamiento de las EDA e ITU. Toda la experiencia acumulada ha posibilitado definir los elementos claves para una variante de tamizaje a plantas que evalúe su efecto sobre la adhesividad fimbrial bacteriana (Barreto et al, 2002). Estos efectos, unidos a otras propiedades comprobadas, como es el efecto diurético de L. virginicum (Fitomed II, 1993) explican el por qué estas plantas ejercen una acción terapéutica, sobre todo cuando se utilizan por períodos prolongados.

La interferencia de la interacción fimbria-receptor de los extractos vegetales no deberá provocar resistencia ya que los microorganismos no se ven expuestos a una presión de selección capaz de desarrollar este fenómeno. Se trata de competencias por un receptor, en algunos casos, de interferencias en la expresión fimbrial y/o de alteraciones de los receptores en otros. La experiencia popular pone de manifiesto que estos tratamientos, sobre todo en el caso de los pacientes crónicos, requieren del consumo de dichos extractos por períodos prolongados, incluso de por vida.

A diferencia de los antibacterianos convencionales, que ejercen su efecto sobre el patógeno a eliminar, y además sobre el resto de los componentes de la flora no patógena sensible, la variante analizada actúa sobre los factores de virulencia del patógeno, por lo que no debe causar alteraciones en la biota normal. La persistencia en esta opción garantiza que los receptores específicos para patógenos estén bloqueados. Los tratamientos prolongados con antibacterianos convencionales, sin embargo, propician las condiciones para el surgimiento de nuevas patologías en los pacientes tratados, como es el caso de la Candidiasis o la Disbacteriosis del colon.

Como se aprecia, muchos pueden ser los factores que afectan la interacción necesaria para que tenga lugar la adhesión de E coli uropatógena o enterotoxigénica y se desarrollen estados patológicos que puedan afectar tanto a animales como al hombre.

En las plantas estudiadas hasta el momento se han detectado flavonoides, quinonas y taninos, su papel en la inhibición fimbrial aún está por demostrar, así como está por demostrar también el posible rol de análogos estructurales que, por simple competencia, interfieran en esta unión. El camino hasta estas soluciones está hipotéticamente trazado (Barreto et al, 2002). Cómo y con qué llegar depende de técnicas fitoquímicas y métodos propios de Biología Molecuar. Todo ello está comprendido en los planes de Doctorado en Ciencias (ya aprobados y en marcha) de dos de los coautores de este trabajo y constituyen la penúltima etapa de esta investigación.

No obstante, aunque se trata de resultados in vitro, los mismos constituyen las primeras respuestas al por qué toda una gama de plantas – no sólo V. macrocarpon – empleadas tradicionalmente, y que carecen de una acción bactericida o bacteriostática pronunciada, tienen efectos terapéuticos en el tratamiento de las ITU y EDA.

Según los naturistas el hombre es un frugívoro que, al tratar de comportarse como carnívoro, ha dañado su salud y limitado su esperanza natural de vida.

Esta aseveración, al margen de los efectos tóxicos de las dietas criticadas, muy bien puede estar relacionada con la presencia en nuestro organismo de toda una serie de receptores para los patógenos más diversos que, si se consumieran frutas, vegetales, etc., quedarían bloqueados como ha ocurrido en los resultados resumidos anteriormente. Esto, por supuesto, es sólo una hipótesis más y su demostración, un gran reto que vale la pena aceptar.

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Autor:

Dr.C. Guillermo Barreto Argilagos*;

Lic. Ana Campal Espinosa**;

M.C. Orlado Abreu Guirado*

*Universidad de Camagûey, Cuba

**Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Camagüey