El metiloma de virus asociados a cancer (página 2)

La regulación epigenética es esencial para asegurar la diferenciación celular de manera apropiada durante el desarrollo de los organismos complejos, que están constituidos por células que son genéticamente idénticas, pero estructural y funcionalmente diferentes. Los cambios epigenéticos globales son los que distinguen y definen los tejidos que conforman un organismo, evidentemente una neurona y un hepatocito tienen un fenotipo muy diferente, pese a tener exactamente la misma información genética. La epigenética también permite diferenciar entre células madre totipotenciales de células diferenciadas, y células en crecimiento de células senescentes (Ballestar y Esteller, 2005)

A pesar de ser heredables, los cambios a nivel epigenético son reversibles, por eso, la epigenética puede definirse también como un intermediario del ambiente con la genética, ya que se observó que factores como por ejemplo la edad y la dieta provocan alteraciones en el epigenoma, que pueden producir enfermedades (Jaenisch y Bird, 2003, Liu, 2003). La importancia de la influencia de estos factores externos sobre la epigenética se demostró en gemelos homocigóticos, que a pesar de ser genéticamente idénticos, presentan diferente susceptibilidad a enfermedades en función de los hábitos de vida y el ambiente (Fraga, 2005) Las alteraciones en el funcionamiento normal de la maquinaria epigenética están involucradas en el desarrollo y progreso de ciertas patologías además del cáncer, como la arteriosclerosis, el lupus eritematoso sistémico, los síndromes ICF, ATRX (Alpha-thalassemia X-linked mental retardation) y el Rett (reviews: Zaina, 2005, Januchowski, 2004, Ehlrich, 2008, Tang, 2004, Kriaucionis y Bird, 2003).

Las células de los mamíferos tienen varias formas de control epigenético de la trascripción de los genes y la estructura de la cromatina: la metilación del ADN, las modificaciones covalentes de las histonas, y la expresión de ARN no codificantes.

Modificaciones Epigenéticas •Son químicamente estables •Modifican el fenotipo y no el genotipo •Son heredables •Son reversibles •Son modificadas por factores ambientales 1.1.3. Metilación del ADN La metilación del anillo de citosina es la principal modificación epigenética en mamíferos, y se produce como resultado de la adición enzimática de un grupo metilo donado por la S- adenosilmetionina (SAM) al carbono 5" de una citosina (Doerfler, 1983) (FIG. 3).

En mamíferos, las principales dianas de metilación son las citosinas que van seguidas de guaninas, los denominados dinucleótidos CpG, aunque también se describió metilación en secuencias CpA y CpT, pero en menor frecuencia.

Los dinucleótidos CpG presentan una distribución característica en el genoma, encontrándose agrupados en regiones que comprenden el 1-2% del genoma total, denominadas "islas CpG", que generalmente coinciden con los sitios promotores de los genes, aunque pueden llegar hasta el primer exón e incluso a veces hasta el primer intrón. Aproximadamente el 60% de los genes humanos están asociados a una isla CpG (Antequera, 1993). También es frecuente encontrar estas regiones ricas en di nucleótidos CpG en secuencias repetitivas satélites y centroméricas (Baylin, 2001, Esteller, 2002).

En el genoma de una célula normal, aproximadamente el 70-80% de los dinucleótidos CpG que no están asociados a una isla se encuentran metilados, incluyendo a los que se encuentran en el interior de los genes, las regiones intergénicas y los elementos repetitivos (Ehrlich, 1982). Sin embargo, a excepción del cromosoma X inactivo de las hembras en mamíferos y los genes implicados en la impronta genética, las llamadas islas CpG parecen estar protegidas de dicha modificación (Bird, 2002).

Cuando la metilación del ADN está presente en las regiones promotoras, está directamente relacionada con la represión transcripcional. La metilación del ADN se asocia a la cromatina que no se transcribe, principalmente las secuencias repetitivas (por ejemplo las Alu), cromosoma X inactivo y genes que intervienen en el proceso de la impronta (imprinting). El imprinting se refiere a la metilación diferencial que ocurre en uno de los alelos ya sea materno o paterno y que establece el patrón de expresión de un determinado gen, por ejemplo Igf2 y H19 (Reik, 2001). Para mantener los niveles de expresión génica equilibrados, las hembras de mamíferos deben inactivar uno de sus cromosomas X, lo cual se hace mediante la metilación del mismo (Goto, 1998). El silenciamiento de este cromosoma se produce en fases tempranas de la embriogénesis y se mantiene así silenciado durante toda la vida del organismo.

La mayor parte del ADN metilado en humanos pertenece a regiones no codificantes de genoma, y que se replican con posterioridad al ADN no metilado (Bird, 1999). Por otro lado, este mecanismo estaría implicado también en evitar la trascripción de las secuencias repetitivas, endoparasíticas o trasposones, potencialmente dañinas para el genoma celular, de modo que la metilación en este caso actúa como mecanismo de defensa para conservar la integridad genómica y la estabilidad cromosómica cuando está localizada en las regiones pericentroméricas (Okano, 1999).

En mamíferos, los patrones de metilación se establecen durante el desarrollo embrionario. Inmediatamente después de la fertilización, ocurre una demetilación total en el ADN del ovocito y el espermatocito. Después de la implantación, la metilación de novo instaura los patrones de metilación normal esenciales para el desarrollo y la diferenciación de los distintos linajes celulares del embrión (Bird, 2002, Morgan, 2005).

1.1.4. Enzimas implicadas en la metilación del ADN Las enzimas responsables de la metilación del ADN son las denominadas metiltrasferasas de ADN (DNMT), que catalizan la transferencia de un grupo metilo desde la S-adenosil-L-metionina (SAM) hasta la posición 5 del anillo pirimidínico de la citosina (FIG. 3). Hasta el momento, se describieron 5 DNMTs en mamíferos: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b y DNMT3L. Todas comparten un dominio C-terminal muy conservado y una porción N-terminal variable (Bestor, 2000). Entre ellas, solo DNMT1, DNMT3a Y DNMT3b tienen actividad metiltrasferasa demostrada en mamíferos (Okano, 2002).

La DNMT1 tiene un peso molecular de 184 kDa, es de expresión ubicua y asociada al ciclo celular, aumentando la misma en la fase S, siendo reclutada por el antígeno de proliferación celular (PCNA) a los sitios de replicación. Es la principal responsable en mamíferos de mantener los patrones de metilación celular tras la replicación (Fuks, 2005), por eso se la conoce como DNMT de mantenimiento, propagando los patrones de metilación preexistentes, al tener mayor afinidad frente a sustratos hemimetilados.

La inhibición de DNMT1 suprime la tumorigénesis in vitro e in vivo (Laird, 1995) pero en células que carecen de DNMT1, la pérdida de metilación no es tan pronunciada como podría esperarse si esta fuera la única enzima responsable del mantenimiento de la metilación (Espada, 2004)

Algunos virus son capaces de interaccionar con DNMT1 a través de sus proteínas, como por ejemplo el antígeno T de SV-40, que es capaz de aumentar los niveles de ARN y proteína de DNMT1, llevando a un aumento en la actividad metiltrasferasa y de la metilación genómica (Slack, 1999). De forma similar, la infección con HIV-1 aumenta la expresión y la actividad de DNMT1, llevando a hipermetilación incluso del promotor del IFN-? (Mikovits, 1998). Además de esto, otros estudios demostraron el aumento en la metilación en determinados promotores en células infectadas con virus tumorigénicos, tales como HTLV-1, EBV y SV-40 (de Bustros, 1988).

La DNMT2 contiene 391 aminoácidos, demostró baja actividad catalítica in vitro (Hermann, 2003) y los ratones que carecen de esta enzima se desarrollan sin problemas aparentes (Okano, 1998). La actividad metiltransferasa de DNMT2 parece estar mas involucrada en la metilación de tARN, habiéndose demostrado que metila al tARN encargado del transporte del acido aspártico (Goll, 2006)

En cuanto a DNMT3a y 3b, se demostró que estas enzimas se expresan principalmente durante el desarrollo embrionario, manteniendo un nivel de expresión relativamente baja pero ubicuo en tejidos adultos. Ambas poseen actividad metiltransferasa de novo, tanto in vitro como in vivo.

Dominios de la Cromatina •Eucromatina: descondensada, representa los loci transcripcionalmente activos, replica tempranamente.

•Heterocromatina: altamente compactada, ADN silenciado, replica tardíamente. Subclasificada en:

•Heterocromatina pericentromérica o constitutiva, enriquecida con 3meK9H3, meK27H3 y 3meK20H4.

•Heterocromatina facultativa, puede convertirse en activa, presencia de 3meK27H3, 2meK9H3 y meK20H4.

El síndrome ICF (Immunodeficiency-Centromeric instability-Facial abnormalities) se asocia a una mutación en DNMT3b. En estos pacientes, las células somáticas presentan hipometilación pericentromérica en los cromosomas 1 y 16, con importantes alteraciones en estas regiones (Maraschio, 1988, Xu, 1999)

La DNMT3L tiene un dominio catalítico metiltrasferasa truncado, lo que la convierte en inactiva enzimaticamente. A pesar de esto, DNMT3L está involucrada en la represión epigenética al reclutar deacetilasas de histonas (HDACs) hacia promotores metilados (Aapola, 2002), estimular la actividad DNMT3a (Chen, 2002) y estimular la actividad de DNMT3a y 3b de ratón in vitro (Gowher, 2005).

Se sabe que existen interacciones entre todas las DNMTs, y que podrían cooperar entre sí de forma eficiente manteniendo los niveles de metilación, o expandiendo la misma a nuevos sitios del ADN.

Además, las DNMTs pueden contribuir a la formación de la heterocromatina mediante mecanismos diferentes a la metilación. Se sabe que las DNMTs interaccionan con proteínas represoras, como las HDACs y las metiltransferasas de histonas (HMTs), dirigiéndolas hacia los promotores metilados (Baylin, 2001, Fuks, 2001)

1.1.5. Demetilación del ADN El establecimiento de los patrones de metilación tiene lugar durante el desarrollo embrionario y es precedido de la demetilación global del genoma. Esta demetilación también ocurre durante el proceso de gametogénesis (Bird, 2002). Se han descrito dos modelos para explicar este fenómeno: la demetilación pasiva y la demetilación activa.

La demetilación pasiva ocurre por inhibición o falta de acción de la metiltransferasa de mantenimiento (DNMT1), ya sea por estar reclutada por algún cofactor o bien por la imposibilidad de unirse al ADN por presentar este último histonas acetiladas. Se produce cuando la célula avanza hacia una segunda ronda de replicación antes que la metilación de mantenimiento se haya completado. Esta forma de demetilación es lenta, y requiere de la progresión del ciclo celular.

En mamíferos, se propuso que la demetilación activa sucedía por varios mecanismos. De hecho, la existencia y la naturaleza de una demetilasa de ADN en mamíferos ha sido tema recurrente de controversia, irreproducibilidad e incertidumbre (Ooi, 2008). La demetilación activa necesita de enzimas o complejos que remuevan el grupo metilo de la citosina o bien que reemplacen el anillo completo de la metil-citosina por una citosina no metilada.

Recientemente, dos estudios publicados en Nature sugieren que el proceso de demetilación es llevado a cabo por las mismas enzimas que lo metilan: DNMT3a y DNMT3b (Kangaspeska, 2008, Metivier, 2008). Uno de ellos sugiere que estas enzimas poseen actividad deaminasa y propone que ambas están implicadas en una vía dinámica de metilación- demetilación que ocurre durante la transcripción de los genes.

Se propuso que MBD2, uno de los componentes de las proteínas MBD, podría reemplazar al grupo metilo por un átomo de hidrogeno (Bhattacharya, 1999), pero estos resultados no pudieron ser reproducidos por otros laboratorios (Wolffe, 1999).

Otro mecanismo propuesto involucra el proceso de reparación del ADN. Implica a las ADN glicosilasas, que cortarían la unión de la 5-metilcitosina con el ADN, siendo reemplazada luego por una citosina no metilada (Jost, 1997, Weiss, 1996, 1997), aunque esta demetilasa aun no ha podido ser clonada.

Vale la pena tener en cuenta que la demetilación asociada a la transcripción no requiere necesariamente de la actividad de una demetilasa. La unión de factores de transcripción a las secuencias tanto promotoras como no promotoras es suficiente para causar la demetilación en forma pasiva a través de la replicación.

1.1.6. Proteínas reclutadas por el ADN metilado El ADN metilado provoca el reclutamiento de distintas enzimas, factores de trascripción y represores. Además, el ADN metilado impide la unión de factores de trascripción, por ejemplo CREB (Cyclic-AMP-Response-Element-Binding), SP1, o proteínas involucradas en el establecimiento de la impronta génica, como por ejemplo CTCF o BORIS (Brother Of the Regulator of Imprinted Sites) (Jaenisch y Bird, 2003). De todas estas proteínas, destacan en importancia la familia de proteínas MBD (methyl binding domain), compuesta por 5 integrantes: MeCP2, MBD1 MBD2, MBD3 y MBD4. A excepción de MBD3, el resto se une a los dinucleótidos CpG metilados a través del dominio MBD. MBD4 participa en la reparación del ADN, y no en la represión transcripcional.

Estas proteínas tienen la capacidad de reconocer citosinas metiladas, a través de su dominio de unión. Excepto MBD4, el resto de las proteínas MBD median la interacción entre el ADN metilado y otros componentes de la cromatina debido a que son capaces de reclutar complejos represores que incluyen a las deacetilasas de histonas (HDAC) (Ballestar, 2001).

1.1.7. Modificaciones epigenéticas de las histonas La metilación del ADN ocurre en el contexto de modificaciones químicas de las histonas. Estas proteínas, además de servir para empaquetar el ADN, participan en la regulación de la expresión génica.

La porción N-terminal de las histonas del core es flexible, rica en aminoácidos básicos y bastante conservada entre las células eucariotas. Como estas colas protruyen del nucleosoma, son susceptibles para interaccionar con otras proteínas, como así también con enzimas que las modifiquen. Las modificaciones más comunes incluyen: acetilación de lisinas, metilación de lisinas y argininas, fosforilación de serinas y treoninas, ubiquitinación, sumoilación y biotinilización de lisinas (FIG. 4).

En general la acetilación de lisinas esta asociada a activación transcripcional. Esta modificación es llevada a cabo por las enzimas conocidas como acetiltransferasas de histonas (histone acetyl transferasas, HATs), y es revertida por las deacetilasas de histonas (histone deacetylases, HDACs). La acetilación de lisinas influencia la interacción de las histonas con otras macromoléculas. Por un lado, la carga positiva de la lisina desaparece cuando se acetila, y de esta forma interfiere con el contacto entre la histona y el ADN, ARN u otras proteínas. Por otro lado, la acetilación representa un lugar de acoplamiento para proteínas que contienen regiones bromodominio, encargadas de la regulación de la transcripción.

La metilación de lisinas se produce tanto en heterocromatina (K9H3, K27H3 y K20H4) como en eucromatina (K4H3, K36H3 y K79H3), y a su vez pueden encontrarse mono, di o trimetiladas (Kouzarides, 2002). La metilación no altera la carga de la lisina, pero si incrementa su hidrofobicidad. Esta modificación es llevada a cabo por enzimas denominadas metiltransferasas de histonas (histone methyl transferasas, HMTs), que utilizan SAM (S- adenosil-L-metionina) como donante del grupo metilo. Hasta hace relativamente poco tiempo se pensaba que la metilación de histonas era la modificación más estable, pero actualmente se describieron varias enzimas capaces de revertir esta modificación. La primera en describirse fue la LSD1 (lysine specific demethylase 1), cuyo sustrato mas habitual es la lisina 4 de H3 (Shi, 2004) y posteriormente se sumaron las proteínas con dominio JmjC, por ejemplo la JHDM1A y JMJD3, entre otras (Kubicek, 2004, Hong, 2007).

FIG. 4. Modificaciones post-traduccionales de las histonas.

La metilación de argininas se relaciona tanto con represión como con activación transcripcional. La arginina puede metilarse en posición R8H3, R17H3 y R3H4. Hay descritas 7 PRMT (protein arginine methyl transferases), que también utilizan SAM como dador de grupo metilo.

La fosforilación de serinas y treoninas es una modificación asociada a procesos mitóticos y activación transcripcional. Es llevada a cabo por las enzimas MSK1/1 y RSK2, y en el caso de la fosforilación de la serina 10 en H3, está relacionada con la condensación mitótica de la cromatina (Wei, 1999).

Existen además variantes de las histonas clásicas, como la H3.3, H2AZ, H2ABbd o la H2A.X, que se localizan en regiones especializadas de la cromatina. A diferencia de las histonas canónicas, éstas no se sintetizan en la fase S del ciclo, y son incorporadas a la cromatina de forma independiente a la replicación del ADN.

Todas estas modificaciones junto con la metilación del ADN y la presencia de ARN no codificante actúan de forma controlada para regular la estructura de la cromatina y la expresión de los genes a través del ciclo celular. Todas ellas están interconectadas y dependen unas de otras para permitir a la célula almacenar y transmitir a la descendencia la información que no esta codificada en el ADN.

A partir de esta idea, se propuso lo que se conoce como "código de histonas", que plantea que las modificaciones de las histonas, actuando de forma combinada o secuencial en una o varias histonas, son reconocidas por diferentes proteínas que determinan las funciones especificas derivadas de tales modificaciones. (Strahl y Allis, 2000)

1.1.8. microRNA Los microRNAs (miRNA) son unas moléculas pequeñas de aproximadamente 22 nucleótidos de ARN no codificante de cadena sencilla que reprimen la expresión génica. Esto lo llevan a cabo por degradación o inhibición de la traducción del ARN mensajero, también intervienen en procesos como la formación de heterocromatina centromérica.

Tienen un papel importante en la proliferación, rearreglos genómicos, apoptosis y diferenciación celular (He, 2004, Miska, 2005, John, 2004). Muchas características únicas de los miRNAs, entre las que se cuentan su pequeño tamaño, la falta de colas poliadeniladas, y su tendencia a unirse a sus RNAm diana mediante secuencias parcialmente complementarias, los han convertido en un gran desafío a la hora de estudiarlos con más detalle. Se estima que aproximadamente un 30% de los genes son regulados por miRNA (Rajewsky, 2004).

1.1.9. Técnicas para el estudio de la metilación del ADN El ADN es una biomolécula muy dinámica, lo que se refleja en la gran diversidad y complejidad de los mecanismos que la regulan.

En la última década se desarrollaron múltiples abordajes para el análisis de la metilación. La secuenciación por bisulfito rápidamente se destacó como la favorita para el análisis de metilación del ADN, habiendo sido utilizada para la descripción del perfil de metilación en 3 cromosomas humanos en 12 tejidos diferentes (Eckhardt, 2006). Además de ésta, el estudio de genes concretos también se puede realizar con la técnica de MSP (PCR específica de metilación).

El análisis del metiloma es una herramienta muy importante para explorar y mejorar la comprensión de cómo funciona el genoma en la salud y en la enfermedad. La interpretación que se le pueda dar a la información epigenética y su integración con la información genética que ya se posee (Beck, 2008).

1.1.10. Epigenómica.

Siguiendo la tendencia de los análisis a nivel global, el término epigenómica fue introducido para definir el estudio de los cambios epigenéticos en todo el genoma.

Fundamentalmente, la epigenómica estudia los efectos de la estructura de la cromatina incluyendo tanto la metilación del ADN, como las modificaciones covalentes de las histonas (Beck, 1999).

Posteriormente al éxito de la secuenciación del genoma humano, se generó un gran interés en caracterizar el epigenoma, que permitirá saber a ciencia cierta de que forma el genoma ejecuta la información que contiene para definir los distintos fenotipos (Int. Symposium on Genome-Wide Epigenetics, 2005).

En Europa se han formado dos consorcios internacionales alrededor de esta idea: por un lado el Proyecto Epigenoma Humano (www.epigenome.org) establecido en 1999, tiene como objetivo principal identificar, catalogar e interpretar los patrones de metilación del ADN a lo largo de todo el genoma y los perfiles de todos los genes humanos en los principales tejidos (Bradbury, 2004). Por otro lado, el Epigenome Network of Excellence (www.epigenome-noe.net) establecido en 2004, tiene como objetivo el de proveer una vasta selección de recursos epigenéticos y ampliar la investigación epigenética a campos como la modificación de la cromatina, la dinámica de los nucleosomas, los ARNs no codificantes, imprinting, y generar mapas epigenómicos de células sanas y enfermas.

El desarrollo de estas plataformas proveerá, además de un campo novedoso para la investigación básica, aplicaciones inmediatas para el diagnóstico, nuevos enfoques en medicina para el tratamiento de enfermedades, una mejora en la comprensión de la influencia del ambiente y la nutrición en los seres vivos, así como también ampliará el conocimiento que se tiene sobre ciertas enfermedades neurológicas o procesos neurodegenerativos que se sabe tienen una gran influencia epigenética.

Pasaron ya casi 60 años desde el descubrimiento de la 5 metil citosina, y más de 25 desde que se sabe que la alteración en la metilación del ADN está relacionada con muchas enfermedades pero recién este año fue descrito el primer perfil de metilación (metiloma) de un organismo completo, el de Arabidopsis thaliana (Lister, 2008).

El epigenoma de una persona está muy influenciado por factores ambientales y nutricionales, lo que podría explicar el porque ciertas enfermedades como el cáncer aparecen mas frecuentemente con la edad.

Uno de los objetivos de estas redes es encontrar una firma epigenética asociada a determinadas enfermedades, basándose en el perfil de metilación de las CpG a nivel global. Esto ayudara también a elucidar procesos complejos como la impronta, la inactivación del cromosoma X y enfermedades multifactoriales como las inmunitarias o el cáncer. Una de las primeras herramientas que deberían desarrollarse sería una base de datos epigenómica que integre todos los datos derivados de los estudios en ADN, ARN y proteínas (similar al GenBank) (Murrel, 2005). Los resultados generados en este trabajo aportan una base sólida para comenzar este tipo de estudios.

1.2. Segunda Parte: Epigenética y Cáncer

1.2.1. Carcinogénesis El cáncer es una enfermedad en la que se alteran los procesos de regulación del crecimiento y división de la célula. Para que una célula normal se transforme en tumoral, los genes que regulan el crecimiento y diferenciación celular deben alterarse. La mayoría de los tumores presentan una gran variedad de funciones génicas alteradas, incluyendo la activación de oncogenes y el silenciamiento de genes supresores de tumores, lo que se traduce en un crecimiento celular descontrolado (Jones, 2002).

La carcinogénesis es el proceso a través del cual una célula normal escapa a los mecanismos de control de crecimiento y se divide de forma descontrolada. Las teorías más aceptadas suponen que la carcinogénesis incluye dos o más pasos, entre ellas destacamos la "Teoría de Berenblum" (1947) que propone que el cáncer es el resultado de dos etapas: la iniciación, provocada por una mutación y proliferación rápida debido a un agente iniciador; y la promoción, en la que un agente promotor genera cambios en el crecimiento, transporte y metabolismo celular.

Actualmente se acepta la teoría de Sell y Pierce, que expone que la mutación, iniciación y la transformación maligna ocurre en la célula progenitora o stem cell, debido a un bloqueo o detención de su maduración. Las mutaciones en células somáticas por el contrario no resultarían en cáncer, ya que son células maduras, con vida media corta y que habitualmente terminan en apoptosis antes que nuevas mutaciones puedan desdiferenciarlas (Sell, 2006).

1.2.2. Epidemiología del cáncer El cáncer es la segunda causa principal de muerte natural, detrás de las enfermedades cardíacas (Jemal, 2005). Sin embargo, las muertes por enfermedades cardiovasculares están disminuyendo, mientras que las muertes por cáncer están aumentando. Se estima que a lo largo del siglo XXI, el cáncer será la primera causa de muerte en los países desarrollados. A pesar de esto, debemos reconocer que los esfuerzos realizados en las investigaciones han producido un aumento en la supervivencia de los pacientes que sufren esta enfermedad.

1.2.3. Metilación aberrante del ADN en cáncer.

La epigenética del cáncer humano se ha convertido en un área de creciente investigación debido a la comprensión de las vías involucradas y al alto desarrollo de las nuevas tecnologías.

El desarrollo de los tumores es el resultado de la suma de alteraciones tanto genéticas como epigenéticas, llevando a la pérdida del control necesario para mantener la homeostasis, lo que conduce a un crecimiento celular desregulado y anárquico

en el que se pierden los mecanismos de inducción de la apoptosis entre otras cosas. Algunas de estas alteraciones pueden otorgarle a la célula tumoral ventajas selectivas para el crecimiento, ya sea adquiriendo resistencia a fármacos, o bien aumentando las señales positivas de crecimiento, mediante la activación de oncogenes o la inactivación de genes supresores de tumores (Bird, 2002).

Etiología del cáncer •Hormonal •Química •Biológica •Radiación •Hereditario La alteración epigenética asociada a cáncer mas estudiada es sin duda la metilación del ADN.

Existen 2 alteraciones principales que afectan a los patrones normales de metilación, y que se encuentran estrechamente relacionadas con la desregulación de la actividad metiltransferasa característica en los tumores (FIG. 5):

• Hipometilación global del genoma: principalmente en las regiones que se corresponden con el cuerpo de los genes y en secuencias repetitivas, que está relacionada con la inestabilidad cromosómica y reactivación de secuencias endoparasíticas (Alves, 1996, Bestor, 1996). Las anomalías cromosómicas que se asocian con hipometilación incluyen traslocaciones y deleciones entre otras.

• Hipermetilación en las islas CpG de regiones promotoras: se relaciona con el silenciamiento transcripcional del gen regulado por dicho promotor, en general supresores de tumores. Los genes inactivados por la hipermetilación de sus promotores igualan o incluso superan a aquellos inactivados por mutaciones puntuales en cáncer (Herman, 1994).

Además de estas 2 clásicas alteraciones, recientemente se demostró la inactivación de miRNA por metilación (Lujambio, 2007).

FIG. 5. Representación esquemática de la distribución de la metilación en células normales y células tumorales. Las células normales poseen sus CpGs demetiladas en los promotores y metiladas en el cuerpo del gen. Las células tumorales ganan metilación en las regiones promotoras y la pierden en el cuerpo de los genes.

La metilación de las islas CpG de genes supresores tumorales en las distintas líneas celulares de un determinado tipo tumoral presentan un alto grado de similitud, existiendo un perfil de metilación especifico para cada tipo de tumor (Paz, 2003). Esta característica también puede ser utilizada para determinar el origen del tumor, ya que también las neoplasias primarias siguen un patrón determinado de metilación de genes supresores de tumores (Esteller, 2001)

Las alteraciones epigenéticas, principalmente la metilación del ADN y la modificación de histonas, se reconocen actualmente como mecanismos adicionales que contribuyen al fenotipo maligno, siendo los patrones aberrantes de metilación del ADN una de las alteraciones moleculares encontradas más frecuentemente en las neoplasias humanas. Actualmente, existe un interés creciente en comprender los mecanismos moleculares que subyacen en estos cambios durante el desarrollo tumoral, puesto que cada vez existen más evidencias que muestran que estas alteraciones epigenéticas actúan junto con las alteraciones genéticas para conducir la tumorogénesis (Esteller, 2007, Li, 2005)

1.2.4. Modificaciones de las histonas en cáncer.

Las modificaciones covalentes de las histonas también se alteran de manera particular en cáncer. La hipermetilación de promotores de genes supresores de tumor en las células cancerígenas se asocia con una combinación particular de marcas de histonas: deacetilación de H3 y H4, metilación de H3K9, trimetilación de H3K27 y pérdida de trimetilación de H3K4 (Ballestar, 2003, Jones, 2007). La monoacetilación de K16 y la trimetilación de K20 están reducidas, y se asocian con la hipometilación de las secuencias repetitivas en el ADN de las células tumorales (Fraga, 2005). Los patrones de acetilación se pueden alterar también por mutaciones en las enzimas encargadas de mantenerla, por ejemplo, HDAC2 se encontró mutada en carcinomas esporádicos con inestabilidad cromosómica y en pacientes con síndrome de cáncer colorrectal hereditario no polipósico (Ropero, 2006).

En cuanto a la histona H4, se describió que pierde las formas monoacetiladas y trimetiladas (Fraga, 2005). Estos cambios aparecen de manera temprana y se acumulan durante el desarrollo del tumor.

1.2.5. miRNA y cáncer.

Las alteraciones de los miRNA también están relacionadas con el desarrollo de neoplasias. Las islas CpG que regulan la expresión de miRNA también se metilan de forma aberrante, dando lugar a silenciamiento transcripcional que favorece el desarrollo de tumores.

En estudios recientes se demostró que los perfiles de expresión de estos miRNA eran diferentes en la célula normal comparado con la célula tumoral, e incluso diferían entre los distintos tipos de tumores (Chen, 2005, Calin, 2006, Lu, 2005). Una característica común en tumores es la activación de la ciclina CDK6 y se descubrió que uno de los mecanismos implicados podría ser el silenciamiento del miR-124a (Lujambio, 2007).

1.2.6. Aplicaciones de la epigenética en el manejo del cáncer.

La metilación del ADN y las modificaciones de las histonas asociadas con el desarrollo y la progresión del cáncer tienen un uso clínico potencial.

Por ejemplo, para el diagnóstico precoz, puede ser útil la detección de hipermetilación en fluidos biológicos y suero (el gen GSTP1 en orina de pacientes con posible cáncer de próstata) (Esteller, 2008). Para el pronóstico, se pueden realizar perfiles de metilación tanto a nivel global como específico de ciertos genes, así como también un mapa de las modificaciones de las histonas. A nivel predictivo en respuesta a ciertos tratamientos, por ejemplo el gen MGMT en pacientes con gliomas tratados con temozolomida. Otra aplicación es en el seguimiento de los pacientes, detectando hipermetilación en fluidos biológicos y suero como podría ser el caso de la metilación de p15 en la leucemia mieloide aguda (Esteller, 2008).

1.3. Tercera parte: VIRUS

1.3.1. PAPILOMAVIRUS El virus del papiloma humano (HPV) es un miembro de la familia Papillomaviridae. El HPV puede inducir infecciones líticas, crónicas, latentes y de transformación, dependiendo de la célula huésped a la que infecte. De acuerdo al tejido susceptible, se los pueden dividir en HPV cutáneos o HPV mucosos. Los cutáneos infectan y replican en el epitelio escamoso de la piel produciendo verrugas. Los mucosos infectan y replican en membranas mucosas produciendo papilomas genitales, orales y conjuntivales e inducen proliferación epitelial. (Zheng, 2006, Villiers, 2004, Jung, 2004)

Morfológicamente hablando, el HPV es un virus pequeño, de 55nm de diámetro, no envuelto. Posee una cápside icosaédrica compuesta de 72 capsómeros, cada uno de los cuales contienen al menos 2 proteínas de cápside: L1 y L2 (Jung, 2004, Baker, 1991) (FIG. 6).

FIG. 6. Estructura de los viriones de HPV

El cáncer de cérvix o cuello uterino es el segundo cáncer más frecuente entre las mujeres en

todo el mundo. Es una de las consecuencias de la infección causada por el HPV, que es la enfermedad de transmisión sexual de mayor prevalencia en el mundo. Cada año, a nivel mundial, 300 millones de mujeres se infectan con alguno de los cien tipos diferentes de HPV, 30 millones padecen lesiones leves, 10 millones sufren patologías más graves y 500.000 desarrollan cáncer de cuello uterino.

El virus de papiloma humano se reconoce actualmente como la mayor causa de cáncer de cuello de útero, estando presente en el 95% de las lesiones (zur Hausen, 1996, Zheng, 2006).

1.3.1.1. Tipos Para la clasificación taxonómica de los HPV, es necesario que la secuencia del gen L1 entre los tipos difiera un 10% o más. Hay más de 100 tipos identificados, de los cuales 40 infectan el tracto genital, y se clasifican según su potencial de inducir transformación (Chen, 2005). Entre las cepas de alto riesgo, se encuentran el HPV16 que es responsable del 58,9% de los casos de cáncer cervical, siendo mayoritariamente carcinoma de células escamosas, y el HPV18, que produce en general adenocarcinomas y tumores más agresivos. Se citan como de riesgo intermedio los tipos 31, 33 y 45; y como de bajo riesgo, los tipos 6 y 11, que solo generan verrugas pequeñas en el tracto genital. (Zheng, 2006, Motoyama, 2004, Giannoudis, 2001) (FIG. 7 y TABLA 1)

FIG. 7. Los papilomavirus están contenidos en 5 grupos. Los tipos que infectan el cérvix pertenecen al grupo alfa, que contiene más de 60 miembros. Los tipos Beta, Gamma, Mu y Nu infectan sobre todo epitelio cutáneo. Recuadrados en rojo, se destacan al HPV16 y HPV18 como representantes de las especies alfa 9 y alfa 7 respectivamente. (de Clin. Sci. (2006), 110)

1.3.1.2. Genoma El genoma viral consiste en una doble hélice circular de ADN, que en el caso del HPV16 posee 110 CpGs y en el HPV18, 168. Los genomas de todos los tipos de HPV contienen aproximadamente 8 ORF (open reading frames) los cuales son transcritos como ARN mensajeros policistrónicos desde la misma hebra de ADN, sin haber evidencia de transcripción alguna desde la otra hebra.

La molécula de ADN del HPV mide aproximadamente 8-kb de longitud, y su genoma está organizado en 3 regiones: los genes tempranos (E1 a E7), los genes tardíos (L1 y L2) y la secuencia reguladora URR (por sus siglas en inglés: upper regulatory region, o también conocida como LCR: long control region). Las regiones de genes tempranos y tardíos son ambas codificantes de proteínas, las que se expresan en infecciones de transformación y productivas respectivamente. La URR es no codificante, posee varios sitios de unión para represores y activadores de la transcripción, sugiriendo que puede jugar un papel en determinar el rango de hospedadores para los determinados tipos de HPV (Motoyama, 2004). Esta región mide de 400 a 1000 bp, y es la que posee la mayor variabilidad entre los distintos tipos de HPV. Contiene todos los elementos regulatorios cis necesarios para la transcripción, incluyendo al promotor temprano (p97 en el caso de HPV16 y p105 en el HPV18) y al origen de replicación (ori) (FIG. 8) (O"Connor, 1998, Jung, 2004).

TABLA 1. Clasificación de los alfa papilomavirus, pueden subdividirse en 3 categorías (alto riesgo, bajo riesgo y cutáneos) dependiendo de la prevalencia en la población general y la frecuencia con la que causan cáncer cervical. Los de alto riesgo provienen de los grupos 5,

6, 7, 9 y 11. la frecuencia con la que los distintos tipos de HPV se encuentran en cáncer cervical (carcinoma de células escamosas o adenocarcinomas) se muestra en las columnas centrales. En los casos en los que no aparece ningún porcentaje , es que ese tipo de HPV no se asocia en general con cáncer cervical. (adaptado de Clin. Sci. (2006), 110)

Los genes de la región temprana se transcriben antes de la replicación productiva del ADN, en cambio los de la región tardía son transcritos después de la amplificación del ADN viral. La mayoría de los genes de HPV 16 son iniciados del promotor mayor p97, y los del HPV 18 desde el promotor p105.

Se identificaron dos TATA boxes upstream del ORF de E6, en bp 17 y 65, y otra upstream L1, en bp 4291. Una CAT box potencial precede a las TATA boxes cerca de la región de E6, en bp 7898. Las señales de poliadenilación pueden ser encontradas al final de las regiones de los genes tempranos y tardíos, en bp 4215 y 7321 (Zheng, 2006).

1.3.1.3. Ciclo vital del HPV Estos virus son altamente específicos de especie. Todos tienen tropismo por las células epiteliales escamosas (aunque se desconocen los receptores, algunos HPV se adhieren a la célula vía heparin sulfato, aunque también pueden estar implicados los proteoglicanos), causando lesiones epiteliales. El ciclo de vida productivo del HPV esta directamente relacionado a la diferenciación del epitelio celular. La infección por papiloma virus se produce por microtraumas en el epitelio, exponiendo la capa basal a la entrada del virus (Fehrmann, 2003).

FIG. 8. Representación esquemática de la organización del genoma del HPV16. E1 a E7: genes tempranos; L1-L2: genes tardíos. LCR: long control region (región de control)

Después de la entrada en los queratinocitos de la capa basal, el genoma del HPV se establece como episomas, con aproximadamente 50-100 copias por célula, los cuales se replican en sintonía con la replicación del ADN celular (la expresión de los genes tempranos E1 y E2 es detectada en esta fase, los cuales contribuyen a la replicación y al mantenimiento del estado episomal). Después de la división celular, las células hijas infectadas abandonan la capa basal, migran hacia las regiones suprabasales y se diferencian. En contraste con los queratinocitos que no están infectados, los cuales abandonan el ciclo celular tan pronto como se desprenden de la membrana basal, las células infectadas entran en fase S tras alcanzar la capa suprabasal. Esta entrada en fase S resulta en la amplificación de los genomas virales a cientos de copias por célula. Al mismo tiempo, con la amplificación del ADN viral se sintetizan las proteínas virales E1, E4 y las de la cápside, resultando en el ensamblaje de los viriones infectantes. De esta forma los viriones son liberados en las capas más altas del epitelio. La conversión maligna no produce infección productiva. (Fehrmann, 2003, Lowy, 2006) (FIG. 9)

La transcripción tardía se induce en las células más distales de la capa granulosa, que lleva a la acumulación de proteínas L1 y L2 y al ensamblaje de genomas en viriones maduros, que son liberados al exterior con las células muertas del estrato córneo.

La liberación de los viriones en la capa más distal del epitelio, lejos de la dermis, impide su acceso a la sangre y explica la falta de respuesta inmune contra estos virus, la persistencia de las infecciones y las lesiones que producen.

FIG. 9. Progresión de las lesiones en la infección con HPV. Las células del estrato basal descansan sobre la membrana basal, que esta sostenida por la dermis. El HPV accede a las células basales por microtraumas en el epitelio. Después de la infección, se expresan los genes E1, E2, E4, E5, E6 y E7 y el DNA viral se replica de forma episomal. En las zonas mas altas del epitelio, el genoma viral se replica en mayor numero y se expresan los genes L1, L2 y E4. Finalmente, los viriones se ensamblan y se liberan, pudiendo iniciar una nueva infección. (Adaptado de Lowy DR, Schiller JT. Journal Clin Investigation, 116: 1167-73, 2006)

1.3.1.4. Transcripción.

Se sabe que solo una hebra del genoma se transcribe, produciendo 2 clases de proteínas, las tempranas y las tardías. Todos los transcritos de la región temprana terminan en un sitio de polyA común en la unión entre los ORF tempranos y tardíos.

Los transcritos se originan de un único promotor y por splicing alternativo generan la expresión de las proteínas E2, E4 y E5. Los ORF tardíos podrían también utilizar los mismos promotores que los tempranos, pero no se sabe con certeza.

En los papilomavirus animales, los transcritos tempranos y tardíos se originan de varios promotores, en cambio en los papilomavirus humanos, los transcritos empiezan de uno o dos promotores.

Las proteínas tempranas son reguladoras e incluyen a las que regulan la transcripción de E2 y E7. La transcripción comienza con la interacción de los factores de transcripción basales con la TATA box del URR. Una vez que la transcripción comenzó, los transcritos son empalmados de diferentes maneras, produciendo varios mARN diferentes que codifican para genes distintos. Este proceso permite la expresión de genes en diferentes marcos de lectura. En modelos animales y algunos cutáneos, E2 es un fuerte activador de la transcripción, estimulando genes tempranos y tardíos. La localización de los sitios target de E2 muy cerca de la TATA box, desplaza la maquinaria de transcripción basal, resultando en la represión de la transcripción temprana.

Los promotores tardíos del HPV parecen estar ubicados fuera de la URR, a diferencia de los otros papilomavirus, en los que se ubican dentro. Todavía no se sabe si E2 estimula la transcripción tardía (FIG. 10) (Zheng, 2006, Bernard, 2002).

FIG. 10. Representación del genoma de HPV 16, indicando los genes y transcritos, el promotor mayor (p97) y los sitios poly-A.

1.3.1.5. Replicación del genoma viral.

El genoma se replica de forma episómica. Hay 2 mecanismos involucrados:

• Replicación plasmídica. Ocurre en células de las capas más bajas de la dermis.

Inicialmente, el ADN viral es amplificado hasta alcanzar unas 50/400 copias por genoma diploide. Después de esto, al replicarse una vez por división celular, el número de copias por célula permanece constante. La proteína E1 esta involucrada en esta fase de replicación.

• Replicación vegetativa. Ocurre en las células en diferenciación terminal de la epidermis.

En estas células diferenciadas (o células arrestadas en cultivo) el control del número de copias parece haberse perdido, y el ADN es amplificado a muy altas copias por célula.

El virus se libera de las células epidérmicas cuando estas mudan, y es transmitido por contacto directo e indirecto.

1.3.1.6. Regulación de la replicación Para mantener un número de copias en la capa basal del epitelio, y así permanecer en infección latente, el ADN viral debe replicarse junto con la célula. La proteína E1 interacciona con la primasa y la polimerasa celular para permitir la unión al sitio especifico del origen del virus, esta tiene función ATPasa y helicasa, se une al ADN viral con baja especificidad de secuencia. E2 se une a E1 (forman un complejo) y también a la secuencia URR adyacente al origen viral.

El origen de replicación contiene una región de unión de E1, flanqueada por dos sitios de unión para E2.

Después de la interacción física entre E1 y E2, el genoma del papiloma virus se replica a bajo nivel (20 copias por célula) en un modo de replicación "theta". En células diferenciadas, el HPV se replica a altas tasas (más de 100 copias por célula). En esta etapa, los genes de transcripción tardía empiezan a producir las proteínas de la cápside, que tienen la capacidad de autoensamblarse en viriones. (Wentzensen, 2004)

1.3.1.7. Integración del ADN El ADN del HPV es en general extracromosomal o episomal en las lesiones benignas preneoplásicas, aumentando la frecuencia de integración a medida que progresa la lesión. Los tejidos cancerosos pueden tener ADN episomal o integrado al mismo tiempo, aunque la integración parece ser más frecuente en la infección con HPV18 que con HPV16 (Motoyama, 2004, Woodman, 2007).

Durante la integración, que requiere la linearización del genoma, usualmente el ADN viral se rompe en la región E1-E2, lo que lleva a la pérdida de estas regiones. La pérdida de E2, que codifica una proteína que inhibe la transcripción de E6 y E7 resulta en una expresión descontrolada y aumentada de estas oncoproteínas, que llevan a transformación maligna de las células (Motoyama, 2004) (FIG. 11).

Cuando el ADN viral es liberado en el núcleo, varios factores de transcripción celulares interaccionan con la región URR, comenzando la transcripción de los genes tempranos E6 y E7. Después de la traducción, las proteínas transformantes interaccionan con los reguladores celulares antioncogénicos p53 y Rb, interrumpiendo así el ciclo celular e inhibiendo el arresto. Concomitantemente, los genes de E1 y E2 se expresan para regular la replicación y la transcripción del ADN. En el HPV genital, E2 reprime la transcripción temprana por su interacción con blancos específicos en la URR, desplazando la maquinaria de transcripción basal. En los papilomavirus animales y cutáneos E3 activa varios promotores, incluyendo los tardíos (Wentzensen, 2004).

1.3.1.8. Transformación.

Una vez que el virus se integra al genoma celular, comienza la etapa de transformación de la célula, y disminuye notablemente la replicación. En esta fase juegan un papel primordial las proteínas que expresa el virus, de manera que a continuación se comentarán brevemente.

FIG. 11. A: Esquema de la progresión histológica desde el epitelio normal hasta el carcinoma invasivo. Las lesiones de bajo grado mantienen replicación viral productiva. Algunas infecciones con HPV progresan a displasias mas graves que pueden terminar en carcinoma invasivo, asociado a la integración del HPV en el genoma celular, pérdida o interrupción de E2, con la subsecuente sobreexpresión de E6 y E7. (Adaptado de Lowy DR, Schiller JT. Journal Clin Investigation, 116: 1167-73, 2006).

B: Representación del episoma de HPV indicando el sitio de corte al momento de la integración.

1.3.1.9. Proteína E6 E6 es uno de los primeros genes expresados durante la infección con HPV, y juega un papel importante en la inmortalización celular. La proteína E6 no tiene actividad intrínseca enzimática y ejerce sus funciones interactuando con proteínas celulares.

E6 es un péptido de 151 aa (16 a 19 kD), la mayoría de ellos básicos, y contiene 4 motivos C-x-x-C que forman 2 dominios de unión de zinc (proteína dedos de zinc).

Una función importante de E6 (el extremo carboxilo) es que se une a p53 lo que resulta en su degradación mediada por ubicuitina. E6 primero se une a una ligasa celular de ubicuitina, la E6-AP (de100 kDa), y este complejo es capaz de unirse a p53. E6-AP recluta al complejo enzimático que ubicuitina las lisinas en p53, iniciando su proteólisis por el proteosoma (FIG. 11BIS).

Además de degradar a p53, E6 activa a la telomerasa. La inmortalización de queratinocitos requiere la activación de hTERT y de la vía de p16. El mecanismo por el cual E6 logra activar a la telomerasa se desconoce, aunque muchos estudios demostraron que E6 puede aumentar los niveles de hTERT endógenos en queratinocitos mediante activación transcripcional de su promotor. Este mecanismo parece ser independiente de p53, y puede incluir a myc (Fehrmann, 2003).

1.3.1.10. Proteína E7 E7 es una pequeña fosfoproteína nuclear ácida de 100 aa de longitud (10 a 14 kD), que dimeriza a través de un motivo de dedo de zinc en el C-terminal. Su actividad primaria es asociarse con miembros de la familia de Rb, para facilitar la progresión a la fase S. En células normales, Rb está hipofosforilado en G1 temprano, y se hiperfosforila en la transición G1-S. En su estado hipofosforilado, Rb se une al factor E2F y reprime la transcripción de los promotores que contienen sitios de unión a E2F. Un gran número de genes requeridos para la síntesis de ADN, como ADN polimerasa alfa y timidina quinasa, son transcritos regulados mediante E2F. Uniéndose a Rb hipofosforilado, E7 impide que se una con E2F, y así promueve la progresión del ciclo celular, incluso en células epiteliales diferenciadas, permitiendo la replicación de los genes virales.

Adicionalmente, E7 induce la degradación de Rb mediada por ubiquitina. Además de con Rb, E7 interacciona con p107 y p130, miembros de la misma familia que también regulan negativamente la transcripción de E2F (FIG. 11BIS).

La expresión de E7 en ausencia de otras proteínas virales lleva a transformación de fibroblastos de ratón. Mientras que E7 sola puede inmortalizar queratinocitos humanos, la presencia de E6 realza la frecuencia en que esto pueda ocurrir.

E7 también suprime la actividad inhibitoria de p21 y p27 (Fehrmann, 2003).

FIG. 11BIS. E6 y E7 interactúan con p53 y pRB respectivamente e inducen su degradación proteolítica. E7 también puede interferir con p53 e incluso inhibir a p21, el mayor mediador del arresto celular mediado por p53. Esto interfiere con los check points celulares y el programa de apoptosis.

1.3.1.11. Proteína E5 Es la proteína con capacidad transformante más pequeña que se conoce.

Es una proteína altamente hidrofóbica, de 80 aa, que se localiza principalmente en las membranas endosomales, aparato de Golgi y en menor medida en la membrana plasmática (Munger, 2002). Su función en transformación se basa en incrementar la señalización de receptores de membrana, como EGF-R y PDGF-R, haciendo a las células más sensibles a concentraciones menores de les respectivos factores sin aumentar el numero de receptores. Al unir moléculas a estos receptores facilita su auto fosforilación, dimerización y activación. Además, E5 impide la bajada de pH en las vacuolas celulares, lo que determina que el reciclaje de los receptores a la superficie este favorecido sobre su degradación en los lisosomas.

Se demostró que E5 incrementa el crecimiento celular de fibroblastos de ratón, y los puede transformar a un crecimiento independiente de adhesión. También incrementa la capacidad proliferativa de los queratinocitos humanos, este hecho realzado con la adición de EGF. La expresión de E5 resulta en un incremento ligando-dependiente de los niveles de fosforilación de EGFR, y aumento de la señal mitogénica de EGFR.

Esta proteína es una de las menos conservadas entre los papilomavirus (Fehrmann, 2003).

1.3.1.12. Proteína E1 E1 es una fosfoproteína nuclear larga (68-76 kD) esencial para la replicación del HPV. Interacciona con E2 y se une con gran afinidad al origen de replicación (ori) localizado en la URR. Las funciones de E1 están asociadas con la replicación y consiste en unión al ATP, con actividad helicasa e interacción física con numerosos componentes de la maquinaria de replicación celular del ADN (ADN pol, primasa) (Hebner, 2006).

1.3.1.13. Proteína E2 El gen de E2 codifica para una proteína altamente fosforilada de 48 kD. Regula la transcripción y la replicación del ADN viral a través de la interacción con las secuencias parcialmente palindrómicas, 5"- ACCN6G(GT)T-3" localizadas en la URR. En los HPV 16 y 18, hay 4 de esos sitios y la proteína E2 se une al promotor temprano y disminuye la expresión de E6/E7; por lo tanto, la pérdida de E2 es el primer paso en el proces de transformación. (Hebner, 2006, Romanczuk, 1990)

1.3.1.14. Proteína E4 Se expresa en las últimas etapas de la infección (como una proteína de fusión con 5 aminoácidos del extremo N-Terminal de E1) cuando los viriones completos se ensamblan, y no se sabe si posee propiedades transformantes, pero juega un papel importante en la maduración y replicación viral. E4 también induce el colapso de la red de citoqueratina citoplasmática en queratinocitos humanos, lo que puede facilitar la salida de los viriones de la célula infectada (Zheng, 2006). Esto podría ser la causa del característico halo perinuclear de los "coilocitos", las células que se observan en los cortes histológicos y citologías de las células infectadas (FIG. 12).

FIG. 12. Preparado delgado con grupo de células normales cervicales a la izquierda y células infectadas con HPV a la derecha (displasia leve), mostrando formas típicas de coilocitos: núcleos aumentados x2 o x3 e hipercromasia.

1.3.1.15. L1 y L2 El gen de L1 codifica la proteína mayor de la cápside (56-60 kD). Es la proteína más antigénica de los papilomavirus, está débilmente fosforilada y no se une al ADN. Puede ser glicosilada y entrecruzada mediante disulfuros, pero las implicaciones de estos cambios no se conocen. Está bastante conservada entre los papiloma virus.

TABLA 2. Genes y proteínas del HPV y sus respectivas funciones.

El gen de L2 codifica para la proteína menor de la cápside (49-60 kD), que está altamente fosforilada y se une al ADN. A diferencia de L1, L2 no se entrecruza ni se une a sí misma (Hebner, 2006).

1.3.1.16. Región reguladora Operacionalmente definida como la región que va desde la terminación del gen de L1 hasta la primera metionina del gen de E6, es la región menos conservada entre los papilomavirus. Contiene al promotor temprano y varios motivos reguladores de la transcripción, incluyendo aquellos de la familia de AP-1, YY1, NF-1/CTF, Octa, TEF-2 y Sp1, y el sitio de unión de E2. El origen de replicación (ori) también se encuentra aquí, normalmente centrado entre los dos sitios de unión del E2 (Hebner, 2006, Giannoudis, 2001, Romanczuk, 1990).

1.3.1.17. Vacuna contra el virus del papiloma humano La última generación de vacunas preventivas para el HPV está basada en partículas de la cápside del virus, es decir que no contiene ADN viral del núcleo y por tanto, su capacidad de infección queda totalmente anulada. Actualmente hay disponibles dos vacunas, una bivalente que protege contra los tipos mas comunes de alto riesgo: HVP16 y HPV18 (Cervarix®) y la otra tetravalente que además es activa frente a los tipos 6 y 11 (Gardasil®). Ambas vacunas previenen la infección inicial con el virus, y se espera que sus efectos protectores duren al menos 4 años.

Si bien es un avance importante, hay que tener en cuenta que esta inmunización solo protegerá contra los tipos incluidos en las vacunas, el tiempo que dure la protección todavía no se sabe con certeza y puede que no sea absoluta. Por otra parte, las mujeres mayores no están cubiertas por el plan de vacunación, por lo que continúan siendo un grupo de riesgo.

También hay un creciente interés en desarrollar vacunas terapéuticas, que provoquen respuestas inmunes contra las infecciones ya establecidas, pero hasta la fecha todavía no se ha conseguido.

1.3.1.18. Patogénesis de los papilomavirus Los papilomavirus infectan aves y mamíferos. Sólo producen lesiones en el epitelio escamoso estratificado. No hay evidencia de extensión por vía sanguínea, permaneciendo la infección localizada, y pudiendo permanecer como infecciones latentes sin evidencia de enfermedad.

La resolución más común de las infecciones es la formación de un crecimiento benigno de células, una verruga o un papiloma. Esto puede ocurrir en cualquier parte del cuerpo. Las verrugas de la piel se dividen en planas (superficiales) y plantares (en los pies o en los dedos).

• Verrugas cutáneas: mayormente benignas, asociadas a HPV 1, 2, 3 y 4. en general se desarrollan antes de la pubertad. Se suele infectar un sitio de trauma, y difundirse por auto inoculación.

• Lesiones respiratorias: se pueden localizar en la cavidad oral, nariz y laringe, pudiéndose extender a traquea, bronquios y pulmones, aunque no es lo más común.

• Lesiones genitales (condyloma, neoplasia intraepitelial, malignidad): es una enfermedad de transmisión sexual, pero la mayoría de las infecciones permanecen en forma latente o subclínica. El 0,01-0,1% de las lesiones cervicales progresan a cáncer, siendo menor el porcentaje en lesiones ubicadas en otros sitios. Según la epidemiología, la transformación maligna requiere de cofactores.

1.3.1.19. Cofactores Como ya se ha mencionado anteriormente, muchos casos de infección con HPV se curan espontáneamente. Más aún, incluso en los casos donde la infección persiste, el cáncer no aparece hasta una década después. Esta demora apoya la teoría que la infección con HPV puede ser causa necesaria pero no suficiente para que la lesión progrese a carcinoma, y que la influencia de otros factores, o cofactores, son necesarios para establecer la malignidad inducida por HPV (Gatza M, 2005).

Entre estos cofactores encontramos: número de embarazos, tabaco, clamidiasis y otras enfermedades de transmisión sexual, estrógenos y anticonceptivos orales (demostraron aumentar la transcripción de E6 y E7) y también la coinfección con HIV (Motoyama, 2004, Cavalcanti, 2000, Castellsague, 2002).

Este comportamiento podría explicarse mediante el estudio de los factores epigenéticos, que integren los componentes ambientales con el desarrollo y progresión de las lesiones.

TABLA 3. Ubicación de las lesiones según el tipo de papiloma virus involucrado.

1.3.1.20. Cambios epigenéticos en la neoplasia cervical La metilación aberrante de los promotores de genes supresores de tumores es uno de los cambios epigenéticos más importantes que contribuyen a la carcinogénesis. Tanto los genes virales como los del hospedador pueden ser blancos para la maquinaria de metilación celular. El patrón de metilación de los genes del HPV varia de acuerdo al ciclo vital, la presencia de enfermedad y posiblemente el tipo viral (Kim, 2003, Badal, 2004, Kalantari, 2004, Turan, 2006).

La metilación de novo del HPV puede verse como un mecanismo de defensa para suprimir la transcripción de ADN extraño, una estrategia que utiliza el virus para mantener una infección a largo plazo, o ambas (Remus, 1999, Badal, 2003).

Los oncogenes virales inducen la metilación de genes celulares previa activación de las DNMTs celulares. Por ejemplo, el gen de la caderina 1 se metila después que la proteína LMP1 del EBV activa a la DNMT1. Este mecanismo se produce a través de la vía AP1-JNK (activated protein 1-JUN N-terminal kinase). Aunque no hay evidencia hasta ahora que HPV pueda inducir la metilación en genes supresores de tumor, la proteína E7 de HPV16 se une a DNMT1 y puede estimular su actividad enzimática (Burgers, 2006). Más aún, E7 puede también activar la transcripción de DNMT1. DNMT1 es un blanco del factor de transcripción E2F1 y E7 puede inactivar a los miembros de la familia de Rb que son los que inhiben a E2F. Por lo tanto, E7 puede estimular la actividad de E2F y la transcripción de DNMT1.

También los genes celulares son silenciados por hipermetilación de sus promotores en el cáncer cervical. Comparando muestras tumorales con tejido normal, se encontraron reprimidos genes como p16, MGMT, GST y DAP-kinasa (Rosas, 2001, Sánchez-Céspedes, 2000).

El tratamiento con agentes demetilantes como el 5-aza ha demostrado que reactiva la transcripción de HPV silentes en líneas celulares de cáncer de cérvix (Van Tine, 2004). Esto plantea la posibilidad, aunque todavía no hay evidencias empíricas, que la detección de HPV en mujeres mayores puede ser por la reactivación epigenética de virus que se encontraban silenciados previamente.

1.3.2. Epstein-Barr Virus El virus Epstein-Barr (EBV) fue descubierto hace más de 40 años a partir de células derivadas de linfoma de Burkitt de pacientes africanos. Sin embargo, el 90% de la población mundial adulta está infectada con este virus. La infección primaria suele ocurrir en la infancia, permaneciendo la infección en forma asintomática en los linfocitos B durante toda la vida del individuo (Rickinson, 1996).

TABLA 4. Clasificación de los herpesvirus humanos.

Es un virus ubicuo, que infecta las células de la mucosa orofaríngea y establece infecciones latentes en linfocitos B. Se transmite por la saliva, ya que el virus infecta el epitelio bucal y las glándulas salivales, y de ahí pasa a los linfocitos B del tejido linfoide de la faringe desde donde se disemina a todo el organismo. Cuando el virus se reactiva, se elimina por saliva y es capaz de contagiar a otro individuo (Rickinson, 1996).

El EBV pertenece a la familia Herpesviridae, de la que se conocen 8 miembros que afectan humanos y muchos otros que producen enfermedades en otras especies (TABLA 4).

Los virus herpes se clasifican en tres grupos: Alfaherpesvirinae, Betaherpesvirinae y Gammaherpesvirinae de acuerdo a sus propiedades biológicas. En el caso de los Herpesvirus humanos, esta clasificación además se corresponde con el tipo de célula en la que desarrollan la latencia.

Los herpesvirus alfa son neurotrópicos, causan lesiones epiteliales y permanecen en latencia en ganglios y neuronas. Esta subfamilia incluye a los herpesvirus 1, 2 y 3 (más conocido como el virus varicela-zóster) que tienen como característica común la de destruir la célula a la que infectan.

Los herpesvirus beta incluyen los tipos 5, 6 y 7, que permanecen latentes en glándulas secretoras, células linforreticulares y riñón entre otros tejidos. La infección con este tipo viral produce un aumento en el tamaño de la célula, apareciendo cuerpos de inclusión en el núcleo y el citoplasma. Los individuos inmunocomprometidos son los más susceptibles de padecer enfermedad por este tipo de virus, pudiendo incluso llevar a la muerte. Además, este virus es capaz de transmitirse desde la madre al feto, y así causar daño congénito en bebés.

Los herpesvirus gamma muestran tropismo por los linfocitos, donde establecen su latencia. Los integrantes de este grupo son el Virus de Epstein-Barr (EBV, el tipo 4) y el tipo 8 (el asociado a sarcoma de Kaposi). El EBV tiene preferencia por los linfocitos B a los que inmortaliza eficientemente in vitro, y cuya infección aguda se asocia con desordenes linfoproliferativos (Kieff E, 2001).

CARACTERISTICAS PRINCIPALES DE LOS HERPESVIRUS •Tamaño: 120-300 nm •Simetría de la cápside: Icosaédrica •Genoma: DNA lineal de doble cadena, 120-250 Kb •Presencia de tegumento y envuelta lipídica •Gran numero de enzimas involucradas en el metabolismo de ácidos nucleicos, síntesis de DNA y procesamiento de proteínas •Infecciones latentes •Transcriben, replican y ensablan en el núcleo celular •La producción de progenie infecciosa se acompaña de la destrucción de la célula infectada.

1.3.2.1. Morfología del virión Los viriones están compuestos por un core, una cápside, un tegumento y una envoltura. El core contiene la molécula de ADN de doble cadena de aproximadamente 172 Kb. El genoma del EBV está organizado como una región única larga que codifica para unos 90 genes y posee de 6 a 12 elementos de repetición internos y terminales. La recombinación de sus repeticiones terminales origina la forma episomal del virus que es la que se encuentra en el núcleo de las células infectadas de forma latente.

La cápside es de conformación icosaédrica y posee 162 capsómeros, el tegumento es una estructura poco definida que se encuentra entre la cápside y la envoltura, está compuesto por numerosas proteínas codificadas por el virus sin simetría apreciable. Algunas de estas proteínas necesarias para iniciar la infección, mientras que otras favorecen la interacción envoltura-cápside, con lo que aumenta la estabilidad de la partícula. Estrechamente asociada al tegumento se encuentra la envoltura, de naturaleza lipídica con algunas glicoproteínas de aspecto trilaminar al microscopio electrónico (Carrasco, 2006) (FIG. 13).

FIG. 13. A: Los Herpesvirus poseen una envoltura que rodea la cápside icosaédrica de aproximadamente 10 nm de diámetro, que contiene el DNA del virus. Cuando la envoltura se rompe y se despega de la cápside, el virión adquiere una forma típica de huevo frito.

B: Microfotografía electrónica del EBV.

1.3.2.2. Arquitectura genética La mayoría de los genes de los herpesvirus contienen una región promotora upstream de una TATA box, un inicio de trascripción downstream de la TATA box, un open reading frame (ORF) con un inicio de traducción y sitios de poliadenilación con secuencias flanqueantes standard. Una característica bastante común es el solapamiento de los genes.

Los herpesvirus son capaces de alterar el medio ambiente celular según sus necesidades. Estas alteraciones incluyen estimular o reprimir la síntesis de macromoléculas, inducir o inhibir la replicación del ADN celular, o bien inmortalizar a la célula. El virus es capaz de bloquear la apoptosis, activar la vía del interferón, bloquear la presentación de péptidos antigénicos en la superficie de la célula e incluso sintetizar proteínas virales que actúen como inmunomoduladores. Esto trae como consecuencia que la célula infectada no se elimine pronto, permitiendo la permanencia del virus y la dispersión a otros hospedadores susceptibles.

1.3.2.3. Ciclo infectivo La entrada del virus a la célula puede dividirse en dos fases: la adhesión y la penetración. En el reconocimiento y unión del EBV a los receptores de las células epiteliales y de los linfocitos intervienen tres glicoproteínas de la envoltura: la gH (gp85 o BXLF2) y gL (gp25 o BKRF2) para las células epiteliales, y la gp42 para los linfocitos. Esta interacciona con la CD21, que está implicada a su vez en la regulación del complemento a la que se une por medio de su glicoproteína gp350/220.

Esta unión puede desencadenar la actividad tirosin quinasa y tener efectos activadores en el linfocito B, ya que se vio que comienzan a secretar grandes cantidades de IgG apenas se produce la exposición al virus. CD21 también aumenta la activación de NF-KB y del promotor de EBNA, Wp.

Una vez que se ha unido el virus a su receptor, se produce la fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática, liberándose la nucleocápside al citoplasma. La cápside junto con parte del tegumento es transportada por el citoesqueleto hasta el complejo del poro nuclear, donde se abre e inyecta el genoma viral al interior del núcleo (FIG. 14).

1.3.2.4. Expresión génica Una vez en el núcleo, donde tiene lugar la mayor parte del ciclo vital de los herpesvirus, el genoma viral se circulariza entre las 12 y 16 horas post-infección. Si se trata de una infección lítica, comienza la trascripción de un gran número de genes virales, llevada a cabo por la ARN polimerasa II celular, pero con la intervención de factores transcripcionales codificados por el virus. Los herpervirus codifican un gran número de enzimas relacionadas con el metabolismo de los ácidos nucleicos (timidita quinasa, dUTPasa, timidilato sintetasa), síntesis de ADN (ADNpolimerasa, helicasa, primasa) y para el procesamiento de proteínas (protein quinasas), las cuales modulan la actividad de la polimerasa celular y determinan el reconocimiento ordenado de los promotores virales por los complejos de trascripción.

Durante la infección lítica se distinguen tres fases de expresión génica: la inmediatamente temprana (proteínas a), la temprana (proteínas ß) y la tardía (proteínas ?). Las proteínas a son las primeras en expresarse, son reguladores de la expresión génica cuya trascripción no depende de la síntesis de proteínas de novo, e inducen la trascripción de los genes beta. Las proteínas ß están relacionadas con la replicación viral, incluyendo por ejemplo la ADN polimerasa, la helicasa y la timidita quinasa. Una vez replicado el ADN viral, se expresan los genes ? que codifican para las proteínas estructurales.

1.3.2.5. Maduración y salida Una vez que las cápsides virales maduraron por contener el genoma viral empaquetado dentro, salen del núcleo rodeándose de la membrana nuclear interna donde previamente se han insertado proteínas codificadas por el virus. Para salir del núcleo pueden tomar dos alternativas: atravesar el lumen entre las membranas nucleares interna y externa fusionándose con la externa, abandonando la envoltura y saliendo al citosol como cápside desnuda para adquirir el tegumento; o bien adquirir el tegumento en el núcleo sin perder la envoltura adquirida en la membrana nuclear interna.

De cualquiera de las dos maneras, los viriones se rodean sucesivamente por envueltas del retículo endoplasmático y aparato de Golgi, hasta que finalmente son liberados de la célula infectada. (FIG. 14)

1.3.2.6. Inducción de la transformación en linfocitos B por el EBV EBV induce la proliferación en linfocitos B, por los que muestra un marcado tropismo (Pope, 1968). En primer lugar se une a un receptor de superficie que hay en la superficie de los linfocitos B, denominado CD21. Esta unión induce la activación de la célula, la que entra en ciclo mitótico llevando a la aparición de líneas proliferantes, que se conocen como "líneas celulares linfoblastoides" (LCL). La interacción de la molécula CD21 con el EBV se asocia a la secreción de IgG. Las células comienzan entonces a dividirse haciéndose luego independientes de los mecanismos autócrinos de control de crecimiento y proliferación.

En estas células, el genoma viral se mantiene como episomas en forma latente y expresa 9 proteínas: los antígenos nucleares EBNAs 1, 2, 3A, 3B, 3C y LP, y las proteínas de membrana LMPs 1, 2A y 2B (Gatza, 2005, Klein, 2007, Williams, 2006, Young, 2004).

1.3.2.7. Patología de los herpesvirus humanos.