Descripción de un protocolo estandarizado de toxicidad aguda para cladóceros

Indice1. Introducción 2. Bioensayos 3. Tipos 4. Bioensayos de toxicidad aguda con cladóceros 5. Conclusiones y Recomendaciones 6. Bibliografía

1. Introducción

La actividad humana produce gran variedad de desechos que son liberados a los ambientes terrestres, aéreos y acuáticos. La introducción de un determinado desecho antropogénico puede o no introducir desequilibrios en un ecosistema que conduzcan a su deterioro. Para cada desecho existe una concentración umbral, por encima de la cual se detectan los efectos responsables de dichos desequilibrios (Cairns, 1986). En general, los sistemas naturales poseen la capacidad de soportar alteraciones debidas a la presencia de agentes foráneos mediante los procesos internos de autodepuración. El deterioro de un ecosistema se produce cuando la cantidad y calidad de desechos introducidos superan su capacidad de recuperación (Tortorelli y Hernández, 1995). La contaminación es la impregnación del aire, el agua o el suelo con productos que afectan a la salud del hombre, la calidad de vida o el funcionamiento natural de los ecosistemas (Microsoft Encarta, 2001). Esta es una consecuencia indeseable de los procesos productivos que afecta no sólo a la salud humana sino también a la integridad de los ecosistemas, ocasionando daños a veces irreversibles, tales como las pérdidas de biodiversidad (Paggi y de Paggi, 2000). Donde quizás el deterioro ambiental se hace más acuciante es en el agua, pues es un insumo básico para la subsistencia de todo organismo vivo y para las actividades productivas del hombre (Paggi y de Paggi, 2000). Existen varias estrategias para la elaboración del diagnóstico de la calidad de agua de un ambiente determinado, tales como: la determinación de parámetros físico-químicos y bioquímicos; la detección de bioindicadores de contaminación y la realización de bioensayos de laboratorio y de campo (Tortorelli y Hernández, 1995). Los bioensayos son pruebas en las cuales un tejido vivo, organismo o grupo de organismos son usados como agentes para determinar la potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa o de actividad desconocida (Reish y Oshida, 1987), permitiendo comparar la toxicidad de diferentes compuestos y conocer la sensibilidad de las diversas especies, para determinar los mecanismos de los efectos de las sustancias ensayadas (Alcazar, 1988). Una de las formas básicas de prevenir los problemas derivados de la contaminación es el control periódico de la calidad del agua, es decir, conocer qué sustancias tiene disueltas o suspendidas. Para esto se debe hacer un análisis específico por cada una de las sustancias que se desee saber si existe, o en qué concentración se encuentra (Paggi y de Paggi, 2000). En este sentido los bioensayos de toxicidad permiten evaluar el grado de afectación que una sustancia química tiene en organismos vivos y éstos pueden ser agudos o crónicos. Las pruebas agudas cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico a una especie en particular. El valor calculado se denomina concentración letal media (CL50) y corresponde a la concentración de un xenobiótico que causa la muerte al 50 % de la población experimental al cabo de un tiempo determinado, generalmente en 48 o 96 horas. En contraste, las pruebas crónicas estiman la concentración – efecto media (CE50) de la sustancia de prueba que causa un efecto al 50 % de la población experimental, al cabo de un tiempo determinado (Rodríguez y Esclapés, 1995). Para regular las descargas de aguas residuales tóxicas hay que utilizar datos de ensayos de toxicidad hechos con organismos vivos y confiar en estos datos, además de efectuar estudios detallados de las características físicas y químicas de los contaminantes y de los cambios que ocurren después de su descarga en el medio. Cuando se puedan describir con precisión en términos químicos y físicos los componentes tóxicos de un contaminante y se disponga de técnicas analíticas pertinentes y de suficiente información acerca de la toxicidad de esos componentes para los organismos acuáticos, se podrán establecer normas para tales contaminantes en valores numéricos para los componentes tóxicos (FAO, 1981). Los bioensayos de toxicidad con agentes contaminantes en organismos vivos bajo condiciones de laboratorio, se han incrementado en estos últimos tiempos debido a la brevedad con que se obtiene la información sobre las dosis letales y subletales (CL50) que afectan negativamente organismos vivos en los ambientes marinos, estuarinos (Villamar, 1996) y dulceacuícolas. La prevención, y más aún la corrección, de los efectos negativos de la contaminación es muy costosa. Países como Estados Unidos, Japón, y de Europa, han incorporado a su rigurosa legislación de control de calidad del ambiente criterios que surgen de los bioensayos. La ventaja de estos métodos es que nos informan si en el agua hay alguna sustancia que resulte tóxica, o sea, algún agente que pueda producir un efecto adverso en el sistema biológico, dañar su estructura o función, o producir la muerte. En la práctica estos métodos no pueden reemplazarse por los análisis químicos (Paggi y de Paggi, 2000). Los contaminantes según su efecto se pueden dividir en dos grupos principales (FAO, 1981):

• Los directos que tienen efectos bien definidos y nocivos en las poblaciones de organismos acuáticos. Este grupo abarca los contaminantes térmicos y químicos tóxicos que pueden degradarse fácilmente, como el fenol, o las sustancias tóxicas persistentes y posiblemente bioacumulativas, tales como plaguicidas clorados orgánicos.
• Los indirectos son capaces de modificar el medio ambiente acuático de un modo que afecta perjudicialmente a la fauna y la flora. Este grupo incluye las sustancias sólidas, orgánicas o inorgánicas, no tóxicas que pueden quedar en suspensión y que por ello estorban la penetración de la luz y en consecuencia la acción fotosintética de las algas, o bien pueden sedimentarse, con lo cual afectan a los seres bentónicos, y las aguas residuales con elevada demanda bioquímica de oxígeno, que son la causa de que en el medio haya bajas concentraciones de oxígeno disuelto.

De forma general, los contaminantes que llegan al medio marino y se consideran críticos por sus efectos negativos sobre dicho ambiente y el hombre, se ordenan en metales pesados, productos químicos sintéticos, petróleo y sus derivados, elementos radioactivos y desechos sólidos (Lam et al., 1997). Los metales pesados son de origen natural y antropogénico. Normalmente, se encuentran en los sedimentos y son bioacumulados a lo largo de las cadenas tróficas. No pueden destruirse, y pueden combinarse con sustancias orgánicas formando complejos sumamente tóxicos. En orden descendente de toxicidad los metales pesados para organismos marinos, con respecto a las fases más sensibles de los ciclos de vida, es como sigue: mercurio (Hg), plata (Ag), cobre (Cu), zinc (Zn), níquel (Ni), plomo (Pb), cadmio (Cd), arsénico (As), cromo (Cr), estaño (Sn), hierro (Fe), manganeso (Mn), aluminio (Al), berilio (Be), y litio (Li) (Lam et al., 1997). El uso de bioensayos para la evaluación de toxicidad de sustancias liberadas al medio a través de efluentes, ha llevado a la utilización de biomonitores propios de los ambientes evaluados, lo cual favorece indirectamente la preservación de la biodiversidad local. Sin embargo, la variabilidad en la aplicación de las técnicas experimentales para el mantenimiento de organismos silvestres afecta la interpretación y comparación de los resultados entre laboratorios, por lo que se hace necesario desarrollar metodologías estandarizadas para establecer condiciones controladas (Palacios y Pereira, 1997). La captación y utilización de zooplancton como biomonitores data desde comienzos de siglo XX (Sosnowski et al., 1979), hoy en día, gracias al desarrollo de técnicas para su cultivo en el laboratorio, representa una herramienta que gana cada vez más reconocimiento en la evaluación ecotoxicológica (Maciorowski, 1981). Al usar organismos provenientes directamente del hábitat natural, los resultados pueden verse distorsionados por fuentes de variabilidad no previstas, como nutrición y dinámica de la población, estrés por depredación, etc. (Sosnowski et al., 1979). Estas variables pueden ser controladas o eliminadas en las poblaciones de laboratorio; además, el entrecruzamiento consanguíneo que ocurre a lo largo del tiempo en esas poblaciones, resulta en una considerable reducción de la variabilidad genética (Lewontin, 1974). A causa de la complejidad del ambiente acuático y de las comunidades biológicas que lo integran es difícil establecer el grado de deterioro que afecta a las especies o comunidades acuáticas. Por esta razón es conveniente realizar bioensayos utilizando organismos vivos en condiciones controladas de laboratorio. Sin embargo, el objetivo primordial de un bioensayo es reflejar la realidad de cómo afectaría a los organismos vivos en su medio natural y para ello es necesario paralelamente investigar continuamente las comunidades en su propio hábitat (Villamar, 1996). Dentro de los organismos comúnmente utilizados en los bioensayos de toxicidad se encuentran los cladóceros, también llamados pulgas de agua, son crustáceos pequeños que constituyen la mitad de la Clase Branchiopoda. El caparazón (bivalvo) encierra al tronco, pero no a la cabeza y suele terminar posteriormente en una espina apical. La cabeza porta un sólo ojo nauplio mediano; también posee antenas frecuentemente largas y utilizadas en la natación. Además, presenta de cuatro a seis pares de apéndices troncales y el potsabdomen esta girado ventralmente hacia delante. La mayoría de estos organismos son pálidos y transparentes y viven casi exclusivamente en agua dulce (Ruppert y Barnes, 1996). Debido a su importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos, se les considera especies indicadoras de condiciones ambientales adversas. Además, por ser organismos de fácil mantenimiento bajo condiciones de laboratorio, normalmente se utilizan en pruebas de toxicidad acuáticas. En nuestro país existen numerosas especies de cladóceros que habitan los lagos naturales y artificiales, zonas inundables y charcas temporales (Rodríguez y Esclapés, 1995). Según Reish y Oshida (1987), para la realización de bioensayos es conveniente el uso de zooplancton por su pequeña talla, requiere equivalentemente poco espacio de laboratorio, poco volumen de agua, poca cantidad de tóxico, ciclo de vida corto, requerimientos nutricionales generalmente conocidos, lo cual lo hace ideal para estudios de bioacumulación. Existen numerosos trabajos realizados con cladóceros sometiéndolos a metales pesados: Pereira y García (1994), Rodríguez y Esclapés (1995), Martínez-Tabche et al.(1997), Baillieul y Blust (1999), Esclapés (1999). También se han hecho experiencias utilizando insecticidas como contaminantes: Bergling y Dave (1984), Gliwcz y Sieniawska (1986), Chu et al. (1997), Dewey y Parker (1998), demostrando que estos organismos son ampliamente utilizados como bioindicadores.

Los objetivos del presente trabajo de investigación son: Elaborar una descripción completa de los bioensayos y de todos los elementos necesarios en su realización.

• Definir bioensayo y establecer una clasificación.
• Describir los criterios generales requeridos en la selección de especies a utilizar en ensayos.
• Nombrar las ventajas que ofrecen los cladóceros como organismos utilizados en bioensayos.
• Describir la preparación del material, de las soluciones de exposición, desarrollo de los bioensayos y análisis de resultados.

Elaborar un protocolo estandarizado específico para bioensayos de toxicidad aguda con cladóceros.

• Describir la elaboración de medios de cultivo para cladóceros y para microalgas.
• Nombrar las condiciones óptimas necesarias en el desarrollo de los bioensayos con cladóceros.

2. Bioensayos

Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad se desconoce (FAO, 1981). Los bioensayos, o pruebas de toxicidad son experimentos que miden el efecto de uno o más contaminantes en una o más especies (Reish y Oshida, 1987), permiten evaluar el grado de toxicidad de una sustancia química, un efluente, un cuerpo de agua, etc., empleando organismos vivos (Esclapés, 1999). Puede determinarse la influencia relativa de cada factor sobre los parámetros biológicos estudiados. Los rangos de variación de los factores considerados pueden ser mayores que los existentes en el ambiente natural, lo que muchas veces facilita el estudio de su modo de acción. También pueden estudiarse combinaciones de dos o más factores, lo que permite revelar la existencia de antagonismos o sinergismos entre ellos. La posibilidad de controlar muchas de las variables hace posible la eliminación de las fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a cabo (Rodríguez et al., 1995). Para proteger el medio acuático es necesario fijar límites superiores a las descargas de contaminantes perjudiciales químicos y físicos, además de vigilar y regular las descargas que se realicen posteriormente. Los límites superiores de las descargas se derivan de la consideración de los criterios apropiados de calidad de agua formulados a partir de datos de respuestas para sistemas biológicos (bioensayos crónicos o agudos) (FAO, 1981). Las pruebas pueden durar varios periodos de tiempo, pero las de 96 horas son las más comunes. Los individuos son expuestos a concentraciones crecientes del tóxico para determinar cambios en el organismo. En general la muerte es el criterio más utilizado en la prueba de 96 horas. Uno o más controles son utilizados en organismos expuestos a similares condiciones excepto cuando existe falta de disponibilidad del tóxico (Reish y Oshida, 1987). Los bioensayos toxicológicos tienen por finalidad determinar las concentraciones de un tóxico dado que ocasionen efectos dañinos o nocivos en un organismo modelo. Estos efectos pueden incluirse en las siguientes categorías:

• Afectación del término de vida
• Alteración de la tasa de crecimiento
• Cambios de los parámetros reproductivos (Reish y Oshida, 1987).

3. Tipos

1. Ensayos de respuesta directa. Bioensayos de toxicidad:
2. 1. Bioensayos agudos: Cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico a una especie en particular. El valor calculado se denomina concentración letal media (CL50), y representa la concentración que causa la muerte al 50 % de la población experimental, en un tiempo determinado (generalmente 48 o 96 horas) (Esclapés, 1999).
   2. 1. De tipo estático: Se efectúa sin la renovación continua del flujo constante de las diluciones sometidas al ensayo (FAO, 1981).
      2. 1. Sin renovación: los organismos se exponen a la misma solución de prueba el tiempo de duración del ensayo (Esclapés, 1999).
         2. Con renovación: los especimenes se someten a una preparación fresca de la misma concentración inicialmente empleada, periódicamente (generalmente cada 24 horas) (Esclapés, 1999). Tal renovación puede ser necesaria cuando importantes sustancias tóxicas se deterioran, o son absorbidas, o se pierden por cualquier otra razón, con suficiente rapidez para influir considerablemente con los resultados del ensayo (FAO, 1981).
      3. De flujo continuo: Circula continuamente una corriente de sustancia de prueba nueva en contacto con los individuos experimentales (Esclapés, 1999). Se realizan con la renovación continua o casi continua de las diluciones sometidas al ensayo, con el fin de mantener casi constantes las concentraciones de las sustancias tóxicas activas (FAO, 1981).
   3. Bioensayos crónicos: Estiman la concentración efecto media (CE50), la cual es la concentración de la sustancia de prueba que causa un efecto al 50% de la población experimental, al cabo de un tiempo determinado; depende del estadío de vida considerado o del ciclo de vida del organismo empleado. Alternativamente, un ensayo definitivo puede utilizarse para estimar el tiempo requerido para producir un efecto al 50% de los organismos (TE50), a una concentración específica (Esclapés, 1999).
   4. Bioestimulación: Se mide la facultad de las aguas residuales o de las sustancias químicas de estimular la multiplicación y el desarrollo de algas, efecto este de eutroficación que frecuentemente se traduce en una superabundancia o proliferación de algas (FAO, 1981)
   5. Bioensayos de repelencia: Trata de medir en el laboratorio las reacciones de escapes de los animales acuáticos frente a un contaminante. Al organismo utilizado (generalmente pez o crustáceo de buen tamaño) se le ofrece la oportunidad de elegir entre aguas "contaminadas" y aguas "limpias" en un tubo o tanque pequeño; el gradiente de interfaz puede ser brusco. Los aparatos y procedimientos miden también, por lo general, cuando existe la atracción hacia el contaminante. Para las especies con motilidad el escapamiento puede ser a veces la respuesta subletal clave, de naturaleza más sensible y más significativa que el deterioro de la reproducción medido mediante ensayos de toxicidad crónicos. Sin embargo, es particularmente difícil predecir, a partir de estos resultados de laboratorio, lo que ocurriría en el medio. Las respuestas de escape pueden estar o no relacionadas con la toxicidad del contaminante, en algunos casos los organismos no pueden soportar determinadas concentraciones tóxicas o pueden ser atraídas por ellas (FAO, 1981).
   6. Bioacumulación: Son necesarios para las sustancias que se acumulan en las plantas y animales acuáticos; las grandes concentraciones de sustancias tóxicas en los tejidos pueden causar la muerte, pero el organismo es capaz de acumular durante algún tiempo cantidades menores sin sufrir daño. En este último caso, los depredadores pueden acumular las sustancias en grado tal que resulte nociva para ellos o para los depredadores del nivel trófico siguiente (FAO, 1981).
   1. Ensayos organolépticos: Algunos contaminantes pueden producir olores o sabores desagradables en los organismos acuáticos. El contaminante puede no ser nocivo para el organismo acuático, pero puede ocurrir que el organismo pierda valor económico. El mejor procedimiento consiste en la evaluación por parte de personas experimentadas en bromatología y emplear gran número de catadores diestros (FAO, 1981).
   2. Ensayos de bioestimulación: Los efectos de los nutrientes adicionales pueden ser indirectos, como por ejemplo, la producción de sustancias tóxicas o la desoxigenación del agua debida a la proliferación de algas (FAO, 1981).
3. Ensayos de respuesta indirecta:

Los bioensayos se pueden realizar en el laboratorio bajo condiciones controladas o en el campo directamente en el medio natural (Tortorelli y Hernández, 1995). Los bioensayos de laboratorio pueden ser mono o multiespecíficos. Los monoespecíficos son diseñados para obtener información acerca de los efectos de la calidad de agua sobre la supervivencia y aspectos de la estructura y dinámica de una población dada. Los multiespecíficos pueden ofrecer información sobre el impacto a nivel de una comunidad determinada (Tortorelli y Hernández, 1995). Los bioensayos de campo consisten en la exposición de una o más poblaciones a la acción directa del cuerpo de agua, para ello se utilizan contenedores que permiten mantener la población en estudio en un espacio adecuado, sin afectar su relación con el medio. Estos proponen, principalmente, estudiar los efectos sobre comunidades o poblaciones, sin prestar atención a los mecanismos de acción de los contaminantes a nivel de los individuos en particular (Tortorelli y Hernández, 1995). En la Tabla 1 se comparan las ventajas y desventajas que presentan las pruebas de toxicidad realizadas en el laboratorio y en el medio natural.

(Del Valls y Conradi, 2000)

No existe un ensayo ni un organismo universal para utilizarlo en todos los experimentos de laboratorio, pero todos tienen su utilidad; sin embargo, es esencial entender las limitaciones de estas pruebas de toxicidad (Del Valls y Conradi, 2000). La selección del tipo de prueba a emplearse dependerá de los objetivos del ensayo, la disponibilidad de los recursos, los requerimientos de los organismos de prueba, las características de la sustancia a evaluar y de los objetivos y alcances particulares del estudio (Rodríguez y Esclapés, 1995). Al elegir un ensayo de toxicidad se deben tener en cuenta los siguientes elementos: los resultados deben ser relevantes a nivel ecológico y estar relacionados con los sucesos ocurridos en el ecosistema objeto de estudio; el ensayo y las variables a estudiar deben ser suficientemente sensibles para identificar el problema y distinguir entre los distintos puntos o sitios considerados; las pruebas deben ser rápidas, reproducibles y la respuesta del control predecible; la metodología debe ser estándar; las variables a medir en las pruebas deben responder de manera similar a sustancias químicas parecidas (Del Valls y Conradi, 2000). Para generar información más completa acerca del estudio toxicológico en el ambiente es la determinación de parámetros físico-químicos de calidad de agua, completados con la realización de bioensayos de laboratorio o de campo. Obteniendo una descripción de las condiciones del cuerpo de agua y del impacto de las mismas sobre aspectos estructurales y/o dinámicos de determinadas poblaciones (Tortorelli y Hernández, 1995). Es importante señalar que un resultado negativo en un ensayo de toxicidad aguda con una muestra dada, no garantiza la ausencia de toxicidad crónica. Adicionalmente, debido a la variabilidad temporal potencial que existe en la toxicidad de un desecho, un resultado negativo en una muestra particular, no excluye la posibilidad de que muestras colectadas de la descarga en otro momento, puedan mostrar toxicidad aguda o crónica. La frecuencia con que los ensayos de toxicidad se deben realizar en estudios de efluentes, dependerá de la variabilidad y grado de toxicidad del desecho, cronograma de producción y cambios en los procesos (Esclapés, 1999). Cuando varias sustancias químicas se encuentran presentes en un cuerpo de agua, la interacción toxicológica entre estas sustancias puede invalidar los datos de toxicidad de las sustancias aisladas. Además, la elaboración de un inventario completo de las sustancias químicas presentes y sus concentraciones individuales puede resultar difícil o imposible de realizar. Para estos casos, puede ser útil la determinación de la toxicidad total de las descargas al cuerpo de agua y también la del cuerpo de agua mismo. Esta medición de toxicidad puede emplearse para evaluar el significado de cada descarga en el cuerpo de agua (Thomann, 1994).

Selección de Especies Para obtener la máxima información de los bioensayos es necesario escoger los organismos más apropiados. Se debe tener en cuenta que requieren diferentes períodos de aclimatación en el laboratorio, según las especies, y es sumamente importante que los organismos de ensayo se manipulen con cuidado, no sufran daños, se encuentren sanos y sean de edad o tamaño uniformes (FAO, 1981); en la Tabla 2 se mencionan los grupos de organismos utilizados en bioensayos y su adaptabilidad al laboratorio. Según Henry (1988) la selección de organismos para bioensayos debe basarse en:

• Los objetivos del programa toxicológico
• La información disponible sobre los posibles organismos
• Las características de las especies
• Las instalaciones y equipos de laboratorio
• El nivel de capacitación de los técnicos

Criterios generales de selección:

• ¿Existe suficiente información sobre la historia de vida del organismo? ¿Sobre las técnicas de cultivo? ¿Sobre los procedimientos de bioensayos? (Henry, 1988).

Los organismos acuáticos frecuentemente tienen ciclos de vida y requerimientos de cultivo y de manejo complejos. El desarrollo de esta información es una tarea larga que frecuentemente requiere años de investigación. Es recomendable que se consideren solo aquellos organismos de los que se tiene suficiente información en cada una de estas

(Henry, 1988)

Tareas. Las especies con información limitada sobre cultivo y procedimientos de prueba deben evitarse (Henry, 1988).

• ¿Es apropiado el ciclo de vida de los organismos a los objetivos y diseños? (Henry, 1988).

El diseño de los bioensayos tiene que ser cuidadosamente considerado en el contexto del ciclo de vida del organismo. La mayoría de los protocolos de bioensayos agudos y crónicos requieren organismos jóvenes o recién nacidos. Sin embargo, algunos protocolos tales como la prueba de crecimiento de ostras, se aplican a organismos adultos. Asimismo, para pruebas crónicas que involucran reproducción, el tiempo requerido para la reproducción del organismo es un factor clave (Henry, 1988).

• ¿El bioensayo es para toxicidad en agua o en sedimentos? Para sedimentos, ¿es el objetivo determinar las sustancias tóxicas que se filtrarán hacia el agua superficial o las sustancias tóxicas que pueden acumularse en los organismos bénticos? (Henry, 1988).

Los sedimentos pueden servir como fuentes de sustancias tóxicas para el agua superficial o para los organismos bénticos que viven en los sedimentos. Las sustancias tóxicas que se mueven desde los sedimentos hacia el agua superficial pueden ser determinados preparando lixiviados del sedimento para bioensayos. También pueden ser de preocupación las sustancias tóxicas que están estrechamente ligadas a los sedimentos y que pueden ser bioconcentradas en organismos bentónicos, particularmente cuando éstos son un componente importante de una cadena alimenticia que resulta en la exposición humana (Henry, 1988). Los bioensayos para determinar toxicidad en agua o de sedimentos en contacto con agua se realizan en mejor forma con organismos planctónicos o de libre natación. Aún cuando el sedimento puede ser el material de prueba, la toxicidad puede ser evaluada exponiendo los organismos planctónicos a un lixiviado o a un extracto del sedimento usando el agua superficial (Henry, 1988). Si se sospecha la presencia de sustancias tóxicas firmemente ligadas a los sedimentos, entonces deben usarse los organismos bentónicos en contacto directo con los sedimentos. Estas pruebas revelarán cualquier toxicidad de los sedimentos y también el potencial de bioacumulación de las sustancias tóxicas y su transferencia a través de la cadena alimenticia (Henry, 1988). Características de un organismo óptimo para bioensayos:

1. Representativo de ambientes tropicales, de amplia distribución en el país o de importancia comercial (Esclapés, 1999).
2. Disponibilidad, ser fáciles de encontrar, en número suficiente y colectarse sin dificultad. Se debe tomar en cuenta problemas con el transporte (FAO, 1981).
3. Con un tamaño suficientemente pequeño para poseer los necesarios por experiencia y que sean representativos para los estudios estadísticos (FAO, 1981).
4. De fácil cultivo, lo que garantiza un adecuado suministro de organismos en los ensayos y el establecimiento con exactitud de la edad o estado de desarrollo. La edad es de suma importancia en los bioensayos, ya que la sensibilidad puede variar significativamente durante su desarrollo (Esclapés, 1999).
5. Especies con gran susceptibilidad a exposiciones con sustancias xenobióticas. Garantizando cubrir el peor de los escenarios, y proporcionando resultados que ofrecen una alta protección al resto de la cadena trófica (Esclapés, 1999).

El uso de más de una especie permitirá una determinación más cuidadosa de toxicidad porque los organismos acuáticos varían en su respuesta a las sustancias tóxicas. Por ejemplo, los peces pueden ser más sensibles que los invertebrados a una sustancia química, mientras que puede suceder lo contrario con otra sustancia química (Henry, 1988).

Organismos criados en el laboratorio para bioensayos Ventajas: Disponibilidad en forma inmediata de organismos aclimatados, saludables, que han sido criados bajo las mismas condiciones (Henry, 1988). Los organismos cultivados minimizan la variabilidad genética que supondría traer individuos capturados en diferentes localidades geográficas (Esclapés, 1999). La respuesta de los organismos para bioensayos a la sustancia tóxica está influenciada por factores tales como su edad (los animales jóvenes son usualmente más sensibles), dieta (los animales bien alimentados brindan respuestas más consistentes), estrés (los organismos alterados son más sensibles) y condiciones físicas como temperatura, luz y el nivel de oxígeno disuelto en el agua (Henry, 1988). Los organismos para bioensayos cultivados en laboratorio representan una fuente predecible de organismos de prueba de una edad conocida. El uso de condiciones estándares de laboratorio y de alimentación asegurará que todos los organismos de prueba responderán a las sustancias tóxicas en forma similar con el paso del tiempo. Es una característica importante cuando se comparan los resultados de diferentes laboratorios (Henry, 1988). Desventajas: Muchos organismos con ciclo complejo de vida o información insuficiente sobre su cultivo no pueden ser cultivados en el laboratorio. Por lo tanto, la variedad de organismos está limitada cuando se usan los que han sido cultivados en el laboratorio. Los requerimientos de cultivo para organismos acuáticos varían sustancialmente, aún entre especies estrechamente relacionadas. Es necesario conocer el alimento óptimo, la temperatura, el ciclo de luz y el agua a fin de mantener cultivos continuos en el laboratorio. Aunque muchas algas, invertebrados y especies de peces se han usado como organismos para bioensayos, sólo existe información disponible sobre algunas especies, que permiten un cultivo satisfactorio de laboratorio (Henry, 1988). Falta de representatividad a las condiciones y organismos en la comunidad a ser probada. El aspecto negativo de los organismos estándares criados en el laboratorio es que ellos no son necesariamente representativos de la comunidad acuática o de las condiciones de salud de los organismos de cada lugar. Por lo tanto, si el objetivo es estudiar un efluente específico o la descarga a un río o lago, entonces deben considerarse los organismos recolectados en el campo como una alternativa (Henry, 1988).

Organismos recolectados en el campo para bioensayos Según Henry (1988), existen circunstancias en las que los organismos recolectados en el campo son apropiados. Las siguientes son algunas preguntas que necesitan hacerse antes de decidir usar los organismos recolectados directamente del medio.

• ¿Puede recolectarse el organismo directamente del campo? ¿Esto ocurre en poblaciones grandes, monoespecíficas?
• ¿Están los organismos disponibles durante todo el año o sólo durante ciertas estaciones?
• ¿Es el organismo sensible al manejo durante su recolección y transporte al laboratorio?
• ¿Se adaptará el organismo al agua del laboratorio o se necesita un abastecimiento de agua fresca diariamente desde el campo?

Ventajas: Representativo de la comunidad impactada por el efluente. Se puede seleccionar una especie importante en una comunidad específica (Henry, 1988). Las pruebas de microcosmos conteniendo muchas especies pueden prepararse fácilmente. Se pueden desarrollar exámenes con varias especies en la misma cámara de prueba. Los organismos que son compatibles, tales como caracoles, almeja, peces y plantas acuáticas pueden incluirse en la misma cámara de prueba, permitiendo un estudio simultáneo de efectos múltiples (Henry, 1988). Los bioensayos hechos en el laboratorio utilizando organismos recolectados en el campo han sido menos satisfactorios, con muy pocas excepciones. Los organismos recolectados en el campo son más satisfactorios cuando el laboratorio está cerca al lugar de recolección y el abastecimiento de agua desde allí está siempre disponible (Henry, 1988). Desventajas: El estrés y la mortalidad frecuentemente están asociadas con los procedimientos de recolección y transferencia. Muchos organismos pueden morir antes o durante la prueba y otros pueden ser inusualmente sensibles a sustancias tóxicas como resultado de la presión asociada con los procedimientos de recolección y transferencia. Las muertes en los controles pueden invalidar la prueba (Henry, 1988). La disponibilidad de los organismos puede estar limitada. Muchas especies no abundan durante todo el año o tienen varios cambios en su ciclo de vida (Henry, 1988). La edad, salud y condiciones de cultivo de los organismos son desconocidas. No existe manera de obtener organismos "estandarizados" del campo y frecuentemente hasta la edad es desconocida (Henry, 1988). Los invertebrados son un grupo mucho más diverso que las algas o los peces, con diferencias dramáticas en su forma física, sus características históricas de vida y sus requisitos de cultivo (Henry, 1988). Es conveniente el uso del plancton en los bioensayos debido a su pequeño tamaño y porque con ellos es posible realizar muchos ensayos en espacios reducidos. Su ciclo vital es muy corto y se conocen sus necesidades nutricionales. Son buenos para los estudios de bioacumulación, puesto que se ubican en el nivel más bajo de la pirámide trófica (FAO, 1981).

Uso de los cladóceros en los bioensayos Los cladóceros (Figura 1), están dentro de los organismos más utilizados para bioensayos y son el grupo recomendado en el informe de Henry (1988) para representar a los invertebrados. Ventajas: Corto ciclo reproductivo. Los cladóceros son organismos partenogenéticos, es decir, tienen la habilidad de reproducirse sin machos (Figura 2). Esta habilidad simplifica significativamente su uso como organismos para bioensayos porque su período de reproducción es corto y simple (Henry, 1988).

Figura 1.- Vista general de cladóceros, Daphnia pulex. Fuente: Enciclopedia Microsoft Encarta 2001.

Figura 2.- Reproducción partenogenética, hembra Daphnia sp. con huevos partenogenéticos. Fuente: http://www.udec.cl/bioensayos/recursos_biologicos.html

Representante de un eslabón intermedio importante en la cadena alimenticia. El zooplancton, especialmente los "predadores" tales como dáfnidos que se alimentan de algas, es un eslabón importante entre los productores primarios y los peces. Las comunidades acuáticas pueden sufrir un daño significativo por sustancias tóxicas, tales como sulfato de cobre, que son más tóxicas para el zooplancton que para los peces (Henry, 1988). Alta sensibilidad a sustancias tóxicas en el agua. En general, se ha encontrado que los cladóceros son más sensibles que los peces a las sustancias tóxicas (Henry, 1988). Presentan sistema nervioso, lo cual sugiere la presencia de la acetilcolina (Ach), este neurotrasmisor normalmente es hidrolizado por la AChA, la cual es muy sensible a diferentes contaminantes, entre los que se pueden mencionar los metales pesados, detergentes e hidrocarburos policíclicos (Martnez-Tabche et al., 1997). Es capaz de detectar la presencia de, por ejemplo, 0,005 mg. del peligroso mercurio en el agua, y aún menores concentraciones de numerosos pesticidas y residuos industriales (Paggi y de Paggi, 2000). Información extensa sobre técnicas de cultivo. Los dáfnidos, tales como Daphnia magna (Figura 3), Ceriodaphnia sp., han sido usados ampliamente para pruebas de bioensayos y existe considerable información sobre las técnicas de cultivo y la sensibilidad a las sustancias tóxicas. Los requisitos de temperatura, luz y nutrientes están bien definidos (Henry, 1988).

Figura 3.- Vista general de Dahpnia magna. Fuente: http: www.sacsplash.org/critters/ daphnia.htm

Las técnicas de cultivo son relativamente simples. Como con las algas, la necesidad de capacitación en las técnicas de cultivo es relativamente poca, y puede aprenderse frecuentemente de manuales y otra literatura, aunque la capacitación "práctica" por un técnico experimentado es siempre preferible (Henry, 1988). Los requerimientos de cultivo no son prohibitivos. El zooplancton es pequeño y requiere de poca agua comparado con los peces. Los refrigeradores de temperatura regulada tales como los usados para análisis de demanda bioquímica de oxígeno (DBO) pueden usarse para su cultivo y prueba (Henry, 1988). Pruebas de toxicidad crónica o de ciclo de vida pueden hacerse en 1 a 3 semanas. El ciclo de vida de los invertebrados es relativamente corto y se puede monitorear su reproducción dentro de un período corto. Aunque el tiempo para un estudio crónico de invertebrados es mayor que para algas, es considerablemente menor que para peces (Henry, 1988). Se puede usar para pruebas de suelo y sedimento así como para pruebas de agua. Los cladóceros son de libre natación y, por lo tanto, son más apropiados para examinar agua y no sedimentos. Sin embargo, los dáfnidos también han sido usados satisfactoriamente con lixiviados de suelos y sedimentos. La toxicidad del lixiviado se usa entonces para reflejar la toxicidad del suelo o del sedimento (Henry, 1988). Desventajas: Los cladóceros son los organismos preferidos y tienen pocas desventajas comparados con otros organismos (Henry, 1988).

Preparación del material de vidrio Según Rodríguez y Esclapés (1995), toda la vidriería que se utilice en los ensayos y en contacto con los efluentes debe lavarse como sigue:

• Lavar con agua caliente y solución jabonosa
• Enjuagar tres veces con agua de chorro
• Enjuagar tres veces con solución de ácido clorhídrico (HCl) al 10%
• Enjuagar una vez con agua de chorro
• Enjuagar tres veces con acetona
• Enjuagar tres veces con agua desionizada.
• Una vez lavado el material, se debe colocar a secar, boca abajo, sobre material absorbente.

Preparación de las soluciones de exposición En la preparación de soluciones de exposición a partir de efluentes o compuestos puros se debe emplear vidriería volumétrica. En el caso de compuestos puros se prepara una solución madre. Las soluciones de exposiciones deben preparar en secuencia comenzando con la más diluida (Rodríguez y Esclapés, 1995). Mediciones iniciales de oxígeno disuelto (OD), temperatura y pH se deben tomar en una de las réplicas del control y para cada una de las concentraciones. La conductividad se debe tomar en el control y en cada concentración. El objetivo principal de esta medida es asegurar que las soluciones de exposición se prepararon correctamente (Rodríguez y Esclapés, 1995). Todos los reactivos deben tener calidad American Chemical Society (A.C.S.) o al menos un 99% de pureza. Se recomienda la preparación de soluciones madres de 1000 mg/l (Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo, 1998). En los bioensayos con cladóceros las diluciones se realizan con agua sintética dura o moderadamente dura, dependiendo de cual es la especie utilizada (Esclapés, 1999; C.I.I.D., 1998). Un mínimo de 200 ml de muestra se debe recolectar en envases limpios de polietileno o vidrio, en el control y en la concentración más alta, para la determinación de alcalinidad total, conductividad y dureza. Estas determinaciones se deben realizar siguiendo metodología estandarizada (Rodríguez y Esclapés, 1995).

Ensayos preliminares Estos ensayos se utilizan para determinar en forma preliminar, la toxicidad de una sustancia o de los efluentes. Los tratamientos son dos y consisten de un control (se usa agua de la localidad o agua de laboratorio preparada para el cultivo) y efluente sin diluir (100 %). El número de réplicas, densidad de los organismos y procedimientos generales son los mismos empleados en el ensayo definitivo para la especie en cuestión. A excepción de los ensayos con microalgas, la duración de las pruebas preliminares, generalmente es la mitad de la duración de las definitivas. La determinación de oxígeno disuelto, temperatura, alcalinidad, dureza total y conductividad específica se realizan como en el ensayo definitivo (Rodríguez y Esclapés, 1995). Estos ensayos están diseñados para proveer un estimado preliminar de las concentraciones, cuando se desconoce la toxicidad de la muestra a evaluar. Se preparan de cinco a diez diluciones de exposición. En este tipo de ensayo, es suficiente que las concentraciones de las soluciones de exposición sean aproximadas, por lo que se pueden utilizar cilindros graduados para su preparación. Este ensayo permite definir el orden de magnitud del intervalo de las concentraciones entre las cuales se debe realizar el ensayo definitivo (Rodríguez y Esclapés, 1995).

Ensayo definitivo Es un experimento en el cual un grupo de organismos se exponen durante un período de tiempo determinado a una serie de concentraciones de un efluente o un compuesto de interés (Esclapés, 1999). Las soluciones de preparación en un ensayo definitivo son aquellas que contiene una cantidad predeterminada de efluente o compuesto puro, a las cuales se exponen los organismos. Las soluciones de exposición se preparan diluyendo la muestra a evaluar con el agua de dilución apropiada hasta alcanzar las siguientes concentraciones de exposición: (6,25; 12,5; 25; 50 y 100) %. Si se sospecha que el efluente es altamente tóxico o si ocurre una mortalidad significativa en la dilución de 6,25 % durante las primeras horas de prueba, entonces se deben incluir menores concentraciones del tóxico (Esclapés, 1999). En el caso de compuestos puros, el intervalo apropiado de concentraciones se elige en base a un ensayo previo de búsqueda de intervalo de concentraciones. Las concentraciones en este intervalo deben estar separadas entre sí en un orden de magnitud, aproximadamente (Rodríguez y Esclapés, 1995). Se deben consultar protocolos específicos en relación a recipientes o envases de exposición, volúmenes, densidad de individuos, réplicas, duración y condiciones del ensayo, mediciones rutinarias y otros detalles (Rodríguez y Esclapés, 1995). La sobrevivencia de los organismos se registra a los 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, y luego cada 24 h (Esclapés, 1999).

Mantenimiento diario del ensayo Para bioensayos estáticos sin renovación se debe realizar el contaje de organismos vivos en cada réplica de las exposiciones respectivas, medidas de oxígeno disuelto (OD) y temperatura en una réplica del control y de las concentraciones; los organismos muertos se descartan. En ensayos estáticos con renovación o recambio, se mide oxígeno disuelto (OD), temperatura y pH en una réplica del control y de todas las exposiciones, antes y después de la renovación. La conductividad se mide en todas las exposiciones. Se deben tomar muestras del control y de las soluciones de exposición más altas, cada vez que se realice renovación de las soluciones, para determinar dureza total, alcalinidad total y conductividad (Rodríguez y Esclapés, 1995). Si el oxígeno disuelto disminuye por debajo del 40 % de saturación en la solución de exposición, se debe suministrar aireación. Las burbujas de aire se pueden suministrar a las soluciones a través de una pipeta de vidrio empleando una bomba de aire de acuario. La velocidad de burbujeo debe ser mínima, aproximadamente 100 burbujas/minuto son suficientes para mantener niveles de oxígeno disuelto satisfactorio. La aireación de las soluciones de exposición debe ser reportada (Rodríguez y Esclapés, 1995).

Finalización del ensayo Al final de la prueba, se realizan mediciones de oxígeno disuelto, temperatura y pH en una réplica del control y de las concentraciones. Muestras del control y concentraciones baja y alta, se recolectan en botellas de vidrio o polietileno para determinar alcalinidad total, dureza total y conductividad (Rodríguez y Esclapés, 1995).

Análisis de datos provenientes de bioensayos agudos La mediana o cuantil 50% es el principal estadístico utilizado en pruebas de toxicidad aguda, la cual es representada como la concentración letal media (CL50). La escogencia de este se debe a que suele estar asociado a una menor varianza que la proporcionada por cualquier otro cuantil (Gelber et al., 1985). El programa de Stephan (1977) realiza el cálculo directo de dicho estadístico mediante cuatro diferentes métodos y proporciona, además, un estimado de los límites de confianza al 95 % (excepto para el método binomial, el cual indica los correspondientes valores utilizados en la interpolación). Los métodos utilizados por el programa son los siguientes: Moving Average, Probit, Logit y Binomial (Rodríguez y Esclapés, 1995). El método Moving Average se basa en una interpolación numérica de las concentraciones utilizadas y los resultados de mortandad obtenidos para cada concentración. El método también genera un estimado CL50 y sus correspondientes límites de confianza al 95 %. Debido a que su cálculo se genera por interpolación, se dificulta mucho lograr estimados de otros cuantiles con precisión, puesto que la variabilidad en torno a la mediana pierde simetría, por lo que solo se puede utilizar para estimar el cuantil 50 % (Rodríguez y Esclapés, 1995). El método Probit, es un método paramétrico basado en una transformación probit de los datos según la ecuación: P = @ (A + B) (1) Donde: P = probabilidad de muerte de los organismos expuestos a la concentración X @ = distribución normal estándar A Y B = parámetros desconocidos definidos por la relación "concentración-mortandad"

La transformación probit resulta en un ajuste que logra normalizar los datos, generando una curva sigmoidal que al ser sometida a una transformación logarítmica, logra una linealización de la misma (Rodríguez y Esclapés, 1995). El método Logit o Logístico, al igual que el Probit, corresponde a un modelo paramétrico que resulta en una función sigmoidal. El programa de Stephan (1977) proporciona resultados correspondientes a la CL50, limites de confianza al 95 % y además, indica la ecuación de regresión, producto de un análisis de mínimos cuadrados aplicados a los datos transformados por una función logarítmica. Como todo método paramétrico, existen una serie de restricciones (principalmente normalidad), que dificultan su aplicación en numerosas distribuciones de datos (Rodríguez y Esclapés, 1995). El método Binomial es aplicable a distribuciones de datos cuyo ajuste es un modelo binomial. Dichas distribuciones, en ensayos de toxicidad, se producen cuando no existen mortandades parciales, sino una serie de concentraciones bajas con un 0 % de mortandad y en el resto de las concentraciones más altas, una mortandad total 100 %. La CL50 resultante, viene siendo la media aritmética entre la máxima concentración que produzca 0 % de mortandad y la mínima concentración que logra una mortandad del 100 %. En estos casos de "todo o nada", los modelos anteriores no pueden ser utilizados, pues los datos dejan de ajustarse a los requisitos de los mismos. Ello hace que este método, a pesar de ser de gran imprecisión en la mayoría de los casos, sea de una enorme utilidad, puesto que muchas sustancia tóxicas (como en el caso de ciertos pesticidas), poseen límites umbrales muy irregulares, lo cual hace prácticamente imposible el logro de mortandades parciales (Rodríguez y Esclapés, 1995). La ventaja de un programa como el de Stephan (1977), en el cual se incorporan varios métodos de cálculo de CL50, radica en tener disponibles varias opciones que permitirán escoger la que mejor se ajuste a la distribución de datos obtenidos de un bioensayo en particular. Esto reduce considerablemente el tedioso proceso de repetir N veces el bioensayo hasta lograr el ajuste deseado (Rodríguez y Esclapés, 1995). Existen otros métodos para el cálculo de la CL50 resultante. El más popular de ellos es el método gráfico de Litchfield y Wilcoxon (1949), utilizado en aquellos casos en donde se carezca de apoyo computacional. También se puede nombrar el método no-paramétrico de Spearman-Kraber (S-K), el cual ofrece razonable precisión sin que los datos estén sujetos a restricciones de modelo, logrando obtener un valor de CL50 cuando al menos existe una concentración por encima de una mortalidad del 50 % y otra por debajo (Rodríguez y Esclapés, 1995).