Descripción de un protocolo estandarizado de toxicidad aguda para cladóceros (página 2)

4. Bioensayos de toxicidad aguda con cladóceros

Las especies recomendadas por Rodríguez y Esclapés (1995) y Esclapés (1999) son Moina macrocopa (Figura 4), Daphnia magna y Daphnia pulex (Figura 5); mientras C.I.I.D. (1998) recomienda Daphnia magna; la Environmental Protection Agency (E.P.A., 1985) y la American Public Health Association (A.P.H.A., 1989) aceptan Daphnia magna y Daphnia pulex.

Preparación de Medio de Cultivo: Solución madre de KCl:

• Colocar 8 g de KCl (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l
• Aforar a 1 l con agua destilada
• Almacenar en botellas de polietileno de 1 l (Esclapés, 1999).

Solución madre de MgSO4:

• Colocar 120 g de MgSO4 anhidro (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l
• Aforar a 1 l con agua destilada
• Almacenar en botellas de polietileno de 1 l (Esclapés, 1999).

Solución madre de NaHCO3:

• Colocar 96 g de NaHCO3 (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l
• Aforar a 1 l con agua destilada

Figura 4.- Vista general de Moina macrocopa.

Fuente: http://www-public.tu-bs.de:8080/~y0008601/leben.html

Fuente: http: www.cellsalive.com/ cards/daphn_th.gif

• Almacenar en botellas de polietileno de 1 l (Esclapés, 1999).

Agua sintética dura (160-180 mg/l CaCO3): cultivos de Daphnia magna y Moina macrocopa:

• Añadir 18,2 l de agua destilada en un envase plástico limpio de 20 l
• Adicionar 2,4 g de CaSO4.2H2O a 1 l de agua destilada, contenida en un vaso precipitado de 2 l, revolver hasta disolver por completo el soluto. Transferir la solución al envase de 20 l donde se mezclará con el agua contenida en el recipiente mencionado (Esclapés, 1999).
• Adicionalmente agregar al envase de 20 l las soluciones madres en los siguientes volúmenes:
• • 20 ml de KCl
  • 20 ml de MgSO4
  • 40 ml de NaHCO3 (Esclapés, 1999).

Suministrar aireación durante más de 2 horas antes de su utilización. El pH inicial del medio será aproximadamente de 8,0 y durante el cultivo podrá variar entre 7,0 – 8,6, entre cuyo intervalo no se requiere ajuste (Esclapés, 1999). Agua sintética moderadamente dura (80-90 mg/l CaCO3): cultivos de Daphnia pulex: Se diluye el medio duro antes descrito a la mitad, empleando agua destilada (Esclapés, 1999). Preparación de Medio de Cultivo para Microalgas: Solución madre 1: Disolver en 500 ml de agua destilada: MgCl2.6H2O 6,08 g CaCl2.2H2O 2,20 g H3BO3 92,80 mg MnCl2.4H2O 208 mg ZnCl2 1,64 mg (pesar 164 mg, diluir en 100 ml de agua destilada y añadir 1 ml en solución madre) FeCl3.6H2O 79,90 mg CoCl2.6H2O 0,714 mg (pesar 7,14 mg, diluir en 100 ml de agua destilada y añadir en solución madre) Na2MoO4.2H2O 3,63 mg (pesar 36,6 mg, diluir en 10 ml de agua destilada y añadir 1 ml en solución madre) CuCl2.6H2O 0,714 mg (pesar 60 mg, diluir en 1 l de agua destilada. tomar 1 ml y diluir en 10 ml de agua destilada. Añadir 1 ml de la última dilución en solución madre) (Esclapés, 1999).

Solución madre 2: Disolver en 500 ml de agua destilada: NaNO3 12,75 g (Esclapés, 1999).

Solución madre 3: Disolver en 500 ml de agua destilada: MgSO4.7H2O 7,35 g (Esclapés, 1999).

Solución madre 4: Disolver en 500 ml de agua destilada: K2HPO4 0,522 g (Esclapés, 1999).

Solución madre 5: Disolver en 500 ml de agua destilada: NaHCO3 7,50 g (Esclapés, 1999).

Medio de cultivo Añadir 1 ml de cada solución madre en 900 ml de agua destilada. Se debe mezclar después de agregar cada solución. Aforar hasta 1 l, mezclar bien y ajustar el pH a 7,5 ± 0,1; utilizando 0,1 N de ácido clorhídrico o de hidróxido de sodio, como se requiera. Luego se debe filtrar a través de una membrana de 0,45 µm de diámetro de poro, utilizando un vacío máximo de 380 mm de mercurio o una presión no mayor de 1,5 atmósferas (8 psi). Previamente el filtro debe ser lavado con 500 ml de agua destilada. Si la filtración se realiza con equipo estéril, el medio filtrado se puede colocar directamente en los envases de cultivo estériles, de lo contrario puede esterilizarse en un autoclave pero el pH debe ser verificado (Esclapés, 1999).

Cultivo y Mantenimiento: Los cladóceros se colocan en vasos precipitados de 3 l de capacidad en un número de aproximadamente 40 organismos/2 l de medio de cultivo. Aproximadamente, un 80 % de medio de cultivo se debe sustituir semanalmente por medio previamente aireado. Los organismos se alimentan cada dos días con un concentrado mixto de microalgas (Figura 6) (Selenastrum capricornutum, Ankistrodesmus sp., Chlorella sp. y fitoflagelados) con una concentración aproximada de 4×108 cel/ml (Esclapés, 1999). Diariamente se debe realizar una limpieza del acuario, retirando las mudas producidas (C.I.I.D., 1998). El Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo (1998) recomienda alimentar los cladóceros diariamente con un cultivo de Selenastrum capricornutum, a un volumen calculado con la siguiente formula: V = (AxB)/C (2)

Donde: V = volumen del concentrado algal A = número de cladóceros por acuario B = dosis recomendada (1,5 x 106 células por cladócero/día) C = concentración de la solución algal (número de células/ml) Fuente: http://www.protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Selenastrum/

Preparación y Manipulación de los Organismos: El día anterior a las pruebas, se separan las hembras que posean embriones en avanzado estado de desarrollo y se coloca cada hembra en un envase de vidrio de 15 ml de capacidad con 10 ml de medio de cultivo. Los neonatos se separan con una pipeta Pasteur y se transfirieren a los envases de exposición, comenzando por el control y terminando con las concentraciones más altas. Se debe tener cuidado en el proceso transferencia de no añadir demasiado medio de cultivo para no alterar las concentraciones. Cada envase se cubre con papel plástico transparente (Esclapés, 1999).

Condiciones Durante el Bioensayo La Tabla 3 describe las condiciones necesarias y óptimas requeridas durante la realización de bioensayos de toxicidad aguda que utilicen cladóceros como organismos de prueba. El C.I.I.D. (1998) recomienda una intensidad lumínica de ± 800 lux, un fotoperíodo de 16:8 h luz:oscuridad, temperatura de 21 ± 2 ºC y la confirmación de los individuos muertos mediante la observación de la suspensión de latido del corazón con un microscopio estereoscópico.

Tabla 3.- Condiciones necesarias durante un bioensayo de toxicidad aguda con cladóceros.

(Esclapés, 1999).

5. Conclusiones y Recomendaciones

• Las actividades humanas producen desechos los cuales son eliminados a los ecosistemas sin un debido tratamiento, generando alteraciones a los equilibrios presentes y afectando de manera negativa a las especies más sensibles que allí habitan, llegando incluso a ocasionar su extinción.
• Los bioensayos permiten conocer el efecto que producen las sustancias químicas sobre los organismos vivos.
• Las especies de mayor importancia para los bioensayos son las más sensibles ya que establecen las concentraciones máximas permisibles para las descargas al medio, sin que se produzca un daño irremediable al ambiente.
• Las primeras etapas de los ciclos de vida de los organismos son generalmente las más sensibles a la presencia de sustancias tóxicas y por ende las más utilizadas en los bioensayos.
• Los organismos estandarizados provenientes de laboratorios son los más utilizados en los bioensayos ya que se conoce su biología, son de fácil cultivo, de gran disponibilidad, acondicionados al laboratorio, de mayor respuesta y los resultados obtenidos pueden ser comparados con los de otras experiencias.
• Los invertebrados son los organismos universalmente usados en los bioensayos debido a su pequeño tamaño, corto ciclo de vida, fácil cultivo, alta sensibilidad por ocupar los primeros eslabones de la trama trófica.
• Los cladóceros son ampliamente recomendados en los bioensayos por presentar todas las características necesarias.
• Una de las principales ventajas de los bioensayos con protocolos estandarizados es que permite su reproducción en cualquier lugar y tiempo, generando mayor importancia a las hipótesis y conclusiones alcanzadas.

Recomendaciones

• Al realizar bioensayos es recomendable seleccionar las especies más sensibles y en etapas juveniles ya que estos son los individuos más afectados al momento de la introducción de sustancias antropogénicas al medio.
• Todas las sustancias químicas que son liberadas al medio provenientes de actividades humanas deberían estar reguladas por leyes que utilicen los datos resultantes de los bioensayos.
• Si se desea solo evaluar la afectación de una zona y un problema en particular se debe elaborar un bioensayo con especies presentes en ese medio y con los elementos más similares al sitio afectado, ya que las respuestas en los ecosistemas no son siempre iguales.

6. Bibliografía

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Resumen Los bioensayos o pruebas de toxicidad son experimentos que miden el efecto de uno o más contaminantes en una o más especies. Se clasifican en: ensayos de respuesta directa, representados por los bioensayos de toxicidad, y ensayos de respuesta indirecta formado por ensayos organolépticos y ensayos de bioestimulación. Pueden realizarse en el laboratorio bajo condiciones controladas o en el campo directamente en el medio natural. En un estudio ambiental específico de una localidad es necesario realizar conjuntamente con los ensayos toxicológicos una caracterización físico-química del medio. Cuando varias sustancias químicas se encuentran presentes en un cuerpo de agua, la interacción toxicológica entre estas sustancias puede invalidar los datos de toxicidad de las sustancias aisladas. Los organismos óptimos para los bioensayos deben ser representativos del ambiente estudiado, con amplia distribución, de gran disponibilidad, tamaño manejable, fácil cultivo y muy sensibles; los organismos cultivados en laboratorios presentan mayores ventajas que los colectados en el campo. Los cladóceros se encuentran entre los organismos más utilizados para los bioensayos ya que cumplen con las características requeridas. Todo el material a utilizar en las pruebas debe ser tratado de manera especial. Las diluciones de las sustancias evaluadas se preparan a partir de una solución madre con vidriera volumétrica. Si se desconoce la toxicidad de la sustancia es necesario realizar pruebas preliminares de tanteo para determinar las concentraciones que serán utilizadas en el ensayo definitivo. Durante el bioensayo es necesario evaluar el oxígeno y el pH, siendo todas las condiciones controladas. El programa computarizado de Stephan (1977) realiza el cálculo estadístico de los resultados mediante cuatro diferentes medios, calculando el CL50. Los bioensayos de toxicidad aguda con cladóceros se encuentran entre los más utilizados a nivel mundial, generalmente con Daphnia. Para su mantenimiento es necesario la preparación de medio de cultivo duro (160-180 mg/l CaCO3 para Daphnia magna y Moina macrocopa, y 80-90 mg/l CaCO3 para Daphnia pulex) y de un medio para microalgas que son su alimento.

Autor:

César Augusto Mac-Quhae.