Brucelosis en leche de búfala (página 2)

En la mayoría de los Municipios del Estado Portuguesa existen fincas dedicadas a la explotación bufalina. Según información oficial del Servicio Autónomo de Sanidad Animal (SASA), la mayor concentración de estas es en el Municipio Guanarito. Es el caso que en dicho Municipio existen varias unidades de producción de leche de búfala dedicadas a la elaboración de quesos producidos artesanalmente, por lo tanto este método de producción no garantiza la higiene y una buena calidad del alimento en cuanto a su composición. Esto se debe al desconocimiento del personal que labora con este producto, en cuanto a los parámetros que se deben aplicar para obtener un producto terminado de calidad.

Esta situación puede llevar a que el alimento pueda causar problemas de salud al consumidor, al no contar con las condiciones que favorezcan su conservación, contenido alimenticio, y por otro lado no se cumplan con las características organolépticas deseables, además de existir la posible presencia de brucelosis. De tal manera que es necesario determinar la presencia de Brucellas en la leche de búfala producidos en dichas fincas, con la finalidad de determinar la calidad de la misma y que los consumidores con esta información formen criterios para la adquisición de leche de búfala producidos artesanalmente.

A partir de esta situación se establecen las siguientes interrogantes:

¿Cuántas fincas en Guanarito son utilizadas en la explotación del búfalo y a su vez utilizan la leche para la elaboración de queso?

¿Cual es la producción de leche de búfala producida en fincas ubicadas en el municipio Guanarito, Estado Portuguesa?

¿Existe la presencia de Brucellas en la leche de búfala producida en fincas ubicadas en el municipio Guanarito, Estado Portuguesa?

Objetivos de la investigación

Objetivo General

Determinar la presencia de brucelas (Brucellas abortus) en leche de búfala producida en fincas ubicadas en el municipio Guanarito, Estado Portuguesa.

Objetivos Específicos

Cuantificar la cantidad de fincas que utilizan a las búfalas para el ordeño y producción de queso.

Determinar la producción de leche de búfala en fincas ubicadas en el municipio Guanarito, Estado Portuguesa.

Determinar la presencia de Brucellas en la leche de búfala en fincas productoras ubicadas en el municipio Guanarito, Estado Portuguesa, mediante análisis bioquímicos y serológicos.

Justificación de la investigación

Esta investigación proporcionara conocimientos acerca de los parámetros de calidad con respecto a brucelosis en leche de búfala producida en fincas de Guanarito, estado Portuguesa , la cual es obtenida de manera artesanal, lo cual no garantiza que el productor controle estos parámetros para que la producción sea de forma adecuada según las normas de calidad e higiene (COVENIN).

Los resultados obtenidos en este estudio permitirán tomar decisiones respecto a las mejoras o correctivos durante el proceso de producción de leche, y en los cambios que deben realizar los productores en sus fincas para aumentar la calidad de dicho producto.

Esta investigación beneficiará a todos los consumidores de leche de búfala producida en dichas fincas, ya que contaran con información sobre el cumplimiento de los parámetros en la producción de leche, para la decisión a la hora de su adquisición.

Este trabajo igualmente se justifica, ya que se aplicaran teorías y conceptos de microbiología, bio-química, características físicas, principios y normas para la producción de leche, los cuales serán contrastados con la realidad que se presenta en los diversos sitios donde se produce dicho producto. Por otro lado, se aplicarán las técnicas, procedimientos, y sus resultados podrán servir de referencia a estudios similares en toda la geografía regional y nacional, además de incentivar a los ganaderos a realizar este tipo de análisis (determinación de Brucellas) para conocer la calidad de la leche producida y garantizar dicho producto como apto para consumo directo y/o posterior procesamiento, como por ejemplo el queso.

Alcance de la Investigación

En la presente investigación se pretende adquirir información, en lo que respecta a la determinación de Brucellas en leche de búfala producida en fincas del Municipio Guanarito del Estado Portuguesa, para ello, se deben abordar una serie de recomendaciones tratando de solventar la problemática existente.

Se realizaran análisis bioquímicos y serológicos que determinarán la presencia de Brucellas en leche de búfala, la cual puede deteriorar el alimento y ocasionar daños a los consumidores y contaminación mediante la manipulación o consumo del producto elaborado.

Viabilidad de la investigación

Factibilidad operativa: desde este punto de vista este proyecto es factible ya que los realizaran en el laboratorio El Carrao ubicado en Guanarito, porque cuenta con los equipos necesarios para efectuar los análisis requeridos

Factibilidad técnica: si es factible, ya que se cuenta con el personal capacitado y con experiencia en este tipo de estudio, para la realización de los análisis requeridos.

Factibilidad económica: económicamente es factible, ya que contamos con los recursos económicos para cubrir los costos necesarios para realizar los diferentes análisis.

FASE DE EJECUCIÓN

CAPÍTULO II: MARCO REFERENCIAL

Bases Teóricas

En términos generales se puede afirmar que el búfalo es un animal de gran tamaño, de contextura maciza, lo cual lo hace un buen productor de carne, además de que sus características genéticas lo convierten también en un excelente productor de leche.

Según COVENIN 903(3), la leche es definida como: "El producto integro normal fresco obtenido del ordeño higiénico e ininterrumpido de vacas sanas".

En este orden de ideas, Brinez (2000), define la leche como un líquido complejo segregado por las glándulas mamarias de las hembras mamíferas para alimentar a sus crías, que contiene muchos elementos en diferentes estados de dispersión.

De igual manera, Veisseyre (1983), señala que "La leche es un líquido blanco opaco, dos veces más viscoso que el agua, de sabor ligeramente azucarado y de olor poco acentuado".

Así mismo, D’ Elia (1994), hace referencia a 4 aspectos muy importantes en la leche de búfala:

1. Composición físico-química de la leche de búfala: la leche de búfala presenta características físico-químicas y organolépticas muy propias. Su sabor es levemente endulzado y tiene un color blanco azulado. Esto se justifica por la ausencia de betacaroteno, el búfalo es capaz de metabolizar este pigmento en vitamina A. Por su alto contenido de cationes la leche de búfala presenta baja elasticidad al calor y una alta tensión de la cuajada, además de un alto contenido de sólidos totales. El coagulado de la leche es más rápido y la estabilidad a temperaturas elevadas son menores que la de vaca.

2. pH: debe estar comprendido entre 6.25 – 7 y 6.30 – 6.85. La densidad y glóbulos de grasa son más grandes, además presentan una temperatura de fusión más elevada a pesar de tener mayor contenido de sólidos grasos. Los contenidos de fosfolípidos y de colesterol de la leche bufalina son más bajos que los de la vaca.

3. características microbiológicas: esta leche tiene la propiedad de inhibir el crecimiento bacteriano, hecho atribuido al elevado contenido de lecitina y la presencia de cantidades variables de glicoproteína, conocido como lactoferrina (0.320 mg/ml). La actividad antimicrobiana ha sido demostrada sobre coniformes, Bacillus thermophillus y Sthaphylococcus aureus, inhibiendo el desarrollo de bacterias que requieren hierro.

4. características nutricionales: por su composición esta leche es considerada de alto valor energético, 90 kcal/100 g en comparación a las 60-70kcal/100 g de la leche de vaca, justificado por las cantidades mayores de las proteínas del suero, la presencia de ácidos grasos polinsaturados como el tetraendico, las cantidades de calcio (hasta 190mg/100g), magnesio soluble y fósforo inorgánico (hasta 134mg/100g). el valor de colesterol se ha reportado en 214mg/100g.

Por otra parte, este mismo autor señala que la leche de búfala puede ser utilizada para la elaboración de una extensa variedad de alimentos, tales como: mantequilla, aceite de manteca, quesos duros y blandos, leche evaporada, condensada, descremada, helados, crema de leche, yogurt, entre otros.

Laxminaraya y col. (1968), presenta el siguiente cuadro representa algunas características físicas de la leche de búfala.

CUADRO 1: Representación de las características físico-químicas de la leche de búfala en comparación con la leche de vaca.

Fuente: Laxminaraya y col., 1968.

Por otra parte, Dimov (1947) presenta el siguiente cuadro que muestra las propiedades y composición de la leche de búfala.

CUADRO 2: propiedades y composición de la leche de búfala.

Fuente: Dimov, 1947.

Según Shumen y col. (1960) una valiosa propiedad de la leche de búfala radica en que durante las estaciones de invierno y primavera, el contenido mínimo de Vitamina A es varias veces superior al de la leche de vaca. Dicho autores determinaron el siguiente contenido promedio de Vitamina A (mg. /lt) en leche de búfala y de vaca los cuales se presentan a continuación:

CUADRO 3: Promedio de Vitamina A en leche de búfala y vaca.

Fuente: Shumen y col., 1960.

En otro sentido, la brucelosis es una enfermedad que ha venido tomando relevante importancia en Venezuela y otros países, ya que es un factor que provoca pérdidas económicas y problemas de salubridad en la sociedad. Dicha enfermedad es transmitida por un microorganismo del género Brucellas, que suelen transmitirse al hombre habitualmente a partir de los animales domésticos.

Este término se adoptó en honor del medico Ingles David Bruce, quién aisló por primera vez el microorganismo en 1887.

Los caracteres fisiopatológicos de la Brucelosis no han sido estudiados completamente, sin embargo los podemos resumir de la siguiente manera:

• Después de la infección inicial la bacteria prolongada puede extenderse por un par de años, luego se hace intermitente.
• La bacteria es trasmitida principalmente durante el tiempo del aborto – Tejido placentario abortado y las descargas vaginales pueden contener hasta 1010 organismos por mil- La diseminación a través de esta ruta puede continuar por semanas después del aborto.
• La infección ocurre generalmente por vía oral.
• La transmisión también ocurre a través del apareamiento sexual entre una vaca infectada y un toro sano y viceversa.
• Los machos usualmente almacenan la bacteria en el epidídimo y en la próstata. Suelen ocurrir evacuaciones intermitentes hasta un período aproximado de 15 meses.
• La transmisión coital se ha demostrado experimentalmente cuando vacas no infectada han sido servidas por un toro infectado.
• La secreción de la glándula mamaria de vacas infectadas que han abortado contiene abundantes bacterias.
• Lesiones como epididimitis, orquitis e infertilidad son aspectos importantes de la enfermedad en los machos. El examen del líquido seminal es primordial para establecer un diagnóstico de brucelosis en el semental.
• Se han reportado alteraciones posteriores a la infección en exámenes seminales ( 30 – 80 % formas normales) entre ella:

1. Colas dobladas
2. Pieza media edematosa
3. Colas dobles
4. Cabezas sueltas
5. Vacuolas protoplasmáticas.

• En etapas más avanzadas se observan cambios más acentuados tales como:

1. Más de 90 % de las células espermáticas son anormales.
2. Motilidad reducida.
3. Los neutrofilos y los monocitos son comunes en el eyaculado.
4. Las células espermáticas pueden mostrar aglutinación cabeza con cabeza y se pueden detectar las espermo-aglutininas (1 gG) por largo tiempo (1 año aproximadamente).

PATOGÉNESIS

El microorganismo no tiene una entrada definida, sin embargo, cualquiera que sea la puerta de entrada, los sucesos a ocurrir después son similares en el bovino. Es factible que la puerta de entrada sea múltiple simultáneamente. Una vez que el microorganismo atraviesa las barreras corporales se ubica en el área por un período de dos semanas, desde donde pasa a través de una migración lenta hacia los capilares linfáticos, donde se establece el primer contacto con el aparato inmunológico quién reconoce a la Brucela como antígeno. Una vez que se ha formado el complejo antígeno-anticuerpo se desencadena el proceso de atracción de las células fagocitarias principalmente los polimorfonucleares (Neutrofilos).

Los polimorfonucleares (PMN) van a fagocitar en forma simple a las bacterias invasoras pero con la particularidad de no destruirlas, por lo que estos microorganismos permanecen intactos dentro del neutrofilo donde llegan a reproducirse. De esta forma, a pesar de que se ha comenzado a desencadenar la reacción inmunológica el agente invasor no puede ser destruido por encontrarse intracelularmente. Los PMN infectados pasan a la circulación sanguínea donde se distribuyen a todos los órganos de la economía animal. Al cabo de cuatro semanas se puede localizar y aislar organismos de Brucela en cualquier parte del cuerpo. Como consecuencia de la muerte del PMN las bacterias son liberadas de nuevo en el torrente sanguíneo donde quedan expuestas a la acción de un aparato inmunológico ya prevenido quién se arma de las bacteriolisinas y el complemento del plasma para destruir parte de las bacterias mientras que otras son fagocitadas por células leucocitarias y destruidas. Parte de estas células están representadas por histocitos y monocitos propios de cada tejido. Ahora bien, esta capacidad de destruir las bacterias esta en cierta forma supeditada al alto grado del nivel de sensibilización de estos monocitos hacia la Brucela. En los casos de animales que sufren de primoinfección la capacidad de fagocitosis en los monocitos es menor que en aquellos animales cuyos monocitos han sido previamente sensibilizados a la Brucella en donde se ha observado una fagocitosis extraordinariamente eficiente. Este fenómeno es de gran importancia ya que revela que el proceso inmunitario más importante en esta enfermedad es el celular, más que el humoral.

La bacteremia que perdura por largo tiempo, se presenta con mayor incidencia durante el primer parto y se asocia con abortos, y partos de becerros pequeños. Esta demostrado que esta bacteremia es previa al desarrollo de títulos detectables de anticuerpos sericos o la presencia de manifestaciones clínicas. Las lesiones más comunes se observan en el bazo, genitales y glándulas mamarias. En esta última desarrolla una mastitis intersticial crónica, la cual no determina cuadros clínicos pero si aumenta el número de células somáticas en la leche lo cual representa un signo de mastitis subclínica.

El microorganismo tiene especial atracción por los órganos genitales donde se ubica en el espacio uterocorionico de una hembra bovina condenada al aborto. Muchos de los microorganismos están incluidos en el protoplasma de la célula epitelial. Se ha demostrado que estas células se han derivado de la envoltura externa fetal (El corion), esta membrana presenta áreas engrosadas, no translúcidas y edematosas debido a la multiplicación de este organismo.

Aparentemente el microorganismo induce una inflamación de la membrana lo cual interfiere con la circulación del feto lo que explica él porque el aborto ocurre. El feto usualmente muestra una condición edematosa lo que respalda la teoría de un disturbio circulatorio. La Brucella también puede ser encontrada en cultivos puros en el tracto gastrointestinal y los pulmones del feto, lo cual sugiere que la vía de entrada, es la oral al tragar el líquido amniótico y no a través de la vía sanguínea. Después del parto de los tipos vacúnales que tienden a ser estables después de cierto tiempo de la inoculación. Las muestras se toman con veinte días de separación.

El aborto epizoótico bovino es una enfermedad que se caracteriza por presentar aborto en la última parte de la gestación. El agente causal es la Chilamydia psittaci la cual produce una reacción febril en las vacas susceptibles. Después de un período latente en el cual este microorganismo se propaga en el feto se produce el aborto. Las novillas son las más afectadas y la incidencia de abortos es alrededor de un 60 %. Los infectados tienen el tamaño de neonato ó termino y pueden morir durante el parto o poco después; algunos suelen sobrevivir. El aborto ocurre en forma silenciosa y generalmente hay retención de placenta. El feto presenta edema subcutáneo generalizado con hemorragias en la conjuntiva y base de la lengua. El abdomen se halla marcadamente distendido a causa del acumulo de líquido sanguinolento el hígado del feto esta agrandado y de color pálido o anaranjado con la superficie granular y friable. Para el diagnóstico se debe aislar e identificar C. psittaci .

La enfermedad se conoce en el país desde el año 1930 pero no fue sino hasta el año 1968 cuando el Ministerio de Agricultura y Cría (MAC), a través de la Dirección de Ganadería, publica la Resolución para la campaña nacional de control de la brucelosis que aun continúa en vigencia (MAC, 1987). Hoy en día, el organismo que regula la materia sanitaria animal es el Servicio Autónomo de Sanidad Animal (SASA), y está encargado de velar por el cumplimiento de las normas establecidas en esta resolución, así como promover nuevas medidas de control tendientes a controlar y erradicar la enfermedad.

Debido a la alta producción y calidad de la leche de búfala en el estado Portuguesa es necesario determinar la presencia de Brucellas en dicho producto ya que este es utilizado en su mayoría para la elaboración de queso, el cual no cumple con los requisitos mínimos exigidos por los organismos encargados de velar por la salud pública (SASA).

En el hombre la Brucelosis es capaz de afectar seriamente su salud y minar significativamente su capacidad de trabajo. En los animales ocasionan pérdidas económicas importantes en abortos, crías débiles y en la producción de leche y carne.

DESCRIPCIÓN DE LA ENFERMEDAD EN EL HOMBRE

Es una enfermedad de principio brusco e insidioso que se caracteriza por la presencia de fiebre continua, intermitente o irregular, cefalalgia, sudores, escalofríos y dolores generalizados. Puede ser de curso agudo o crónico. Otros síntomas frecuentes son constipación, anorexia, astenia y dolores generalizados.

Las adenopatías ocurren muchas veces y se puede presentar esplenomegalia (inflamación del bazo). En la brucelosis crónica el paciente muestra irritación, nerviosismo y depresión. La enfermedad puede durar días, meses y a veces, varios años, aunque la recuperación es bastante frecuente.

MODO DE TRANSMISIÓN.

La transmisión de la brucelosis al humano está relacionada con el consumo de leche o subproductos lácteos sin pasteurizar, así como a través del contacto directo con animales infectados, sus productos y secreciones. Algunas décadas atrás, la transmisión al hombre mediante el consumo de leche cruda era epidemiológicamente importante, pero actualmente con la adopción generalizada de sistemas pasteurizados, a la brucelosis ha disminuido notoriamente en al población general y es mayormente una enfermedad ocupacional de veterinarios, ganaderos, matarifes, carniceros, obreros de fincas y otras personas que mantienen contacto con animales o sus productos.

La infección se contrae al manipular fetos y envolturas fetales o al entrar en contacto con secreciones vaginales, excrementos y canales de animales infectados. La entrada del germen por al piel y las mucosas es importante.

DIAGNÓSTICO.

En el hombre el diagnóstico debe basarse en la clínica que presenta el paciente, los antecedentes epidemiológicos y las pruebas de laboratorio. El aislamiento de la brucela a partir de la sangre o médula es lo recomendable. Se puede usar también líquido cefalorraquideo, material de ganglios y de abscesos.

Las pruebas serológicas son también muy útiles. Un título de 100 Unidades Internacionales (U.I.) o más en las pruebas de seroglutinación rápida o lenta, y títulos crecientes en pruebas repetidas indican una base para el diagnóstico.

Otras pruebas serológicas en humanos incluye la fijación del complemento, la prueba de Coombs, y la de 2-mercaptoetanol.

SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA.

Los niños y las personas jóvenes son menos susceptibles que los adultos al presentar la enfermedad. También se ha comprobado que la prevalencia de brucelosis es menor en las mujeres que en los hombres, aunque esto se podría explicar por razones de mayor exposición al riesgo. En algunos mataderos se ha comprobado que los obreros serológicamente negativos y con poco tiempo de empleo se infectan más rápidamente.

TRATAMIENTO

En el hombre se han usado sulfas y varios antibióticos, tales como la penicilina, el cloramfenicol, la erictomicina, la novobicina, etc. siendo la asociación de estreptomicina (vía intramuscular) y la tetraciclina (vía oral) la que ha proporcionado los mejores resultados.

CONTROL DE ENFERMEDAD EN EL HOMBRE.

Por ser la brucelosis una enfermedad que raramente se transmite de persona a persona y son los animales domésticos sus principales reservorios, el control debe dirigirse a la eliminación de la misma en dichos reservorios, con medidas como la vacunación de las terneras con Cepa 19, la eliminación o segregación de reaccionantes y la pasteurización de leche y productos lácteos.

Ha sido demostrado completamente que al disminuir la infección en los animales, se reduce de la misma forma, la enfermedad en el hombre.

Prevención y control:

La brucelosis es principalmente una enfermedad de animales domésticos y salvajes, siendo el hombre solo accidentalmente infectado con una infección terminal que no se trasmite a otros. Por lo antes dicho, el control de la enfermedad humana depende de eliminación del riesgo de que se extienda la enfermedad desde los animales al hombre.

El riesgo de la infección a través de la ingesta de quesos, leche y otros productos lácteos, puede controlarse mediante la esterilización o pasteurización de utensilios de la leche.

Antecedentes

Hurtado y col. (2005) publicaron un estudio sobre Determinación de los parámetros físico-químicos de la leche bufalina en un sistema de producción orgánica.

El objetivo de la investigación fue el de evaluar el efecto del mes y año sobre los parámetros físico-químicos de la leche de búfala en un sistema de producción orgánica del Magdalena medio colombiano.

Fueron analizados un total de 210 muestras de leche bufalina, colectadas durante 4 años (2000-2003), con un promedio de 4 muestras mensuales. Se realizaron análisis de varianza para las constituyentes de leche bufalina. Los porcentajes de grasa variaron entre 6.65 a 7.36%, sólidos no grasos entre 9.57 a 10.75% y sólidos totales entre 16.17 a 17.66%, punto criogénico entre -0.549 a -0.529, y densidad entre 1.0339 a 1.0351. Todo esto confirmó que los componentes físico-químicos varían a lo argo del año.

Méndez y col. (2002) publicaron un estudio sobre Brote de brucelosis debido al consumo de queso de cabra fresco sin higienizar en Andalucía (España), enero a marzo de 2002. El objetivo fue identificar el vehículo y el origen de la infección, describir las circunstancias del brote y establecer medidas de control.

En primer lugar, se estableció una búsqueda activa de casos mediante entrevista a todos los médicos generales de los centros de salud de las zonas afectadas, se estableció un protocolo para identificar casos asintomáticos en personas expuestas a casos sospechosos, se llevó a cabo un estudio descriptivo inicial, se diseñó un estudio de casos y controles en base a los resultados preliminares.

El aislamiento de brucella del mismo serotipo en todas las muestras y el hecho de no producirse más casos tras agotarse el lote implicado de quesos sin higienizar, evidencia a éste como el origen del brote. Se identificaron dos puntos diferentes de distribución de los quesos sin higienizar: La explotación y un vendedor ambulante. La mayoría de los casos entrevistados señalan a La explotación como el sitio de adquisición de los quesos infectados.

Valbuena y col. (2001) publican la Evaluación de la eficacia de un método de aislamiento para Brucellas abortus en quesos no pasteurizados procedentes del Estado Táchira. Como objetivo general se evaluó la eficiencia de un método para el aislamiento de Brucella abortus en quesos artesanales no pasteurizados procedentes de la zona Norte del estado Táchira.

Para dicho estudio se recolectaron 12 muestras cada 8 días provenientes de 4 fábricas de queso artesanales en 4 muestreos, para un total de 48 muestras. El método de aislamiento consistió en moler 250 g de queso y pesar una submuestra de 25 g y se adicionó a 225 ml de agua peptonada al 0,1 % con NaCl al 0,85% y Tween 80 al 2%, se homogeneizó en el Stomacher® y se sembró en el medio Kusdas y Morse con 25000 U.I. /l de Bacitracina; 600 U.I. /l de Polimixina y 0,72 g/l de Benomil. La incubación se realizó en una atmósfera con 10% de CO2 a 37°C por 48 horas. Para la identificación de las cepas se utilizaron pruebas bioquímicas y serológicas.

Se obtuvo el aislamiento de Brucella abortus en 27 muestras de queso equivalente al 57% del total de las muestras con recuentos de aerobios menores a 50×106 ufc/g y ausencia con recuentos mayores, indicando la influencia de la carga microbiana del queso sobre la supervivencia de Brucella. En conclusión se demostró la eficacia del método aplicado en esta investigación para el aislamiento de cepas de Brucella en quesos y el riesgo potencial de los quesos como fuente de transmisión de enfermedades zoonóticas para el hombre.

López y col. (1995), en su estudio sobre Diagnóstico de brucelosis bovina en leche por el Ring Test y ELISA en lecherías de la provincia de Ñuble (VIII Región). Este trabajo tiene como objetivo determinar la eficiencia de la prueba ELISA en el diagnóstico de la brucelosis bovina en leche a partir de estanques enfriadores, comparándola con la prueba del RT y la determinación de la prevalencia predial en los principales planteles lecheros de la provincia de Ñuble, Chile.

El estudio fue realizado con 60 muestras correspondientes a 60 predios lecheros de la provincia de Ñuble (VIII Región de Chile). Las muestras fueron recolectadas durante los meses de noviembre y diciembre de 1995, meses que corresponden a la mayor recepción de leche por parte de las plantas lecheras, representado por el mayor número de animales que se encuentran en producción. Los predios fueron clasificados, según el número de animales en lactancia al momento de la toma de muestra, en tres grupos: estrato A (menos de 50 vacas) con 17 predios, estrato B (entre 50 y 100 vacas) 27 predios y estrato C (entre 100 y 150 vacas) con 16 predios. Se recolectaron 50 ml de leche en frascos de plástico estériles, previa agitación en el estanque de frío durante 10 minutos, y mantenidos en refrigeración a 4° C por 24 horas. Para la prueba del Ring Test, el antígeno utilizado se obtuvo desde el Instituto de Microbiología de la Universidad Austral de Chile. Para la realización de la prueba fueron extraídos del frío, tanto las muestras como el antígeno, hasta alcanzar la temperatura ambiental. Se depositó 1 ml de leche en un tubo Khan y se agregaron 33 µl de antígeno mezclado por inversión varias veces e incubado a 37° Celsius durante 1 h. Las muestras fueron leídas, clasificándose como positivas, positivas débiles y negativas. Para la prueba de ELISA se realizó como lo descrito por el fabricante del kit Chekit® Brucellotest de Hoescht que utiliza microplacas previamente sensibilizadas con el antígeno inactivado, monofásico de B. abortus. Se depositaron 200 µl de las muestras de leche en cada uno de los pocillos de la microplaca por duplicado. Como controles positivos y negativos se utilizaron los proporcionados por el kit, 200 µl y diluidos 1:2 y fueron incubados por 90 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda. Luego de la fase de lavado, se depositaron 200 µl de conjugado monoclonal Anti-IgG peroxidasa bovino diluido 1:200 en cada uno de los pocillos e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente del segundo lavado, se agregaron 200 µl del cromógeno proporcionado por el kit. Los resultados fueron leídos en un espectrofotómetro a 405 nm (Dynatech®). Las Densidades Ópticas (DO) de las muestras problemas en duplicado fueron promediadas y corregidas por sustracción de la DO del control negativo, estas fueron divididas por las DO de los controles positivos por 100. Se consideraron muestras positivas sobre 100%, positivas débiles o dudosas, entre 70% y 100% y negativas, bajo 70%.

Del total de predios en estudio, 28.33% corresponden al estrato A (menos de 50 vacas en lactancia), 45% al estrato B (entre 50 y 100 vacas) y 26.67% al estrato C (entre 100 y 150 vacas). Los resultados obtenidos por ambos métodos fueron similares, 18 muestras positivas y 42 negativas. La diferencia se estableció en 5 muestras (8.3%) que fueron clasificadas como positivas débiles al Ring Test y confirmadas como positivas por ELISA. Se determinó que la prevalencia predial de brucelosis bovina fue de un 30% en predios lecheros con estanque enfriador en la provincia de Ñuble. El método de ELISA resultó ser una prueba confiable para diagnosticar brucelosis bovina en leches colectivas.

Ruelas y col. (1999) desarrollaron un estudio denominado desarrollo y estandarización de una prueba de Elisa indirecta para brucelosis ovina. El presente trabajo fue diseñado con el objetivo de desarrollar y estandarizar una prueba de ELISA indirecta (ELISA-I), utilizando como antígeno, el extracto salino de una cepa nacional Brucella ovis, y evaluar su aplicación para la detección de anticuerpos específicos a B. ovis.

El antígeno (extracto salino) de Brucella ovis, fue preparado a partir de una cepa aislada de un carnero con epididimitis clínica procedente de una empresa ganadera de la sierra central del Perú. La prueba ELISA-I fue validada examinando 74 sueros positivos procedentes de carneros con epididimitis clínica y positivos al aislamiento bacteria y 75 sueros negativos procedentes de carneros sin lesiones testiculares.

Las estandarizaciones determinaron los siguientes parámetros: uso de microplacas de poliestireno de 96 celdas de fondo plano, dilución del conjugado (1:2 000), dilución del antígeno (1:400), dilución de los sueros (1:200). Los valores máximos del coeficiente de variación (CV) intra e interplaca fueron 16.07% y 15.95%, respectivamente. El análisis de las características del operador-receptor (ROC) indicó que el punto de corte se encuentra en 23.89 % de positividad (PP). Consecuentemente ELISA-I tuvo una sensibilidad diagnóstica del 97.3% y una especificidad diagnóstica del 98.6%. Se concluye que la prueba desarrollada es una buena alternativa diagnóstica para brucelosis ovina.

Mariño y col. (2001), realizaron un estudio llamado evaluación de metodologías diagnósticas para brucelosis en población de búfalos del Magdalena Medio, Colombia. El objetivo general de este trabajo fue el determinar el comportamiento de diferentes pruebas serológicas utilizadas para diagnosticar la brucelosis en la especie bufalina.

Para dicho estudio se analizaron 1400 sueros de búfalos mayores de 2 años provenientes del Magdalena Medio, bajo condiciones de manejo de la región y con vacunación reglamentaria entre los 3 y 9 meses de edad con B. abortus cepa 19. Se realizó seguimiento de dinámica de anticuerpos a un grupo de 20 búfalos crías vacunados a la edad reglamentaria. Se realizaron pruebas serológicas de aglutinación Rosa de Bengala, fijación de complemento y ELISA Competitiva a la totalidad de los sueros. En la fase inicial, 822 sueros fueron trabajados además por las técnicas de ELISA Competitiva modalidad cadena-O e inmunodifusión radial.

Los resultados preliminares indicaron correlación (r = 0.8728) entre las pruebas de ELISA modalidad cadena-O y sLPS, razón por la cuela los estudios se complementaron con base en la modalidad sLPS de aplicación común actualmente. La prueba de inmunodifusión radial presentó baja sensibilidad desde el inicio y, por consiguiente, no se mantuvo su utilización. En la población estudiada, la evaluación comparativa de las serologías con respecto a la prueba de referencia, fijación de complemento (para bovinos e igualmente aceptada para la especie bufalina), confirmó la menor sensibilidad diagnóstica de la prueba Rosa de Bengala. Según lo esperado, se evidenciaron las ventajas de la prueba ELISA Competitiva con sensibilidad del 96.7% y especificad del 94.28%, además de una confiabilidad mayor al 92%, características que la sugieren como herramienta a escoger para apoyo a un programa de control y erradicación de la brucelosis en la población estudiada.

Sequera y col. (2002), presentaron un trabajo en el cuarto congreso de ciencia y tecnología del Estado Portuguesa denominado "Prevalencia de la brucelosis en fincas ganaderas del Estado Portuguesa.

La selección de las fincas y animales a muestrear se realizó de forma aleatoria y el tamaño de la muestra se calculó utilizando la formula Ziggman para población infinita, ajustando un 10% para obtener una muestra representativa estadísticamente.

Para ello se visitaron 10 fincas de los diferentes municipios del Estado y fueron muestreados 2885 bovinos encontrándose una prevalencia del 5,54% de animales positivos para el Estado Portuguesa, y 11,16% de animales sospechosos a las pruebas de diagnóstico serológicos realizadas. Por municipios, la mayor prevalencia encontrada está en Esteller con 15,08%, Guanarito con 10,08%, Sucre con 10%, Ospino con 6,41%. Por tipo de explotación, se determinó que las fincas doble propósito fueron las que presentaron una mayor prevalencia con 7,56%, las de carne con 5,76% y las de leche con 2,71%. El análisis estadístico realizado mediante la prueba J2 mostró diferencias significativas (P < 0,05) entre fincas por tipo de explotación. El 38,46% de las fincas visitadas presentaron animales positivos. Estos resultados indican una alta proporción de animales infectados y representan un riesgo alto para la salud animal y humana. Un alto porcentaje de fincas (31%) no vacunan sus animales contra esta enfermedad.

Por otro lado Paublini (1978) en su guía sobre brucelosis señala que esta enfermedad es conocida en Venezuela desde el año 1898 cuando Mosquera describió el caso de un paciente procedente de Alemania. El primer aislamiento de Brucella se realizó en Caracas en 1939. En 1940 Landaeta y col. identifican el primer caso autóctono en el país aislando mediante hemocultivo B. abortus en un paciente de 27 años procedente de Calabozo Estado Guarico.

En 1941 Briceño realizo una encuesta en 1963 pacientes febriles de Caracas encontrando una positividad del 0.2% mediante aglutinación. Cuando se investigaron los grupos a riesgo, los resultados fueron diferentes. Fossaert (1955), encuentra un 19.5% de positividad en pacientes febriles que trabajan en haciendas ganaderas del centro del país. En 1966 Novoa Montero encuentra en trabajadores de haciendas completamente asintomáticos del Distrito Colon Estado Zulia una positividad de 7.26%. En este mismo grupo los "caveros" (trabajadores que cargan carne ya preparada a los camioneros) dieron una positividad de 20.5%.

Bello (1973) encuentra un 15.2% de positivos en personal de mataderos de los estados Barinas, Portuguesa y Zulia y un 20% en pacientes febriles en riesgo de infección. Andrade (1973) trabajando con personal de mataderos y fincas lecheras del estado Lara ha encontrado entre un 7 y 10% de positividad, utilizando métodos de aglutinación en tubos y fijación del complemento.

Conceptualización de la Variable

CAPÍTULO : METODOLOGÍA

TIPO DE ESTUDIO

El tipo de estudio se adapta a la modalidad de un estudio evaluativo de campo, puesto que su objetivo es Determinación de Brucella en leche de búfala producida en fincas ubicadas en el municipio Guanarito del estado Portuguesa

POBLACIÓN Y MUESTRA

Según la universidad Pedagógica Experimental Libertador (UPEL) define la población como "el conjunto de personas, animales o elementos de los cuales pretendemos indagar y conocer sus características o de una de ellas y para el cual serán validas las conclusiones obtenidas en la investigación. (p.122)

Bajo esta consideración, la población en estudio estuvo conformada por las 14 fincas productoras de leche de búfala ubicadas en el municipio Guanarito del estado Portuguesa.

El muestreo según Arias (1999) lo define como: "el procedimiento en el cual todos los elementos tienen la misma probabilidad de ser seleccionado y se basa en la división del universo en unidades menores, para determinar luego las que serán objetivos de investigación o donde se realizara la selección (p.97)

Según Skins (2004), el tamaño de la muestra depende de la precisión que se quiera conseguir en la estimación que se realice a partir. Para su determinación se requieren técnicas estadísticas superiores, pero tomando en cuenta siempre las variables y limitaciones que se puedan presentar para la determinación de dicha muestra, en la cual se acepta que la muestra esté representada por el 25 o 30% de la población total. Por otra parte resulta sorprendente como, con muestras notablemente pequeñas, se pueden conseguir resultados suficientemente precisos, por lo tanto se seleccionaron 6 fincas (42,86% de la población total) utilizando para esto un recipiente en el cual se introdujeron los nombres de las fincas y se seleccionaron garantizando que todas tuvieran la misma probabilidad de ser elegidas.

DISEÑO DE LA MUESTRA

El diseño estadístico a utilizar es una t- student donde se tomara una población y la variable respuesta es cuantitativa, lo que supone que la población posee una distribución normal determinándose el tamaño de la muestra

El objetivo del proceso de recolección de muestra es determinar la presencia de Brucellas en leche de búfala producida en fincas ubicadas en el Municipio Guanarito del Estado Portuguesa.

TÉCNICA DE RECOLECCIÓN DE DATOS

Según Rodríguez (2001), las técnicas de recolección de datos se definen como "La parte del método que en un procedimiento o conjunto de procedimientos, regulado y previsto de una determinada eficacia" (p 107).

La técnica utilizada para la recolección de datos fue a través de entrevistas informales con los médicos veterinarios del departamento de producción animal del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA), y con médicos veterinarios del Municipio Guanarito los cuales tienen experiencia en este tipo de investigaciones.

Las muestras se tomaron en cada una de las cántaras o envases obtenidos en el ordeño del día. Se agitó el contenido de las cántaras para asegurar que la leche estuviese homogenizada, luego utilizando una pipeta de 10 ml. se extrajo la muestra y se depositó en tubos de ensayo utilizando uno por cántara. (ver anexo 2)

PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS DE LA MUESTRA

PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE EN TITULO FINAL (*)

1. REACTIVOS NECESARIOS

1. Antígeno para la prueba del anillo en leche.
2. Leche total negativa para Brucelosis procedente de 25 animales o más.

1. EQUIPOS NECESARIOS.

1. Pipetas de 1,0 ml.
2. Jeringas automáticas de 2,0 ml. con cánula de 3 ó 4 pulgadas o aguja calibre 16.
3. Tubos de ensayo de 11,0 x 100 mm.
4. Gradillas para sostener los tubos de ensayo.
5. Incubadora (37,5 o C)

1. PROCEDIMIENTO

PRUEBA DE TAMIZ (SCREENING)

1. Colocar tubos de ensayo de 11,0 x 100 mm. en gradillas e identificar cada uno de modo que corresponda a las muestras de leche. (ver anexo 3)
2. Utilizando una pipeta de 1,0 ml. colocar 1 ml. de las muestras de leche a ser examinadas en cada tubo.
3. Con una jeringa automática agregar 1,0 ml. de leche entera total negativa para brucelosis.
4. Agregar dos gotas (0,06 ml.) de antígeno para la prueba del anillo en leche a cada tubo.

   (*) Holm, G.C.; Eveleth, O.F., and Rheault, P.L.; A Dilution Method for the Milk Ring Test in Bovine Brucelosis Detection Vet. Med. 45, (1950): 400-404

5. Mezclar bien colocando el dedo mayor sobre la parte superior del tubo y agitarlo fuertemente. Entre una y otra muestra secarse el dedo con una toalla.
6. Colocar las gradillas con los tubos en una incubadora (37,5 º C) durante una hora.
7. Leer las muestras y realizar la dilución seriada para la prueba del anillo en leche en las muestras positivas.

PROCEDIMIENTO ESTADÍSTICO

El estudio de distribución estadísticos para muestras pequeñas se denomina teoría de muestras pequeña menores a 30 muestras. Sin embargo un nombre mas adecuado seria teoría exacta del muestreo ya que los resultados que se obtienen son validos tanto para muestras grandes como para muestra pequeña.

Por esta razón se realizará en este estudio una distribución de t- student porque las muestras en estudios son menores a 30.

Murray (2002), llama a la t-student en honor de su descubridor W.S.GOSSETT; quien publicó sus trabajos bajo el pseudonimo student en los inicios del siglo XX. para valores de V o N (ciertamente N ≤30) se aproximan mucho a la curva normal estandarizada.

CAPÍTULO ІV: ANÁLISIS DE RESULTADOS

Análisis de resultados

Una vez recopilados los datos, se procede a preparar una serie de estadísticas que permiten la elaboración de tablas con su respectivo análisis e interpretación a cada muestra recolecta a razón de establecer las conclusiones.

El cuadro 4, presenta en promedio de producción diario de leche de búfala en las fincas muestreadas. Es importante mencionar que la totalidad de dicha producción es destinada para la elaboración de queso, ya sea directamente en las fincas o en las distintas receptorias que se encuentran en el municipio.

Cuadro 4: Promedio de producción diario de leche en las fincas muestreadas.

En el cuadro 5, se muestra los resultados de la leche analizada el cual reflejó que en las fincas muestreadas no existe presencia del microorganismo en estudio, esto es de gran relevancia ya que se demuestra que los productores han tomado conciencia en cuanto a medidas para prevenir esta enfermedad en sus rebaños, cumpliendo así con lo establecido por el Ministerio de agricultura y cría en la resolución de la campaña contra brucelosis (ver anexo 7).

Cuadro 5: Resultado del análisis de presencia de Brucillas

Leyenda: 1 Positivo; 2 Negativo

CAPÍTULO V: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

• La totalidad de las fincas en el Municipio destinan su producción de leche a la elaboración de queso.
• De las seis fincas seleccionadas para el muestreo, solamente dos de ellas elaboran quesos dentro de sus instalaciones. Las demás fincas venden la leche a las receptorías para su posterior transformación en queso.
• La producción total de las fincas muestreadas es de 2029 lts/día.
• En todas las fincas analizadas para determinar la presencia de Brucellas abortus los resultados fueron negativos, lo que quiere decir que en dichas fincas se realiza el control preventivo para mantener los rebaños protegidos del microorganismo.

RECOMENDACIONES

• Realizar este tipo de análisis cada seis meses para mantener un control, lo cual garantiza la calidad de la leche en este aspecto.
• Utilizar personal obrero con certificado de salud (vigente), para garantizar que la persona que manipula el alimento es sana.
• Ofrecer conferencias, charlas y cursos en las respectivas asociaciones de ganaderos para demostrar lo importante que es mantener los rebaños sanos.
• Las receptorias deben recolectar la leche en tanques cisternas para llevarlas a sus instalaciones, en lugar de hacerlo en tobos plásticos que es como lo hacen actualmente, ya que esto es una mala práctica de recolección al exponer la leche al polvo y a otros agentes contaminantes. (ver anexo 4 y 5)
• Exigir al personal obrero (ordeñadores) que utilicen los equipos mínimos requeridos para un ordeño higienizado evitando la contaminación de la leche. (ver anexo 6 )

BIBLIOGRAFÍA

• Arias, F. (1999). El proyecto de investigación. Guía para su elaboración. Episteme, Caracas-Venezuela.

• Bohórquez, N. (2001). Curso sobre actualización de brucelosis como problema de salud pública. Facultad de ciencias veterinarias, Maracaibo.

• Cedeño A. (1999). Simposio internacional sobre brucelosis. Maracay, Venezuela

• Hurtado-Lugo, N; Cerón-Muñoz, M; Lopera, M. Bernal, A. y Cifuentes T. (2005). Determinación de parámetros físico-químicos de leche

bufalina en un sistema de producción orgánica. [Documento en línea] Disponible: http// [Consulta: 2005, agosto 25]

• Méndez, C.; Páez, A.; Cortés, M.; Salmoral. E.; Mohedano, E.; Plata, C.;

Varo B. (2002). Brote de brucelosis debido al consumo de queso de cabra fresco sin higienizar en Andalucía (España), [Documento en línea] Disponible: http://www.google.com.ve/brote/brucelosis.htm [Consulta: 2003, Julio 12]

• Organización Mundial de la salud (1979). Informe de comité mixto

FAO/OMS de expertos en brucelosis. Ginebra.

• Paublini H. (1978). Guía sobre brucelosis. Caracas.
• Ramos, M. (2001). Pruebas complementarias para el diagnostico serológico de la brucelosis. Centro Panamericano de Zoonosis. Buenos Aires.

• Ruelas C. y Raúl Rosadio A. (1999). Desarrollo y estandarización de una prueba de ELISA indirecta para brucelosis ovina. Revista de Investigaciones Veterinarias de Perú; 10(2):43-55.

• Sequera, W; Pedrique, C; Medina, A; Paz, M; Perdomo, G; Colmenarez, M; Mendoza, E. (2000, Octubre). Prevalencia de la brucelosis en fincas ganaderas del estado Portuguesa.

Ponencia presentada en el IV Congreso de Ciencia y Tecnología del Estado Portuguesa.

• Skins, D. (2004) Métodos de muestreo [Documento en línea] Disponible: http://buscador.rincondelvago.com/métodosdemuestreo. [Consulta: 2006, marzo 22]

•  

  Universidad del Zulia (1997). Curso de actualización sobre brucelosis bovina. Maracaibo.

• Universidad Pedagógica Experimental Libertador (1998). Metodología de la investigación. Caracas, Venezuela.

Autor:

Herrera Rafael

Hoyos Orlando

Rivas Aarón

TUTOR: Prof. Nicolás Arias

Fecha: Marzo del 2006