Anuros como bioindicadores del impacto de la industria minera

Introducción

En una escala mundial, las actividades antropogénicas como la minería, han generado un impacto significativo sobre la sostenibilidad de los recursos hídricos. Estas actividades mineras son consideradas como una fuente importante de residuos que afectan los sistemas acuáticos, debido a la gestión inadecuada de estos y contribuyen a la contaminación de sustratos del suelo, destrucción del paisaje ecológico y el agua superficial y subterránea (Othmani et al. 2015), representado un alto riesgo para la fauna, flora y calidad del agua (Eisler & Wiemeyer, 2004), alterando el hábitat de organismos como los anuros que realizan parte de su ciclo de vida en el agua.

Para la evaluación de los efectos de los contaminantes en hábitats acuáticos se ha demostrado la eficiencia del uso de larvas de anuros, debido a que presentan una gran sensibilidad a la concentración de sustancias toxicas (Rowe et al. 1996). A pesar de que no existe consenso acerca de la elección de un grupo como bioindicador, los anuros se presentan como un excelente opción para la evaluación de contaminantes ya que tienen algunas de las siguientes características: están disponibles en grandes cantidades, son fáciles de trabajar en el laboratorio, tienen comportamientos que pueden ser fácilmente supervisados y son buenos representantes de los ambientes de agua dulce y terrestre (Burger & Snodgrass 1998).

En los últimos años los trabajos que utilizan los anuros como modelos experimentales en la evaluación de contaminantes químicos derivados de actividades humanas han sido reportado por diferentes autores (Lascano et al., 2009; Peltzer et al. 2013; Attademo et al. 2014).

Por lo anterior este trabajo, revisa las ventajas e importancia de los anuros como bioindicadores, ya que estos permiten observar el efecto de sustancias toxicas en laboratorio o campo dando respuestas de aspectos fisiológico, comportamental, ontogénico y ecológico con su entorno, lo que brinda la posibilidad de monitorear los efectos de contaminantes provenientes de la minería sobre las poblaciones.

Impacto ambiental de la Industria minera: Marco teórico

La actividad minera desempeña un papel importante para el hombre contribuyéndole principalmente en lo social y económico; sin embargo, para el desarrollo de estos procesos de extracción de recursos minerales se requieren grandes extensiones de tierra y la circulación de millones de litros de agua, lo cual provoca muchos problemas ambientales (Gardner et al. 2007). La contaminación ambiental derivada de la minería y las operaciones de fundición son una preocupación en todo el mundo, y los ambientes han sido gravemente contaminados con cianuros, ácido sulfúrico y metales como mercurio (Hg), arsénico (As), cadmio (Cd), cobre (Cu), plomo y zinc (Zn), a partir de la extracción de los minerales y su procesamiento (Dong et al. 2015).

En los últimos años las compañías mineras internacionales han multiplicado sus inversiones en exploración y explotación en todo el mundo. (FEDESARROLLO 2008). Por lo cual la industria minera, requiere de gran atención por los costes ambientales que pueden ser generados al darse una mala administración de estos procesos de extracción de minerales, reconociendo el daño a poblaciones humanas, la vida silvestre y los ecosistemas relacionados a estos (Beasley & Levengood 2007).

Debido al aumento del uso de productos químicos contaminantes en este tipo de industrias, se hace necesario el desarrollo de técnicas como la medición de la ecotoxicidad. Para ello en diferentes investigaciones se han utilizado como bioindicadores peces, macroinvertebrados y anfibios (Fleeger et al. 2003, Connon et al. 2012, Plötner & Matschke 2012, Pander & Geist 2013). Dentro de estos últimos se encuentran los anuros que nos pueden servir como un modelo de bioindicador apropiado para obtener una apreciación más cercana del verdadero impacto del factor estresor sobre el ambiente a evaluar (Dube & Hossetti 2010).

Anuros como Bioindicadores

Los anuros son bioindicadores de la calidad ambiental de los ecosistemas acuáticos, cumplen un papel importante en la cadena trófica, siendo depredadores de insectos y presa de algunas especies de serpientes, aves y mamíferos (Ferreras 2008). Estos ocupan un rol importante en la transferencia de energía y nutrientes a través de las redes tróficas acuática y terrestre (Beard et al. 2002). Además de estas características relacionadas a la ecología de este grupo, también se han utilizado como modelos en investigaciones ecotoxicologicas (Hopkins 2007). Diversos trabajos sugieren que características fisiológicas como: piel permeable sin presencia de escamas o pelo y huevos que sin cubierta de cascarón los hace sensibles a cambios de temperatura, humedad y presencia de agentes contaminantes en el ambiente (Duellman & Trueb 1986, Plötner & Matschke 2012, Peltzer et al. 2013), por lo tanto la explotación de los hábitats acuáticos y terrestres representan alto riesgo, ya que cualquier tipo de contaminación en alguno de estos podría afectar la supervivencia de las poblaciones. (Junges et al. 2010)

Por otra parte, informes de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) indican que un tercio de las especies de anfibios han sido sometidas a extinción o severos descensos poblacionales (Stuart et al. 2004). En los últimos 25 años el porcentaje de anfibios ha disminuido de manera considerable en muchas zonas del mundo, situándolos en mayor vulnerabilidad frente a mamíferos o aves. Entre las causas de esta disminución se encuentran los contaminantes ambientales, la radiación UV, enfermedades infecciosas, la introducción de especies exóticas, la explotación directa, el cambio climático y la perdida de hábitat (Beebe & Griffiths 2005). A pesar de todo esto la comunidad científica coincide en que este declive está más relacionado a un efecto ambiental principalmente antropogénico que afecta no sólo a estos organismos, sino a otros y hasta al hombre, hecho que situaría a los anfibios como especie bioindicadora de severos problemas ambientales (Hopkins 2007).

Dentro del ciclo de vida de los anfibios, la fase acuática, especialmente los cambios que se presentan en el desarrollo embrionario y larval, pueden ser aprovechados para medir el impacto de sustancias contaminantes en los ecosistemas, debido a que estos son un vector de la contaminación, por presentar parte de su ciclo de vida en el agua y terminando su desarrollo en la tierra, dando así señales de zonas afectadas por contaminantes, como los desechos de la industria minera (Hernández et al. 2013)

Pruebas de toxicidad

4.1. Desarrollo ontogénico

Un aspecto importante es la descripción en el desarrollo embrionario y larval de anuros de acuerdo a la tabla de Gosner (1960), pues permite analizar rasgos morfológicos su relación con aspectos fisiológicos de los organismos. Se han realizado investigaciones en anuros que muestran el efecto de sustancias provenientes de la industria minera como por ejemplo el efecto de diferentes concentraciones de zinc (Zn) y cobre (Cu) en Bufo arabicus. Barry (2011), el efecto de uranio en renacuajos de Pelophylax perezi (Marques et al. 2013), el cadmio (Cd) en embriones y renacuajos de Xenopus laevis (sharma & Patiño 2009) y Acidos naftalenicos en Lithobates pipiens (Melvin et al. 2013), en los cuales se reporta la reducción en la tasa de crecimiento de las especies de renacuajos estudiadas.

4.2. Sensibilidad

Se ha encontrado que la mayor sensibilidad a contaminantes se encuentra en los primeros estadios de desarrollo o por lo menos antes de la formación de las extremidades (Burger & Snodgrass 2000). Un estudio de toxicidad aguda de metales pesados en Microhyla ornata, mostro una alta sensibilidad de renacuajos a estos contaminantes. (Rao & Madhyastha 1987). En concordancia con estas ideas, Hernández y colaboradores (2013), evaluando el impacto de mercurio en larvas de anuros en Colombia, reportan que individuos en estado de desarrollo avanzado no reflejan ningún efecto subletal, después del estadio 30 según la clasificación de Gosner (1960).

4.3. Comportamental

En cuanto a efectos comportamentales, estudios realizados por Adlassnig et al. (2013), en los cuales observaciones de anfibios como Rana ridibunda, R. temporaria, Bufo viridis en hábitats gravemente contaminados por la minería de metales pesados, sugieren que estos pueden estar presentes en los zonas mineras, siendo capaces de reconocer y alejarse de lugares extremos de contaminación, evitando así la absorción de los contaminantes y parecen poseer una tolerancia limitada contra los metales pesados.

• Bioacumulacion

Por otro lado se han desarrollado estudios que miden la bioacumulación de diferentes sustancias como metales pesados en anfibios, pues se presumen que son más propensos a acumular cargas corporales debido a que las sustancias tóxicas pueden entrar en su cuerpo por dos rutas: a través de la ingesta en la dieta, y por absorción a través de su piel semipermeable (Rowe et al. 1996). Algunos ejemplos de investigaciones de bioacumulacion son: el análisis de la concentración de talio (Tl) en el desove de Bufo bufo, se puede utilizar como un indicador sensible de la presencia de este elemento en el medio ambiente (Dmowski et al. 2015) y Hernández y colaboradores (2013) reportan la bioacumulacion de mercurio (Hg) en larvas de anuros en el rio dagua en Colombia. Todos estos reportes nos sirven como señales de efectos en los ecosistemas, dada la importancia de los anuros en las redes tróficas.

• Pruebas de Citotoxicidad

Los efectos tóxicos de las sustancias también pueden ser evaluados a nivel celular, De acuerdo a Nikoloff (2013) los parámetros más utilizados son:

4.5.1 Índice mitótico: Es una medida de porcentaje de células que se encuentran atravesando la fase M (mitosis) del ciclo celular en un tiempo determinado y cuyo registro se realiza en preparados cromosómicos. Esto se puede alterar al exponer estas celular a contaminantes que pueden afectar su desarrollo.

4.5.2 Cinética de proliferación celular: Este parámetro permite conocer cuántas veces una célula determinada ha atravesado por la fase S del ciclo celular en un tiempo dado. Permite establecer si un agente es capaz de inducir variaciones en la cinética del ciclo celular.

4.5.3 Viabilidad celular: El fundamento de la técnica es utilizar colorantes que permitan detectar si la célula sometida al agente bajo estudio se encuentra viva o muerta después de un tiempo dado de exposición a un determinado agente.

4.5.4 Muerte celular programada: El mecanismo de apoptosis o muerte celular programada por el mismo organismo para controlar su desarrollo y crecimiento, siendo controlado por distintas señales celulares, evitando la proliferación celular. Una de las técnicas para cuantificar y determinar el fenómeno apoptótico, es la técnica de marcación de membrana plasmática con Anexina V-FITC. Esta metodología se basa en los eventos tempranos de la apoptosis.

Algunos autores han utilizado estas pruebas en la evaluación del efecto de sustancias contaminantes en anuros (Balboni et al. 1992, Meyer et al. 2010, Vera et al. 2010)

4.6 Pruebas Genotoxicidad

4.6.1 Micro núcleos: Estos son fragmentos o cromosomas completos que quedan fuera del núcleo durante la mitosis, se puede realizar el conteo de micronúcleos en cualquier tejido que se divida, debido a su alta confiabilidad y bajo costo son utilizados en pruebas de evaluación de contaminantes (Torres & Ramos 2013). Diversos autores han realizado estudios que muestran la valiosa herramienta que pueden ser los micronúcleos en la evaluación del efecto de contaminantes en anuros, aunque se ha investigado principalmente en sustancias agro toxicas, sirven como modelo para la evaluación de contaminantes propios de la industria minera, algunos ejemplos son: Se reportó una correlación entre el número de micronúcleos y el aumento de la concentración de glifosato en Odontophrynus cordobae y Rhinella arenarum (Bosch et al. 2011). Por otra parte Vera y colaboradores (2010) reportan el aumento de micronúcleos evaluando el efecto de un insecticida en Rhinella arenarum. También se ha reportado el efecto de pesticidas mediante el uso de la prueba de micronúcleos en los eritrocitos de renacuajos Hyla pulchella (Lajmanovich et al. 2005).

4.6.2 Electroforesis en gel de una célula única o Ensayo Cometa: Permite evaluar distintos niveles de daño ejercido en la molécula de ADN y también de su reparación sin la necesidad de trabajar con células en proliferación. La técnica consiste en lisar las células de interés para liberar al ADN del sistema de endomembranas, luego las mismas son embebidas en un gel de agarosa y sometidas a un campo eléctroforético. Si hay daño, se formarán fragmentos de ADN capaces de migrar hacia el ánodo del campo eléctrico al cual se encuentra sometido (Nikoloff 2013). Valencia et al. (2011) han reportado el uso de esta prueba evaluando el daño genético en Eleutherodacty lusjohnstonei

4.7 Estrés oxidativo

El estrés oxidativo es un estado de la célula en la cual se encuentra alterada la homeostasis óxido-reducción intracelular. Las Especies reactivas de oxigeno (EROs) son moléculas esenciales en el control fisiológico de diversas funciones celulares, por lo tanto el efecto de distintos contaminantes sobres los organismos puede provocar un incremento en la producción de EROs, lo que afecta el estado redox celular y pueden activar señales moleculares que conducen tanto a la apoptosis como a la proliferación celular, alterando la fisiología de los organismos (Mardirosian 2015).

Para combatir los efectos nocivos de las EROs, los organismos han desarrollado un sistema de defensa antioxidante, desencadenando una situación de estrés oxidativ (Davies 1995). Dentro de los componentes enzimáticos del sistema antioxidante se encuentran:

4.7.1 Catalasa: Esta es una de las enzimas antioxidantes claves en la defensa contra la toxicidad potencial del peróxido de hidrogeno, producido en distintas reacciones redox del metabolismo aeróbico normal. Investigaciones recientes han demostrado como la actividad de esta enzima aporta información clave para evaluar el efecto de distintos contaminantes producto de la industria minera, por ejemplo Muniswamy y colaboradores (2008) demostraron como el cianuro de sodio (NaCN) inhibe la actividad de la catalasa, en el pez Cyprinus carpio, en donde una concentración subletal de 0.066 mg/L conlleva a la acumulación del peróxido de hidrogeno que puede conducir a daños celulares y perturbación fisiológica.

4.7.1 Glutatión S-transferasa: La glutatión S-transferasa (GST) es una familia de enzimas que catalizan la conjugación del glutatión endógeno a una variedad de compuestos electrofílicos, protegiendo las macromoléculas biológicas como las proteínas y los ácidos nucleicos de las consecuencias tóxicas de una reacción covalente (Díaz et al. 2004). El efecto de esta reacción, generalmente, es convertir una molécula lipofílica reactiva en una soluble en agua mediante la formación de un conjugado no reactivo que puede ser excretado fácilmente (Mardirosian 2015).

El uso de pruebas de actividad enzimática para ver el efecto de los contaminantes en los parámetros bioquímicos de los organismos ha sido ampliamente reportado por diferentes autores (Attademo et al. 2014, Peltzer et al. 2013, Lascano et al. 2009). Por lo anterior, se considera que la actividad enzimática es una buena herramienta para el diagnóstico de la toxicidad provocada por sustancias provenientes de la minería.

Conclusiones

El buscar herramientas que nos permitan evaluar objetivamente el impacto de sustancias químicas provenientes de la industria minera en los distintos ecosistemas, ha llevado a los investigadores a utilizar bioindicadores y los anuros son un modelo experimental efectivo e interesante utilizado para identificar efectos adversos de etiología ambiental, ya que los cambios en el ambiente pueden generar disminución en las poblaciones de estos organismos con el tiempo y alterar las relaciones tróficas del sistema entrando en procesos de biomagnificación. Estos resultados se pueden utilizar como indicadores biológicos que ofrecen una perspectiva única que une la fisiología y ecología del organismo con su entorno. (Dube & Hosetti, 2010). Contribuyendo en forma muy significativa para establecer criterios de calidad ambiental que garanticen la protección de los ecosistemas, la biodiversidad y la salud humana.

Referencias bibliográficas

Adlassnig, W., Sassmann, S., Grawunder, A., Puschenreiter, M., Horvath, A., & Koller-Peroutka, M. (2013). Amphibians in metal-contaminated habitats. Salamandra, 49(3): 149-158.

Attademo,A.M.,Peltzer,P.M.,Lajmanovich,R.C., Cabagna-Zenklusen, M. Junges,C., Lorenzatti, E., Aró,C., & Grenon,P. (2014). Biochemical changes in certain enzymes of Lysapsuslimellium (Anura:Hylidae) exposed to chlorpyrifos. Ecotoxicology and Environmental Safety 113 287–294.

Balboni, F., Bernabei, P.A., Barberio, C., Sanna, A., Ferrini, P.R., & Delfino, G. (1992). Cutaneous venom of Bombina variegata pachypus (Amphibia, anura): Effects on the growth of the human HL 60 cell line, Cell Biology International Reports, Volume 16, Issue 4. Pages 329-338.

Barry, M.J. (2011). Effects of copper,zinc and dragon fly kairomone on growth rate an dinduced morphology of Bufo arabicus tadpoles. Ecotoxicology and Environmental Safety 74 918–923

Beard, K.H.; Vogt, K.A. & Kulmatiski, A. (2002). Top-down effects of a terrestrial frog on forest Beasley, Val R., & J. M. Levengood. (2007). Principles of Ecotoxicology."Veterinary Toxicology . New York, NY: Elsevier, 689-708.

Beebee, T.J.C., & Griffiths, R.A., (2005). The amphibian decline crisis: A watershed for conservation biology? Biological Conservation 125, 271–285.

Bosch, B., F. Mañas, N. Gorla and D. Aiassa. (2011). Micronucleus test in post metamorphic Odontophrynus cordobae and Rhinella arenarum (Amphibia: Anura) for environmental monitoring. J. Toxicol. Environ. Health Sci., 3: 155–163.

Burger J, Snodgrass J. (2000) Oral deformities in several species of frogs from the Savannah river site, USA. Environ Toxicol Chem. 19(10):2519-2524.

Burger, J., & Snodgrass, J. (1998). Heavy metals in bullfrog (Rana catesbeiana) tadpoles: Effects of depuration before analysis. Environ Toxicol Chem. 17(11):2203-2209.

Connon, R. E., Geist, J., & Werner, I. (2012). Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors, 12(9), 12741-12771.

Davies, K.J. (1995). Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochem. Soc. Symp. 61, 1–31.

Dmowski, K., Rossa, M., Kowalska, J. & Krasnodebska-Ostrega, B. (2015). Thallium in spawn, juveniles, and adult common toads (Bufo bufo) living in the vicinity of a zinc-mining complex, Poland. Environ. Monit. Assess. 187, 4140–4147.

Diaz, C., Rrodriguez, M.M., Fresneda, M.,  &  Bisset, J.A. (2004). Determinación de la actividad glutatión-S-transferasa en cepas de Culex quinquefasciatus de Cuba y otros países de América Latina. Rev Cubana Med Trop [online]. vol.56, n.2, pp. 111-116.

Dong, C., Taylor, M. P., Kristensen, L. J., & Zahran, Sammy. (2015).  Environmental contamination in an Australian mining community and potential influences on early childhood health and behavioural outcomes. Environmental Pollution. 207 345-356.

Dube, P.N., & Hosetti, B.B. (2010). Behaviour surveillance and oxygen consumption in the freshwater fish Labeo rohita (Hamilton) exposed to sodiumcyanide. Biotechnol. Anim. Husb. 26 (1–2), 91–103.

Duellman, W. E. (1986). Biology of amphibians. JHU Press.

Eisler, R., Wiemeyer, S.N. (2004). Cyanide hazards to plants and animals from gold mining and related water issues. Rev. Environ. Contam. Toxicol.183, 21–54.

FEDESARROLLO. (2008). La minería en Colombia: impacto socioeconómico y fiscal. Recuperado de: http://www.fedesarrollo.org.co/wpcontent/uploads/2011/08/La-miner%C3%ADa-en-Colombia-Informe-de-Fedesarrollo-2008.pdf

Ferreras, P. (2008). Funciones de la depredación en los sistemas naturales. En: Especialista en control de predadores (pp. 6-21). España: Biblioteca de la Escuela Española de Caza

Fleeger, J. W., Carman, K. R., & Nisbet, R. M. (2003). Indirect effects of contaminants in aquatic ecosystems. Science of the Total Environment, 317(1), 207-233.

Gardner, T.A., Barlow, J., & Peres, C.A. (2007). Paradox, presumption and pitfalls in conservation biology: The importance of habitat change for amphibians and reptiles. Biological conservation. 138 166 –179.

Gosner K.L. (1960). A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification. Herpetologica16, 183-190.

Hernández, O.D., Castro, F., & Paez, M. (2013). Bioacumulación de mercurio en larvas de anuros en la zona afectada por la Minería de Oro en el Río Dagua, Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia. Acta Biológica Colombiana 18(2): 341–348.

Hopkins, W.A. (2007). Amphibians as Models for Studying Environmental Change. ILAR Journal 48 (3): 270-277.

Junges, C.M., Lajmanovich, R.C., Peltzer, P.M., Attademo, A.M., & Bassó, A. (2010). Predator–prey interactions between Synbranchus marmoratus (Teleostei: Synbranchidae) and Hypsiboas pulchellus tadpoles (Amphibia: Hylidae): Importance of lateral line in nocturnal predation and effects of fenitrothion exposure. Chemosphere 81 1233–1238.

Lajmanovich, R., Cabagna, M., Peltzer, P., Gabriela, A., Stringhini, G., & Attademo, A. (2005). Micronucleus induction in erythrocytes of the Hyla pulchella (Amphibia: Hylidae) tadpoles exposed to insecticide endosulfan. Mutat. Res., 587: 67-72.

Lascano, C.I., Sotomayor, V., Ferrari, A., & Venturino, A. (2009). Alteraciones del desarrollo embrionario, poliaminas y estrés oxidativo inducidos por plaguicidas organofosforados en Rhinella arenarum. Acta Toxicol Argent. ;17(1):8-19.

Mardirosian, M. (2015). Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum. Doctorado. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires.

Marques, S.M., Chaves, S., Gonçalves, F., & Pereira, R., (2013). Evaluation of growth, 452 biochemical and bioaccumulation parameters in Pelophylax perezi tadpoles, following 453 an in-situ acute exposure to three different effluent ponds from a uranium mine. Sci. 454 Total Environ. 445-446, 321-328.

Melvin, S.D., Lanctot, C.M., Craig, P.M., Moon, T.W., Peru, K.M., Headley, J.V., & Trudeau, V.L. (2013). Effects of naphthenic acid exposure on development and liver metabolic processes in anuran tadpoles. Environ. Pollut., 177 pp. 22–27.

Meyer, E.A., Cramp, R.L., & Franklin, C.E. (2010). Damage to the gills and integument of Litoria fallax larvae (Amphibia: Anura) associated with ionoregulatory disturbance at low pH, Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, Volume 155, Issue 2. Pages 164-171.

Nikoloff, N. (2013). Genotoxicidad de herbicidas de importancia agroeconómica en Argentina. Doctorado. UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MUSEO.

Othmani, M.A., Souissi, F., Ferreira da Silva, E.,& Coynel, A. (2015). Accumulation trends of metal contamination in sediments of the former Pb-Zn mining district of Touiref (NW Tunisia), Journal of African Earth Sciences doi: 10.1016/j.jafrearsci.2015.07.007.

Pander, J., & Geist, J. (2013). Ecological indicators for stream restoration success. Ecological Indicators, 30, 106-118.

Peltzer, P.M., Lajmanovich,R.C., Attademo,A.M., Junges,C.,Cabagna Z. M., Repetti,R.,Sigrist,M., & Beldomenico,H. (2013). Effect of exposure to con- taminated pond sediments on survival,development,and enzyme and blood biomarkers in veined tree frog(Trachycephalustyphonius) tadpoles. Ecotoxicol. Environ.Saf.98,142–151.

Peltzer, P.M.,Lajmanovich,R.C.,Attademo,A.M.,Junges,C.,CabagnaZenklusen,M., Repetti,R.,Sigrist,M., & Beldomenico,H. (2013). Effectofexposuretocon- taminated pondsedimentsonsurvival,development,andenzymeandblood biomarkers inveinedtreefrog(Trachycephalustyphonius) tadpoles.Ecotoxicol. Environ.Saf.98,142–151.

Plötner, J. & Matschke, J. (2012). Akut-toxische, subletale und indirekte Wirkungen von Glyphosat und glyphosathaltigen Herbiziden auf Amphibien-eine Übersicht. Zeitschrift für Feldherpetologie, 19(1), 1-20.

Rao. J & M. N. Madhyastha, M.N. (1987).Toxicities of some heavy metals to the tadpoles of frog, Microhyla ornata(Dumeril & Bibron). Toxicology Letters, vol. 36, no. 2, pp. 205–208.

Rowe, C., & Kinney, O., Fiori, A., & Congdon, J. (1996). Oral deformities in tadpoles (Rana catesbeiana) associated with coal ash deposition: Effects on grazing ability and growth. Fresh Biol. 36:723-730.

Sharma, B., & Patiño, R. (2009) Effects of cadmium on growth, metamorphosis and gonadal sex differentiation in tadpoles of the African clawed frog, Xenopus laevis. Chemosphere76:1048–1055

Stuart, S.N., Chanson, J.S., Cox, N.A., Young, B.E., Rodrigues, A.S.L., Fischmann, D.L., & Waller, R.W., (2004). Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science 306, 1783– 1786.

Torres, O., Ramos, M. (2013). Utilidad de la Prueba de Micronúcleos y Anormalidades Nucleares en Células Exfoliadas de Mucosa Oral en la Evaluación de Daño Genotóxico y Citotóxico. Int. J. Morphol, 31:650-657.

Valencia, L., Garcia, A., Ramirez,, P.M., Fuentes, J.(2011). Estimates of DNA damage by the comet assay in the direct-developing frog Eleutherodacty lusjohnstonei (Anura, Eleutherodactylidae). 34(4): 681-8.

Vera, J.C., Natale, G.S., Soloneski, S., Ronco, A.E., & Larramendy, M.L. (2010). Sublethal and lethal effects on Rhinella Arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles exerted by the pirimicarb-containing technical formulation insecticide Aficida®, Chemosphere, Volume 78, Issue 3. Pages 249-255.

Autor:

Cuero Villegas, Manuel Salvador

Maestría en Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima.