Evaluación de diferentes concentraciones en el efecto del nitrato de plomo en los embriones del pez Bagre bagre

El nitrato de plomo es un contaminante acuático que genera impacto negativo sobre diferentes ecosistemas, afectando el desarrollo de organismos como los peces. Este estudio se realizará con el fin de evaluar el efecto teratogénico del nitrato de plomo a diferentes concentraciones, sobre el desarrollo embrionario del pez Bagre bagre una variedad conocida también como pez gato, es uno de los recursos pesqueros más consumidos en el país, situación que ha derivado en una drástica disminución de la especie.

Se llevará a cabo un bioensayo exponiendo 360 ovocitos, a cinco concentraciones diferentes de nitrato de plomo, a un tiempo determinado de exposición, para esto se tuvo en cuenta el tiempo promedio que tarda el desarrollo de un embrión de pez, donde se evaluó el porcentaje de mortalidad y la posible incidencia de malformaciones en cada una de las dosis utilizadas. Este estudio está basado a partir de análisis de contaminación de agua, donde se analizan parámetros físico-químicos, toxicológicos de la misma, que establecen que un 44% de los bagres tienen rastros de plomo en la sangre.

Con estos resultados se puede inferir que el nitrato de plomo es un agente teratogénico para los embriones del Pez gato (Bagre bagre) incidiendo altamente en la cantidad de malformaciones que estos presentan y en la mortalidad, por tanto estos estudios permiten llegar a un acercamiento a las posibles partes afectadas que están asociadas al desarrollo del embrión.

2. DURACIÓN: 10 meses aproximadamente

Justificación

El bagre (Bagre bagre), es una especie de peces de la familia Ariidae y hace parte del orden Siluriformes, Los machos pueden llegar alcanzar los 55 cm de longitud total, se alimenta de peces e invertebrados por ejemplo, crustáceos, Es un pez demersal y de clima tropical. Se encuentran en el mar Caribe y océano Atlántico suroccidental (desde Colombia hasta la desembocadura del río Amazonas). Variedad conocida también como pez gato, es uno de los recursos pesqueros más consumidos en el país, situación que ha derivado en una drástica disminución de la especie.

El plomo es un metal inorgánico que genera múltiples efectos adversos en los organismos expuestos a este compuesto; puede afectar su capacidad de aprendizaje y reproducción, retardar su crecimiento, y generar numerosas lesiones en su metabolismo. Elevan sus valores normales de hematocrito (porcentaje de glóbulos rojos) y de proteína plasmática, lo que altera su salud. Además tiene la capacidad de almacenarse en los huesos aumentando su concentración en la cadena alimenticia hasta llegar a los humanos (Rubio C. et al. 2004). A diferencia de otros metales el plomo es un compuesto sin función fisiológica en lo seres vivos, en cambio genera alta toxicidad en los organismos expuestos a este elemento. Los esfuerzos por reducir los contenidos y emisiones de plomo no han sido suficientes pues sigue siendo un gran contamínate hasta el punto de encontrarse en la dieta humana. (Patte Oliver H., Deborah J. Pain. 2002).

Uno de los problemas ambientales más importantes y críticos de la actualidad es la contaminación acuática debido a las actividades industriales antrópicas. Los metales pesados son el tipo de contaminante que más impacto genera ya que su toxicidad, persistencia y capacidad de bio-acumulación afecta la capacidad de supervivencia de los organismos perturbando la dinámica poblacional de las especies y de esta manera la estructura y función ecosistémica (Posada, M. I & Arroyave,M.2006).

La toxicología ambiental permite analizar los efectos de los contaminantes evaluando la naturaleza de estos y las dosis que afectan, ya sea de manera toxica o nociva a los diferentes niveles estructurales de los seres vivos (Díaz-Báez 2004). La evaluación de la toxicidad de metales pesados en diversos organismos, es de gran importancia puesto que es una herramienta que define y describe las alteraciones físicas que experimenta dichos organismos ante un contaminante ya sea específico o combinado. La toxicidad o teratógeno de los contaminantes genera alteración en la morfogénesis temprana, lo cual influye en la aparición de malformaciones en estadios tardíos del desarrollo o incluso después de su eclosión. Algunos de estos problemas van a repercutir durante la etapa de alevín con saco vitelino causando mortalidades variables en los organismos (Osorio 2010).

Planteamiento del problema

Según un reporte del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), mientras que en 1977 se extraían 15.960 toneladas de bagre rayado, en el año 2008 la cifra bajó drásticamente a 839 toneladas, debido a la sobrepesca y al deterioro ambiental en la cuenca del río Magdalena. Uno de los metales pesados de uso común dentro de la industria es el plomo, el cual es utilizado en la elaboración de pigmentos, cables de energía y baterías eléctricas, entre otros (Osorio 2012).

Las deposiciones de desechos industriales o lixiviados de rellenos sanitarios han aumentado las concentraciones de plomo en el agua en forma de sal inorgánica (Nitrato de PlomoPb (NO3)2) acumulándose rápidamente (Petrucci 2003). Altas concentraciones de nitrato de plomo en el agua ocasionan efectos irreversibles en organismos acuáticos (Patte 2002), estos pueden ser teratogénicos, afectando sensiblemente la supervivencia de las larvas acuáticas, como los peces.

Se realizan pruebas toxicológicas para conocer los efectos de sustancias toxicas a distintos niveles de organización trófica, con el propósito de aportar herramientas para el control de calidad de agua por vertimientos y evaluación de compuestos específicos. Las pruebas in vitro sirven para determinar un estimado cuantitativo y cualitativo del potencial teratogénico permitiendo pronosticar sus efectos in vivo. Estos bioensayos son una fuente importante de información para la evaluación de ecosistemas intervenidos por el hombre lo que permite realizar planes de manejo de aguas, evitando y previendo la extinción de diferentes especies (Alarcón 2008).

Para obtener información sobre las alteraciones que se generan en organismos acuáticos debido a la contaminación del agua con este metal pesado es pertinente realizar investigaciones en organismos con alta sensibilidad a cambios ambientales. Uno de estos organismos es el Pez (Bagre bagre) que es utilizado en estudios que buscan entender las dinámicas de diversas sustancias toxicas. Donde es necesario conocer la información sobre su morfología, bioquímica y fisiología tanto en los estadios tempranos de desarrollo como en sus formas juveniles y adultas. Lo anterior hace que el uso del Pez sea ideal para la identificación de efectos adversos sobre la exposición a cualquier sustancia química (Sisman 2008).

Este estudio tiene como objetivo establecer los efectos adversos (teratogénicos) en el desarrollo del Pez (Bagre bagre) causados por el nitrato de plomo; determinando las malformaciones morfológicas macroscópicas, la toxicidad de este compuesto sobre esta especie y por ultimo analizar las relaciones entre las concentraciones, los tiempos de exposición y las malformaciones.

Marco teórico y antecedentes

8.1 Características generales del plomo

El plomo es un metal pesado no esencial y altamente tóxico. Su densidad es de 11,34 g/cm3, es altamente maleable, dúctil y bajo conductor eléctrico. Es constituyente de más de 200 compuestos en la naturaleza pero es relativamente raro encontrarlo en la corteza terrestre (0,016g Pb/Kg), sus emisiones naturales consisten en la degradación de rocas, actividades ígneas y decaimiento radioactivo, sin embargo la emisión antropogénica ha incrementado las concentraciones de plomo generando concentraciones más altas que las naturales, tanto en ambientes sólidos como acuosos (Patte 2002).

Es un metal muy usado en la industria, en la fabricación de pigmentos, recubrimientos, recipientes, ungüentos, baterías eléctricas e incluso algunos licores. Además presenta aplicaciones en la metalurgia como munición de armas, metal para cojinetes, cobertura de cables, compuestos de calafateo, plomo laminado, soldaduras, vidriado de cerámica y ciertos tipos de cristal. De igual manera, es utilizado en la fabricación de insecticidas, plaguicidas y gasolinas que contienen aditivos de plomo (Sandoval 2004), aunque estos han disminuido ante la prohibición de su uso (OMS 2006).

El nitrato de plomo Pb (NO3)2 es una sustancia cubica, cristalina e incolora, con una densidad de 4.53 g/cm3. Este compuesto se produce disolviendo plomo, monóxido o carbonato de plomo en ácido nítrico (Pauling, L.1951). Es uno de los pocos compuestos del plomo que es soluble (Petrucci 2003) y su uso principal, desde la edad media, ha sido la producción de pigmentos. Debido a que es un compuesto altamente soluble en el agua, puede contaminarla fácilmente, ya que los desechos de aguas negras de las industrias mencionadas anteriormente llegan directamente a cuerpos de agua.

• Toxicología del plomo

El plomo es una sustancia tóxica no específica a nivel molecular que inhibe la actividad de múltiples enzimas; entre los efectos más estudiados están los desórdenes sanguíneos por anemias y nerviosos afectando funciones cerebrales relacionadas con el aprendizaje, la supervivencia y el comportamiento; además de la reproducción (Patte 2002).

La susceptibilidad por toxicidad por plomo se encuentra principalmente en individuos jóvenes, donde puede afectar el desarrollo del sistema nervioso central (Garza 2005), sin embargo existen diferencias en el proceso toxicológico por múltiples factores como la edad, sexo, condiciones ambientales y fisiológicas; en términos generales es la dieta el aspecto más relevante para el incremento hasta niveles tóxicos de este compuesto.

Se han identificado múltiples efectos adversos en varios órganos y sistemas incluyendo el hematopoyético, renal, cardiovascular, reproductivo e inmunitario, se conoce que el plomo puede generar encefalopatías en gatos y perros expuestos a elevadas dosis, también afecta los huesos y se ha demostrado que es cancerígeno en ratas y ratones tratados con nitrato de plomo (WHO 1995). Es agente causal de anomalías congénitas en embriones debido a que es capaz de atravesar la barrera placentaria y afectar directamente al embrión. Se demostró que este compuesto puede transferirse de madre a hijo por medio de la leche mediante el trabajo con ratas en periodos de lactancia (Child, M. 1985).

Los efectos teratogénicos del plomo se asocian a malformaciones de la columna vertebral y medula espinal, estas alteraciones fueron descritas en hamsters después de la exposición a este compuesto. Además se ha demostrado gameto-toxicidad y efectos reproductivos en las crías de varias especies, estos efectos se evidencian en el cambio de tamaño (enanismo o gigantismo), peso y supervivencia de las crías (Child, M. 1985).

La toxicología del plomo en los peces es muy similar a la descrita para mamíferos, pues afecta las funciones orgánicas de manera similar en los mismos órganos y tejidos. Generalmente es más evidente en estados inmaduros como alevinos (Cordero 2007). En peces, se ha reportado que la exposición al plomo impide la captación de oxígeno por las branquias debido a la excesiva producción de moco, que las recubre y aísla. En los organismos expuestos a su incidencia se ha relacionado con inmunodepresión. La exposición al plomo por largos periodos de tiempo en peces induce efectos subletales en la morfología e inhibe la acción enzimática de encimas como la delta-ALAD, así como infertilidad, daños musculares y formaciones tumorales (Patte 2002).

• Pruebas de Toxicidad

Los ensayos biológicos o pruebas de toxicidad son herramientas para estimar el efecto de agentes físicos y químicos sobre organismos bajo condiciones experimentales específicas y controladas. Estos efectos pueden ser tanto de inhibición como de magnificación, evaluados por la reacción de los organismos tales como muerte, crecimiento, proliferación, multiplicación, cambios morfológicos, fisiológicos o histológicos (Ronco 2004). La toxicidad se define entonces como la capacidad de una sustancia para ejercer un efecto nocivo sobre los organismos o la biocenosis dependiendo de las propiedades químicas del compuesto su concentración, tiempo de exposición, frecuencia de exposición y su relación con el ciclo de vida del organismo (Ronco 2004).

• Teratogénia

Teratogénia viene del griego "terato" que significa monstro, hace referencia a los efectos negativos producidos durante el desarrollo embrionario y su etiología. Se puede evidenciar como malformaciones, las cuales son producidas cuando se expone el organismo a diferentes concentraciones de agentes tóxicos ya sean físicos (rayos X) o químicos (metales pesados) durante su embriogénesis (Gilbert 2006).

• Malformaciones congénitas

Las malformaciones congénitas hacen referencia a aquellas características que se adquieren durante el desarrollo embrionario y por ende se presentan en el momento de la eclosión (Burgos 1999).

En este estudio se pretende estudiar malformaciones implicadas en el desarrollo de la espina dorsal, estas suelen presentarse como desviaciones en la columna vertebral debido a daños parciales en el esclerotoma generando una curva en la columna vertebral. Estas malformaciones pueden ser en diferentes sentidos y se puede evaluar según el grado de curvatura. La escoliosis es la curvatura lateral de la espina dorsal usualmente en forma de una S o una C, estas pueden llegar a ser muy severas afectando la movilidad (Lonstein 1999). La cifosis es la curvatura excesiva de la columna torácica hacia la parte ventral del cuerpo. En diversos grados puede afectar la movilidad de los embriones. La lordosis es la curvatura excesiva de la columna en la región lumbar hacia la parte dorsal del cuerpo.

Otras anormalidades incluyen la fusión dorsal incompleta de las vértebras alrededor de la medula espinal generando espina bífida (Brown 1995). El vitelo adicional, se genera cuando los blastómeros en el estadio de blástula se proliferan aceleradamente y en desorden formando lo que se conoce como un ex ovado (Weigt 2010). Por otro lado se puede encontrar edema pericárdico, este se presenta como una acumulación de líquido en el espacio intersticial del pericardio aumentado su tamaño y alterando la contracción cardiaca lo cual puede causar la muerte del embrión (Robbins, S.L). Se puede evidenciar hemorragia cefálica, esta tiene lugar cuando existe una ruptura de un vaso sanguíneo encefálico debido a un pico de hipertensión o a un aneurisma congénito, al derramarse la sangre sobre los tejidos cerebrales se genera apoptosis, en algunos casos se puede generar derramamiento en la cúpula óptica del embrión (Robbins, S.L).

La hipertrofia en la aleta caudal, se presenta cuando existe algún tipo de desorden o anomalía en los tejidos de esta estructura. Se evidencia como un desorden de tejidos aumentando la proporción del tamaño de la aleta caudal (Samson 2000).

9. OBJETIVOS:

9.1 OBJETIVOS GENERALES

Determinar los efectos teratogénicos durante el desarrollo embrionario del Pez (Bagre bagre) causados por la exposición a 3 ppm, 1 ppm, 0.8 ppm, 0.5 ppm y 0,1 ppm de nitrato de plomo en un tiempo de 144 horas.

10. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Especificar el porcentaje de mortalidad en cada una de las concentraciones utilizadas.

• Describir las malformaciones morfológicas macroscópicas presentes en los embriones del Pez (Bagre bagre) expuestas a cinco concentraciones subletales de nitrato de plomo.

• Relacionar las malformaciones encontradas de acuerdo a las concentraciones y el tiempo de exposición.

Diseño metodológico

• Procedimiento en laboratorio:

El propósito Metodológico a Desarrollar implica llevar a cabo las siguientes actividades para obtener los productos deseados

• Primero se realizará una evaluación de Fertilidad de los Huevos de Bagre bagre.

• Estos huevos fertilizados serán puestos en las diferentes concentraciones. Se usará un número de 360 huevos fertilizados.

• Cada concentración tendrá 3 réplicas y en cada replica habrán 20 huevos.

• Se usarán 5 Concentraciones de Nitrato de plomo (0.1 ppm, 0.5 ppm, 0.8 ppm, 1 ppm y 3 ppm) y el Control.

• Se evaluarán hasta las 144 horas de exposición realizando un monitoreo (0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 144).

• Los embriones muertos serán removidos, para posteriormente reportarlos en tablas de mortalidad, concentración y tiempo de exposición.

• Se realizará un registro fotográfico de los embriones malformados.

• Se tomaría una muestra y se fija en formol buferizado.

• Finalmente poder realizar una descripción macroscópica del embrión teniendo en cuenta características normales.

• Diseño experimental.

El n-muestreal fue establecido por literatura, teniendo en cuenta el estudio realizado por Selderslaghs y col. (2009), en el cual la muestra era de 20 huevos por tratamiento, en este estudio se trabajó con el mismo número de embriones por replica. Se realizaron seis tratamientos con las siguientes concentraciones: 0,1 ppm, 0,5 ppm, 0,8 ppm, 1 ppm y 3 ppm y el control.

Los embriones de cada concentración serán evaluados hasta las 144 horas de exposición, en intervalos de 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 horas; aquellos embriones muertos serán removidos y podrán ser reportados en una tabla de mortalidad por concentración y los vivos se evaluarán macroscópicamente para evidenciar las malformaciones (Selderslaghs 2009).

• Tratamiento estadístico de los datos

Para los datos de mortalidad y malformaciones que se obtendrán de los bioensayos se aplicará un diseño completamente aleatorizado con igual número de réplicas, empleando una prueba de Ji Cuadrado (?2), con el fin de comparar la mortalidad entre el grupo control y los grupos experimentales (Box 2008). Adicionalmente se realizarán graficas comprando los diferentes tratamientos, las malformaciones y las horas de exposición de cada tratamiento.

Bibliografía

• 1. Alarcón, J. & Ardila, L. 2008. Determinación de la concentración letal media (CL50-48) de Daphniapulex por medio de bioensayos de toxicidad acuática con aluminio y plata. Tesis de pregrado. Universidad de la Salle. Facultad de Ingeniería ambiental y sanitaria. Bogotá, Colombia. 30- 31pp.

• 2. Box, G. Hunter, J. Hunter, W. 2008. Segunda edición. Estadística para investigadores diseño, innovación y descubrimiento. Editorial Reverté. España. pp 627.

• 3. Brown, C.L. & J. M. Núñez. 1995. Disorders of Development. Pp: 1-17 en: Leatherland, J.F., P.T.K Woo (eds). Fish Diseases and Disorders. Vol 2. Non infectious disorders. New York. USA.

• 4. Burgos, M.E. 1999. Malformaciones encontradas en alevines de salmón del atlántico (Salmo salar) provenientes de ovas nacionales e importadas en una piscicultura de la Décima Región, Chile. (Tesis de Grado). Universidad Austral de Chile. Facultad de Ciencias Veterinarias. Valdivia, Chile. 49p.

• 5. Child, M. 1985. Efectos del acetato de plomo en los embriones de Hyla labialis. (Tesis de pregrado). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá, Colombia. Pp. 5-7, 14-15.

• 6. Cordero, R. D. 2007. Presencia de metales pesados en Trucha (Salmo trutta Linnaeus: Salmonidae) en el lago de Tota (Boyacá, Colombia). Trabajo de grado. Universidad de los Andes. Facultad de Ciencias. Bogotá, Colombia. 10p.

• 7. Díaz-Báez, M; Bustos, M. & Espinosa, A. 2004. Pruebas de toxicidad acuática: fundamentos y métodos. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. 18p.

• 8. Garza, A., H. Chavéz, R. Vega, E. Soto. 2005. Mecanismos Celulares y Moleculares de la Neurotoxicidad por Plomo. Salud Mental. 28 (2):48-58.

• 9. Gilbert, F. S. 2006. Biología del Desarrollo. Séptima Ed. Editorial Médica Panamericana. Argentina. Pp 881.

• 10. Lonstein, John E. 1999. Congenital Spine Deformities: Scoliosis, Kyphosis, and Lordosis. Orthopedic Clinics of North America. 30(3):387-405.

• 11. Organización Mundial de la Salud (OMS). 2006. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. VOLUME 87. Inorganic and Organic. Lead Compounds. Lyon, France.

• 12. Osorio, A. 2010. Efectos del Nitrato de Plomo en la Embriogenesis de la Trucha Arcoíris Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792). (Tesis de pregrado). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá. 70p.

• 13. Pauling, L.1951. Química general: una introducción a la química descriptiva y a la moderna teoría química. Segunda Edición. Editor Aguilar. Madrid. 460p.

• 14. Petrucci, R; Harwood, W. & Herring, F. 2003. Química general. Octava Edición. Pearson Educación S.A. Madrid. 897p.

• 15. Posada, M. I & Arroyave, M. 2006. Efectos del mercurio sobre algunas plantas.

• 16. Robbins, S.L. & Angell, M. 1983. Patología Básica. Segunda edición. Nueva Editorial Interamericana S.A. México D.F. Pp. 10-11, 75

• 17. Ronco, A., M. Días Baez, Y. Pica Granados. Conceptos Generales. En Castillo, G. (ed). 2004. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización, Intercalibración, Resultados y Aplicaciones. Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo. Mexico. pp 232.

• 18. Samson, Jennifer C. & Jonathan Shenker. 2000. The teratogenic effects of methylmercury on early development of the Zebrafish, Danio rerio. Acuatic Toxicology. 48:343-354.

• 19. Sandoval, M. T., Pérez, C. & Herkovits, J. 2004. Teratogénesis y alteración del desarrollo de embriones de Bufo arenarum por exposición al plomo. Reunión de comunicaciones científicas de la Universidad Nacional del Nordeste. Buenos Aires, Argentina. 10p.

• 20. Selderslaghs, Ingrid W.T., An R Van Rompay. Wim De Coen, Hilda E. Witters. 2009. Development of a screening assay to identify teratogenic and embriotoxic chemicals using the Zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28:306-320.

• 21. Sisman T., Fatime G., 2008. The teratogenic effects of polychlorinated naphthalenes (PCNs) on early development of the Zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Pharmacology 25:83–88.

• 22. Weigt, Stefan, Nicole Huebler, Thomas Braunbeck, Friedrich von Landenberg. 2010. Zebrafish teratogenicity test with metabolic activation (mDarT): Effects of phase I activation of acetaminophen on zebrafish Danio rerio embryos. Toxicology. 275:36-49.

• 23. World Health Organization. 1995. Environmental Health Criteria 165. Inorganic Lead. Gneva, Suiza. 29p.

Autor:

Giovanny Andres Giraldo Barbosa

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:

BIOLOGÍA DEL DESARROLLO EN PECES