Avances en técnicas para el diagnóstico de enfermedades virales en animales

• Introducción

Las infecciones virales han sido reconocidas como causa importante de morbilidad y mortalidad, especialmente en poblaciones inmunocomprometidas. Uno de los mayores retos que enfrenta la medicina actualmente es el diagnóstico de entidades virales. Durante las últimas décadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas para evidenciar las causas de tipo viral, hace posible que estas entidades se puedan descubrir y estudiar no sólo a nivel de laboratorios especializados, sino también en los comunes. Las pruebas diagnósticas simples, rápidas y poco costosas para la demostración de antígenos han reemplazado las técnicas tradicionales, largas y dispendiosas y esto ha producido una mayor agilidad en la definición del diagnóstico. (Herrero Uribe, 2004).

Algunos virus de animales pueden causar infecciones a humanos o pueden mutar y dar lugar a estas. El Síndrome respiratorio agudo severo (SARS), el cual viene de una fuente animal, ha llevado a un brote de infección humana y destaca la importancia de los virus albergados por los animales. El virus de la influenza, que persiste en su hospedero natural las aves, a veces puede infectar a los humanos (virus zoonotico). El estudio de los virus animales contribuye a nuestra comprensión de la infección viral en general. (Thomas C. Mettenleiter y Francisco Sobrino, 2000)

El diagnóstico viral por el laboratorio es de gran ayuda para confirmar la etiología, así como para el seguimiento clínico de la entidad. Adicionalmente, realizar un diagnóstico adecuado permite conocer la epidemiología de la infección viral y determinar las connotaciones que implica a nivel de salud pública; tal es el caso de infecciones como el dengue y la fiebre amarilla. Por las características estructurales, ecológicas y biológicas de los virus, su demostración in vitro es y será uno de los mayores retos a los que se enfrentan los científicos. (Maria del pilar crespo. 2000)

Al igual que la mayoría de los microorganismos, los virus se pueden descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas directas son las que evidencian al virus o algunos de los antígenos virales que se pueden encontrar presentes en los tejidos o fluidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se utilizan con más frecuencia y básicamente demuestran un contacto del huésped con el agente viral mediante la determinación de anticuerpos específicos contra el virus. En muchos casos el diagnóstico de infección viral se hace por el cuadro clínico del paciente y la presencia de anticuerpos contra el agente viral sospechoso; sin embargo, hay algunas técnicas rápidas para demostrar los antígenos virales y también se sabe de técnicas para amplificar su material genético. No obstante la variedad de pruebas diagnósticas que se han desarrollado, es necesario tener en cuenta que para un óptimo diagnóstico de las entidades virales, debe haber una adecuada indicación, recolección y transporte de las muestras que se han de analizar para este propósito.Esta revisión brinda un resumen sobre el tema, se revisa a partir publicaciones científicas los avances en las pruebas para el diagnóstico de enfermedades virales, así como también las pruebas de diagnóstico con mayor aplicabilidad en detección de estos virus. (Herrero Uribe, 2004).

Para iniciar un reciente estudio denominado: "Methods for molecular surveillance of influenza" del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda en EE.UU. Evidencia como su nombre lo indica las técnicas moleculares más usadas en la detección de virus de la gripe y como estas se han convertido en un componente integral de los programas de vigilancia humana y animal en las últimas dos décadas a través de evidencia científica. 

Tras la pandemia generada por la influenza porcina tipo A (H1N1) y la circulación continua de la influenza aviar altamente patógena (H5N1) se han reforzado la necesidad de una identificación rápida y precisa del virus de la influenza para la vigilancia, la gestión de los brotes, el diagnóstico y el tratamiento. Ha habido notables progresos en la detección y caracterización molecular de las infecciones de virus de la gripe, aves mamíferos domésticos y aves silvestres en los últimos años. (Ruixue Wang y Jeffery K Taubenberger. 2010).

El virus de la influenza es de cadena simple de forma helicoidal, es un virus RNA de la familia de los orthomyxovirus. Los antígenos básicos tipos A, B y C son determinados por el material nuclear. Influenza tipo A tiene subtipos que son determinados por antígenos de superficie de hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Tres tipos de hemaglutinina en humanos (H1, H2 y H3) tienen un papel en el ataque de los virus a las células. Dos tipos de neuraminidasa (N1 y N2) tienen un papel en la penetración de los virus en las células.Influenza A causa enfermedad de moderada a severa, y afecta todos los grupos de edades. El virus infecta humanos y otros animales, como los puercos y pájaros.Influenza B generalmente causa enfermedad más leve que el tipo A, y primordialmente afecta a los niños. Influenza B es más estable que influenza A, con menor inestabilidad antigénica y consecuencias en la estabilidad inmunológica. Este afecta solo a humanos. Puede ser asociado con el síndrome de Reye. Influenza C es raramente reportada como causa de enfermedad humana, probablemente porque la mayoría de los casos son subclínicos. No ha sido asociada con enfermedad epidémica.

• Métodos basados en PCR

PCR convencional / Transcriptasa inversa-PCR

El desarrollo de la transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR) ha permitido el rápido y preciso diagnóstico de la gripe por virus A través de la detección sensible de determinadas secuencias de ácido nucleico viral. La mayoría de las técnicas de PCR-RT se llevan a cabo ya sea por una sola fase o en dos etapas de RT-PCR. 

• Un paso de RT-PCR combina la transcripción reversa y PCR, junto con uno de los cebadores de la PCR, oligo (dT)-iniciadores o cebadores aleatorios para la transcripción reversa.

• La otra fase se lleva a cabo mediante la realización de la transcripción reversa, seguido por PCR. 

En este método al mismo tiempo se puede amplificar segmentos de ARN directamente desde la nasofaringe humana y muestras orofaríngeas independientemente del subtipo de virus. Esta amplificación del genoma completo del virus de influenza A pueden superar las dificultades del análisis de algunos virus que no son fácilmente recuperados por el aislamiento convencional del virus y proporcionar información precisa sobre el subtipo de virus con el posterior secuenciamiento.

PCR en Tiempo Real / RT-PCR

PCR en tiempo real es un acontecimiento clave en la tecnología basada en PCR.Esta técnica utiliza la química y la instrumentación de las plataformas para amplificar y cuantificar simultáneamente una molécula de ADN específica. En la actualidad, son cuatro técnicas diferentes de uso general: TaqMan ® , Molecular Beacons, Scorpions ® y SYBR ® Green para PCR en tiempo real. 

Todos estos químicos permiten la detección de productos de PCR a través de la generación de una señal fluorescente. PCR en tiempo real es ahora ampliamente utilizado en la detección de virus de la gripe A, el diagnóstico y la vigilancia debido a su alta sensibilidad, buena reproducibilidad y rango dinámico ancho de cuantificación, con potencial de alto rendimiento y proyección de un gran número de muestras. En la última década, la PCR en tiempo real se ha convertido en la herramienta más útil para la detección del virus de la influenza aviar (AIV) así como para su vigilancia de rutina brote e investigación.

Multiplex PCR

Multiplex PCR es una variante de la PCR que amplifica el ADN simultáneamente varios objetivos con más de un par de cebadores en un tubo de reacción.Combinado con los sistemas convencionales de RT-PCR o PCR en tiempo real, PCR múltiple se ha utilizado con éxito en la detección, tipificación y subtipificación de virus de influenza A y puede proporcionar la detección exacta del virus de la gripe. La mayoría de los métodos desarrollados para la PCR múltiple se han centrado en la identificación de la cepa H5N1 en la última década. Más adelante identificaremos a fondo la avances en esta técnica a través del estudio realizado por Fang Shisong et al. 2011.

Detección simultánea de virus de la influenza tipo B y el virus tipo A subtipos H1N1, H3N2 y H5N1 usando Multiplex PCR  en tiempo real RT-PCR Este estudio fue realizado por Fang Shisong et al. 2011. A pesar de ser el aislamiento del virus en cultivo celular la técnica que ha servido durante mucho tiempo como el estándar de oro para el diagnóstico del virus de la influenza, el enfoque por sí solo es ineficaz cuando se producen brotes en todo el mundo, es menos sensible y requiere más tiempo. En la actualidad, métodos más rápido con mayor sensibilidad y especificidad se han desarrollado, como la inmunofluorescencia, la enzima inmunoensayo, y los métodos de biología molecular, que incluyen la técnica RT-PCR, la cual se ha convertido en la principal técnica de detección viral en el caso de generarse un brote de pandemia gracias a su conveniencia, la velocidad y precisión.

En este estudio La sensibilidad de los ensayos puede alcanzar un límite de detección de aproximadamente entre 102 y 101 copias por µL, que son más sensibles de lo normal y son similares a la de la señal en tiempo real RT-PCR y transcriptasa reversa en tiempo real múltiplex previamente realizado por otros investigadores. La diferencia de sensibilidad entre los distintos subtipos puede atribuirse a una serie de factores. Por ejemplo, el diseño pares de primers / sondas, como también las condiciones de reacción son más favorables para ampliaciones de H5, B, y los genes N1. El ensayo múltiplexRT-PCR en tiempo real en el presente estudio han demostrado tener una alta especificidad y sensibilidad casi se acerca100%, ya que reconoció con éxito todos los resultados positivos, así como subtipos, de un gran número de muestras clínicas.La eficiencia de amplificación de PCR es un indicador importante para evaluar el desempeño de los sistemas de PCR en tiempo real. En el presente estudio, se utilizaron os métodos para determinar la Eficiencia de amplificación de PCR. Uno de ellos fue por la medición de la pendiente de la regresión lineal de la trama de amplificación con la TC frente a cada dilución en serie de la ARN transcrito in vitro. La eficiencia en el uso de ARN transcrito in vitro, fue entre 103% y 110%. Los resultados indican que las interacciones no-específicas de estos cebadores y sondas utilizadas en los dos sistemas múltiplex eran débiles. Sin embargo, en otra prueba con las cepas de virus, subtipo H1dio un rendimiento inconsistente con su serie diluciones posiblemente causadas por amplificaciones inespecíficas. 

En conclusión, la técnica multiplex PCR  en tiempo real RT-PCR ofrecen una respuesta rápida, sensible, específica, estable y ampliamente aplicable para la identificación y subtipificación del virus de la influenza humana, incluido el H1N1, H3N2,5N1, y B. El método se puede seguir estudiando para convertirse en una herramienta de diagnóstico para la detección del virus de la influenza cuando se trata de  muestras clínicas en la vigilancia diaria y durante los brotes de virus de la gripe. (Fang Shisong, et al. 2011).

Desarrollo rápido de SYBR un paso en RT-PCR tiempo real para la detección del virus del síndrome reproductivo y respiratorio. Realizado por Hong Tian, et al 2010. El SYBR Green es un agente intercalante utilizado en la tinción de ADN para el análisis por electroforesis de productos de PCR, o como fluorocromo utilizado como medio de visualización directa de los productos de la PCR en tiempo real. Esta molécula se introduce en la estructura secundaria de la doble hélice del ADN y se acopla energéticamente a los ácidos nucleicos que lo forman, de manera que se incrementa notablemente su tasa de emisión fluorescente.Detección precoz del virus del síndrome respiratorio porcino y reproductiva (PRRSV) en las muestras de campo es eficaz para el control de virus del síndrome reproductivo y respiratorio (PRRS), reduciendo así el daño económico potencialmente grave que puede resultar de un brote. En este estudio, una rápida SYBR, ha sido desarrollada para la detección del virus del síndrome reproductivo y respiratorio (PRRS). Cebadores fueron diseñados sobre la base de la secuencia de la región muy conservadora de PRRSV gen N. En tiempo real RT-PCR tiene varias ventajas sobre RT-PCR convencional. En primer lugar, es más rápido y sensible. En segundo lugar, se realiza en un tubo de un sistema cerrado y evita la contaminación cruzada durante la preparación del potencial de la muestra para el análisis post-PCR. Ensayos de PCR-RT en tiempo-real han sido ampliamente utilizados para el diagnóstico precoz de muchas otras enfermedades virales de los animales. (Agüero M, et al.2007) y (Shaw AE, et al. 2007).  En este estudio un paso real PCR-RT una vez se ha desarrollado y evaluado para la detección de PRRSV en muestras de campo. El ensayo se describe en este informe genera resultado completo en 2 horas y puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico rápido. El ensayo de un solo paso de RT-PCR en tiempo real que describe este estudio parece ser un método sencillo, sensible, específico y rápido para la detección y cuantificación de PRRSV en muestras de campo (Tian et al.2010). 

• Métodos basados en la secuencia de ácidos nucleicos

Microarrays de ADN

La tecnología de microarrays del ADN, contiene oligonucleótidos inmovilizados, se puede utilizar para detectar miles de secuencias de ácidos nucleicos diferentes al mismo tiempo. También proporciona un medio para la identificación y tipificación del virus de la gripe A. Una matriz de ADN, MChip, fue desarrollada para subtipos del virus de la gripe A seleccionando un segmento del gen de la matriz de la gripe A. Este método fue evaluado con 16 subtipos de H1N1, incluyendo un (A/Brevig Mission/1/1918). MChip logró detectar el segmento de genes de la matriz de los 16 virus. Townsend et al. 2066 desarrollaron una densidad de microarrays (FluChip-55 [InDevR] para el subtipo del virus H1N1, H3N2 y H5N1 (Townsend MB, et al. 2006). En 2009, una nueva versión de los microarrays patógeno (gripe TessArray RPM 3.0 y 3.1 [teselas, LLC, VA, EE.UU] fue diseñado para la identificación y detección de todos los subtipos de virus de la gripe (Lin BC et al. 2009). Huang et al. 2009 desarrollaron un ensayo de combinación de un paso de transcripción reversa-PCR multiplex con la tipificación y subtipificación de un microarray, dirigida a los H1, ??H3, H5 y N1, N2 y los genes de la matriz de la gripe A y NS de genes del virus de la influenza virus B (Huang Y, et al. 2009).

Señal de mejora en microarrays de ADN utilizando un tinte nanopartículas de silicio: aplicación a la detección Virus del Papiloma Humano (VPH).Este estudio fue realizado por Raffaele Riccò, et al. 2010 en  Venecia, Italia. Los microarrays de ADN son una herramienta poderosa para establecer un paralelo entre los ácidos nucleicos y otras moléculas biológicamente significativas. En este estudio se informa sobre una ruta de síntesis fácil y barata para la incorporación de colorantes orgánicos en nanopartículas monodispersas de sílice inorgánicos y su aplicación en la detección de riesgo carcinógeno humano del Virus del Papiloma utilizando la tecnología de microarrays de ADN. Correlacionamos nuestro sistema convencional con colorantes directos y puntos cuánticos comerciales, con un aumento prometedor en señal óptica, y una disminución de la relación del límite de detección, dando así una mejora notable en esta técnica para el diagnóstico precoz de enfermedades y detección de trazas nivel de peligro contaminantes biológicos. Estas nanoestructuras son un etiquetado adecuado en la diapositiva de cristal de microarrays para la detección de moléculas de ADN viral, utilizando el sistema de vinculación clásica constituida por la estreptavidina, biotina y conjugados. Las nanopartículas son muy monodispersas, presentan una forma esférica regular de 250 nm de diámetro aproximadamente y no global, incluso si se secan. Además, la modificación de la superficie no afecta a la forma o el tamaño de las partículas o su agregación que el anterior.El desarrollo de las etiquetas más eficiente para las aplicaciones de microarrays de ADN basado en nanopartículas de sílice luminiscentes se ha investigado e informado. Hemos encontrado que la incorporación de colorantes en las esferas de sílice en lugar de colorantes libre da muy buenos resultados en términos de intensidad de la señal. Estas nanopartículas luminiscentes eran más adecuadas que los puntos cuánticos comerciales con el estándar de equipos de escaneo, gracias a su mejor superposición de los espectros de excitación y de emisión a las características técnicas de los instrumentos comerciales [F. Enrichi, et al. 2010].

• Pyrosequencing

Pyrosequencing es una técnica de secuenciación del ADN basada en la liberación de pirofosfato en la incorporación de un nucleótido en una secuencia de ADN naciente para proporcionar los datos de secuenciación directa. En una cascada de reacciones enzimáticas, la luz emitida se genera en un nivel proporcional al número de nucleótidos incorporados. Como parte de una mayor vigilancia para la aparición de virus resistentes, el método de pirosecuenciación ha demostrado ser una poderosa técnica. Se ha utilizado para la rápida detección de marcadores moleculares de resistencia a los bloqueadores de los canales iónicos-M2 e inhibidores de la NA en la influenza AH5N1 (Deyde VM et al. 2009) y recientemente también se ha empleado para detectar y cuantificar la resistencia al fármaco inhibidor de la neuraminidasa (NA) [Lackenby A, et al. 2008].

Detección de arbovirus en insectos vectores por Pyrosequencing rápida y de alto rendimiento.Estudio realizado por A. Bishop-Lilly, et al 2010. A pesar de la amenaza global causada por los virus transmitidos por artrópodos, no existe un método eficiente para la detección de vectores y sus secuencias virales. La detección actual viral y los métodos de vigilancia basados ??en la cultura puede ser costoso y el tiempo y se basan en el conocimiento previo del agente etiológico, ya que dependen de oligonucleótidos específicos o anticuerpos. Por lo tanto, estas técnicas pueden ser inadecuadas para situaciones en las que el agente causante de un brote es desconocido. En este estudio se exploró el uso de pirosecuenciación de alto rendimiento para la vigilancia de los virus ARN transmitidos por artrópodos. El virus del dengue, un miembro de la cadena positiva de ARN de la familia Flavivirus que se transmite por varios miembros del género Aedes de mosquitos, se utilizó como modelo. mosquitos Aedes aegypti infectados experimentalmente con el virus de dengue tipo 1 (DEN-1) se combinaron con los mosquitos no infectados para simular muestras derivadas de los programas permanentes de vigilancia de arbovirus. Utilizando métodos aleatorios, se realizó transcripción inversa del ARN total y la consiguiente cDNA fue sometida a 454 pirosecuenciaciónes. En dos tipos de muestras, una con 5 mosquitos adultos infectados por DEN-1 y el otro con un DENV-1 mosquito infectado y 4 mosquitos no infectados, se identificaron DENV-1 secuencias de ADN. DENV-1 secuencias no fueron detectados en un grupo de control no infectado. Se calculó la proporción infecciosa de Aedes metagenoma aegypti aportados por cada genoma del virus del dengue (p IP), que osciló entre 2,75 × 10 -8 a 1,08 × 10 -7. DENV-1 RNA se concentra lo suficiente en el mosquito que su detección fue posible mediante la instrumentación actual de secuenciación de alto rendimiento. También se identificaron algunos de los componentes de la microflora del mosquito en la base de la secuencia del ARN expresado. Esto incluía a miembros de los géneros bacterianos Pirellula y Asaia, diversos hongos, y un caracterizados mycovirus potencialmente (A. Bishop-Lilly, et al. 2010).

• NASBA

Se fundamenta en una amplificación basada en la transcripción y una detección basada en un método de electroquimioluminiscencia. Cada muestra se procesa con tres controles o calibradores internos presentes a concentraciones diferentes (100, 10 y 1) que se diferencian entre si y del ARN amplificado del VIH en 20 nucleótidos. La reacción de RT se lleva a cabo sobre la muestra y los calibradores mezclados, dando lugar a ADN de doble cadena; toda la amplificación se realiza a una misma temperatura (isoterma) y uno de los iniciadores contiene una zona promotora necesaria para la actuación de la ARN-polimerasa T7 que sintetiza ARN a partir de ADNc. La detección se basa en la emisión de luz por parte de átomos de rutenio unidos al ARN amplificado, que se cuantifica y extrapola sobre una recta obtenida a partir de la emisión de los calibradores.

• Amplificación Isotérmica Mediada por bucle (LAMP)

Recientemente, se desarrolló una nueva variante de la técnica de PCR llamada Amplificación Isotérmica Mediada por bucle (LAMP: Loop-Mediated Isothermal Amplification Method) . Esta metodología utiliza múltiples iniciadores ("primers") y condiciones isotérmicas (60-65 °C) para la amplificación de la secuencia blanco, en un tiempo relativamente corto (30 min-1h), utilizando la Bst-DNA polimerasa (Bst-DNApol). LAMP no requiere termociclador para garantizar los ciclos de denaturalización-reasociación para la hibridación de los primers y la actividad de la polimerasa, como ocurre en la PCR. Similar a una reacción de PCR anidada ("nestedPCR"), LAMP requiere de varios primers, 4 a 6, que reconocen y se unen por homología a distintas regiones del blanco; estos primers pueden generarse a través del software Primer Explorer v3. La síntesis de DNA es producto de la actividad de polimerización y desplazamiento de cadena de DNA por parte de la polimerasa, debido al anclaje permanente de los primers sobre los productos de amplificación que se generan. La reacción genera en corto tiempo una cantidad extraordinaria del producto de amplificación. El proceso es altamente específico y de una sensibilidad comparable al mejor ensayo de PCR. La observación del producto de amplificación puede hacerse visualmente por turbidez o por cambio de color asociado a reactivos propios de la reacción. Dada la simplicidad de LAMP, se han desarrollado distintos ensayos de alta especificidad, sensibilidad y facilidad de uso en condiciones de campo para el diagnóstico molecular de varios agentes infecciosos (Njiru ZK, et al. 2008). También se ha utilizado para detectar virus de influenza A subtipo H3 y H1 y cepas de virus de la gripe B (Ito M, et al. 2006.).

Desarrollo de un ensayo de amplificación isotérmica mediada bucle para la detección rápida del virus del subgrupo J de leucosis aviar. Estudio realizado porZhang Xiaotao, et al 2010. La infección de las bandadas reproductoras en China con el virus del subgrupo J de leucosis aviar (ALV-J) se ha incrementado recientemente. En este estudio, hemos desarrollado un bucle de amplificación isotérmica mediada por la Alfabetización (LAMP) ensayo para la detección rápida de ALV-J de la cultura aislados y muestras clínicas. El ensayo LÁMPARA ALV-J-específica eficiente amplifica el gen diana dentro de 45 min a 63 ° C con sólo un simple baño de agua de laboratorio. Para determinar la especificidad de la prueba LAMP, diversos subgrupos ALVs y otros virus relacionados se han detectado. Un patrón de escalera en la electroforesis en gel se observó en ALV-J aislados, pero no para otros virus. El límite de detección del ensayo LÁMPARA fue de 5 copias del gen diana / reacción, que era hasta 20 veces superior a la de la PCR convencional. Para evaluar la aplicación de la prueba de lámpara para la detección de ALV-J en muestras clínicas, 49 muestras sospechosas de infección ALV de manadas reproductoras fueron probados por el ensayo de LAMP y PCR. Por otra parte, el aislamiento del virus de estas muestras se llevó a cabo también mediante cultivo celular. Las relaciones positivas de la muestra fueron 21/49 (43%) mediante PCR convencional, 26/49 (53%) por el ensayo de LAMP, y 19/46 (41%) por el aislamiento del virus. Además, una reacción positiva de la lámpara puede ser visualmente comprobada por la observación de turbidez o un cambio de color después de la adición de colorante SYBR Green I. En consecuencia, el ensayo de LAMP es un método de diagnóstico sencillo, rápido y sensible y potencialmente se pueden desarrollar para la detección rápida de la infección ALV-J en el campo [Urisman ARJM, et al. 2006].

Identificación de infecciones virales en la próstata y la evaluación de su asociación con el cáncer. Este estudio fue realizado por Margarita L Martinez, et al. 2010 en el departamento de Bioquímica y Medicina Molecular del Hospital Universitario de la Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey en México. La metodología básicamente se basó en el estudio de 130 sujetos (55 casos de cáncer de próstata y 75 controles). ADN y ARN aislado de los tejidos de la próstata fueron examinados para detectar la presencia de genomas virales, se realizó por el método de Taqman. La evaluación de la variante R462Q (rs486907) de RNASEL se realizó mediante el ensayo Taqman (Applied Biosystems: ABI, Foster City, CA), según lo informado por Urisman et al. 2006[12]. En la primera etapa, 10 ng de DNA fueron amplificadas por PCR. En un segundo paso, la discriminación alélica se realizó mediante la RT-PCR con el sistema de StepOne v2.0 (Applied Biosystems).Antes de detección del tejido de la próstata para el ADN viral, se realizó una etapa de validación de los protocolos seleccionados para la identificación del virus, este se llevó a cabo para establecer las detecciones copia. Esto se logró a través de la amplificación por PCR convencional, utilizando diluciones seriadas de los plásmidos del control para cada virus que consiste de 600.000 a 60 copias virales. Los productos de reacción se sometieron a electroforesis a través de geles de agarosa al 3% y visualizados por tinción con bromuro de etidio. Los productos PCR de las muestras que fueron positivos para las secuencias virales fueron purificados por el Asistente para SV y PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI). La secuencia directa se realizó con el BigDye ® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1 (Applied Biosystems) y se analizaron mediante el Avant 3100 Genetic Analyzer. Las secuencias se compararon con las secuencias de referencia reportados para cada virus.

Genotipos de VPH de ADN fueron distinguidos con el Linear Array VPH Genotyping Test (Roche Diagnostics, Basel, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los resultados fueron validados por dos muestras de secuenciación.

Un total de 130 hombres (55 casos de cáncer de próstata y 75 controles) fueron incluidos en el estudio. La mayoría (92,3%) de los sujetos eran del noroeste de México. Para los hombres con el PC, el 47,3% eran mayores de 70 años de edad, mientras que 24,0% de los controles eran mayores de 70 años. La edad media de los casos fue de 71 años (rango: 36-88) y la edad media de los controles fue de 66 años (rango: 50-88), p = 0,003. Hubo una diferencia estadística en los valores de PSA entre los grupos de casos y control (p 10,0 ng / ml. Los factores genéticos, como la variante de R462Q RNASEL, pueden desempeñar un papel en la etiología de la PC. Además, las infecciones virales de la próstata también se han sugerido como factores de riesgo importantes relacionados por el virus para PC, en particular, las infecciones por citomegalovirus, virus JC y BK, de alto riesgo del VPH, y más recientemente, el XMRV. Sin embargo, los estudios diseñados para replicar la asociación ya sea de la variante R462Q o infecciones virales con el PC han producido resultados contradictorios en todo el mundo. Este estudio evaluó la asociación entre las infecciones virales, la variante de R462Q RNASEL, y PC. Nuestros resultados muestran una baja frecuencia de Q / Q sujetos homocigotos (6,7% en los controles y 0,0% en los casos) en comparación con los encontrados en estudios previos (5,7 a 13,3%) y las asociaciones con este genotipo no se pudo demostrar. Se encontró asociación entre el PC y la infección de próstata por el VPH. El 462Q / genotipo Q RNASEL no estuvo representada en los casos de PC, por lo tanto las interacciones entre las infecciones virales de próstata, PC, y el alelo 462Q no pudo ser probada (Shook SJ, et al. 2007).

Matriz péptido-ácido nucleico para la detección de mutaciones puntuales en el virus de la hepatitis B asociado con la resistencia antiviral.Realizado por Jang Hyunjung, et al 2010. La detección de mutaciones antivirales resistente a virus de la hepatitis B (VHB) es importante para el control de la respuesta al tratamiento y para las decisiones de tratamiento eficaz. Hemos desarrollado una matriz con sondas de ácido nucleico peptídico (PNA) para detectar mutaciones puntuales en el VHB asociadas con resistencia a los antivirales. Sondas de PNA se han diseñado para detectar mutaciones asociadas con resistencia a lamivudina, adefovir y entecavir . El ensayo matriz ANP fue lo suficientemente sensible para detectar 10 2 copias / ml. El ensayo de la matriz de ácidos nucleicos peptídicos (ANP) fue capaz de detectar mutantes presente en más del 5% de la población del virus cuando el total de concentración de ADN del VHB fue superior a 104 copias / ml. Se analizaron un total de 68 muestras clínicas de este ensayo y validado su utilidad mediante la comparación de resultados con los del método de secuenciación. La matriz de la ANP identifico correctamente mutantes virales y tiene una alta concordancia (98,3%) con la secuenciación directa en la detección de mutaciones resistentes a antivirales. Nuestros resultados muestran que la matriz de la ANP es sensible y fácilmente aplicable a un ensayo rápido para la detección de mutaciones resistentes a antivirales en el VHB. Por lo tanto, la matriz de la ANP es una poderosa herramienta de diagnóstico y útil para la detección de mutaciones puntuales o polimorfismos (Hyunjung Jang, et al. 2010).

Detección de VEB, VHB, VHC, VIH-1, HTLV I y II y SMRV en líneas celulares humanas y otros primates.Estudio realizado por Cordón Uphoff C, et al 2010. Las culturas humanas de células primarias y líneas celulares se han convertido en herramientas fundamentales para la investigación básica en numerosas facultades de ciencias de vida, así como para la producción de reactivos bioactivos en la biomedicina y la biotecnología. Ya se utilizan desde hace varias décadas y los cultivos celulares congelados o muestras de sangre y tejidos obtenidos hace muchos años se pueden encontrar en numerosos laboratorios. Como la experiencia ha demostrado en la medicina de transfusión y trasplante, las células humanas pueden albergar un número de diferentes patógenos humanos y transmitir un riesgo potencial para llegar a infectarse. En los virus patógenos humanos en particular, como la inmunodeficiencia humana tipo 1 del virus (VIH-1), de células T humanas de la leucemia / linfoma tipo de virus I y II (HTLV-I y II), y el virus de la hepatitis, por ejemplo, virus de la hepatitis B (VHB) y virus de la hepatitis C (VHC), se encuentran en donantes humanos y materiales de pacientes.  Las líneas celulares se han establecido por lo general de pacientes que igualmente podrían estar infectados con los virus o tal vez con virus relacionados con tumores específicos, por ejemplo, el virus del herpes humano 8 (HHV-8) o nuevos tipos de virus del papiloma. Un porcentaje considerable de las líneas celulares se estableció antes de la contaminación viral, han sido sistemáticamente analizadas. Además, el riesgo de patógenos emergentes tiene que ser mantenido bajo constante revisión. En este reporte se describe el uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), el sur y Western blot para la detección de formas activas y latentes de los virus patógenos humanos (VEB, VHB, VHC, VIH-1, HTLV I y II), SMRV, y los retrovirus en general en un gran panel de líneas continuas de células de primates para determinar el riesgo potencial y el manejo de estas líneas celulares. En cuanto a EBV, la inducibilidad del ciclo lítico fue investigado por el tratamiento de las líneas de células con infección latente con el éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) y el butirato de sodio (Na-butirato). En resumen, se ha demostrado que otros primates y las líneas de células humanas obtenidas directamente de un centro de recursos biológicos no tienen un riesgo alto contaminantes virales y por lo tanto no representan riesgos de seguridad para los cultivadores de la célula. Los ensayos de PCR proporcionan un robusto, rápido, barato, sensible, y un método fiable para el cribado de rutina. La característica adicional de incorporar un control interno en cada ensayo reduce la posibilidad de datos falsos. Es importante destacar que, a diferencia de micoplasmas, otras infecciones bacterianas y la línea de la contaminación cruzada de células, los virus no se difunde entre las líneas celulares de células debido a la técnica de cultivo pobres. Sólo una pequeña parte de la EBV + líneas celulares produce virus activo o puede ser estimulado para su producción. La detección de BZLF1 proteína por Western blot, secuencias TR por Southern blot, y FISH en interfase se puede aplicar a reconocer las líneas de células productoras activas partículas EBV y asignar un cultivo de células a un grupo de riesgo legal.Recientemente se han establecido líneas celulares, debe hacerse la prueba de infecciones-VEB para detectar el VEB transformado de células B que dan lugar a B-LCLs. [Cord C. Uphoff, et al. 2010].

Tras realizar la revisión de las técnicas más utilizadas para el diagnóstico viral, muchos nuevos estudios sobre el diagnóstico molecular del virus siguen siendo publicados. Las pruebas de diagnóstico viral se han desarrollado de manera importante en los últimos años, nuevas técnicas más rápidas, simples, poco costosas, sensibles y específicas se ofrecen hoy en día, sin embargo, la evaluación de éstas siempre se debe hacer con base en los «estándares de oro» (como los cultivos y la fijación de complemento, etc.) y de acuerdo con una adecuada correlación clínica. La disponibilidad de estas pruebas se debe acompañar de una óptima realización a nivel técnico, y una adecuada recolección y almacenamiento de la muestra, además de una interpretación acertada. Es de gran relevancia continuar, a la par de los progresos tecnológicos, estandarizando y desarrollando nuevas técnicas moleculares para el diagnóstico de las enfermedades que afectan a las diferentes especies animales de interés productivo para nuestro país, de tal forma de poder ofrecer un servicio eficiente, veras y oportuno, sustituyendo o apoyando las técnicas convencionales; para así contribuir en el control y erradicación de patologías que afectan a los animales que repercuten en el desarrollo económico, social y político de nuestra sociedad.

• Referencias

A. Bishop-Lilly, et al. 2010. Arbovirus Detection in Insect Vectors by Rapid, High- Throughput Pyrosequencing. PLoS Negl Trop Dis 4(11): e878. doi:10.1371/journal.pntd.0000878.

Agüero M, et al. A real-time TaqMan RT-PCR method for neuraminidase type 1 (N1) gene detection of H5N1 Eurasian strains of avian influenza virus. Avian Disease 2007, 51(1 Suppl):378-381.

Cord C. Uphoff, et al. 2010. Detection of EBV, HBV, HCV, HIV-1, HTLV-I and -II, and SMRV in Human and Other Primate Cell Lines. Department of Human and Animal Cell Lines, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ, Inhoffenstraße 7b; 38124 Braunschweig, Germany.

Deyde VM et al. 2009 Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother 2009; 53 (3):1039-1047. [PubMed: 19124660]

F. Enrichi, et al. 2010.Signal enhancement in DNA microarray using dye doped silica nanoparticles: Application to Human Papilloma Virus (HPV) detection. CIVEN, via delle Industrie 5, 30175 Marghera, Venezia, Italy

Fang Shisong, et al. 2011.Simultaneous detection of influenza virus type B and influenza A virus subtypes H1N1, H3N2, and H5N1 using multiplex real-time RT-PCR. Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-011-3192-8.

Huang et al. 2009. Multiplex assay for simultaneously typing and subtyping influenza viruses by use of an electronic microarray. J. Clin. Microbiol 2009;47(2):390-396. [PubMed: 19073867] •• Microarray that can simultaneously type influenza A and B virus and distinguish influenza A virus subtypes H1N1, H3N2 and H5N1.

Hyunjung Jang, et al. 2010. Peptide Nucleic Acid Array for Detection of Point Mutations in Hepatitis B Virus Associated with Antiviral Resistance. doi:10.1128/JCM.02058-09

Ito M, et al. 2006. Rapid detection and typing of influenza A and B by loop-mediated isothermal amplification: comparison with immunochromatography and virus isolation. J. Virol. Methods 2006;135(2):272-275. [PubMed: 16616961]

Lackenby A, et al. 2008. Rapid quantitation of neuraminidase inhibitor drug resistance in influenza virus quasispecies. Antivir. Ther 2008; 13(6):809-820. [PubMed: 18839782]

L. Herrero Uribe. 2004. Capítulo 6. Estrategias generales para el diagnóstico virología. Pp. 80-93. En: Procedimientos en virología médica. 1. ed. San José. C.R. Editorial de la Universidad de Costa Rica.

L Martinez-Fierro, et al.2010. Research article Identification of viral infections in the prostate and evaluation of their association with cancer. BMC Cancer 2010, 10:326

Lin BC et al. 2009 Universal detection and identification of avian influenza virus by use of resequencing microarrays. J. Clin. Microbiol 2009;47(4):988-993. [PubMed: 19279171] •• Broad-spectrum surveillance tool for detecting the circulation of influenza viruses in the poultry industry, wild birds or incidental exposures and infections in humans.

Maria del pilar crespo. 2000. El diagnostico viral por el laboratorio. Redalyc [internet], 31 (003). Fecha de acceso 2011 Noviembre 10. Disponible en

Njiru ZK, et al. (2008) Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Method for Rapid Detection of Trypanosoma brucei rhodesiense. PLoS Negl Trop Dis 2(2): e147. doi:10.1371/journal.pntd.0000147.

Ruixue Wang; Jeffery K Taubenberger. 2010. Methods for molecular surveillance of influenza. Laboratory of Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA. 517-527. doi:10.1586/eri.10.24.

Shaw AE, et al. Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagnosis of foot-and-mouth disease. Journal of Virology Methods 2007, 143(1):81-85.

Shook SJ, et al. 2007. Association of RNASEL variants with prostate cancer risk in Hispanic Caucasians and African Americans. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2007.

Thomas C. Mettenleiter, Francisco Sobrino. Animal Viruses: Molecular Biology. [Internet], Fecha de acceso 2011 Noviembre 10. Disponible en

Tian et al.2010. The development of a rapid SYBR one step real-time RT-PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virology Journal 2010, 7:90.

Townsend MB, et al. Experimental evaluation of the FluChip diagnostic microarray for influenza virus surveillance. J. Clin. Microbiol 2006; 44(8):2863-2871. [PubMed: 16891504]

Urisman ARJM, et al. 2006. Identification of a Novel Gammaretrovirus in Prostate Tumors of Patients Homozygous for R462Q RNASEL Variant. PLoS Pathogens 2006.

Autores

Aleyda Diaz Castillo

Facultad de Ciencias. Programa de Biología

Metodología de la Investigación

Barrió Santa Helena Parte Alta, Ibagué, Tolima, Colombia

A. 546 Universidad del Tolima.

Sneider Alexander Gutierrez Guarnizo

Facultad de Ciencias. Programa de Biología

Metodología de la Investigación

Barrió Santa Helena Parte Alta, Ibagué, Tolima, Colombia

A. 546 Universidad del Tolima.

Cristian Fabian Barrios Romero

Facultad de Ciencias. Programa de Biología

Metodología de la Investigación

Barrió Santa Helena Parte Alta, Ibagué, Tolima, Colombia

A. 546 Universidad del Tolima.

Enviado por:

Aleyda Diaz Castillo