Microbiología industrial. Familia Micrococcaceae

Descripción de la Familia Micrococcaceae:

Familia Micrococcaceae

Género Micrococcus:

Los micrococos son células esféricas dispuestas en masas irregulares, racimos, tétradas o paquetes. La mayor parte de las especies que predominan en los alimentos son Gram – positivas. Su temperatura óptima de crecimiento está entre los 25 y los 30 ºC, creciendo bien en los medios de cultivos ordinarios. Por otra parte, resulta difícil generalizar acerca de sus características, que varían considerablemente de especie a especie. Los distintos tipo de micrococos son interesantes en los limeñitos por las siguientes características:

Ciertas especies son capaces de utilizar las sales amónicas y otros compuestos nitrogenados simples como única fuente de nitrógeno.
la mayoría de las especies fermentan los azúcares, produciendo cantidades moderadas de ácido.
algunos son ácidos – proteolíticos (M. Freudenreichii).
otros toleran gran cantidad de sal, creciendo por lo tanto a niveles de humedad bajo; estas especies se desarrollan en salmueras de curado de carnes, tanques de salmuera, etc.
muchos son termodúricos, es decir, resisten la pasteurización comercial de la leche (M. Varians).
otros son pigmentados y dan una coloración anormal a las superficies de los alimentos sobre los que crecen; M. Luteus, por ejemplo, es amarillo y M. Roseus, rosa.
ciertos micrococos crecen bien a temperaturas alrededor de 10 ºC o incluso más bajas.

Los micrococos son muy abundantes en la naturaleza, viéndose aislado mas frecuentemente del polvo y del agua. A menudo se encuentra en utensilios y equipos usados en alimentación que no han sido adecuadamente limpiados e higienizados.

Género Staphylococcus;

Los estafilococos Gram – positivos, crecen aislados, en parejas, en tétradas o en masas irregularmente agrupadas como racimos de uvas. La especie mas importante, Staphylococcus aureus, generalmente crece ando color amarillo a la naranja, aunque en ocasiones puede ser blanco. Necesita una fuente nitrogenada orgánica y en sus necesidades de oxígeno es facultativo. Muchas de las cepas beta-hemolíticas coagulosa – positivas son patógenas y algunas producen una enterotoxina que causa intoxicaciones alimentarias.

Características Bioquímicas de los Micrococos y Estafilococos. Métodos Adicionales de Aislamiento:

Los estafilococos y micrococos se aíslan frecuentemente de materiales patológicos y de los alimentos. Es importante diferenciar entre los dos grupos. Se sabe que algunos estafilococos son patógenos dudosos u oportunistas; otros y los micrococos parecen ser inofensivos, aunque son útiles indicadores de contaminación. Los estafilococos son fermentadores, pueden producir anaeróbicamente ácido de la glucosa; los micrococos son oxidantes y producen ácido de la glucosa solamente en presencia de oxígeno.

Como con otro grupos de microorganismos, las reciente modificaciones taxonómicas y den nomenclatura no han modificado realmente la identificación de los cocos Gram – positivos que se aíslan en la rutina de los laboratorios de los productos clínicos y de los alimentos. El término "micrococos" se usa todavía imprecisamente para incluir muchos organismo que no se identifican fácilmente.

Aislamiento:

Material Patológico:

Se siembra en placas el pus, sedimentos de orina centrifugada, hisopos, etc., en agar sangre o en agar sangre hidratado de cloral para impedir la difusión de proteus y se siembra en caldo de carne salado. Se incuba durante la noche a 37 ºC. Se siembra en placas de agar de sangre el caldo de carne salado.

Productos alimenticios:

Se preparan suspensiones al 10% en agua peptona al 0,1 % en un Stomacher Lab Blender. Si se sospecha choque térmico, se añaden cantidades de 0,1 ml a varios tubos que contengan 10 ml de caldo infusión de cerebro corazón. Se incuba durante 3 – 4 horas y seguidamente se resiembra. Se utilizan uno o mas de los medios siguientes: agar leche salino (MSA), agar fosfato de fenolftaleína polimixina (PPP), medio de Baird – Parker (BP) o agar yema de huevo telurito polimixina (TPEY). Se incuban durante 24 – 48 horas. Se ensaya con amoniaco en el medio PPP investigando colonias fosfatasa positivas.

El agar MSA se baja en el alto contenido de en sal para que crezcan selectivamente los streptococos. En el medio PPP, la polimixina inhibe muchos otros organismos. El medio BP es muy selectivo pero puede ser invadido por proteus. Se añaden 50 m g/ml de sulfametazina.

Para enriquecimiento o para determinar la carga de estafilococos, se emplea caldo de carne salado o caldo de manitol salado. Se añaden 0,1 y 1,0 ml de la emulsión a 10 ml de caldo y 10 ml a 50 ml. Se incuba durante la noche y se resiembra en placas de algunos de los medios sólidos. Si hay presentes estafilococos en grandes cantidades en el alimento, se producirá un intenso crecimiento en el inóculo de 0,1 ml; cantidades muy pequeñas solo pueden dar crecimiento del tubo sembrado con 10 ml. Si se requieren recuentos, se emplea el método de Miles y Misra y uno de los medios sólidos.

Cocos aerobios:

Se siembra en placas de agar sangre y agar infusión de cerebro corazón. Se incuban cultivos replicados a 25 y 27 ºC.

Identificación:

Las colonias de estafilococos y micrococos en medios ordinarios son pardo doradas, blancas, amarillas o rosas, opacas, cupuladas, de 1 – 3 mm de diámetro tras 24 horas en agar sangre y por lo general se emulsionan fácilmente. Pueden ser b – hemolítica en agar sangre. Los aerococos presentan a – hemólisis.

En medio de Baird – Parker después de 24 horas, Staphylococcus aureus forma colonias negras, brillantes, convexas, de 1 – 1,5 mm de diámetro; hay un estrecho borde blanco y las colonias están rodeadas por una zona clara de 2 – 5 mm de diámetro. Este aclaramiento puede hacerse evidente tan solo a las 36 horas.

Otros estafilococos, micrococos, algunos enterococos, coryneformes y enterobacterias pueden crecer y producir colonias negras pero no dan lugar a la zona clara. Algunas cepas de S. Epidermidis presenta una zona clara estrecha. Pueden ignorarse cualquier colonia gris o blanca. Se inhibe el desarrollo de la mayoría de los organismos de otros grupos (aunque no proteus).

En el medio TPEY, las colonias de S. Aureus son negras o grises y forman una zona de precipitación alrededor y/o debajo de las colonias.

Se examinan extensiones teñidas por el Gram. se realizan las pruebas de coagulasa y DNAsa sobre los cocos Gram – positivos que crecen en racimos de la siembra de materiales clínicos. Este es un procedimiento abreviado: las cepas positivas para ambas pruebas son probablemente S. Aureus.

Prueba de la coagulasa:

La posesión del enzima coagulasa que coagula el plasma es una propiedad casi exclusiva del S. Aureus. Hay dos vías de realizar esta reacción:

Se emulsionan una o dos colonias en una gota de agua sobre un portaobjetos. Si no se forman grumos en 10 – 20 segundos se hunde un alambre recto en plasma humano o de conejo (EDTA) y se agita la suspensión bacteriana con él. S. Aureus aglutina en 10 segundos, formando grumos visibles
Se utiliza agua en lugar de suero salino porque algunos estafilococos son sensibles a la sal, especialmente si se han cultivados en medio salino. Debe evitarse el exceso de plasma (por ej., un asa), ya que puede producir resultados positivos falsos. Debe comprobarse el plasma con un estafilococo coagulasa positivo conocido.
Reacción de coagulasa en portaobjetos:
se hace:
1. Para confirmar la reacción en portaobjetos.
2. Si la prueba portaobjetos es negativa.
Reacción en tubos:

Se añaden 0,2 ml de plasma a 0,8 ml de caldo nutritivo (sin glucosa) en un tubo pequeño. Se siembra con el estafilococo sospechoso y se incuba a 37 ºC en un baño maría durante 6 horas. Se examina a la hora y luego a cada media hora. Deben incluirse en la prueba controles conocidos positivos y negativos. En el tubo de ensayo, el plasma citrado puede ser coagulado por cualquier organismo que sea capaz de utilizar el citrato, por ejemplo, los estreptococos fecales (pero estos son catalasa negativos), Pseudomonas y serratia. Por ejemplo, es aconsejable utilizar plasma con EDTA (se encuentran en el comercio) o plasma con oxalato o heparina. Se comprueba mediante extensiones teñidas por el Gram los organismos de todos los tubos coagulasa positivos.

S. aureus puede formar un coágulo, gelificar todo el contenido del tubo o producir una trama floja de fibrina. La prolongación de la incubación puede dar lugar a la desaparición del coágulos por digestión (fibrinólisis).

La reacción en portaobjetos descubre la coagulasa "ligada" (factor de aglutinación), que actúa sobre el fibrinógeno directamente o la reacción en tubo detecta la coagulasa "libre", que actúa sobre el fibrinógeno en unión con otros factores del plasma. Pueden estar presentes algunas de ellas o ambas.

Reacción DNAsa:

Se siembran placas de agar DNAsa con un asa de manera que el crecimiento en las placas sea como de 1 cm de diámetro. Se incuba durante la noche a 37 ºC. Se inunda la placa con ácido clorhídrico 1N. La transparentación alrededor de las colonias indica actividad de DNAsa. El ácido clorhídrico reacciona con el ácido desoxirribonucleico no alterado para dar un precipitado turbio. Algunas otras bacterias, por ejemplo, Serratia, pueden dar una reacción positiva.

Si los organismos son coagulasa y DNAsa negativos o se han desarrollados en un medio selectivo se distinguen entre estafilococos y estreptococos con al menos dos de estas reacciones:

Reacción OF utilizando el método de Baird – Parker;
Reacción de Evans y Kloos,
Reacción de Schleifer y Kloos,
Sensibilidad a Lisostafina.

Se resiembran en agar sangre para repetir las pruebas de la coagulasa y de DNAsa y se realizan la reacción de la fosfatasa.

Reacción de Evans y Kloos

Se preparan cultivos agitados en medios de tioglicolato de Brewer que contengan 0,3 % de agar. Se incuban a 37 ºC y se examina el crecimiento sumergido, es decir, el crecimiento anaerobio (estafilococos) o el superficial (micrococos).

Reacción de Schleifer y Kloos

Se emplea agar púrpura base comercial que contenga 10 nl de glicerina y 0,4 mg de eritromicina/litro. Los estafilococos varía el color del indicador (púrpura de bromocresol) amarillo: los micrococos no crecen.

Reacción de la lisistafina:

Se prepara una solución de lisostafina (Sigma Chemicals) disolviendo 10 mg en 40 ml de tampón fosfatos (0,02 M). Se ajusta a pH 7,4 y se añade NaCl para obtener una concentración de 1 % (p/v). Se distribuye en cantidades de 1 ml y se conserva a –60 ºC. Para usarlo se añade 1 ml a 9 ml de tampón fosfatos y se mezclan cinco gotas de un cultivo en caldo incubado durante la noche en un tubo de ensayo pequeño. Se incuba a 35 ºC y se examina si se ha producido lisis a los 30, 60 y 120 minutos. Debe incluirse un testigo utilizando tampón fosfatos en vez de Lisostafina. Se lisan la mayoría de los estafilococos.

Reacción de la fosfatasa:

Se siembra agar fosfato fenolftaleína y se incuba durante la noche. Se expone a los vapores de amoníaco. Las colonias de estafilococos coagulasa positivos viran a rosa.

S. aureus produce una reacción positiva (aunque se ahn señalado cepas negativas). Los estafilococos y micrococos coagulasa – negativos son por lo general fosfatasa negativos.

Caracterización general de la flora fúngica (mohos y levaduras), medios de cultivos y métodos adicionales de aislamiento, identificación de los mohos y levaduras en aislamientos.

Levaduras y Mohos:

Las levaduras y los mohos crecen mas lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos. Sin embargo, en los alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que las bacterias, determinando por ello importantes pérdidas por la alteración de frutas frescas y jugos, vegetales, quesos, productos cerealícolas, alimentos salazonados y encurtidos, así como en los alimentos congelados y en los deshidratados, cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas. Además, existe el peliro potencial de producción de micotoxinas por parte de los mohos. Para eliminar o reducir tales problemas, los manipuladores de alimento susceptibles de enmohecimiento deberán:

Reducir la carga de esporas, observando unas buenas prácticas higiénicas.
Reducir los tiempos de almacenamiento y vender los alimentos lo antes posible
Almacenar los alimentos congelados a temperaturas inferiores a los –12 ºC,
Eliminar o reducir el contacto con el aire (mediante envasado o por otros procedimientos)
Calentar el alimento en su envase final para destruir las células vegetativas y las esporas
Añadir ácidos para retardar el crecimiento
Añadir conservadores químicos, tales como los sorbatos y benzoatos.

Ni el hombre ni los animales deben consumir alimentos visiblemente enmohecidos, excepto, por supuesto, los quesos tales como Roquefort ó Camembert y ciertos salamis que deben sus sabores especiales a algunos mohos.

Las levaduras crecen mas rápidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. Mientras que los mohos son casi siempre aerobios estrictos, las levaduras generalmente crecen tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, aunque con mayor rapidez y hasta poblaciones mas elevadas en presencia de este gas. La fermentación es completamente un proceso anaeróbico. Las bebidas fermentadas están fuera del marco de esta publicación.

En los alimentos frescos y en los congelados, pueden encontrarse números reducidos de esporas y células vegetativas de levaduras, pero su presencia en estos alimentos es de escaso significado. Solo cuando el alimento contiene cifras elevadas de levaduras o mohos visibles, el consumidor se dará cuenta de la alteración. La alteración por levaduras no constituyen un peligro para la salud.

Factores de crecimiento de los mohos:

Nutrimentos:

Los mohos, por sus paredes celulares quitinosas duras, obtienen nutrimentos solo por difusión o por transporte de sustancias solubles y en consecuencia, su nutrición se limita a alimentos bastantes sencillos. Muchos mohos obtienen carbono y energía de los carbohidratos; especialmente de la glucosa, pero algunos utilizan alcoholes o ácidos orgánicos. Pueden obtener también el carbono de las proteínas, y si falta alguna fuente de fácil obtención, lo obtienen de productos de la digestión de las proteínas. Algunas especies utilizan exclusivamente grasas.

Humedad y presión osmótica:

El medio húmedo facilita el crecimiento de los mohos, pero dichos organismos no necesitan el mismo grado de humedad que bacterias y levaduras, que requieren un medio prácticamente hídrico. El crecimiento en materiales secos; pulpas secas, granos, tejidos, cuero curtidos y muebles ocurre solamente en una atmósfera húmeda. Al añublo o moho aparece en libros o zapatos; por ejemplo: durante periodos duraderos, húmedos y calurosos en climas en que hay poco sol.

Temperatura:

Algunas especies de hongos crecen a temperaturas menores de 42 ºC o mayores de 42 ºC.

Oxígeno:

Prácticamente todos los mohos son aerobios y necesitan bastante oxígeno. Solamente algunas especies; la que se emplea en la manufactura del queso Roquefort, crecen satisfactoriamente en medios con menor tensión de oxígeno. Incluso en este caso, no obstante, se facilita el crecimiento al picar el queso con alambres para obtener agujeros por el cuajo en maduración.

Cultivo de los Mohos:

Para estudiar los mohos se usan los mismos métodos generales de cultivo que para las bacterias. Casi todos, se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medios de cultivos bacteriológicos usuales, a temperaturas que varían entre 20 y 30 ºC. La mayor parte lo hacen mas lentamente que las bacterias, y así, cuando llegan a coexistir, el desarrollo de estas sobrepasa con creces el de los mohos.

Si se quiere aislar los mohos, resulta muy práctico usar un medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero que no sea óptimo para las bacterias. Medios ácidos (ph 5,6) con concentraciones relativamente elevadas de azúcar con tolerados bien por los mohos pero inhiben muchas bacterias.

Medios de cultivos:

Hay tres tipos generales de medios de cultivos para los mohos:

Medios naturales, como pedazos o infusiones de frutas, vegetales, granos de cereales o tejidos animales. Estos medios varían mucho en su composición y no son fácilmente reproducibles. Tampoco son de amplio uso.
medios de cultivos preparados con peptonas, extractos de plantas, agar y otros compuestos de composición desconocida o variable.
medios de cultivos sintéticos de composición química definida.

Un medio natural de amplio uso para el cultivo de los hongos es una infusión de maíz al que se le adiciona agar y glucosa. Otro medio de cultivo para los mohos y levaduras contiene infusión de papa con agar y glucosa.

Muchas fórmulas de los medios de cultivos para los mohos y levaduras contienen peptona, algún carbohidrato y agar; en cambio, los medios para los hongos patógenos necesitan ser enriquecidos con otras sustancias.

Uno de los medios de cultivos mas conocido y antiguo para cultivar hongos Sabouraud, y contiene maltosa y peptona con sus ingredientes principales, pero fue modificado y ahora en Estados Unidos se usa uno que solo contiene glucosa. Este medio se utiliza mucho para aislar mohos y ciertas levaduras; además es muy útil para el crecimiento de hongos patógenos a partir del cuerpo y exudados. Su acción selectiva parcial se debe a su alta concentración de azúcar y bajo pH.

Examen Morfológico de los Mohos:

Puesto que la identificación de los hongos depende en gran parte de características morfológicas como el tipo y la agrupación de las esporas se deben tomar muchas precauciones al hacer preparaciones para el examen microscópico. En general, el cultivo en medios líquidos no es satisfactorio para este propósito. Los cultivos en medios sólidos, sobre todo en placas se pueden ver con una lupa o con el objetivo seco débil del microscopio, empezando desde el fondo hasta la parte superior de la placa lo cual nos proporcionará suficiente información para identificar o precisar el genero del moho examinado. Se deben hacer observaciones posteriores tomando con una aguja o asa una pequeña muestra de micelio en desarrollo, la que se coloca en una gota de azul algodón lactofenol que esté sobre un portaobjeto y se cubre luego con el cubreobjeto. En una preparación hecha de esta manera, la hifas deben ser examinadas para ver si hay tabiques, estructuras de las esporas y otras partes del hongo que son determinantes, sin embargo, una manipulación de este tipo rompe y desorganiza las estructuras del organismo pues la disposición característica de la que depende la identificación se pierde y no es posible clasificarlo.

Un método mejor para examinar los hongos es la técnica de cultivos en portaobjeto (microcultivo), ya que permite manejar y observar la especie sin modificar su desarrollo, y el arreglo y acomodo de sus partes permanecen intactos.

Factores de crecimiento de las levaduras:

Agua:

En términos generales, las levaduras necesitan un poco mas de agua que los mohos, pero menos que las bacterias. Conviene insistir no obstante, que entre las levaduras hay gran variación; algunas especies crecen en medio que contienen incluso 40 por 100 de agua, por ejemplo en miel y jaleas o compotas. Los microorganismos que crecen en soluciones de gran presión osmótica se denominan osmófilos.

PH:

Las levaduras crecen en límites amplios de pH, aunque sus requerimientos son mas limitados que los de los mohos. Muchas especies se multiplican en soluciones con acidez de pH 3 y alcalinidad de pH 7.5. la reacción óptima suele localizarse entre pH 7.5 y 5.0

Temperatura:

No hay crecimiento a temperaturas superiores a la del congelamiento, ni tampoco a temperaturas superiores a 47 ºC; las temperaturas máximas para algunas especies son algo menores. La temperatura mas adecuada suele situarse entre 20 y 30 ºC. La incubación a 30 ºC suele ser satisfactoria

Oxígeno:

Las levaduras fueron los primeros microorganismos en que se encontró crecimiento en un medio sin oxígeno atmosférico. Pasteur se admiró notablemente de este hecho, y observó que la utilización anaerobia de azúcar generaba principalmente alcohol y bióxido de carbono, en tanto que los productos aerobios eran bióxido de carbono y agua. La multiplicación de las levaduras es más rápida y la cosecha de células es mayor en condiciones aerobias que en anaerobias, en consecuencia, se necesita abundancia de oxígeno en la elaboración de levadura comercial, pero el oxígeno se excluye cuando se desea producir alcohol (en la fermentación de cerveza o en la producción de vino).

Recuentos de Mohos y Levaduras:

Todos los mohos y levaduras crecen bien a valores de pH de 5,0 y aún inferiores, por lo que generalmente sustituyen a las bacterias en los alimentos ácidos. Además, muchos mohos y levaduras toleran bajas Aw (aproximadamente inferiores a 0,95) mucho mejor que la mayoría de las bacterias; incluso a valores por debajo de 0,75, algunos mohos y levaduras son los únicos organismos que pueden crecer. Por lo tanto, los mohos y las levaduras son los agentes alterantes de un número importante de alimentos.

Waksman (1922) sugirió el uso de medios acidificados para el recuento de mohos del suelo y a partir de esta fecha los microbiólogos de los alimentos adoptaron esta técnica para el recuento de mohos y levaduras en alimentos. Sin embargo, pronto se hizo patente que el uso de medios con pH bajo, incluso por debajo de 4 (Mossel y col., 1962; Koburger, 1970), y (2) algunos mohos y levaduras crecen con dificultad a los valores de pH de muchos de los medios propuestos (Holwerda, 1952; Mossel y col., 1962; Ingram, 1959; Koburger, 1970, 1971, 1972, 1973; B. Jarvis, 1973), especialmente cuando las células han sido dañadas poco antes de la siembra (Nelson, 1972). Por lo tanto, los medios de pH bajo no son enteramente satisfactorios para el recuento de mohos y levaduras.

Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los medios diseñados para el recuento de mohos y levaduras, en los últimos 20 años se han utilizado con eficacia los antibióticos. Entre ellos puede citarse la penicilina + estreptomicina, el cloranfenicol, la clorotetracilina, la oxitetracilina y la gentamicina (W. B Cooke, 1954; Beech y Carr, 1955; Flannigan, 1973). Para fines generales, han sido muy utilizadas la oxitetracilina (Moosel y col., 1962; Put, 1964; Sainclibver y Roblot, 1966), que se refiere al a clorotetracilina debido a su mayor estabilidad. La gentamicina suprime el crecimiento de las bacterias Gran negativas y es efectiva por ellos en alimentos tales como la carne refrigerada (Hup y Stadhouders, 1972; Mossel y col., 1970, 1975). El rosa de bengala retarda el crecimiento de aquellos mohos que normalmente producen abundante micelio aéreo, como Neurospora y Rhizopus (B. Jarvis, 1973). Sin embargo, también anhibe algunas levaduras (Mossel y col., 1975). La mejor temperatura de incubación de los cultivos se sitúa alrededor de 22 ºC (Mossel y col., 1962; Koburger, 1970, 1972; Flannigan, 1973), y el tiempo de incubación es de 5 días.

Las colonias de mohos pueden formarse a partir de hifas o de esporas. Por ello el talo de un moho que esté muy cargado de espora dará recuentos de placas muchos mas altos que otro de tamaño similar sin esporas. Si el método de recuentos de mohos de Howard (AOAC, 1975) en lugar del método de recuento en placa por siembra en todo el medio que se describa a continuación.

Método de Recuento de Levaduras y Mohos por Siembra en Placa en Todo el Medio:

Material y Aparatos:

Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos
Placas de Petri, de vidrio (100 x 15 mm) ó de plástico (90 x 15 mm).
Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10 ml.
Baños de agua o estufa de aire forzado para templar el agar fundido, 44 – 46 ºC.
estufa de incubación, 20 – 24 ºC.
Contador de colonias (tipo Québec de campo oscuro o similar)
Dispositivo de recuento con registro automático.
agar oxitetraciclina gentamicina extracto de levadura glucosa (Medio 79).

Técnica:

Preparar la muestra de alimento por alguno de los tres procedimientos recomendados en el capítulo sobre preparación y dilución de los homogenizados de alimentos. (Importante: procurar que transcurra el menor tiempo posible para evitar el crecimiento o la muerte delos microorganismos suspendidos en el diluyente).
Pipetar en placa de Petri alícuota de 1 ml de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5, utilizando dos placas por cada dilución. Se propone esta serie de diluciones para los casos en que no se conozca el número aproximado de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra. Por supuesto, las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre están función del recuento esperado.
Rápidamente, verter en las placas de Petri 10 – 15 ml de agar oxitetraciclina gentamicina extracto de levadura glucosa, fundido y templado a 44 – 46 ºC.
Mezclar inmediatamente el inóculo con el agar balanceando la placa de izquierda a derecha cinco veces, realizando otras cinco vedes el movimiento de vaivén en sentido perpendicular al primero y rotándola, finalmente, cinco veces en sentido contrario a las agujas del reloj.
invertir las placas cuando se haya solidificado el agar e incubarlas a 20 – 24 ºC durante 3 – 5 días.
Con ayuda del contador de colonias y el dispositivo de recuento con registro automático, contar las colonias en aquellas placas que contengan entre 30 y 300, llevando a cabo un examen microscópico cuando sea necesario para identificar las colonias de levaduras.
calcular el número de levaduras y mohos por gramos o mililitros de alimento.

Característica general del Staphylococcus aureus. Identificación bioquímica del S. Aureus. Medios de cultivos y métodos de aislamiento a nivel de laboratorio de microorganismos.

Staphylococcus aureus:

Esta especie es coagulasa y DNAsa positiva, produce ácido e la lactosa, maltosa y manitol, reduce los nitratos, hidroliza la urea y reduce el azul de metileno. Es por lo general fosfatasa positivo, aunque no crece en agar fosfato de amonio.

La mayoría de las cepas son hemolíticas en agar sangre de caballo, pero la zona de hemólisis es relativamente pequeña si se compara con el diámetro de la colonia (diferenciación con los estreptococos hemolíticos).

La producción de pigmento amarillo dorado es probablemente la característica mas variable. Los cultivos jóvenes pueden no producir ningún pigmento. Puede desarrollarse color si se dejan los cultivos uno o dos días sobre la mesa del laboratorio a temperatura ambiente.

Se favorece la producción de pigmento pr la presencia en el medio de lactosa o de otro carbohidrato y de sus productos de escisión. La mejor forma de demostrarlo es en agar glicerina monoacetato.

En los laboratorios clínicos, se identifica generalmente S. Aureus bien por la reacción de la coagulasa o la de la DNAsa. Son posibles pruebas positivas falsas de las coagulasa con enterococos, Pseudomonas y Serratia si se utiliza plasma citratado. Serratia puede dar una reacción DNAsa positiva. También se presentan cepas coagulasa negativas, DNAsa positivas. Por tanto pensamos que deben realizarse ambas reacciones, la de coagulasa y la de DNAsa.

La fermentación del manitol no es fiable. Se hallan cepas de S. Epidermidis que fermentan el manitol.

S. aureus es un agente corriente de las infecciones piógenas y de las toxiinfecciones alimentarias. Los estafilococos se diseminan por las actividades domesticas y comunitarias tales como hacer cama, vestirse o desvestirse. Se hallan presentes fosas nasales, sobre la piel y el cabello de una gran proporción de la población.

Son un ejercicio interesante las tomas de muestra de aire mediante placas, las cepas de S. Aureus deben enviarse a un experto de referencia para la tipificación por bacteriófago. Las bacterias de fagotipificación han sido descritas por Blair y Williams y Asheshov.

Identificación:

El S. aureus es cogulasa positivo, lo cual constituye su característica mas distintiva. Enlos pocos casos de un posible S aureus que no produce coagulasa puede realizarse la prueba para desoxirribonucleasa termoestable que es aún mas específica. Otros métodos para nucleasa termoestables, como el de Zarzour y Belle, consisten en cavar pequeños huecos en el agar ADN y colocar suspensiones de cultivos de 18 – 24 horas hervidas; este método es algo mas engorroso pero necesario para laboratorios que no tienen acceso a mecheros de gas.

Madison y Baselski emplearon 1 ml de líquido sobrenadante de botellas para hemocultivos con cocos Gram – positivo en racimos para un amodificación rápida de la prueba para nucleasa termoestable descriptiva. El sobrenadante se lleva a ebullición durante 15 min y se coloca en cavidades de 3mm de diámetros practicadas en placas con agar ADN.la correlación con los métodos estándar fue 100 % y solo se necesitaron 2 horas de incubación antes de interpretar los resultados. Otro método rápido muy similar para realizar la prueba de la nucleasa termoestable directamente a partir del caldo de un hemocultivo. El origen de agar ADN es esencial para obtener resultados confiables. Otro método rápido para la identificación de los cocos Gram- positivos visualizados en los caldos de hemocultivos es la modificación de la prueba de Severance y col. Para lisostafina descrptiva por Knight y Slhaes. También se ha encontrado que la sensibilidad a la polimixina permite distinguir entre cepas de S aureus coagulasa positivas y negativas. Heltberg y Bruunencontraron que los S. Aureus, incluso las pocas cepas coagulasas negativas, son resistentes a la polimixina, mientras que otras especies de Staphylococcus son sensibles.

En el comercio se encuentra varias pruebas de aglutinación de partículas para la diferenciación rápida entre S. Aureus y otros estafilococos. Staphylatex (American Scientific Products), Sero – STAT (Scott Laboratories), Staph Latex (Difco Laboratories) y ACU – Staph (Carr – Scarborough Microbiologicals) emplean partículas de latex y Staphyloslide (BBL Micrbiology Systems) usa eritrocitos sensibilizados de oveja como partículas. Aunque estos sistemas son confiables, existe un pequeño porcentaje de resultados negativos falsos con las cepas resistentes a la meticilina, según ha sido informado por Woolfrey y col. Las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina con frecuencia dan resultados negativos en la prueba para coagulasa sobre portaobjetos, lo que sugiere que una misma estructura celular contribuye a la expresión del factor de agregación y a la resistencia a la meticilina. Los métodos rápidos comerciales mencionados pueden ser usado en la mayoría de las instituciones siempre que el laboratorios confirme la identificación de las cepas resistentes a la meticilina (mencionadas mas adelante) mediante la prueba para coagulasa en tubo.

Las cepas de S. Aureus pueden ser identificadas para fines epidemiológicos por tipificación con fagos. La caracterización de cepas según su fagotipo, biotipo, perfil de plásmidos y producción de polisacáridos capsular (Slime) permiten reconstruir el trazado de las vías de diseminación de las cepas entre los pacientes hospitalizados, le medio ambiente y el personal médico. Si bien este método fue empleado principalmente para la investigación de brotes hospitalarios de infección por S. Aureus, se han desarrollados pruebas de fagotipia para estafilococos coagulasa negativos. En algunos casos los factores de virulencia pueden asociarse con ciertos fagotipos determinados. Este procedimiento, que insume mucho tiempo, es realizado por un pequeño número de laboratorios en los EEUU, Canada e Inglaterra.

Caracterización general de la flora ácido láctica. Identificación bioquímica, medios de cultivos y técnicas de aislamiento:

Género Streptococcus:

Los cocos de este género se disponen característicamente en pares o cadenas largas o cortas, dependiendo de las especies y condiciones de crecimiento. Todos son homofermentativos. Los estreptococos se pueden clasificar serológicamente mediante una reacción de precipitinas en grupos llamados de Lancefield, que se designan con letras mayúsculas (A, B, C, D, etc.), pero normalmente los que son importantes en los alimentos se dividen en cuatro grupos: piógenos, viridans, lácticos y enterococos.

El grupo piógeno (productores de pus) comprende especies patógenas, entre las que están el S. Agalactiae, que ocacionan matitis en las vacas, y el S. Pyogenes, que origina en la especie humana faringitis séptica, escarlatina y otras enfermedades; se han encontrado en la leche cruda. Los estreptococos piógenos no crecen a 10 ºC ni a 45 ºC.

Los del grupo viridans incluyen el S. Thermophilus, importante en los quesos que se elaboran cociendo a altas temperaturas la cuajadas y en ciertas leches fermentadas como el yogur, y el S bovis, que se encuentra en el estiércol y en la saliva del ganado vacuno, como el S. Thermophilus, es termodúrico, por lo que se puede hallar en el recuento en placas de la leche pasteurizada. Estas especies crecen a 45 ºC pero no a 10 ºC.

El grupo láctico comprende las importantes bacterias de la leche Streptococcus lactis y S. Cremoris, que crecen a 10 ºC pero no a 45 ºC. Estas bacterias se emplean como "fermentos" para el queso, mantequilla fermentada y ciertos tipos de mantequilla, juntamente con especies de Luconostoc. S, lactis a menudo toma parte en la acidificación de la leche cruda. Estas bacterias lácticas no toleran mas del 2 a 4% de sal, por lo que no toman parten en la fermentación láctica de los productos vegetales, en salmueras. Los gérmenes lácticos se encuentran en las plantas verdes, piensos, ensilajes y en algunos utensilios.

El grupo entero cocos los constituyen el S. Faecalis, S. Faecium y ciertas subespecies afines. S. Faecalis y S. Faecium son muy parecidos entre sí, pero se pueden diferenciar mediante pruebas fisiológicas. S. Faecalis es, en general, mas resistente al calor y suele ser mas veces de procedencia humana, mientras que S. Faecium procede en mas ocasiones de vegetales. S. Faecalis subespecie zymogenes es una variedad beta – hemolítica. Estos estreptococos en un principio recibieron el nombre de S. Liquefaciens S. Zimogenes, respectivamente. S. Faecalis y S. Faecium se encuentran con mas frecuencia en los alimentos crudos. Las bacterias de este grupo crecen tanto a 10 ºC como a 45 ºC.los enterococos tienen ciertas características en común que los convierten en estreptococos muy particulares:

Son termodúricos, resistiendo fácilmente la temperatura de pasteurización de la leche o incluso otras mas altas.
Toleran un porcentaje de sal del 6,5 % o superior
crecen a un pH alcalino de 9,6
se desarrollan en un intervalo de temperaturas amplio, algunos desde los 5 y los 8 ºC, y la mayoría pueden hacerlo incluso a 48 ó 50 ºC.

S. faecalis se han encontrado también en el tocino entreverado. Como indica su nombre, los enterococos provienen del tracto intestinal del hombre y de los animales y a veces se usan como organismos indicadores de contaminación fecal en los alimentos. Puede también desarrollarse en productos lácteos, contaminando los utensilios y los equipos industriales.

Género Pediococcus:

Hasta la fecha solo se han encontrado en los alimentos la especie P. Cerevisiae. Son cocos aislados, en parejas, en cadenas cortas o en tétradas. Son Gram – positivos, catalasa – negativos y microacrófilos. Homofermentativos, produciendo a partir delos azúcares de 0,5 a 0,9 % de ácido, principalmente láctico, crecen bien en salmueras de cloruro sódico de hasta una concentración de 5,5 % y pobremente cuando la concentración es alrededor de 10 %. Crecen a temperaturas de 7 a 45 ºC, pero su crecimiento óptimo tiene lugar entre 25 y 32 ºC. Características que los hacen interesantes en los alimentos son: tolerancia a la sal, producción de ácido, escala de temperaturas de crecimiento amplia y habilidad especial para crecer a temperaturas de refrigeración. Los pediococos se han encontrado en las salmueras de los encurtidos en fase fermentativa, siendo responsables de ciertas alteraciones en las bebidas alcohólicas, por ejemplo, cerveza, donde su proporción de diacetilo es perjudicial. El P. Cerevisiae se usado como cultivo starter en los embutidos fermentados.

Género Leuconostoc:

Este género, llamado Betacoccus por Orla – Jensen, comprende los estreptococos lácticos heterofermentativos que fermentan el azúcar, produciendo ácido láctico y cantidades considerables de ácido acético, alcohol etílico y dióxido de carbono. Por la capacidad que tienen las especies L. Dextranicum y L. Citrovorum de fermentar el ácido cítrico de la leche, produciendo una sustancia de sabor agradable, diacetilo (también produce acetoina y 2,3 – butilenglicol), y estimular a los estreptococos lácitocos, se han incluido en los llamados "fermentos lácticos" dela mantequilla, crema y queso.

Son importantes las especies de Leuconostoc en los alimentos por

producir diacetilo y otras sustancias aromáticas.
tolerar las concentraciones salinas de ciertas salmueras, como la de la fermentación del sauerkraut y encurtidos hortícolas, permitiendo al L. Mesenteroides que lleve a cabo la primera fase de la fermentación láctica
su capacidad de iniciar la fermentación en productos vegetales con mas rapidez que otras bacterias lácticas u otros organismos y de producir suficiente ácido como para inhibir el crecimiento de las bacterias no lácticas
la gran tolerancia de l: mesenteroides para concentraciones azucaradas de hasta 55 a 60%, lo que permite crecer en jarabes, caramelo líquido, crema de helados, etc.
producción de cantidades considerables de dióxido de carbono a partir de los azúcares, produciendo ojos en ciertos quesos, la alteración de alimentos de gran contenido azucarado (jarabes, cremas, etc.) y la fermentación de algunas clases de pan
producción de gran cantidad de mucílagos en medio que contienen sacarosa, lo que es desear en la producción de dextrano, pero presenta un riesgo en alimentos ricos en dicho disacárido

Leuconostoc:

Este género contienen varias especies de estreptococos microerófilos de importancia económica. Algunos de ellos producen un dextrano viscoso en los vegetales congelados.

Aislamiento:

Se cultiva en material en agar levadura glucosado a pH 6,7 – 7,0. se incuba a 20 – 25 ºC en 5% de dióxido de carbono.

Identificación:

Se siembran azúcares MRS: glucosa, lactosa, sacarosa, manosa, arabinosa y xilosa y se investiga la formación de dextrano viscoso en medios sólidos que contengan glucosa.

Especies de Leuconostoc:

Leuconostoc mesenteroides:

Es esta la especia mas importante. Forma una gran cantidad de dextrano viscoso en medios y en materia vegetal que contengan glucosa. Las colonias en los medios de agar sin el azúcar son pequeñas y grises. Es crecimiento es muy pobre en medios sin extracto de levadura. Intervienen en la fermentación del chucrut y en la producción de ensilado y es responsable de la alteración viscosa de la salmuera (a menos que se favorezca el desarrollo de Lactobacillus Plantarum por la elevada salinidad). También es responsable del "azúcar limoso" o de la "alteración del azúcar". Altera los guisantes y sumos de frutos congelados.

L. paramesenteroides:

Es similar a L. Mesenteroide pero no forma dextrano viscoso. Está muy difundido en la vegetación y en la leche y productos lácteos.

L. dextranicum:

Forma bastante menos viscosidad que L. Mesenteroides y es menos activo bioquímicamente. Está extensamente difundido en verduras en fermentación y en la leche y productos lácteos.

L. cremoris:

Es raro en la naturaleza, auque es utilizado como indicador en los productos lácteos.

L. lactis

No es frecuente. Se halla en la leche y en productos lácteos.

Pediococcus

Los pediococos son cocos microaerófilos no capsulados que se representan aislados y en parejas. Son exigente nutricionalmente y tienen importancia económica en la industria cervecera, de la fermentación y del procesado de alimentos.

Aislamiento:

Se emplean medios enriquecidos y agar mosto de cerveza para los pediococos alterantes de la cerveza. Los mejores medios son los de sumo de tomate a pH 5,5. se incuban a temperaturas distintas de acuerdo con la especie investigada en 10% de dióxido de carbono.

Identificación:

Si es necesario proceder a la identificación de las especies, se siembran medios azucarados MRS: lactosa, sacarosa, galactosa, salicina, maltosa, arabinosa y xilosa. Se incuban a temperaturas adecuada. Ninguna de las especies produce gas.

Especies de Pediococcus:

Pediococcus damnosus (P. Cerevisiae)

Se halla en las levaduras y en el mosto de cerveza. La contaminación de la cerveza da lugar a un producto turbio y ácido con un olor peculiar "alteración por sarcina". P. Damnosus es resistente a los agentes antibacterianos en el lúpulo.

P. acidi-lacti:

Se halla en el chucrut, así como en los encurtidos, ensilados y papillas de cereales, pero no en la cerveza lupulada.

P. urinae – equi:

Es un contaminante de la levaduras de cerveza. (el nombre indica que se aisló originalmente de la orina de caballo).

P. halophilus

Como sugiere su nombre, es tolerante a la sal (hasta 15% de NaCl). En halla en la papilla de soja.

Lactobacillus:

Los lactobacilos son importantes para la industria láctea y alimenticia y son comensales del hombre y los animales.

Aislamiento:

Se siembra en placas por duplicados en medios MRS, Rogosa o simila a pH 5,0 – 5,8. es especialmente útil el medio diferencial LS (O) en el examen del yogur. Muchas cepas crecen muy mal, si lo hacen a pH 7,0, aunque el material patológico humano se siembra en agar sangre. Se incuba una serie de placas en aerobiosis y la otra en atmósfera de dióxido de carbono – hidrógeno 5:95. se incuban los cultivos procedentes de alimentos a 28 – 30 ºC y los de procedencia humana o animal a 35 – 37 ºC durante 48 – 72 horas. Se investiga la presencia de colonias blancas, muy pequeñas. Muy pocos otros organismos, aparte de los hongos, pueden crecer en medios ácidos. Para la identificación provisional de L. Acidophylus, que es la especie mas común en materiales humanos, se pone en placas de agar sangre.

un disco de sensibilidad de sulfamida que se ha sumergido en la solución saturada de sacarosa, y
un disco de penicilina (5 unidades).

L. acidophylus da hemólisis verde. El crecimiento se estimula por la sacarosa; es resistente a las sulfamidas y sensible a la penicilina.

Identificación:

Se resiembra si es necesario para obtener un cultivo puro y se siembra densamente en caldo MRS modificado que contenga los siguientes azúcares: glucosa (con un tubo de Durham), lactosa, sacarosa, salicina, manitol, sorbosa y xilosa, en caldo MRS que contenga 2% de glucosa en el que el citrato amónico se ha sustituido por 0,3 % de arginina (para la prueba de hidrólisis de la arginina) y el caldo MRS que contenga 4% de cloruro sódico. Se incuba a 28 – 30 ºC durante 3 – 4 días. Se siembran tubos de caldo MRS y se incuban a 15 ºC y a 45 ºC.

Se cultiva en medio sólido con bajo contenido en carbohidratos para la prueba de la catalasa (los medio con altos contenidos dan reacciones falsas positivas). Es útil el sistema API.

No es fácil la identificación de los lactobacilos; las reacciones varían de acuerdo con la técnica y la posición taxonómica de algunas especies es confusa.

El método del tubo Durham no siempre puede detectar el dióxido de carbono producido por los lactobacilos heterofermentadores. Es útil el método de Leon – Campbell.

Se siembra un tubo de medio, por ejemplo, caldo MRS, que contenga 2% de glucosa y, si es necesario, 5% de zumo de tomate. Se pone este tubo dentro de otro mayor que contenga varios mililitros de solución de hidróxido bárico y se cierra el tubo mas grande con un tapón de goma. Se incuba a 72 ºC durante 48 – 72 horas. Si se produce dióxido de carbono, se formará un precipitado de carbono bárico. Es aconsejable poner un testigo con una cepa homofermentadora conocida.

Para el crecimiento de los lactobacilos homofermentadores que producen el enverdecimiento de las carnes curadas, se añade 0,1 g de clorhidrato de tiamina a cada litro de medio o se usa medio APT (D).

Especies de lactobacilos:

Lactobacillus acidophylus:

Está ampliamente diseminado y se halla en la leche y productos lácteos y como comensal del tracto digestivo de los mamíferos. Se emplea para fabricar "leche ácida" y se supone se halla relacionado con la caries dental del hombre, en la que puede describirse como L. Odontolyticus, L. Acidophylus es probablemente el organismo descrito como bacilo de Boas – Oppler, que se observa en casos de carcinoma del estómago del hombre y también del bacilo Doderlein, que se encuentra en la vagina humana.

Las colonias de este organismo en medios de agar se describen como "plumosas" o "canceriformes".

L. Bulgaricus:

Están asimismo relacionadas con la leche y productos lácteos, aunque es termófila y no se halla en el intestino de los mamíferos. Se utiliza en la elaboración del yogurt, junto con S. Thermophilus, en la de quesos cremosos y para producir agujeros de gas en la de quesos duros. La fermentación natural del ensilado se debe en parte a este organismo. Las colonias en medios de agar son pequeñas y grises.

L. casei y L. Plantarum

Son difíciles de separar salvo por cromografías de papel del resultado de la fermentación de los carbohidratos. L. Casei se emplea para obtener suero de la leche y se presenta naturalmente en la leche y en el queso. L. Plantarum está extensamente difundido en vegetales, vivos o muertos, y es uno de los organismos responsables de la fermentación de los encurtidos y de la fabricación de chucrut. Ambos organismos dan crecimientos muy deficientes en agar.

L. delbruckii:

Se halla en la vegetación y en los cereales y se emplea como "starter" para iniciar las condiciones ácidas en la fermentación de granos mediante levaduras. Este organismo crece en medio de agar en colonias pequeñas, planas y de bordes dentados.

L. leichmanii:

Se encuentra en la mayoría de los productos lácteos. Se emplea en la producción comercial de ácido láctico y crece en agar como pequeñas colonias blancas.

Discusión de los Resultados:

Experimento # 1:

Determinación de la familia microcococea

(Staphylococcus, Micrococcus), Muestra de Queso:

para esto se utilizó agar manitol sal, este es un medio bastante rico y su capacidad para crecer en este con altas concentraciones de sal ofrece un amanera sencilla para el aislamiento de ambos.

Para ello se pesó la muestra (25 gr), se agitó con el diluyente, luego le agregamos 0,1 ml de la muestra a las placas. Las placas se inocularon en superficies y estas placas tenían rojo fenol, luego a las 24 horas se observó crecimiento de las colonias rojas y amarillas. Lo cual nos indica que el micrococo es un aerobio estricto que además de fermentar el rojo fenol produjo ácido a partir de la glucosa. Mientras que el staphylococcus es un aerobio facultativo y produjo ácido a partir de la glucosa tanto aeróbicamente como anaeróbicamente. Según la bibliografía de Madigan de Biología de los Microorganismos. Y esto se debe a que su composición de base del DNA es muy distinta a la del micrococo.

Tanto el staphylococcus como el micrococcus son organismos aeróbico con un metabolismo respiratorio típico. Son catalasa positivos y esta prueba permite diferenciar del streptococcus y de algunos géneros de cocos gram – positivos.

Como se sabe los cocos gram – positivos son relativamente resistentes a un potencial de agua reducido y toleran bastante bien las sequías y la salinidad y como en el laboratorio se sembró un inóculo cobre la placa de agar con un medio (manitol sal) que contenga un porcentaje de NaCl y se incubaron aeróbicamente y observándose a las 24 horas observamos que los cocos gram – positivos eran las colonias predominantes y como estos microorganismos suelen ser fermentados constituyen ayuda para su selección tanto de staphylococcus y de micrococcus pueden separarse fácilmente a través de la prueba oxidación – fermentación.

Según la bibliografía de Madigan, los pigmentos amarillos nos indican la presencia de staphylococcus aureus en la muestra ya que el presenta una forma fermentada amarilla, el cual está asociada corrientemente a situaciones patogénicas como; neumonía, artritis, meningitis, etc. Y donde este produce un exotoxina importante, la coagulasa, factor parecido a una enzima que actúa sobre una fibrina y forma un coagulo y son normalmente coagulasa positiva.

Como la muestra analizada (queso) se observaron un gran número de staphylococcus, esto significa por lo general, que las prácticas de limpieza y desinfección y el control de la temperatura no han sido, en algún lugar, adecuado.

Experimento # 2 "Flora Fúngica"

Los mohos comprenden hongos predominantemente unicelulares y filamentoso; por otra parte las levaduras son, por lo regular unicelulares, dado que los hongos son clasificados parcialmente basándose en los métodos de reproducción sexual., los mohos y las levaduras pueden reducirse de la misma forma.

En el laboratorio se observó colonias blancas y amarillas en la cual, la dilución 10-1 por duplicado dio una población incontable y la dilución. En la dilución 10-2 presenta colonias blancas (176) y un hongo en la muestra de queso blanco, y la 10-3 presentó 135 colonias. Según la bibliografía de Carpenter de Microbiología los mohos crecen por un fenómeno vegetativo de agrandamiento y divisiones celulares especialmente en el extremo de una hifa y ellos crecen medios muy diversos. Su crecimiento es facilitado por la acidez y por ende las placas con agar contenían HCl para facilitar su crecimiento e inhibir bacterias; e igualmente necesitan humedad pero no necesariamente sustrato húmedo y abundancia de oxígeno.

Los mohos suelen asociarse con la descomposición de los alimentos, pero también son fuentes importantes de sustancias químicas y de antibióticos. Casi todos los mohos son estrictamente aerobios, su crecimiento lo incrementa la abundancia de oxígeno y se desarrolla generalmente de 22 – 30 ºC que es la óptima para la mayoría de las especies.

Se aconseja que para aislar los mohos se debe usar un medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero que no sea óptimo para la bacteria. Medio ácido (pH 5,6) con concentraciones relativamente elevadas de azúcar son toleradas por hongos y mohos pero inhiben muchas bacterias.

Experimento # 3

Es un medio rápido para determinar muchos organismos presentes, ya que trae un medio deshidratado con todos sus nutrientes, para propiciar el desarrollo rápido de los microorganismos a utilizar y para ello preparamos en el laboratorio diluciones para determinar flora fúngicas, enterobacterias, aerobios mesófilos, etc., tanto en muestras de queso como en muestras de pollo.

A cada grupo de laboratorio se le hizo entrega de petrifilm por duplicado, y una vez que se le agregó un ml de muestra se tapó y se incubó a 37 ºC por 24 horas. Observándose en los petrifilm de enterobacterias colonias rojas incontables en dilución 10-1. en flora fúngica la dilución 10-1 nos dio ufc = 930 por lo tanto es incontables.

Aerobios dio incontable en la dilución 10-1 en muestras de pollo.

Experimento # 4: "Prueba de Portadores"·

Para esto se tomó un hisopo, el cual fue introducido en las fosas nasales, luego inoculamos en la placa que contenía agar para staphylococcus, procediéndose a dividir una placa y colocándosele el nombre de cada uno delos integrantes y luego inoculamos con líneas paralelas; lo incubamos a 37 ºC / 24 horas, luego le observamos y a las placas de Rómulo y Lisseth les dio negativa esta prueba. Al equipo 3 que les dio positivo se le hizo la prueba del DNAsa; con un asa tomaron del cultivo que se desarrolló en inocularon en otra placa y lo incubaron a 37 ºC/ 24 horas. Procediéndose al siguiente día a realizar la prueba de la catalasa la cual es útil para la identificación de catalasa. Como el staphylococcus es catalasa positivo, catalisa la liberación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno, un producto final del metabolismo que es tóxico para la bacteria según la bibliografía de Bailey Scott Diagnostico Microbiológico. Como al agregarle una gota de peróxido de hidrógeno a una colonia se liberó burbujas de gas dejándose por 15 minutos y se observó la formación de un aro transparente el cual nos indica que ambos individuo son portadores de staphylococcus aureus patógenos.

Experimento # 5

"Métodos para el establecimiento de anaerobiosis"

las bacterias anaeróbicas estrictas son causa frecuente de infecciones y pasan desapercibidas, a menos que se tomen las debidas precauciones para su aislamiento y cultivo. Muchos anaerobios son muy sensibles al oxígeno. En el organismo existen distintos hábitos en los que pueden encontrarse bacterias anaerobias obligadas formando parte de la microbiota. Otras partes del organismo pueden llegar a ser anóxicas como resultado de una herida o un traumatismo que da lugar a la disminución de aporte sanguíneo al lugar de la herida.

En general las bacterias anaerobias patógenas forman parte de la microbiota y son únicamente patógenos oportunistas.

Existen dos patógenos anaerobios importantes, Clostridium tetanis (que produce el tétano) y Clostrium perfungens (causante de la gangrena gaseosa y un tipo de toxiinfección alimentaria), que osn bacterias formadoras de esporas y predominan en el suelo.

El microbiólogo debe asegurarse de que la muestra tomada esté libre de contaminación y que no entre en contacto con el aire.

Cuando se precisa de una incubación en anaerobiosis, las placas de agar se coloca en una jarra Gaspack sellada que se hace anóxica reemplazando la atmósfera de la jarra con una mezcla de gas libre de oxígeno. Existen otras formas de eliminar el oxígeno libre como son cultivos que contengan agentes reductores y la utilización de cámaras de anaerobiosis.

En el laboratorio las placas con agar se inocularon con una muestra diluida con un ml de pollo luego las placas se introducen en la jarra. Luego se corta el sobre por un extremo y se le agrega 10 ml de agua y este se introduce en la jarra, luego se tapa.

La inoculación de una muestra de gases que contiene hidrógeno es seguida con la reacción catalítica del oxígeno con el hidrógeno produciendo agua. De esta forma solamente se desarrollará microorganismos anaeróbicos estrictos y los aerobios facultativos crecen limitados.

Experimento # 6

Este experimento se realizó igual que el de la jarra Gas Pack con la diferencia en que aquí las placas se colocaron en un frasco de forma invertida se le colocó una vela encendida y se tapó el frasco y luego que la vela se apagó se creo un vacío; se dejó en temperatura ambiente por 24 horas y luego se sacó del frasco y se observó colonias y se procedió a la prueba de la catalasa para determinar su patogenesidad.

BIBLIOGRAFÍA:

PELZAR, MICHAEL. Microbiología. Editorial Mc Graw – Hill. 2ª edición. Impreso en México, S.A.

SCOTT, BAILEY. Diagnóstico Microbiológico. Editorial Panamericana. 7ª edición. Impreso en Argentina.

CARPENTER PHILIP. Microbiología. Editorial Interamericana. 2ª edición. Impreso en México.

COLLINS, C.H. Métodos Microbiológicos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza España. Impreso en España.

MADIGAN, MICHAEL. Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice may. 8ª edición. Impreso en España (1999).

Documento cedido por:

JORGE L. CASTILLO T.

Universidad Nacional Experimental

De los Llanos Occidentales

Ezequiel Zamora

UNELLEZ