Evaluación toxicológica de plaguicidas microbianos de origen fúngico

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Resumen

Los plaguicidas de origen biológico se consideran una opción ambientalmente benigna para el control de las plagas. Sin embargo, esto no significa que están libres de riesgos para la salud y el ambiente. Como parte del proceso de desarrollo de nuevos productos, de los procedimientos de registro y el interés de comercializarlos ha aumentado la necesidad de evaluación de la seguridad y el impacto ambiental de agentes de control biológico. Por tanto, la evaluación toxicológica de los plaguicidas microbianos, garantiza la seguridad de dichos productos ya que está diseñada para evaluar la patogenicidad, infectividad y la toxicidad de los agentes microbianos y de los contaminantes microbianos de la formulación.

Palabras claves: Toxicidad, pesticidas microbianos.

Abstract

Pesticides of biological origin are generally considered to provide an environmentally benign pest control option. However, this does not mean that they are entirely free of hazards to health and the environment. Because of interest in the registration and commercialization, the need of safety and environmental impact evaluation of biological control agents have been increased, both as part of the product development process, and as part of the registration procedure. Toxicology evaluation of microbial pesticides is therefore necessary to provide the security of these products and is designed to evaluate pathogenicity, infectivity and toxicity of the microbial agents and of microbial contaminants.

Key Words: Toxicity, Microbial pesticides

Introducción

Los nemátodos constituyen una de las plagas que más ataca a los cultivos agrícolas, se estima que provocan pérdidas de alrededor del 10% del rendimiento de cultivos de importancia económica, equivalentes a 80 mil millones de dólares anuales en todo el mundo (Handoo, 2001). En el trópico, cultivos como el cafeto, tabaco, plátanos y hortalizas son gravemente afectados por estos organismos, fundamentalmente por especies del género Meloidogyne (Luc et al, 1990). En Cuba, los programas de producción diversificada de alimentos están seriamente afectados por la alta incidencia de nemátodos agalleros; especialmente Meloidogyne incógnita (Kofoid y White) Chitwood. (Hidalgo, 1999)

Durante años, se han empleado una amplia gama de nematicidas, muchos de los cuales son biocidas de marcada influencia negativa sobre los organismos beneficiosos presentes en el suelo (Hooper y Evans, 1993). La resistencia de plagas e insectos frente a plaguicidas químicos, así como problemas de contaminación ambiental que han impactado negativamente en la biodiversidad de los agroecosistemas, de seguridad y salud pública inherentes a la fabricación y uso inadecuado de los agroquímicos; han conducido a la búsqueda y desarrollo de alternativas ecológicas para el tratamiento de las plagas agrícolas. Es en este contexto, el desarrollo y aplicación de agentes de control biológico (ACB), adquiere una importancia relevante como alternativa ambiental segura para el manejo de las plagas, ya que son un componente natural del ambiente y usualmente son mucho más selectivos que los plaguicidas químicos. Según datos publicados, resultados de evaluaciones y la experiencia ganada en su uso, los bioplaguicidas presentan un potencial de riesgo más bajo (Goettel y Jaronski , 1997).

No obstante, la introducción de cualquier organismo viviente en el ambiente es a menudo un paso irreversible por lo que debe hacerse con cautela, para que el organismo no se convierta en una plaga por sí misma, o interfiera con el funcionamiento natural de otros agentes de control de plagas, y/o cause toxicidad en las especies no-diana, incluyendo el humano y otras formas de vida que cohabitan en el ambiente. De ahí que, la seguridad de los hongos utilizados en el control biológico deba ser considerada a todos los niveles, ya sean efectos directos e indirectos sobre todos los miembros del ecosistema y sobre el ecosistema mismo (Hajek y Goettel, 2000).

En tal sentido, una vez demostradas las potencialidades del microorganismo como agente de control de plagas y antes de su inclusión en programas de control biológico se hace imprescindible llevar a cabo un conjunto de estudios toxicológicos para determinar seguridad e inocuidad para el hombre, los animales, las plantas y el ambiente; con especial énfasis en los estudios de toxicidad aguda en mamíferos que constituyen la etapa inicial de esta evaluación.

Control de plagas. Generalidades.

A finales del siglo XIX, ante las dificultades encontradas por el hombre en dominar las múltiples formas en que las plagas lo atacaban y asediaban, tuvo que recurrir a los medios químicos para su control. La química orgánica de los plaguicidas, nacida hace algo más de 30 años, puso en sus manos las más mortíferas armas químicas, jamás soñadas por el hombre, para la lucha contra las plagas. Desde el punto de vista de prevención y control, el empleo de dichos plaguicidas permitió de forma relativamente rápida y efectiva eliminar estos problemas. Sin embargo, esta efectividad está unida a una serie de efectos desfavorables como son entre otros: las afectaciones sobre la fauna beneficiosa, la contaminación ambiental y el desarrollo acelerado de resistencia de los insectos a los plaguicidas (Zavaleta-Mejia, 1999).

Una de las vías de reducción del empleo de estos plaguicidas es la introducción de los medios de control biológico y el Manejo Integrado de Plagas (MIP); ya que ambos ofrecen una salida alternativa a esta crisis mundial y demuestran cada día que son capaces de forjar una agricultura ambientalmente segura, socialmente justa y económicamente viable.

Los ACB de origen microbiano tienen un futuro promisorio dentro del MIP (Lacey y Goettel, 1995). Los microorganismos como componentes naturales del ambiente constituyen un grupo importante de elementos biológicos de uso fitosanitario, debido a su diversidad y la posibilidad de crear epizotias, que en ocasiones logran mantener las plagas y enfermedades por debajo del umbral de daño, sin necesidad de nuevas aplicaciones. Algunos de estos productos han sido utilizados durante muchos años sin ningún efecto dañino aparente sobre la salud humana o el ambiente (Goettel y Jaronski, 1997).

Los nemátodos constituyen una de las más serias amenazas para los sistemas de producción intensiva de hortalizas, ya que la inmensa mayoría de los cultivos hortícolas son buenos hospedantes de nemátodos del género Meloidogyne, especialmente M. incógnita. (Stefanova y Fernández, 1995). Para su control se invierten anualmente grandes cantidades de recursos; por ejemplo en los Estados Unidos (EEUU) se emplean aproximadamente siete billones de dólares por año para el control de esta plaga (Cook et al, 1996).

Muchos nematicidas químicos tienen efectos adversos sobre la salud de las aves y los mamíferos y algunos pueden tener efectos tóxicos y alergénicos sobre organismos no-diana, especialmente durante la producción/ formulación y la aplicación; como es el caso del bromuro de metilo que está demostrado que produce efectos tóxicos y degrada el ozono; por lo que se ha prohibido su uso en muchos países y está en vías de prohibirse incluso su producción a escala mundial (Stirling, 1991). Esta prohibición ha incrementado los problemas agrícolas de los nemátodos y por ende la necesidad de la búsqueda de nuevos nematicidas. (Lopez-Llorca y Jansson, 2001).

1.1.1 Hongos contra nemátodos

Existe un número considerable de hongos antagonistas de fitonemátodos con potencialidades para el control biológico, y un gran interés en su aplicación (Duncan , 1991). Sin embargo, ninguno es ampliamente usado en la práctica agrícola (Fravel, 1999) debido fundamentalmente al deficiente conocimiento entre otros aspectos del: modo de acción, producción de metabolitos y eventos o condiciones que afectan su actividad como bioplaguicida (López-LLorca y Olivares-Bernabeu , 1998)

Arthrobotrys robusta Dubbington, es un hongo atrapador de nemátodos, que ha sido vendido en Europa con fines nematicidas y Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson, ha sido usado en las Filipinas como parásito de huevos de nemátodos (Stirling, 1991)

Uno de los hongos nematófagos más estudiado es P. chlamidosporia considerado como uno de los ACB más eficaces para el manejo de poblaciones de nemátodos agalleros (Kerry , 2001) en particular de huevos de M. incógnita. (Hidalgo, 1999)

P. chlamydosporia var catenulata, cepa Vcc-108 (IMI SD No. 187) es un Deuteromycete, parásito facultativo de huevos de nemátodos agalleros, función que alterna con la de saprófito en la rizosfera. Está ampliamente distribuido y en las dos últimas décadas ha sido aislado de importantes nemátodos de quiste y agallas en gran diversidad de suelos y agro-ecosistemas, en todo el mundo. Aparece como parte de un complejo de diferentes especies relacionadas (Kerry y Bourne, 2002) parasitando quistes, huevos o nemátodos de vida libre. (Gams, 1988).

La segunda edición del Compendio de Protección de Cultivos del 2001 informa la siguiente posición sistemática:

Reino: Fungi

Phylum: Hongos mitospóricos

Clase: Hyphomycetes

Género: Verticillium

Especie Verticillium chlamydosporium

P. chlamydosporiaparásita huevos de nemátodos formadores de agallas formando apresorios, desarrollados a partir de la hifa indiferenciada que permite la colonización de la superficie de los huevos de los nemátodos. Sin embargo, la penetración, es el resultado de una presión física y una actividad enzimática. Una enzima proteasa serina alcalina (subtilasa) designada como VCP1 ha sido parcialmente caracterizada y en pruebas in vitro demostró eliminar la membrana vitelina más externa de la cáscara del huevo y expuso la capa de quitina de nemátodos formadores de agallas de raíces (Segers et al, 1996).

De los aislamientos estudiados por Hidalgo y cols (1999), se seleccionó a la cepa Vcc-108 de la var. catenulata como la más promisoria con un 68% de huevos de M. incognita parasitados en condiciones semicontroladas y el 70% de las masas de huevos colonizadas sobre la rizosfera del tomate, después de seis meses de aplicado el hongo en una sucesión de cultivos (Atkins et al. 2003).

Con esta cepa se han desarrollado metodologías de reproducción masiva en bandejas mediante formulación sólida (Hidalgo, 1999) y posteriormente mediante una tecnología de Fermentación en Estado sólido en Bolsa para obtener mayores rendimientos y desarrollar ensayos de campo a mayor escala (Hidalgo et al, 2004.). En estos ensayos de campo se ha demostrado que con una sola aplicación del hongo a razón de 5000 clamidosporas por gramo de suelo, después de dos ciclos consecutivos de tomate este logra infestar más del 60% de los huevos expuestos en la rizosfera, reduciendo significativamente el número de juveniles en el suelo. (Peteira et al, 2004)

Además se desarrolló un sistema que permite una identificación integral, desde el punto de vista cultural, morfológico y molecular, como parte de la evidencias necesarias para su detección, monitoreo y registro (Montes de Oca, 2002.)

1.2 Seguridad de hongos como agentes de control biológico

Dentro del grupo de bioplaguicidas de origen microbiano se destaca el uso de los hongos por su amplio número de géneros y especies eficaces en el control de diferentes plagas. Sin embargo, dichos hongos también contienen muchas especies que son plagas y que causan pérdidas incalculables a las cosechas, bosques, productos almacenados, edificios y afectan a la salud humana y animal. (Goettel et al, 2001). Por consiguiente, el desarrollo y uso de los hongos como ACB requieren una valoración de efectos imprevistos asociados con su uso.

Revisiones anteriores sobre la seguridad de los hongos utilizados como plaguicidas han sido informadas por Goettel y Johnson (1992) y Evans (1998, 2000). Las revisiones sobre la seguridad de agentes microbianos para el control de plagas (AMCP) en general son las de Laird et al (1990), Cook et al. (1996) y Goettel y Jaronski (1997).

Las guías para evaluar la patogenicidad e infectividad de entomopatógenos a los mamíferos han sido analizadas por Siegel (1997) y las guías para evaluar efectos de entomopatógenos en los organismos invertebrados no-diana por Hajek y Goettel (2000). Sin embargo, se han realizado muy pocos estudios para determinar los efectos de los hongos nematófagos sobre los organismos no-diana.(Goettel et al, 2001).

El término "organismo no-diana" se aplica a todas las especies que aparecen en el área donde vive la plaga que se quiere controlar y el efecto no-diana que puede producirse sobre estos organismos es más preocupante cuando se afectan especies de importancia comercial. (Hajek y Goettel , 2000)

Un grupo que trabaja con AMCP identificó los siguientes aspectos potenciales de seguridad y efectos no-diana asociado con el desarrollo de microorganismos para el control de plagas (Cook et al, 1996):

Desplazamiento competitivo de microorganismos no-diana
Alergenicidad a humanos y otros animales
Toxicidad a organismos no-diana
Patogenicidad a organismos no-diana

La disminución de la población diana, es otro efecto indirecto que por su importancia, también debe ser considerado como un aspecto potencial de seguridad.( (Hajek y Goettel , 2000)

El potencial de los efectos imprevistos variará en dependencia de los organismos potenciales diana y no-diana y los ecosistemas que ellos habitan. Estos efectos potenciales no intencionales sobre organismos no-diana son también efectos intencionales sobre organismos diana, excepto la alergenicidad. Dichos efectos intencionales sobre organismos diana, a diferencia de los no intencionales, son independientes del origen del organismo (nativo o exótico) y de la forma, si es natural o modificado; de ahí que la habilidad para evaluar el potencial de riesgo dependerá mucho de estos factores (Cook et al, 1996).

1.2.1 Desplazamiento competitivo

El control biológico a través del desplazamiento competitivo tiene gran potencial para el manejo de plagas de las plantas ya que utiliza cepas relacionadas y ecológicamente similares a los patógenos; ya sean organismos naturales o modificados genéticamente (Freeman y Rodríguez , 1993)

Como efecto intencional los hongos introducidos o aplicados como ACB tienen potencial para ocupar competitivamente un nicho y afectar adversamente uno o más organismos nativos dentro de ese nicho. Los efectos imprevistos ocurrirían si este desplazamiento del competidor afectara un organismo no-diana (llevándolo quizás a su extinción), o si de alguna otra manera afectara perjudicialmente un componente del ecosistema (Bennett , 1993)

Los microorganismos introducidos para el control biológico desplazan organismos no-diana como parte de las interacciones microbio-microbio mediada a través de la competencia por sitios o nutrientes. Desafortunadamente es muy difícil monitorear los efectos del desplazamiento competitivo sobre la ecología de los microorganismos no-diana (Cook et al, 1996).

Se han realizado estudios de compatibilidad de P. chlamydosporia con otros microorganismos, tales como Micorrizas, Tricoderma y Rhizobium donde se ha demostrado que no se produce desplazamiento competitivo de estos microorganismos beneficiosos que también forman parte de la rizosfera.¨

1.2.2 Alergenicidad

No existe ningún efecto diana de alergenicidad como mecanismo de control de plagas (Cook et al, 1996). Sin embargo, está demostrado que los hongos mitospóricos pueden causar alergias o reacciones alérgicas; no obstante, los ACB fúngicos reales o potenciales no están entre las especies que producen alergenos comunes (Latgé, 1991).

Existen informes de reacciones alérgicas relacionadas con los hongos de control microbiano, principalmente, en personas expuestas durante la producción masiva y la aplicación (Austwick, 1980). Un grupo de científicos que trabajan con Bauveria bassiana (Bals) Vuill informaron la aparición de reacciones alérgicas de grado moderado a severo, y por consiguiente la Agencia de Protección Ambiental (EPA) lista este hongo como un sensibilizante dérmico (Saik et al, 1990). Además, se ha demostrado que el extracto crudo de Metarhizium anisopliae contienen uno o más potentes alérgenos (Ward et al, 1998).

1.2.3 Toxicidad

La toxicidad como efecto diana está basada en la capacidad que tienen los microorganismos para producir compuestos que inhiben el crecimiento, desarrollo y comportamiento de otros organismos (Cook et al, 1996.)

Los hongos secretan una amplia variedad de compuestos muchos de los cuales son tóxico a las plantas, los invertebrados o los vertebrados. M. anisopliae produce destruxins y cytochalasins; B. bassiana: oosporein, beauvericin, bassianolide y beauveriolide, Hirsutella thompsonii: hirsutellin y Trichoderma harzianum: peptaibols, por sólo nombrar algunos. El papel que éstas toxinas juegan en la patogénesis no está definido; aunque se sabe que algunos pueden contribuir a la capacidad del hongo de superar a su hospedero. Sin embargo, la producción de toxinas varía según el aislamiento y necesariamente no juega un papel importante en la virulencia en cada caso. La seguridad de estas toxinas para los vertebrados se establece por la combinación del conocimiento del modo de acción de la toxina y los datos de pruebas de seguridad acumulados a través de los años (Laird et al, 1990).

La producción de toxinas de un candidato fúngico no debe utilizarse como único elemento para impedir su uso como ACB. Primero deben hacerse consideraciones respecto a los posibles efectos de la presencia de la toxina en el producto formulado, su destino después de la aplicación (ej. proporción de degradación) y la posible bio-acumulación en el hospedante o ambiente (Goettel et al, 2001).

1.2.4 PatogenicidadEl principal uso de los microorganismos empleados para el control biológico ha sido, como patógenos de plagas (Cook et al, 1996), de ahí que la patogenicidad hacia el organismo diana normalmente es el efecto deseado. Sin embargo, la patogenicidad hacia los organismos no-diana podría aparecer como un efecto imprevisto y es sin duda el problema más importante y controversial relativo al uso de los patógenos microbianos como ACB (Goettel et al, 2001).

Los hongos, incluso las especies utilizadas para el control biológico, pueden infectar una amplia variedad de hospedantes que a veces incluyen mamíferos, . por ejemplo, se informa de B. bassiana infectando caimanes americanos cautivos (Saik et al, 1990; Semalulu et al, 1992 ) y Aspergillus ochraceus Wilhelm que se cita como patógeno oportunista en humanos (Sinski, 1975). Además, se han informado varios casos de infecciones en humanos por M. anisopliae (Burgner et al, 1998; Revankar et al, 1999) y por P. lilacinus (Itin et al, 1998; Gutierrez-Rodero et al, 1999) en individuos immunocompetentes e immunoincompetentes. En 1999, este último fue nombrado por la Fundación Nacional para las Enfermedades Infecciosas como un importante patógeno fúngico (Toscano y Jarvis, 1999). Conidiobolus coronatus es otro hongo entomopatógeno que ha sido asociado con lesiones encontradas en humanos y caballos (Saik et al, 1990)Evidentemente la evaluación de agentes fúngicos de control microbiano debe incluir una evaluación de su patogenicidad en organismos no-diana, sobre todo los vertebrados, teniendo en cuenta la exposición humana durante los procesos de producción y aplicación.1.2.5 Disminución de la población dianaEl potencial de riesgo en el uso de los microorganismos depende de las consecuencias que se derivan de la depleción de la población diana por debajo del umbral natural ya que teóricamente no es posible reducir drásticamente el nivel poblacional de una plaga, sin afectar, también de forma adversa, otros componentes del ecosistema.( Goettel et al,.1990)

La meta de cualquier programa de control biológico es disminuir la población de una plaga y esta reducción a su vez puede afectar perjudicialmente a otros organismos no-diana que de una manera u otra dependen de esta plaga. La gravedad del daño a la población no-diana dependerá en gran medida de la magnitud y velocidad de la disminución del hospedero y del tiempo en el que dicho hospedante ha sido su diana (Goettel et al, 2001).

El hongo P. chlamydosporia ha sido asociado con suelos que suprimen naturalmente la multiplicación de nemátodos de quistes, donde coexisten varias especies de hongos nematófagos; además se ha demostrado que produce alrededor de un 70% de parasitismo, por lo que no debe producir daños por esta vía. (Hidalgo, 1999).1.2.6 Características específicas de P. chlamydosporia relacionadas con el riesgo de toxicidadEl potencial de efectos adversos de un hongo depende no sólo del patógeno en cuestión y de su origen (nativo o exótico), sino también de la forma de uso propuesta (liberación inundativa o inoculativa) y el área donde se va a aplicar (Hajek et al, 2003). Dentro de las características de los hongos relacionadas con el riesgo tenemos: rango de hospedero, susceptibilidad relacionada con la dosis, persistencia y dispersión, organismos naturales o genéticamente modificados y organismos exóticos o nativos.Los hongos nematófagos utilizan gran diversidad de tipos de asociaciones con sus hospederos y se agrupan en atrapadores o parasitarios (Stirling, 1991). Los atrapadores han especializado estructuras como anillos contráctiles y/o clavijas para atrapar nemátodos y se considera que tienen poca especificidad de hospedante; en este grupo, el género Arthrobotrys ha recibido la mayor atención. Más recientemente, ha cambiado el interés hacia al uso de hongos parásitos que atacan fases sedentarias de los de nemátodos. Las dos especies más estudiadas han sido: P. lilacinus y P. chlamydosporia (Kerry , 2000). Estos hongos son parásitos oportunistas; cada aislamiento puede diferir del resto en su capacidad de atacar huevos y quistes de nemátodos (Goettel et al, 2001). Otros autores han demostrado que el mecanismo de acción de P. chlamydosporia es dosis dependiente, siendo la dosis mínima efectiva 5000 clamidosporas /g de suelo y el parámetro que podría afectar su efectividad es la temperatura del suelo, donde aparece de 22-30° C como el rango óptimo (Hidalgo, 1999).

Todos los estados de P. chlamydosporia ocurren en el suelo. Las clamidosporas le permiten al hongo sobrevivir cuando el hospedante es escaso (Kerry , 1984) y pueden ser usadas para el establecimiento del hongo (De Leij FAAM y Kerry, 1991) sobreviviendo en un número considerable, hasta tres meses (Kerry et al, 1993). La dispersión en el suelo producto del crecimiento de las hifas es muy limitada (Kerry, 1988) no obstante el hongo puede colonizar la rizosfera y proliferar en el suelo (Bourne et al, 1996). Como AMCP se usará en su forma natural y se propone un uso inundativo, pero con una sola administración al año (Hidalgo et al, 2004) que es lo suficientemente baja como para que los riesgos sean mínimos.1.2.7 Hospedante como alimento humano La mayoría de los ACB son destinados para el uso contra plagas, por lo que sólo podrían ser accidentalmente consumidos por los humanos. No obstante, el riesgo en el consumo humano de patógenos se analiza con ensayos estándar que emplean situaciones de máximo reto que normalmente requieren estudios agudos de toxicidad / patogenicidad en mamíferos (Tabla 1) (Goettel et al, 2001)

Con relación a esto, no se conocen ejemplos documentados de efectos tóxicos producidos en animales o humanos que hayan ingerido partes de plantas tratadas con agentes microbianos (Cook et al, 1996).

Tabla 1. Ensayos requeridos para el registro de un plaguicida microbiano bajo la Subdivisión M de las guías de la EPA.

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Fuente: Código de Regulaciones Federales, 40, parte 158.740.

EP: producto final

TGAI: grado técnico de ingrediente activo

Jaronski

Regulación y registro. Generalidades.El uso de AMCP ha aumentado considerablemente en las recientes décadas, con los productos registrados disponibles en la mayoría de los países desarrollados y muchos países en desarrollo (Copping LG, 2001). Los requisitos regulatorios son costosos y consumen tiempo, no por la falta inherente de seguridad, sino debido al costo del desarrollo y registro de productos de mercado de nicho pequeño. No obstante, es indiscutible que el conocimiento básico de los posibles efectos tóxicos, tiene que ser evaluado antes del registro de un producto basado en un patógeno fúngico y ser considerado como requisito básico para cualquier AMCP (Cook et al, 1996). De hecho, existe una tendencia general hacia el cumplimiento de requisitos regulatorios más exigentes (Barratt et al, 1999)

La implementación de las regulaciones es considerada por muchos países y se espera que tenga un aumento significativo durante la próxima década como respuesta a los acuerdos tomados durante la Sexta Convención de Diversidad Biológica (Convention on Biological Diversity, 2002; Hokkanen et al, 2003).

Actualmente los AMCP representan apenas el 2% del mercado mundial de los plaguicidas. En EEUU a finales del 2001 fueron registrados aproximadamente 195 ingredientes activos y 780 productos clasificados como bioplaguicidas, estimándose cerca de 72 a base de bacterias, 47 de hongos, 40 de nemátodos y 2 de protozoos (Agencia de Protección Ambiental (EPA), 2004)1.3.1 Regulación de los hongos como plaguicidas microbianosEn la mayoría de los países se exige el registro de los patógenos utilizados como AMCP; por ejemplo, en EEUU el registro de agentes microbianos está bajo la jurisdicción de la EPA, la Oficina de Prevención, Plaguicidas y Sustancias Tóxicas y la División de Prevención de Contaminación y se legisla bajo el Acta Federal de Insecticida, Funguicida y Rodenticida (7 USC 136) (Jaronski et al, 2003).

Antes de 1996, los métodos de evaluación de los microorganismos estaban basados en los protocolos de los plaguicidas químicos, quedando aspectos que no estaban bien definidos para este tipo de producto. Debido a esto y a la experiencia obtenida con los primeros registros solicitados para AMCP (US Environmental Protection Agency, 1996) se revisaron las guías y se adoptó un nuevo sistema separado de los plaguicidas convencionales, en la llamada Serie OPPTS 885 que refleja una mejor comprensión de los datos necesarios para los productos microbianos (OTA. Biologically Based Technologies for Pest Control, 1995).En 1996 la Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo (OECD) armonizó los requisitos para el registro de los plaguicidas biológicos en los países miembros de la OECD al encontrar que existían diferencias reales en los datos exigidos por cada país, fundamentalmente en lo relacionado con las propiedades físico-químicas, la ecotoxicología y el comportamiento ambiental. Estas diferencias en los datos exigidos, han sido uno de los aspectos más perjudiciales dentro de las regulaciones de los AMCP. En muchos casos, una compañía que desee registrar un producto en varios países tiene que proporcionar diferente documento de registro para cada país y cada uno con requisitos y estructura diferente, lo que aumenta significativamente los costos del registro y aumentaría también el riesgo en los países con menor desarrollo y menor exigencia en sus regulaciones ya que se verían invadidos de ACB potencialmente tóxicos (Goettel y Jaronski, 1997).Se han realizado esfuerzos promisorios hacia la armonización de los requisitos regulatorios entre los países. Por ejemplo, bajo los auspicios de un Acuerdo norteamericano de Libre Comercio, el Grupo de Funcionamiento Técnico de Plaguicidas, en EEUU, Canadá y México ha trabajado para armonizar los datos que exige el registro de los AMCP en sus países (Neale y Newton, 1999; OECD, 1999).

En la Unión Europea se realizan esfuerzos similares para desarrollar requisitos comunes de registro (OMS, 1981). Un proyecto aún más ambicioso es regular y armonizar los datos que se exigen para el registro de plaguicidas microbianos en los 29 países miembros de la OECD (OECD, 1999).El principio de la evaluación de datos sometidos a una solicitud de registro son las propiedades básicas del microorganismo, tales como: la caracterización taxonómica, la historia de su uso, la biología, la especificidad de hospedero, el modo de acción, la persistencia en el ambiente, la presencia de ingredientes involuntarios (contaminantes, metabolitos de preocupación potencial), y las propiedades físicas y químicas; que unido a los estudios de seguridad tienen el objetivo de evaluar el riesgo que posee un candidato como AMCP, por medio de pruebas de laboratorio cuidadosamente seleccionadas. Estos protocolos de ensayo combinan elementos de evaluación de máximo reto con diferentes métodos de exposición (Goettel et al, 2001).La Organización Mundial de la Salud fue la primera en proponer una estrategia de pruebas por baterías de complejidad creciente para evaluar el riesgo en mamíferos de los agentes microbianos (ISO, 1992). Los elementos de esta propuesta están incorporados en las guías regulatorias actuales para Canadá, EE.UU. y la Unión Europea. Estas guías reemplazan los ensayos a largo plazo que se utilizan en la evaluación de los plaguicidas químicos con exposiciones a corto plazo (1 mes) y combinan elementos de pruebas toxicológicas convencionales tales como exposiciones orales y dérmicas con vías más invasivas, inyección intravenosa o intraperitoneal. Se utilizará una vía u otra en dependencia del AMCP, la primera es la más invasiva y la intraperitoneal se utiliza para agente microbianos de gran tamaño de partícula que podrían ocluir la vena cuando son administrados. Esta batería de ensayos se refiere como Nivel I en el Código de Regulaciones Federales 40, parte 158.740 (Siegel, 1997; Code of Federal Regulations, 2001).

1.3.2. Ensayos de seguridadEl llamado Nivel I es la batería inicial de pruebas toxicológicas, consiste en bioensayos de laboratorio que evalúan un riesgo máximo (por ejemplo, 10-100 veces la cantidad recomendada en el campo). En la mayoría de los casos, sólo se evalúa la calidad técnica del ingrediente activo (es decir, el agente microbiano no formulado). Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, la EPA puede exigir la comprobación del patógeno formulado; como por ejemplo en los casos que se sospeche que la formulación pueda reforzar el efecto del microorganismo. Los resultados negativos en el nivel I, o sea la ausencia de infectividad o patogenicidad indicarían que es poco probable que el AMCP cause problemas al ser liberado en el campo; ya que aunque remota, también existe la posibilidad que pueda producir infección o mortalidad en especies susceptibles o en situaciones únicas durante el uso real del producto (Jaronski et al, 2003).

Los datos del nivel I se usan junto con la información disponible con respecto a los modelos de uso, rango de hospedero, persistencia, y otros factores para evaluar el potencial de efectos adversos del agente. Si se observan efectos adversos en este nivel, se realizarían las pruebas del nivel II que tienen el objetivo de cuantificar los niveles del agente microbiano a los que puede estar expuesto el organismo no-diana susceptible. Si este agente muestra persistencia en el ambiente en niveles elevados, entonces se exigen los estudios del nivel III para determinar los efectos de exposición crónica a los niveles microbianos. En el nivel II y III se determina el riesgo real del AMCP. Los ensayos de este último están diseñados para evaluar el potencial de estos agentes o contaminantes microbianos de las formulaciones que se reconocen como parásitos intracelulares de células de mamíferos o que han demostrado que lo son por los datos obtenidos en los estudios de los niveles I y II e incluyen pruebas adicionales agudas para evaluar el rango de especies no-diana susceptibles, la ruta óptima de exposición y/o relaciones exactas de dosis-respuesta. Finalmente, los estudios del nivel IV, en las pruebas de campo reales o simuladas, evaluarían si hay un problema en el uso, que haría necesario la imposición de restricciones del mismo. Jaronski et al. (2003) plantean que hasta el momento no se le ha exigido estudios de los niveles III ó IV a ningún agente microbiano. El AMCP no tiene que ser inocuo ni en todas las pruebas ni en todas las concentraciones evaluadas, pero sí deben ser analizadas las circunstancias bajo las que produce infección o mortalidad.Este gran grupo de pruebas evalúa los efectos del AMCP sobre organismos no-diana entre los que se incluyen plantas, peces, artrópodos beneficiosos, aves y mamíferos. Aunque, tanto los plaguicidas químicos como los microbianos tienen en común, aspectos de seguridad relacionados con la toxicidad, la principal diferencia es la capacidad que tienen estos últimos para multiplicarse y causar infección. La infección puede ocurrir no sólo en el organismo diana del agente microbiano, sino también en especies no-diana, lo que indica la necesidad de estudios de infectividad (Siegel, 1997).Siegel (1997) define la infección como la alteración causada en el hospedero por agentes vivos ya sea por multiplicación en el tejido, por producción de toxinas o ambos; esta definición relaciona la presencia de microorganismo al daño tisular y sugiere este último como una condición necesaria para considerar que existe infección en los estudios de seguridad en mamíferos. El simple recobrado de un AMCP no es sinónimo de infección. Asumiendo que la respuesta inmune del hospedero es constante, el recobrado de una porción del inóculo así como la redistribución del mismo entre los tejidos del hospedero ocurrirán en una duración de tiempo que dependerá de la vía de administración y la magnitud de la dosis. En condiciones de infección, hay que demostrar que existe multiplicación del agente microbiano (recobrado de una cantidad superior a la administrada, recobrado de formas vegetativas cuando se administran esporas, problemas de aclaramiento en el tiempo) unido a daño tisular. Esta asociación es esencial, porque la aparición solamente de daño en los tejidos (como sucede en la respuesta inflamatoria) o muerte en los animales de experimentación puede ser causada por la naturaleza física del inóculo y/o la respuesta del hospedero a una proteína extraña y dichas reacciones son independientes del agente. De ahí que los grupos controles tratados con el vehículo autoclaveado sean tan importantes en estudios de infectividad ya que se puede determinar si el efecto adverso se debe únicamente a la presencia de esa proteína extraña. El término patogenicidad denota la capacidad intrínseca de un microorganismo para penetrar las defensas del hospedero y el término virulencia se refiere a la velocidad e intensidad con que esto se logra (Siegel, 1997).

1.3.3 Estudios de toxicidad aguda e irritación

Los estudios de Toxicidad / Infectividad / Patogenicidad (TIP) del nivel I están diseñados para detectar efectos tóxicos agudos de los componentes biológicos o no-biológicos de la formulación del AMCP; si en estos estudios se observaran efectos tóxicos en ausencia de signos de infectividad o patogenicidad sería necesario realizar estudios de toxicidad aguda del nivel II.

La evaluación toxicológica se realiza con respecto a tres puntos finales:

Patogenicidad del AMCP y de los contaminantes microbianos
Infectividad / persistencia inusual del AMCP y de los contaminantes microbianos
Toxicidad del AMCP, de los contaminantes microbianos y del producto final.

Los ensayos de TIP Aguda tienen como objetivo evaluar el riesgo de un AMCP, a través de la determinación de la Toxicidad / Patogenicidad de una dosis única administrada por diferentes vías a los animales de experimentación. La vía oral es la recomendada por la EPA y otras agencias regulatorias para el ensayo que inicia el estudio toxicológico ya que es la vía posible, directa o indirecta, de entrada del producto al organismo humano y a otras especies animales que estén en contacto con él; con la intraperitoneal se obtiene información de riesgo una vez que el microorganismo haya atravesado la barrera de la piel. En el caso de la vía dérmica, en la EPA se plantea que en raras ocasiones podría esperarse que un microorganismo pueda pasar la barrera de la piel o infectar células epiteliales de animales hospederos sanos, sólo por el hecho de haber sido puestos en contacto con ella; de ahí que el propósito de este ensayo sea evaluar efectos tóxicos debido a componentes químicos o no-biológicos de una formulación del AMCP aplicado por esta vía (OECD, 1996).

El objetivo de los estudios de irritación es determinar el potencial irritante que pueda tener la sustancia de ensayo sobre determinadas estructuras del organismo, en dependencia de las cuales se clasifican en estudios de irritación dérmica u ocular. Los ensayos de irritación ocular son requeridos por muchas agencias reguladoras como la OECD (García et al, 1988) la Organización Internacional de Estándares (ISO) (Price y Andrews, 1985 ) y el Centro Estatal para el Control de Medicamentos (CECMED), entre otros, para el etiquetado y clasificación de los productos. García y colaboradores (1988) establecieron la tabla de clasificación del potencial irritante de los productos e indicaron como límite de aprobación o rechazo, el valor de 20 (Tabla 6), debido a que por consideraciones oftalmológicas, aquel producto que en el ensayo de irritación ocular muestre un valor de hasta 25 en la escala de Draize (Draize et al 1994), se clasifica como no irritante para el humano (US Environmental Protection Agency, 1996).

La rata como especie roedora y el conejo como no roedora son los animales de laboratorio más utilizados y recomendados por las principales agencias regulatorias en investigaciones farmacotoxicológicas lo que está avalado por el considerable volumen de información que existe sobre cada especie y que son de fácil obtención y manipulación en condiciones de laboratorio. En los estudios dérmicos y oculares el conejo es la especie preferida debido a la permeabilidad superficial característica de su piel y al tamaño de los animales que hace que sea mayor el área a trabajar, así como, ser muy sensibles para la detección de la irritación ocular y tener ojos no pigmentados (permiten observar las lesiones en el iris) y de gran tamaño con respecto al peso corporal que facilita la observación.

En estos estudios se emplean grupos controles para asegurar que los efectos observados están asociados con la exposición a la sustancia de ensayo. Los grupos controles negativos no tratados, como su nombre lo indica no reciben tratamiento alguno. El control tratado con el AMCP inactivado se utiliza para descartar posibles efectos que pueden producirse en el animal de ensayo a través de mecanismos diferentes a la infección y brinda una información útil para determinar el mecanismo de patogénesis. El grupo control tratado con el vehículo se utiliza si se emplean otros vehículos para administrar la sustancia de ensayo diferentes de solución salina o agua destilada (OECD, 1996).

Resultados

El reto básico de los estudios de seguridad es determinar si el AMCP es razonablemente seguro. Así lo resumió Burges (1981) cuando planteó que:

"una situación de cero riesgo no existe, ciertamente no sólo con plaguicidas químicos, sino también con agentes biológicos ya que no se puede demostrar un efecto negativo absoluto. El registro de un químico es esencialmente una declaración de uso en el que los riesgos son aceptables y el mismo debe ser aplicado a los agentes biológicos".

Se ha visto cómo los hongos pueden ser utilizados como agentes de control biológico de manera segura y con éxito, de hecho, son producidos para el control inundativo de plagas de artrópodos, nemátodos y cizañas sin efectos perjudiciales sobre el ambiente o sobre la seguridad de los organismos no-diana. También se han utilizado patógenos fúngicos para el control biológico clásico de insectos y cizañas. Goettel et al (2001) plantearon que hasta la fecha no se ha documentado ningún efecto perjudicial relacionado con el uso de los hongos como ACB. Sin embargo, se ha demostrado que poseen propiedades que los hacen potencialmente peligrosos tanto para el hombre como para el ambiente en general. Por consiguiente, el desarrollo y uso de hongos como agentes de control de plagas requiere una valoración de sus riesgos potenciales, comenzando con los efectos tóxicos en mamíferos (Hajek et al, 2003).

Existe muy poca información publicada acerca de los perfiles de seguridad de los AMCP y los pocos que existen han sido generados por la industria en el curso de desarrollo y registro de nuevos productos. Estos datos son privados y de difícil acceso. Sin embargo, se han publicado los resultados de algunos estudios agudos utilizando diferentes vías de exposición, como son: inhalación, inyección subcutánea, intraperitoneal e intravenosa, irritación dérmica y ocular, estudios dérmicos de sensibilización y estudios en la dieta.(Goettel y Jaronski, 1997; Ward et al, 1998; Smits et al, 1999; Vestergaard et al, 2003; Strasser et al, 2000)

Con respecto a la toxicidad, se conoce que muchos metabolitos producidos fundamentalmente por hongos entomopatógenos (que son los más estudiados) causan toxicidad en mamíferos, lo que se considera como un problema de seguridad para esos AMCP (Undeen, 1990 ; Trammer et al, 1999)

La germinación del microorganismo en el hospedero (rata o conejo) puede ser inhibido o estimulado por varios factores como por ejemplo pH, presión osmótica, presencia de iones específicos, propiedades biológicas de las esporas y la temperatura corporal de los mamíferos, donde valores por encima de 30°C, pueden ser una barrera importante frente a la infección (Mier et al, 1994; Solter et al, 1997) .

En el caso de la vía oral pueden ocurrir tres eventos:

Las clamidosporas pueden pasar a través del tracto digestivo sin ser digeridas y mantenerse viables en las heces fecales (Hylis et al, 1998 )
El tejido del hospedero puede no ser el idóneo para el establecimiento, desarrollo o reproducción del patógeno. (Hajek y Butler, 2000; Vey et al, 2001)
El hospedero puede destruir activamente al patógeno durante su migración al tejido diana por vía de la respuesta celular inmune y la posibilidad de la inmunidad humoral.

En el caso de la patogenicidad, se ha demostrado la presencia de los hongos, tales como P. Lilacinus, en infecciones en humanos (Toscano y Jarvis, 1999). Sin embargo, las pruebas de seguridad en mamíferos de este hongo nematófago que incluyeron toxicidad aguda oral, dérmica y pulmonar en ratas y estudios de irritación en conejos indicaron la relativa seguridad de este microorganismo; por lo que se ha sugerido que posiblemente ese aislamiento de P. lilacinus colectado de nemátodos no presenta riesgos para la salud animal y humana (Goettel et al, 2001.

Relacionado con la infectividad, se ha demostrado que los hongos poseen una gran variedad de estados de vida que hacen que pueda sobrevivir cuando las condiciones ambientales no son las óptimas para su normal crecimiento y desarrollo (esporas); por lo tanto no es sorprendente que estos microorganismos se mantengan viables en los tejidos de los mamíferos durante algún tiempo (Siegel, 1997.

Estos resultados apoyan la utilización segura de los hongos en ambientes en los que pueda ocurrir exposición humana accidental, sin considerar que para tales prácticas se deben usar medios de protección como medida de seguridad y ante el eventual estado de inmunosupresión que pudiera tener algún operario relacionado con la aplicación del ACB.

De manera general, con los estudios de toxicidad se ha podido demostrar la seguridad para los mamíferos durante el uso de algunos ACB de origen fúngico, como es el caso de Bacillus spp., utilizado ampliamente en el mundo para el control de insectos y del cual se informa que tiene bajo potencial para producir patogenicidad en los vertebrados. Las cepas registradas se han evaluado extensivamente para determinar posibles efectos sobre organismos no-diana, incluyendo mamíferos como parte de las exigencias del registro y no se ha observado ningún efecto dañino (Laird et al, 1990). Así mismo, varios aislados de B. bassiana han sido evaluados en estudios de seguridad en vertebrados y se ha demostrado que el hongo no produce infección ni toxicidad, aunque se aclara que se deben tomar precauciones para evitar la inhalación de grandes cantidades de conidios. (Goettel y Jaronski, 1997; Copping, 2001).

Zimmermann (1993), realizó una revisión de datos de seguridad de M. anisopliae en animales de sangre caliente y concluyó que hubo ausencia de síntomas de toxicidad o patogenicidad cuando los conidios de este hongo fueron aplicados por diferentes métodos a las aves, ratones, ratas, curieles y conejos.

Conclusiones

Los plaguicidas de origen biológico, generalmente proporcionan una opción medioambiental benigna para el control de plagas. Sin embargo, esto no significa que ellos están completamente libres de riesgos para la salud y el ambiente. De hecho, además del potencial de riesgo para organismos no-diana (toxicidad, patogenicidad, desplazamiento competitivo y alergenicidad), existe también riesgo por contaminantes microbianos y por otras sustancias utilizadas en la formulación final (ejemplo: excipientes, diluentes, protectores ultravioleta, etc.) y riesgos por el hecho de que algunos patógenos microbianos generales son infecciosos para vertebrados e invertebrados. La evaluación toxicológica de plaguicidas microbianos es por consiguiente necesaria para proteger la salud y seguridad del hombre, los animales y el ambiente.

Bibliografía

Agencia de Proteccón Ambiental (EPA). What are biopesticides? [ en línea] Disponible en: http/www.epa.gov/pesticides/biopesticides/what_are_biopesticides.htm [Consultado Marzo 2004].

Atkins SD, Hidalgo L, Clark I, Morton OC, Montes de Oca N, Gray PA, Kerry BR. Approaches for monitoring the release of Pochonia chlamydosporia var. catenulata, a biological control agent of root knot nematodes. Mycological Research 2003;107(2):206-212.

Austwick PKC. The pathogenic aspects of the use of fungi: the need for risk analysis and registration of fungi. Ecological Bulletin Stockholm 1980;31:91-102.

Barratt BIP, Ferguson CM, Mc Neil MR, Golson SL. Parsitoid host specificity testing to predict host range. En: Whithers TM, Barton Browns I, Stanley JN eds. Host specificity testing in Australia towards improved assay for biological control .CRC for Tropical Pest Management .Brisbane Australia, 1999:70-83.

Bennett F. Do introduced parasitoids displace native ones? Florida Entomologist 1993;76:54-63.

Bourne JM, Kerry BR, De Leij FAAM. The importance of the host plant on the interaction between root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) and the nemathophagous fungus, Verticillium chlamydosporium Goddard. Biocontrol Sci and Technol 1996;6:539-548.

Burges HD. Safety testing and quality control of microbial pesticides. En: Burges HD eds. Microbial Control of Pests and Plant Diseases. 1970–1980. Academic Press, London, 1981:738–767.

Burgner D, Eagles G, Burgess M, Procopis P, Rogers M, Muir D, Pritchard R, Hocking A, Priest M. Disseminated invasive infection due to Metarhizium anisopliae in an inmunocompromised child. Journal of Clinical Microbiology 1998;36:1146-1150.

Code of Federal Regulations. Title 40, Protection of Environment, Washington DC: Office of the Federal Register, National Archives and Records Administration, 2001:150-189.

Convention on Biological Diversity (CBD). Review and consideration of options for the implementation of article 8 (h) on alien species that threaten ecosystems habitats or species. Conference of the parties to the convention on Biological Diversity. Sixth Meeting, The Hague, 7-19 April 2002. Item 22 of the provisional agenda UNEP/CBD/COP/6/18/Add.1/Rev.1, 26 March 2002.

Cook RJ, Bruckart WL, Coulson JR, Goettel MS, Humber RA, Lumsden RD, Maddox JV, McManus ML, Moore L, Meyer SF, Quimby PC, Stack JP, Vaughn JL. Safety of microorganisms intended for pest and plant disease control: A framework for scientific evaluation. Biological Control 1996;7:333-359.

Copping LG. The Biopesticide Manual 2nd ed. British Crop Protection Council, Farnham UK, 2001.

De Leij FAAM, Kerry BR. The nemathophagous fungus, Verticillium chlamydosporium, as a potential biological control agent for Meloidogyne arenaria. Révue de Nématologie 1991;14:157-164.

Draize JH, Woodward G, Calvery HP. Methods of the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membrane. J Pharm and Therapy 1944;82:377-390.

Duncan LW. Current options for nematode management. Ann Rev Phytopathol 1991;29:469-490.

Evans HC. Evaluating plant pathogens for biological control of weeds; an alternative view of pest risks assessment. Australian Plant Pathology 2000;29:1-14.

Evans HC. The safe use of fungi for biological control of weeds. Phytoprotection 1998;79:67-74.

Fravel DR. Commercial Biocontrol products for use against soilborne crop diseases. USDA ARS Biocontrol of Plant Diseases Laboratory: Commercial Biocontrol Product List, 1999.

Freeman S, Rodríguez RJ. Genetic conversion of a fungal plant pathogen to a nonpathogenic, endophytic mutualist. Science 1993;260:75-78.

Gams W. a contribution to the knowledge of nematophagous species of Verticillium. Journal of Plant Pathology 1988;94:123-148.

García G, Palacios M, Pérez P, García R, Díaz GY, Gazapo R. Elaboración de una metodología para la evaluación de la irritabilidad oftálmica. Validación con distintos métodos. Rev Cubana Farm 1988;22(2):5-24.

Goettel MS, Hajek AE Siegel JP Evans HC. Safety of fungal Biocontrol Agents. En: Butt TM, Jackson C, Magan, N. eds. Fungi as Biocontrol Agents. CAB International Wallingford UK, 2001:347-375.

Goettel MS, Jaronski ST. Safety and registration of microbial agents for control of grasshoppers and locusts. Memoirs of the Entomological Society of Canada 1997;171:83-99.

Goettel MS, Jonson DL. Environmental impact and safety of fungal biocontrol agents. En: Lomer C, Prior C eds. Biological control of Locusts and Grasshoppers. CAB International Wallingford UK, 1992:356-361.

Goettel MS, Poprawski TJ, Vandenberg JD, Li Z, Roberts DW. Safety to non-target invertebrates of fungal biocontrol agents. En: Laird M, Lacey LA, Davidson EW eds. Safety of microbial insecticides. CRC Press, Boca Raton Fl, 1990:209-232.

Gutierrez-Rodero F, Moragon M, Ortiz de la Tabla V, Mayol MJ, Martin C. Cutaneous hyalohyphomycosis caused by Paecilomyces lilacinus in an inmunocompetent hostsuccessfully treated with itraconazole: case report and review. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 1999;18:814-818.

Hajek AE, Butler I.. Pedicting the host range of entomopathogenic fungi. En: Follett PA, Duan JJ eds. Nontarget Effects of Biological Control. Kluwer Acad Publ Dordrecht NL, 2000:263-276.

Hajek AE, Delalibera I, Butler L. Entomopathogenic fungi as classical biological control agents. En: Hokkanen HMT, Hajek AE eds. Environmental Impacts of Microbial Insecticides. Kluwer Academic Publishers Netherlands, 2003:15-34.

Hajek AE, Goettel MS. Guidelines for evaluating effects of entomopathogens on non-target organisms. En: Lacey LA, Kaya HK eds. Manual of Field Techniques in Insect Pathology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht Netherland, 2000:847-868.

Handoo AZ. Plant parasitic nematodes, a general article written for plant quarantine inspectors.[ en línea] Febrero 2001. Disponible en: http//sun.ars-grin.gov/ars/Beltsville/barc/psi/nem/aphised.htm. [Consultado Febrero 2004].

Hidalgo L, Montes de Oca N, Correa H, Hernández MA. Manual para la investigación y desarrollo de un Bionematicida a partir de la cepa Vcc-108 de Pochonia clhamydosporia var. catenulata. CENSA. OCIC 2004.

Hidalgo L. Potencialidades de cepas autóctonas de V. chlamydosporium (Goddard) como agente de control biológico de Meloidogyne spp. La Habana. Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas. CENSA-UNAH 1999.

Hokkanen H, Bigler F, Burgio G, Van Lenteren JC, Thomas MB. Ecological risk assessment framework for biological control agents. En: Hokkanen HMT, Hajek AE eds. Environmental Impacts of Microbial Insecticides. Kluwer Academic Publishers Netherlands, 2003:1-14.

Hooper DJ, Evans K. Extraction, Identification and Control of Plant Parasitic Nematodes. En: Evans KDL, Trudgill JM Webster, eds. Plant Parasitic Nematodes in Temperate Agriculture. CAB International Wallingford, 1993:48-59.

Hylis M, Vavra J, Maddox JV, McManus ML. Host specificity of two microsporidian isolates (Potrista, Microspora) from de gypsy moth, Lymantria dispar L. (Lepidoptera, Lymantriidae) for some European Lepidoptera. Abstracts of the 17th European Congress of Entomology, Ceske Budejovice, 1998:572-573.

International Standardization Organization. ISO 10993, Part 11, Test for systemic toxicity. Geneva: ISO, 1992.

Itin PH, Frei R, Lautenschlager S, Buechner SA, Surber C, Gratwohl A, Widmer AF. Cutaneous manifestation of Paecilomyces lilacinus infection induced by a contaminated skin lotion in patients who are severely inmunosupressed. Journal of the American Academy of Dermatology 1998;39:401-409.

Jaronski ST, Goettel MS, Lomer CJ. Regulatory requirements for ecotoxicological assessments of microbial insecticides- How relevant are they? En: Hokkanen HMT, Hajek AE eds. Environmental Impacts of Microbial Insecticides., Kluwer Academic Publishers. Netherlands, 2003:237-260.

Kerry BR, Andersson S. Nematophtora gynophila och Verticillium chlamydosporium, svampparasiter pa cystnematoder, vanliga I svenska jorda med forekomst av strasadescystnematoder. Vaxtskyddsnotiser 1984;47(5-6):79-80.

Kerry BR, Bourne JA. Manual for research on Verticillium chlamydosporium a potencial biological control agent for root-knot nematodes. IOBC/WPRS, OILB/SROP, Gent 2002.

Kerry BR, Kikwood IA, De Leij FAAM, Barba J, Leidens BM, Brookes PC. Growth and survival of Verticillium chlamydosporium Goddard, a parasite of nematodes in soil. Biocontrol Sci Technol 1993;3:355-365.

Kerry BR. Exploitation of the Nematophagous Fungus Verticillium chlamydosporium Goddard for the Biological Control of Root-knot Nematodes (Meloidogyne spp.) En: Butt TM, Jackson C, Magan N eds. Fungi as Biocontrol Agents: Progress, Problems and Potential. CAB International Wallingford, 2001:155-168.

Kerry BR. Rhizosphere interactions and the exploitation of microbial agents for the biological control of plant-parasitic nematodes. Annual Review of Phytopathology 2000;38:323–441.

Kerry BR. Two microorganisms for the biological control of plant parasitic nematodes. Proc Brighton Crop Prot Conf- Pest and Diseases, 1988:603-607.

Lacey LA, Goettel MS. Current developments in microbial control of insect pests and prospects for the early 21st century. Entomophaga 1995;40:3-27.

Laird M, Lacey LA, Davidson EW. Safety of microbial insecticides. CRC Press, Boca Raton Florida, 1990.

Latgé JP, Paris S. The fungal spore: reservoir of allergens. En: Cole GT, Hoch HC eds. The fungal spore and Disease Initiation in Plants and Animals. Plenum Press New York, 1991:379-401.

Lopez-Llorca LV, Jansson H-B. Biodiversidad del suelo: Control Biológico de nematodos fitopatógenos por hongos nematófagos. Cuadernos de Bioversidad 2001;6:12-15.

López-LLorca LV, Olivares-Bernabeu C. Metabolites influencing Pathogenicity of Nematophagous Fungi. En: Bridge PD, Couteaudier Y, Clarkson C eds. Molecular Variability of Fungal Pathogens. CAB International Wallingford, 1998:171-186.

Luc M, Hunt DJ, Sikora RA. Reflections on Nematology in Sudtropical and Tropical Agriculture. En: Luc M, Hunt DJ, Sikora RA eds. Plant Parasitic Nematodes in Sudtropical and Tropical Agriculture. International Institute of Parasitology, CAB International Wallingford, 1990:11-17.

Mier T, Rivera F, Rodríguez-Ponce MP, Carrillo-Farga J, Toriello C. Infectivity of the fungus Verticillium lecanii in mice and Guinea pigs. Rev Latinoam Microbiol 1994;36(2):107-111.

Montes de Oca N. Identificación de la cepa Pochonia chlamydosporia Vcc-108 agente de control biológico de Meloidogyne spp. La Habana. Tesis en opción al título de Master en Microbiología CENSA-UH 2002.

Neale M, Newton P. Registration/regulatory requirements in Europe. En: Hall FR, Menn JJ eds. Methods in Biotechnology. Biopesticides: Use and Delivery. Humana Press, Totowa, New Jersey 1999;5:453–471.

OECD. Data Requirements for Registration of Biopesticides in OECD Member Countries: Survey results. OECD Environment Monograph No. 106, Organization for Economic Cooperation and Development Paris, 1996:121.

OECD. Pesticide Proyects, Organization for Economic Cooperation and Development, Report OECD99-02, 1999.

OMS. Mammalian safety testing of microbial control agents for vector control: a WHO memorandum. Bulletin World Health Organization 1981;59:857–863.

OTA. Biologically Based Technologies for Pest Control. US Congress, Office of Technology Assessment, OTA-ENV-636, Government Printing Office, September, Washington DC, 1995.

Peteira B, Puertas A, Hidalgo L, Hirsch PR, Kerry BR, Atkins SD. Monitoring and assessing the release of two applications of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia var. catenulata and its effect upon root-knot nematode populations in the field. Applied Environmental Microbiology 2004 en prensa.

Price JB, Andrews YJ. The in vitro assessment of eye irritancy using isolated eyes. Food Chem Toxicol 1985;23(2):314-323.

Revankar SG, Sutton DA, Sanche SE, Rao J, Zervos M, Dashti F, Rinald MG. Metarhizium anisopliae as a cause of sinusitis in inmunocompetent host. Journal of Clinical Microbiology 1999;37:195-198.

Saik JE, Lacey LA, Lacey CM. Safety of microbial insecticides to vertebrate domestic, animals and wildlifes. En: Laird M, Lacey LA, Davidson EW eds. Safety of microbial insecticides. CRC Press, Boca Raton Florida, 1990:115-134.

Segers R, Butt TM, Kerry B, Beckett A, Peberdy JF. The role of the proteinase VCP1 produced by the nematophagous Verticillium chlamydosporium in the infection process of nematode eggs. Mycol Res 1996;100(4):421-428.

Semalulu SS, MacPherson JM, Schiefer HB, Khachatourians GG. Pathogenicity of Beauveria bassiana in mice. Journal of Veterinary Medicine 1992;39:81-90.

Siegel JP, Shadduck JA. Some observations on the safety of the entomopathogen to mammals. Journal of Economic Entomology 1987;80:994–997.

Siegel JP. Testing the pathogenicity and infectivity of entomopathogens to mammals. En: Lacey LA eds. Manual of techniques in Insect Pathology. Academic Press London, 1997:325-336.

Sinski JT. The Epidemiology of Human Mycotic Diseases. Yasef Al-Doory eds. Charles C. Thomas Publisher, 1975:210-226.

Smits JE, Johnson DL, Lomer C. Pathological and physiological responses of ring-necked pheasant chicks following dietary exposure to the fungus Metarhizium flavoviride, a biocontrol agent for locusts in Africa. Journal of Wildlife Diseases 1999;35:194–203.

Solter IF, Maddox JV, McManus ML. Host specificity of microsporidia (Protista: Microspora) from European population of Lymantria dispar /Lepidoptera: Lymantriidae) to indigenous North American Lepidoptera. Journal of Invertebrate Pathology 1997;69:135-150.

Stefanova M, Fernández E. Principales Patógenos del Suelo en las Hortalizas y su Control. En: Labrada R eds. Producción Intensiva de Hortalizas en los Trópicos Húmedos. División de Producción y Protección Vegetal, FAO Roma, 1995:111-120.

Stirling GR. Biological Control of Plant Parasitic Nematodes: Progress, Problems and Prospects. En: Stirling GR eds. Safety of Fungal Biocontrol Agents. CAB International, Wallingford UK, 1991:374.

Strasser H, Vey A, Butt T. Are there any risk in using entomopathogenic fungi for Pest Control, with particular reference to the Bioactive Metabolites of Metarhyzium, Tolypocladium and Beauveria species? Biocontrol Science and technology 2000;10:717-735.

Toscano CM, Jarvis WR. Epidemiology and Clinical Aspects of Unusual Fungal Nosocomial Infections. Fungal Infections 1999; II(1):30-33.

Trammer T, Crioralia G, Maier WA, Sitz HM. In vitro replication of Nosema algerae (Microsporidia ), a parasite of anopheline mosquitoes ,in human cells above 36ºC. Journal of Eukaryotic Microbiology

Undeen AH. A proposed mechanism for the germination of microsporidian (Protozoa: Microspora) spores. Journal of Theoretical Biology 1990;142:223-235.

US Environmental Protection Agency. Microbial Pesticide Test Guidelines OPPTS 885.3050 Acute Oral Toxicity/ Pathogenicity. /s.l/: EPA, 1996.

US Environmental Protection Agency. OPPTS Harmonized Test Guidelines. Series 885 Microbial Pesticide Test Guidelines — Final Guideline 1996. [ en línea] Disponible en: http://www.epa.gov/docs/OPPTS_Harmonized/ 885_Microbial_Pesticide_Test_Guidelines/Series/ [Consultado Febrero, 2002].

Vestergaard S, Cherry A, Keller S, Goettel M. Safety of hyphomycete fungi as microbial control agents En: Hokkanen HMT, Hajek AE eds. Environmental Impacts of microbial Insecticides. Kluwer Academic Publishers. Netherlands, 2003:35-62.

Vey A, Hoagland RE, Butt TM. Toxic metabolites of fungal biocontrol agents. En: Butt TM, Jackson C, Magan N. eds. Fungi as Biocontrol Agents. CAB International Wallingford UK, 2001:311-346.

Ward MDW, Sailstad DM, Selgrade MK. Allergic responses to the biopesticide Metharhizium anisopliae in Balb/c mice. Toxicological Sciences 1998;45:195-203.

Zavaleta-Mejia M. Alternativas de manejo de las enfermedades de las plantas. Terra 1999;17(3):201-207.

Zimmermann G. The entomopathogenic fungus Metahrizium anisopliae and its potential as a biocontrol agent .Pesticide Science 1993;37:375-379.

Liseth García García

Gleiby Melchor Orta

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

Grupo Farmacología-Toxicología,

Carretera de Tapaste y Autopista Nacional, La Habana, Cuba.