Una sustancia a ser empleada como FSc debe tener una serie de requisitos: capacidad solvatante alta y selectiva, no inflamable, no tóxico, no corrosivo, condiciones críticas moderadas, bajo precio y fácil consecución, alta pureza, ser un gas a condiciones ambientales y tener compatibilidad con los métodos acoplados (GC, HPLC, SFC). La elección del FSC debe llevarse a cabo tratando de seleccionar aquel que cumpla con el mayor número de requisitos, en este caso, la elección más adecuada y común es el CO2 (Pc = 73. 9 atm, Tc = 31.1 °C). Otros fluidos empleados son el metanol, el cual ha llegado a ser muy eficiente en la extracción de plaguicidas, al igual que el freón-22, el monóxido de dinitrógeno, el etano y el amoniaco. Es importante destacar que entre las desventajas que presentan se tiene que los hidrocarburos son altamente inflamables, el agua supercrítica es corrosiva al igual que el amoníaco (además de reactivo y tóxico) y por lo general tienen condiciones críticas drásticas con excepción del xenón y el monóxido de dinitrógeno. Una de las desventajas del CO2 supercrítico es su baja polaridad, la cual limita su uso a la extracción de solutos no polares y/o de baja polaridad. Una forma de superar esta limitación es el empleo de un cosolvente o modificador de polaridad, el cual ayuda a solubilizar aquellos solutos de polaridad media a alta que son poco solubles en CO2 supercrítico. La elección del cosolvente depende del compuesto que se va a extraer, la matriz de análisis y el objetivo de la extracción. Los cosolventes más usados son metanol, acetona, acetato de etilo y tolueno (Mukhopadhyay, 2000).
Pasos del proceso de extracción
El proceso de extracción con un fluido supercrítico consiste en dos pasos: extracción de los componentes solubles en un solvente supercrítico y la separación de los solutos extraídos del solvente. La extracción puede ser aplicada a sólidos, líquidos o matrices viscosas. Basado en el objetivo de extracción, se pueden considerar dos escenarios:
1. Separación del material portador. En este caso los constituyentes del material de alimento forman el producto final después de la eliminación de componentes indeseables. Ej. Dealcoholización de bebidas alcohólicas, remoción de olores o descafeinización del café.
2. Separación de materiales extraídos. Los compuestos extraídos del material de alimento constituyen el producto final. Ej. Aceites esenciales, antioxidantes o vitaminas.
Instrumentación
Los elementos básicos de un extractor empleando fluidos supercríticos (figura 15) a escala analítica son: una fuente de fluidos supercrítico de alta pureza; una bomba de alta presión capaz de liberar el fluido a presión, para lo cual lo más común son compresores de membrana, bombas neumáticas y bombas empleadas en HPLC; una celda o cámara que alberga la muestra resistente a altas presiones, químicamente inerte y que deberá estar dotada de un mecanismo que permita mantener su temperatura al valor adecuado, pueden emplearse mantas de calentamiento o emplear un horno cromatografico; un restrictor para mantener la presión en la cámara de extracción, aunque también se puede emplear válvulas micrométricas, las cuales permiten el flujo continuo de FSc a través de la celda de extracción con caídas de presión bajas (inferior a 0,1 MPa); un sistema adecuado para la recogida de los componentes extraídos una vez que el FSc se despresuriza, ver figura 15 (De Castro, 1993).
Figura 15. Diagrama de flujo para un proceso de extracción empleando fluidos supercríticos.
Inicialmente el fluido en estado líquido se presuriza hasta la presión de operación y posteriormente se somete a calentamiento hasta la temperatura de proceso. El fluido entonces pasa a través del extractor, donde previamente se ha cargado la matriz a extraer. El analito y el FSC se transportan hasta la unidad de separación, donde por efecto de la descompresión, el fluido se transforma en gas y se puede recircular mediante el enfriamiento y posterior bombeo (Yépez, 2010).
Aplicaciones de los FSC a nivel laboratorio e industria
Micronización y encapsulamiento
Consiste en la producción de micro y nano partículas con el uso de FSC. Una forma consiste en la expansión súbita de soluciones supercríticas, en la cual la solución se expande a través de pequeños orificios y se obtiene el polvo finamente dividido. Es un proceso muy importante para la industria farmacéutica ya que permite controlar la dosificación de un componente activo. Otra forma de realizar el proceso de micronización consiste en disolver el FSC en una solución orgánica que contenga el soluto haciendo que la solubilidad del soluto decrezca y por lo tanto promueva la nucleación y el crecimiento de partículas. De esta forma se han obtenido tamaños de partícula de 50 nm, el cual no es posible lograr por técnicas convencionales de reducción de tamaño de partícula como la molienda y la cristalización. Esta técnica también se ha usado en la purificación de insulina.
Aplicaciones en reacciones químicas
La alta difusividad que presenta un FSC lo hace llamativo para la realización de reacciones químicas beneficiando por ejemplo la reacciones heterogéneas que son muy controladas por la difusión, como en el caso de las reacciones controladas por enzimas. También se obtienen productos de alta pureza (libre de solventes).
Obtención de metabolitos a partir de residuos sólidos
La lista de los productos que se obtienen por EFS se amplía en los recientes años donde se investigan principalmente muestras de origen vegetal. Dentro de las aplicaciones industriales se destaca la extracción del lúpulo de la cerveza, la nicotina del tabaco y la cafeína del té, así como la extracción de sabores, especias y aceites esenciales. En la actualidad más de 100 000 toneladas de café descafeinado se producen mediante esta técnica en el mundo entero (Jessop and Leitner, 1999). La extracción y fraccionamiento supercríticos se ha aplicado en la obtención de aceites esenciales, antioxidantes, aceites de diferentes fuentes vegetales, separaciones cromatográficas e igualmente cuantificaciones cromatográficas. La extracción a partir de fuentes naturales a partir de FSC es la más ampliamente estudiada y trabajada, ver tabla 8.
Tabla 8. Algunos ejemplos del empleo de FS en la obtención de extractos a partir de fuentes naturales
Con el panorama anterior se consideró que los residuos de los frutos del agaucate Hass (Persea americana Mill. Var. Hass), tanto epicarpio como semillas, son fuente promisoria de antioxidantes, los cuales pueden ser extraídos de forma eficiente y selectiva empleando técnicas de extracción como son soxhlet y EFSc.
En este capítulo se hace una descripción de cada uno de los procedimientos desarrollados para alcanzar los objetivos planteados, un resumen general se encuentra en la figura 16
Figura 16. Esquema resumido sobre la metodología desarrollada.
Materiales y reactivos
Muestras
Los aguacates de la variedad Hass se adquirieron en un cultivo de la vereda Tasajo (Sonsón, Antioquia), con fecha de recolección entre el 23 y 24 de Julio de 2013, ver figura 17.
Figura 17. Mapa ubicación de la vereda Tasajo (Sonsón, Antioquia). Tomado de https://maps.google.es/. Fecha de consulta 29/08/2013
El aceite libre de antioxidantes (oleína) fue suministrado por Grasco S.A, vino en presentación de un galón, sellado, tapado, refinado, blanqueado y desodorizado, libre de antioxidantes, se mantuvo almacenado a temperatura ambiente. La muestra de carne de morrillo se adquirió en un supermercado local de la ciudad (10 kg); se lavó bajo corriente de agua y fue recortada del tejido conectivo y grasa externa; se dividió por cortes sucesivos hasta obtener 16 fracciones de 600 g aproximadamente. Cada fracción se cortó en cubos de aproximadamente 1 cm3 los cuales fueron mezclados aleatoriamente y almacenados en bolsas plásticas selladas libres de aire a -4°C (24 h) para su posterior preparación.
Frutos maduros y limpios fueron empleados en este estudio. La separación del epicarpio de la pulpa y de la semilla de los frutos se realizó manualmente.
La semilla se cortó en trozos más pequeños para facilitar su secado (1-3 mm de grosor) empleando un cuchillo de acero inoxidable y se secó a 45°C en un horno a vacío (Sheldom Mfg. Inc., 15 in Hg; 51 kPa) por un periodo de 72 horas, se determinó la humedad y finalmente se almacenó herméticamente en bolsas plásticas a -4°C. Para los residuos del epicarpio se procedió de igual forma.
La muestra seca de cada residuo, mezclada con hielo seco, fue triturada usando un molino manual para granos (Corona Ref. 142). Finalmente el material se almacenó herméticamente en bolsas plásticas a -4°C para las posteriores extracciones.
Reactivos
Los reactivos empleados en los métodos de extracción fueron hexano, acetato de etilo y etanol (96%), en la determinación del CTF se empleó el Reactivo de Foling-Ciocalteu, ácido gálico y NaOH (0,45 M). en la determinación del CTFl se empleó quercetina, AlCl3, etanol (96%) y acetato de potasio (1 M). Finalmente en la determinación de HPL y TBARS se emplearon metanol, cloruro ferroso (0,1 % w/v), isooctano, butil hidroxi tolueno (BHT), metanol, ácido tiobarbitúrico (TBA), ácido tricloroacético (TCA), HCl, butil hidroxi anisol (BHA), cloroforno, tetraetoxipropano (TEP). Los solventes fueron destilados y demás reactivos eran grado analítico. Para el análisis cromatográfico se empleó acetonitrilo y ácido acético grado HPLC.
Obtención de los extractos
Para cada biomasa, epicarpio y semilla, se obtuvieron extractos mediante extracción soxhlet a presión reducida; sobre la biomasa más activa se procedió a obtener extractos mediante CO2 supercritico y cosolvente (acetato de etilo y etanol). Sobre cada uno de los extractos obtenidos se determinó el rendimiento, el CTF, el CTFl y la AA (medición de los productos de la oxidación lipídica de oleína y carne de morrillo).
Extracción Soxhlet
Cada biomasa, epicarpio y semilla, se sometió a extracción soxhlet a presión reducida. Un conjunto de extractos fue obtenido al realizar la extracción de forma directa o consecutiva, usando hexano, acetato de etilo y etanol como disolventes en proporción 15 mL disolvente/g muestra.
A partir del epicarpio (E) o de la semilla(S), sometida a extracción soxhlet de forma directa, con cada uno de los disolventes, se obtuvieron tres extractos de cada biomasa (extractos etiquetados como 1 son obtenidos con hexano; 3 obtenidos con acetato de etilo; 6 obtenidos con etanol, resultando seis extractos: 1E, 1S, 3E, 3S, 6E y 6S, la última letra indica el tipo de residuo). Al someter a extracción cada una de las biomasas, empleando los disolventes mencionados de forma consecutiva, se obtienen tres extractos de cada biomasa (los extractos etiquetados con 2 son obtenidos en acetato de etilo de biomasas previamente desengrasadas con hexano, 2E y 2S; etiquetados como 4 son extractos etanólicos de las biomasas sometidas a extracción con hexano y luego con acetato de etilo, 4E y 4S; 5 son extractos etanólicos de biomasas previamente sometidas a extracción con acetato de etilo, 5E y 5S), ver figura 18; teniendo en cuenta lo anterior, se obtuvieron doce extractos (1E, 2E, 3E, 4E, 5E, 6E, 1S, 2S, 3S, 4S, 5S, 6S) cuyo tiempo total de extracción, fue de ocho horas para todas las extracciones, manteniendo 35°C para las extracciones con hexano, 35°C para las de acetato de etilo y 40°C para las etanólicas. Para cada uno de los extractos, el solvente orgánico se removió por uso del rotavapor a 40°C, finalmente se determinó el rendimiento de extracción, contenido total de fenoles (CTF) y contenido total de flavonoides (CTFl) para cada extracto. El sistema de solventes usado en extracción soxhlet a presión reducida que permitió obtener el extracto más activo, se empleó a presión atmosférica, con el propósito de comparar la actividad antioxidante de este último con la del extracto a presión reducida.
Figura 18. Metodología para el proceso de extracción soxhlet a presión reducida.
Extracción con fluidos supercríticos (EFSc)
La optimización de los parámetros de extracción se realizó en dos pasos para el residuo con mejor actividad antioxidante, a saber:
1. Se obtuvo la curva de extracción global a condiciones de presión (10 MPa) y temperatura (40°C) pre-establecidas usando CO2 como solvente y acetato de etilo como cosolvente (3%). El procedimiento se realizó en modalidad estática en modo de batches de 10 minutos y buscó optimizar el número de éstos necesarios para un mayor rendimiento de extracción. Para este punto se usó un diseño de un factor.
2. Con el mejor número de batches, se realizaron las extracciones a diferentes temperaturas (40, 50 y 60°C), modificando las presiones (10, 15 y 20 MPa), las cantidades de cosolvente usadas (3, 6 y 9%) y la composición del cosolvente (mezcla de acetato de etilo y etanol: 0% etanol, 50% etanol y 100% etanol). En este paso se empleó un diseño central compuesto, dieciséis extracciones fueron requeridas para cubrir todas las posibles combinaciones de los niveles de los tres factores sin réplicas (ensayos 1 al 16); seis extracciones correspondieron al centro del diseño con el fin de estimar el error experimental (ensayos 17 a 22), ocho extracciones correspondieron a la parte axial (ensayos 23 al 30) del diseño, alfa centrado en las caras (1.0) y un bloque confirmado por las últimas tres extracciones (ensayos 31 a 33), ver tabla 9 y tabla 10. Las variables respuesta fueron el rendimiento de extracción en base seca y la A.A. de los extractos. Para realizar las extracciones se ensambló dentro del grupo de investigación un sistema de extracción (ver figura 19) (Reyes et al., 2011).
Tabla 9. Dominio experimental.
Tabla 10. Diseño central compuesto
Se empleó en su totalidad acero 316 permitiendo realizar extracciones en modo de baches. El equipo está conformado por: (C) cilindo de CO2; (BN) bomba neumática (HASKEL ® modelo AGT-7/30, CA. USA.); (CT1, CT2) regulador de temperatura (WATLOW serie SD 31, MI, USA, ± 1,0 °C) con termocupla tipo K; celda de extracción de 50,0 mL; (VP) válvulas de aguja (WHITEY series SS-1 VS4, USA); (BPR) válvula reguladora de presión (AMFLOW BP-6); (M) manómetros (BOURDON HAENNI, vendôme cedex, France, 70 MPa); (B) bomba (BECKMAN-ALTEX 110A); (R) reservorio de cosolvente; (E) extracto.
Figura 19. Diagrama equipo de extracción con fluidos supercríticos.
Contenido total de fenoles (CTF)
El contenido total de fenoles de cada extracto se determinó siguiendo el método de Folin-Ciocalteu (Berker et al., 2013) con algunas modificaciones. Una alícuota de 150 &µL del extracto diluido (10 ppm) se mezcló con 150 &µL del reactivo de Folin-Ciocalteu seguido por 1,55 mL de NaOH 0,45 M. La mezcla se agitó y se dejó en reposo 30 min. en oscuridad, luego se midió la absorbancia a 765 nm. El contenido de fenoles se calculó a partir de una curva estándar de ácido gálico. Los resultados fueron expresados como miligramos equivalentes de ácido gálico (mg EAG) por 100 gramos de material seco.
Contenido total de flavonoides (CTFl)
El contenido total de flavonoides se realizó por el método colorimétrico del cloruro de aluminio (Chang et al., 2002) con algunas modificaciones. Se empleó quercetina (Q) para construir la curva de calibración. 10 mg de Q fue disuelta en etanol (96%) y luego diluido a 25, 50, 75 y 100 &µg/mL. Las diluciones de Q (250 &µL) fueron mezcladas separadamente con 750 &µL de etanol (96%), 50 &µL AlCl3 (10%), 50 &µL acetato de potasio (1 M) y 1,4 mL de agua destilada. Después de un periodo de reacción por 30 min. a temperatura ambiente, se leyó la absorbancia a 415 nm. De forma similar, 250 &µL de una dilución (2,0 mg/mL) de cada extracto en acetato de etilo:etanol (1:1 v/v) fueron sometidos a reacción con AlCl3.
Actividad antioxidante en oleína de palma
Para el estudio de AA en oleína se emplearon dos procedimientos. El primero de ellos para escoger la biomasa más promisoria, el cual se realizaba en 15 días (Frankel et al., 1994). El segundo procedimiento (ensayo de oxidación lipídica acelerado) se llevó a cabo en menor tiempo (3 dias) y con éste se realizó la etapa final del estudio.
En el ensayo convencional de oxidación, cada muestra de oleína de palma (20 g) fue vertida en frascos ambar con tapa, luego se adicionaron los antioxidantes disueltos en etanol (extractos a evaluar, antioxidantes comerciales: BHT, BHA y GA) hasta una concentración final de 200 ppm (Codex Alimentarius, 2011) y una solución de cloruro ferroso en etanol (aprox. 0,1% w/v) hasta una concentración final de 3.5 ppm en hierro (158 &µL en 20 gramos de aceite). El sistema se llevó a oxidación por calentamiento a 60°C empleando un horno termostatado, en condiciones de oscuridad, empleando un horno termostatado con burbujeo de aire cada 24 h y agitación esporádica. Se preparó una muestra control de forma similar, por adición de solvente sin antioxidantes (blanco). Las muestras se mantuvieron en condiciones de oxidación por 15 días. Los análisis de los productos de oxidación se realizaron a los días 0, 3, 6, 9, 12 y 15, comparando los productos de oxidación (HPL y TBARS) formados en la muestra de aceite libre de antioxidantes (blanco), la adicionada con antioxidantes comerciales y los adicionados con cada uno de los extractos obtenidos.
El ensayo de oxidación lipídica acelerado, consistió en trabajar a 80°C y con inyección de aire en forma continua, las otras condiciones del ensayo de oxidación convencional se mantuvieron constantes. Los análisis de los productos de oxidación se realizaron los días 1, 2 y 3.
Actividad antioxidante en carne de res cruda
La actividad antioxidante de los extractos fue evaluada en carne de res cruda (CRC), la oxidación de la carne y la eficiencia de los extractos fue medida en trabajos previos del grupo de investigación (Castro, 2013).
La carne de res cruda se molió en una licuadora a velocidad máxima usando 6 ciclos de 20 s, obteniendo una masa homogénea. Porciones homogéneas de CRC (20 g) fueron colocadas en frascos de vidrio ámbar (50 mL) cerrados herméticamente. Los extractos, junto a los patrones (BHA, BHT y GA) fueron disueltos en etanol y adicionados a las muestras homogéneas de CRC a una concentración final de 100 mg/kg de carne (Codex Alimentarius, 2011), luego las mezclas fueron homogeneizadas por 2 minutos usando un vórtex. Una muestra blanco se preparó usando solvente sin antioxidantes. Un conjunto de muestras de CRC (sin antioxidantes) fue usada para análisis inmediato (día cero) y los otros (adicionados con extracto o patrones) se mantuvieron a 4°C por nueve días. La oxidación lipídica en las muestras de CRC se determinó por la medida del contenido de hidroperóxidos lipídicos (HPL) y el contenido de especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Los resultados fueron presentados como la diferencia del contenido de HPL y contenido TBARS para los dias 0, 3, 6 y 9 respectivamente (Stika et al., 2007).
Análisis de los productos de oxidación lipídica
Medida de los hidroperóxidos lipídicos
La formación de los HPL tanto en oleína como en carne fue evaluada por el método de los hidroperóxidos (Frankel et al., 1994). El contenido de HPL de las muestras de CRC (500 mg) fue determinado por extracción usando hexano:MeOH (1:1), se mezcló, se agitó en vórtex por 30 segundos y se centrifugó a 5500 rpm por 5 min. La capa de hexano fue removida y la capa metanólica fue lavada nuevamente con hexano. La capa de hexano y el hexano resultante del lavado se unieron y se rotaevaporó el hexano. El residuo con los HPL fue diluido en 1 mL de isooctano, se tomó una alícuota de 50 &µL, se diluyó en 5 mL de isooctano y se midió la absorbancia a 234 nm. La concentración de HPL se calculó usando el coeficiente de extinción molar de los hidroperóxidos del ácido linoleico (e = 26000 M-1 cm-1) y los resultados fueron expresados como mmol de HPL por kilogramo de CRC (mmol HPL/kg CRC).
Medida de las especies reactivas al ácido tiobarbiturico (TBARS)
Los valores de TBARS tanto en oleína como en carne fueron medidos de acuerdo a trabajos previos realizados dentro del grupo de investigación (Castro, 2013). 500 mg de CRC se introdujeron en tubos falcon de 50 mL, luego se adicionó 50 &µL de solución BHT en metanol (23 mM), 1.5 mL de solución de TBA (acido tiobarbiturico, 26 mM) y 10 mL de TCA (ácido tricloroacético, 0,30 M en HCl 0,25 M). La mezcla se agitó en un vórtex por 30 segundos y se calentó en un baño con agua en ebullición por 40 minutos. Luego los tubos se llevaron a un baño de hielo por 10 minutos, se tomó una alícuota de 5 mL de la suspensión, se mezcló con 5 mL de cloroformo y se agitó en vórtex por 30 segundos, seguido por centrifugación a 5500 rpm por 20 minutos. Se midió la absorbancia de la fase acuosa a 532 nm. Los resultados se expresaron como mg de malondialdehído (MDA) por kilogramo de CRC (mg MDA/kg CRC) calculados a partir de una curva estándar de MDA (36 nM a 185 nM) (Ohkawa et al., 1979) obtenida de la hidrólisis de tetraetoxipropano (TEP).
Fraccionamiento y Análisis HPLC-MS
Los extractos que presentaron mayor actividad antioxidante en oleína de palma y en carne se fraccionaron por cromatografía en columna empleando como fase estacionaria una resina Diaion HP-20 (250—850 &µm) para posteriormente ser evaluadas en cuanto su AA con el fin de seleccionar la fracción más activa para ser analizada por HPLC-MS. 400 mg de extracto se separaron empleando 7,7 g de resina, realizando elución con las fases móviles que se relacionan en la tabla 11.
Tabla 11. Composición de fases móviles para el fraccionamiento del extracto más activo
Para las fracciones más activas frente al ensayo de AA se analizaron por la siguiente metodología: HPLC-MS (Agilent Technologies 6520) Accurate-masa Q-TOF LC/MS, estaba compuesto por dos bombas isocraticas (G1312B), Desgasificador (G1379B), automuestreador (HIP ALS G1367B) y columna Phenomenex Luna phenyl-hexyl (150 x 4.6mm i.d.; 5 micrometros). La separación se efectuó empleando como fases móviles (A) H2O con ácido fórmico al 0.1 % y (B) ACN con ácido fórmico al 0.1% por un perfil de gradiente: 5% B (isocrático, 0-10 min); 10-45% B (10-45 min); 100% B (45-50 min); 100-5% (50-55 min) a un flujo de 0,30 mL/min, con un volumen de inyección: 1 &µL. El espectro de masas se obtuvo empleando un cromatógrafo modelo Q/TOF 6520, con ionización por electrospray (ESI). Se realizó ESI modo positivo, temperatura del gas: 350 °C, presión del nebulizador: 25 psi, voltaje del detector: 3000 V, rango de adquisición: 50- 1500 m/z y flujo N2: 10 L/min.
Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como el promedio ± desviación estándar. Las extracciones soxhlet y los diferentes ensayos se realizaron por triplicado. Los análisis para la optimización de las extracciones con fluidos supercríticos se realizaron por un diseño central compuesto (superficie de respuesta), optimizando: (1) temperatura, (2) presión, (3) porcentaje de cosolvente y (4) composición de cosolvente. El estudio de la AA tanto para oleína como para carne se realizó un análisis de componente principales (análisis multivariado) para simplificar el análisis de los resultados. Finalmente se realizaron estudios de correlación (Coef. Corr. Pearson) entre los ensayos de actividad antioxidante, CTF y CTFl (anexo A, tabla A16 a A69).
Dado que el propósito del presente trabajo fue evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos a partir de residuos de aguacate Hass empleando técnicas clásicas y emergentes de extracción, el trabajo se organizó en tres etapas, a saber:
(i) En la primera etapa, a partir de cada biomasa se obtuvieron diferentes extractos a presión reducida, con los cuales se determinó el rendimiento de extracción, el CTF y el CTFl; posteriormente se evaluó la actividad antioxidante (AA) de cada extracto obtenido en oleína de palma (OP) y en carne de morrillo cruda (CR), seleccionando en cada caso aquel que presentó la mayor AA. Cabe señalar que las semillas de aguacate presentaron la mayor protección contra la oxidación lipídica tanto para OP como para CR: como complemento a lo anterior, se comparó la AA del extracto más activo con el correspondiente al obtenido a presión atmosférica.
(ii) En la etapa intermedia el residuo más activo, en cada caso (OP y CR), se sometió a extracción con fluidos supercríticos (EFS), bajo diferentes condiciones de extracción, en los extractos obtenidos se evaluó el rendimiento de extracción, el CTF, el CTFl y la AA.
(iii) En una última etapa se fraccionó el extracto más activo, se determinó la AA de las fracciones obtenidas y se realizó la identificación preliminar de algunos componentes presentes en el extracto con mayor AA por HPLC-MS.
Extracción soxhlet
Para cada biomasa (epicarpio – E; semillas – S) se obtuvieron seis extractos, a saber: extracción con hexano (1E, 1S); extracto en AcOEt previa extracción con hexano (2E, 2S); extracción con AcOEt (3E, 3S); extracto etanólico previa extracción con hexano y con AcOEt (4E, 4S), extracto etanólico previa extracción con AcOEt (5E, 5S); extracción con EtOH (6E, 6S).
Rendimiento
Inicialmente se realizó el análisis de varianza de un factor por bloques completamente al azar entre rendimiento, tipo de biomasa y el solvente de extracción, se observó que el tipo de biomasa empleado tiene un efecto significativo en cuanto al rendimiento de extracción (Anexo A, tabla A1 y A2), razón por la cual se realizan las comparaciones entre rendimientos entre cada biomasa por separado. A continuación se resume el estudio descriptivo de los datos en la tabla 12.
Tabla 12. Resumen descriptivo del promedio de los rendimientos de extracción por extracción soxhlet a presión reducida.
Para comparar los rendimientos de extracción para cada biomasa, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor (Anexo A, tabla A2). Se basa en el cumplimiento de dos supuestos fundamentales: normalidad y homocedasticidad. Este análisis permitió comparar varios grupos (extractos) en una variable cuantitativa (rendimiento). Esta prueba es una generalización del contraste de igualdad de las medias obtenidas para dos muestras independientes, es útil para contrastar la igualdad de medias cuando se tienen tres o más poblaciones independientes con distribución normal, es decir, supuestas k poblaciones independientes, las hipótesis son:
La hipótesis a probar que los rendimientos promedio de cada uno de los extractos fueran iguales, contra la hipótesis alterna de que por lo menos un par fueran distintos. Los resultados del análisis de varianza para cada biomasa (Anexo A, tabla A4 y A11), indicaron que la hipótesis nula debía rechazarse en ambos casos, puesto que el valor del estadístico de prueba (Fcalc = 682,78; 115,96) fue mayor que el F teórico (F 0.95, 5, 12 = 3,268). Por tanto, es posible asumir con un nivel de significancia a=0,05, que existen diferencias significativas entre los rendimientos de extracción para cada una de las biomasas.
El resultado anterior hace necesario establecer entre cuales pares de medias existen diferencias respecto al promedio de los rendimientos. Para resolver este interrogante, se establecieron pruebas de comparación múltiple (prueba de diferencia honestamente significativa de Tukey, DHS) para hacer comparación entre todos los pares de medias, indicando estadísticamente cuales de ellas son diferentes. La hipótesis nula y alterna se describe a continuación:
En la tabla A8 y A15 del anexo A aparecen todas las posibles combinaciones dos a dos entre los niveles o categorías del factor (extracto) para cada biomasa, las diferencias entre las medias, así como el p-valor. A partir de esa información, se construye la tabla de comparación múltiple para la prueba de Tukey, a partir de los subconjuntos donde se encuentra cada extracto, es asignada una letra del alfabeto: a, b, c y d, como se muestra en la tabla 13.
Tabla 13. Análisis de Tukey de los valores del rendimiento de extracción por soxhlet a presión reducida.
Se observó que los mayores rendimientos de extracción pertenecieron a los extractos donde se empleó un solvente de extracción sin que la biomasa hubiera pasado por otro solvente anteriormente, lo cual fue más notable para el extracto etanólico tanto para el epicarpio como para la semilla (rendimientos del 13,87 y 5,83 % respectivamente), por lo que estos extractos son los más ricos en cuanto la cantidad de sustancias que fueron extraídas. En el lado opuesto tenemos los extractos con menor rendimiento, que corresponden a los extractos en acetato de etilo donde la biomasa fue previamente desengrasada con hexano, estos son los extractos con mayor selectividad en cuanto a su composición en el tipo de analitos extraídos. En cuanto a trabajos de otros autores, se tiene el reporte del rendimiento de extracción de grasa a partir de la semilla de aguacate de la variedad Hass cultivada en México, donde se reportan valores cercanos a los obtenidos, donde emplearon extracción soxhlet y con CO2 supercrítico: se encontró que con hexano y CO2 supercrítico se extrajo aproximadamente la misma cantidad de grasa, 3.08 y 3.07% respectivamente (García et al., 1999).
Luego de obtener los extractos soxhlet, se procedió a determinar el CTF y el CTFl.
Contenido total de fenoles
Los valores promedio de las medidas realizadas por triplicado junto a las comparaciones realizadas por la prueba de Tukey se muestran en la tabla 14.
Tabla 14. Contenido total de fenoles para cada uno de los extractos obtenidos por extracción soxhlet a presión reducida.
Al comparar los resultados obtenidos con lo reportado en literatura (Rodriguez et al., 2011a), se observaron resultados inferiores en cuanto el CTF del extracto en acetato de etilo empleando como técnica de extracción la maceración, tanto para epicarpio como para semilla (3293 ± 925 y 1699 ± 408 mg EAG/100 g material seco), aunque los valores se encuentran dentro del rango Las diferencias pueden deberse a diferencias en las condiciones geográficas del sitio del cultivo, composición química del suelo de cultivo, metodología de extracción y estados de madurez (Wang et al., 2010).
Se observó que el solvente de extracción jugó un papel importante en el momento de extraer compuestos fenólicos (o de mayor polaridad), debido a que dependiendo de la polaridad del solvente empleado, se afectó la polaridad de los compuestos extraidos (tipo fenol). Los extractos 2, 4, 5, 6 para la semilla y 4 para el epicarpio, presentaron un alto contenido de fenoles en comparación frente a los demás extractos en general. Solamente uno de los cinco extractos mencionados corresponde a epicarpio, por lo tanto, se puede concluir que la semilla en comparación con el epicarpio es más rica en compuestos tipo fenólicos para la variedad Hass del presente estudio empleando extracción soxhlet.
Contenido total de flavonoides
En la tabla 15 se realizó una prueba de Tukey para la cuantificación de los flavonoides por el método del cloruro de aluminio en medio básico, para los extractos obtenidos por soxhlet a presión reducida.
Tabla 15. Contenido total de flavonoides para cada uno de los extractos obtenidos a presión reducida.
Se observa de forma general que la semilla es más rica en este tipo de compuestos que el epicarpio. De igual forma como se observó con los fenoles, los solventes de mayor polaridad tienden a dar valores superiores en flavonoides. Hasta la fecha, no se han encontrado reportes de cuantificación de flavonoides por el método empleado en el presente trabajo.
Luego de evaluar el rendimiento de extracción, el CTF y el CTFl para cada uno de los extractos obtenidos a presión reducida, se procedió a realizar el ensayo de AA en oleína de palma y en carne de res cruda (sección 3.1.4), como la capacidad que tiene cada extracto en retardar la oxidación de los lípidos presentes en cada matriz grasa.
Actividad antioxidante
Actividad antioxidante en oleína de palma
Para evaluar la actividad antioxidante en oleína de palma de los extractos obtenidos por soxhlet a presión reducida, se realizó el seguimiento en la formación de los productos de oxidación entre los días 0 a 15 (días 0, 3, 6, 9, 12 y 15), en ciertas condiciones experimentales, las cuales se detallaron en la sección de metodología. El análisis de los resultados se hizo mediante un análisis de componentes principales (ACP), con el fin de determinar el extracto más promisorio en cuanto a la protección de la oleína frente a la oxidación lipídica mediante la cuantificación de los hidroperóxidos del ácido linoleico (HPL) y las especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Se realizó un blanco de la oleína sin antioxidantes, y controles positivos con butil hidroxianisol (BHA), butil hidroxitolueno (BHT) y ácido gálico (GA), antioxidantes empleados en la protección de aceites, siendo su uso reglamentado por el codex alimentarius 2011 (en aceites comestibles a una concentración de 200 ppm).
Definido el extracto más activo para cada una de las biomasas, las respectivas condiciones de extracción fueron reproducidas a presión atmosférica para determinar el efecto de la temperatura de extracción sobre la actividad antioxidante.
En la tabla 16, se resumen los resultados obtenidos en la medición de los HPL, expresados como el promedio ± desviación estándar, junto a la prueba de Tukey para los doce extractos, los patrones y el blanco (HPL para el dia cero 6,51 mmol HPL/kg oleína). En la tabla 17, se muestran los resultados del análisis de TBARS, expresados estadísticamente de igual forma que los HPL (TBARS día cero 0,0114 mg MDA/kg oleína).
Tabla 16. Cuantificación de los HPL producidos durante la oxidación de oleína adicionada con antioxidantes y con extractos.
Tabla 17. Cuantificación de los TBARS producidos durante la oxidación de oleína adicionada con antioxidantes y con extractos.
En las tablas anteriores se observó que el contenido de los productos de oxidación, es decir, tanto hidroperóxidos como TBARS, aumentaron a lo largo del tiempo del ensayo, presentándose los máximos en el último día de realización de las mediciones (día 15 para oleína y día 9 para carne) y los mínimos para el día tres. Los resultados anteriores proporcionan información sobre la capacidad de los antioxidantes de retardar la oxidación de cada una de las matrices grasas y por lo tanto de decrecer la concentración de los productos de oxidación en las diferentes etapas. Los HPL son productos iniciales de oxidación, y los TBARS son productos intermedios y finales de la oxidación. Por tanto, para tomar una decisión sobre el mejor antioxidante para retardar la oxidación de la oleína, es necesario tener en cuenta los productos que se forman no solamente al final del proceso oxidativo, sino también los productos iniciales.
Con el fin de lograr el objetivo anterior, se realizó un análisis de componentes principales (ACP), el cual permitió tener en cuenta los resultados de forma conjunta y así, identificar los extractos con mayor AA. A continuación, se describirá de forma breve, su desarrollo para asegurar que el lector conozca las bases del principio.
El método de ACP tiene como objetivo transformar un conjunto de variables originales en un nuevo conjunto de variables (sin perder información), conocidas como componentes principales CP1, CP2, …, CPn, donde cada una de ellas es una combinación lineal de las variables originales; en nuestro caso, las variables originales conciernen a los hidroperóxidos correspondientes para los dias 3 (HPL3), 6 (HPL6), 9 (HPL9), 12 (HPL12), 15 (HPL15), y los TBARS correspondientes a los días 3 (TBARS3), 6 (TBARS6), 9 (TBARS9), 12 (TBARS12) y 15 (TBARS15).
Es decir, reuniendo la información de las tablas 16 y 17, habrían diez componentes principales (CP1, CP2,…, CP10), los cuales se describen a continuación solamente dos de ellos para no extendernos demasiado:
No obstante, los coeficientes se eligen de forma que CP1 recoja la mayor variación en el conjunto de datos, CP2 recoge la siguiente mayor parte de la variación y así sucesivamente. Cuando existe una correlación significativa, el número de componentes es inferior al número de variables originales. Si las variables originales están correlacionadas de partida, entonces no tiene sentido realizar un ACP.
El cálculo de los componentes principales generalmente no debe depender de las unidades de medida empleadas, por lo tanto, se deben usar variables tipificadas. Con ello, se eliminan las diferentes unidades de medida y se consideran todas las variables implícitamente equivalentes en cuanto a la información recogida. Si las variables no se tipifican, y una ellas tiene una varianza mayor, entonces, esta controlará el CP1.
En el anexo A, tabla A72, se encuentra la matriz de correlación para las diez variables, donde se puede observar que ninguna variable explica a otra en su comportamiento, razón por la cual, se obtienen diez componentes principales, los cuales se muestran a continuación en la tabla 18, junto con los valores de varianza explicada por cada componente y su varianza acumulada.
Tabla 18. Valores de varianza explicada y varianza acumulada para el ACP.
Se considera que se explican los resultados del ensayo de actividad antioxidante de forma aceptable con una varianza acumulada del 74,37% equivalente a analizar dos componentes principales, CP1 y CP2, por lo tanto los resultados se pueden representar en dos dimensiones, en lugar de las 10 dimensiones originales.
En la tabla 19 se encuentra la matriz de componente rotada con normalización Kaiser, la cual nos permite identificar el peso que tiene cada una de las variables originales sobre cada uno de los componentes. Se observa que el CP1 correlaciona principalmente con TBARS (loadings de 0,62 a 0,93) y el CP2 correlaciona principalmente con HPL (loadings de 0,66 a 0,89).
Estos resultados muestran una diferencia importante entre la información proporcionada por HPL y TBARS, sin que exista correlación entre éstos, por lo cual es necesario un seguimiento no solamente a los productos finales de oxidación sino a los intermediarios, para tener información completa sobre la forma en que actúan los antioxidantes sobre la oleína.
Tabla 19. Matriz de componentes rotada.
A partir de los coeficientes de la tabla 19 para CP1 y CP2, al reemplazar los valores de cada variable tipificada para cada una de los extractos, se calculan las puntuaciones para cada extracto. Estas puntuaciones fueron representadas en un eje de coordenadas de dos dimensiones, ver figura 20, conocida como diagrama de dispersión.
Menores puntuaciones en cualquiera de los componentes, conllevan a mayor protección del aceite frente a la oxidación (loadings positivos). La interpretación de los puntajes se hace en función de su ubicación o de la distancia respecto a otro punto del diagrama (distancia euclideana).
El CP1 explica el 58,84% de la variabilidad total del ensayo y correlacionó principalmente con los TBARS (para las cinco variables que cuantificaron la formación de TBARS para los días 3, 6, 9, 2 y 15), el CP2 el cual explica el 15,53% de la variabilidad total del ensayo correlacionó principalmente con HPL (cinco variables que cuantificaron la formación de HPL para los días 3, 6, 9, 12 y 15). En el gráfico de dispersión se observó que el blanco presenta el nivel superior de oxidación en cuanto a la formación de HPL, pero no en cuanto a la formación de TBARS. En cuanto a los antioxidantes comerciales BHA, BHT y GA, presentaron diferencias en cuanto a la formación de HPL, siendo el GA quien mostró superioridad, no obstante, en cuanto a la formación de TBARS, mostraron niveles similares de protección frente a la oxidación (ver rectángulo, figura 21). El extracto 1S y el extracto 2E no presentan diferencias respecto al blanco en cuanto a la formación de TBARS (ver línea contínua vertical, figura 20). Los extractos 3S, 1E, 3E y 2S estimularon la formación de TBARS, a tal punto que su concentración es superior a la del blanco, por lo que se concluye que presentaron un efecto prooxidante (ver elipse, figura 21), mientras que los extractos 5E, 4E, 4S, 6E, 5S y 6S (extractos ubicados hacia el lado izquierdo de la línea vertical) mostraron
Figura 20. ACP para el ensayo de oxidación lipídica. La última letra del extracto corresponde al tipo de biomasa.
actividad en cuanto a la protección frente a la formación de los TBARS, siendo los más promisorios los extractos 5S, 6S y 6E. Todos los extractos inhibieron la formación de hidroperóxidos, ya que al observar el gráfico de dispersión, se ubican a valores más negativos del blanco, siendo el extracto 5S el que presentó mayor protección de la oleína, solamente se ve superado por el GA (comparar distancias en el gráfico).
En la figura 21 y 22 se representaron las cinéticas de oxidación para los extractos que mejor protegen a la oleína frente a la formación de productos de oxidación a partir del ACP. Se observó que para el extracto 5S los niveles de HPL y TBARS fueron cercanos o inferiores a los producidos en la oleína protegido con el antioxidante comercial (GA). Teniendo en cuenta los resultados anteriores, el extracto 5S fue el más promisorio frente a la protección ante la oxidación de oleína, debido a que inhibe tanto la formación de TBARS como la de HPL.
Figura 21 Cinética de oxidación de HPL para los extractos más promisorios.
Figura 22 Cinética de oxidación de TBARS para los extractos más promisorios.
Respecto a este extracto, cabe anotar que presentó valores intermedios de rendimiento (2,6 ± 0,2 %), de CTF (1093 ± 2 mg EAG/100 g muestra seca, 1,050 ± 0,001 mg EAG/mg Extracto) y de CTFl (702,59 ± 3,6 mg quercetina/100 g muestra seca, 0,269 ± 0,002 mg quercetina/mg extracto).
Un estudio de correlación realizado entre CTF y CP1, concluyó que existe correlación aceptable (Pearson= -0,782, n=12) entre estas dos variables, siendo el CTF expresado en términos de muestra seca (Anexo A, tabla A73).
La semilla del fruto del aguacate Hass se seleccionó como la biomasa promisoria, siendo el extracto etanólico de la biomasa previamente sometida a extracción con acetato de etilo, el que presentó el mejor desempeño frente a la oxidación lipídica en oleína de palma.
En el caso de la oleína de palma, la AA en el extracto a presión atmosférica y en los extractos obtenidos por EFS se determinaron al someter la oleína al ensayo de oxidación acelerado. Como se describió en la metodología, se realizó un cambio en la temperatura del ensayo de oxidación convencional y en la forma de suministrar el oxígeno necesario para llevar a cabo los procesos oxidativos de los lípidos en menor tiempo.
Empleando el extracto 5S obtenido a presión reducida, GA y un blanco, se realizó un estudio de correlación entre el ensayo de oxidación acelerado y el convencional por medición de HPL y TBARS durante tres días, todas las mediciones fueron realizadas por triplicado. A partir de los resultados del estudio de correlación (Pearson) se concluyó que a partir del ensayo de oxidación acelerado se pueden obtener resultados confiables y comparables a los que se obtenían por el método convencional, lo que permite tomar decisiones en menor tiempo entre un conjunto de extractos, sobre cuál sería el más promisorio para la protección de la oleína de palma frente a la oxidación lipídica. La matriz de correlación tanto para HPL como para TBARS se encuentra en el anexo A, tabla A74 y tabla A75, respectivamente.
Los resultados para el extracto obtenido a presión reducida y presión atmosférica se muestran en la tabla 20.
Tabla 20. Comparación del CTF y CTFl para el extracto más promisorio, obtenido a presión atmosférica (5Satm) y a presión reducida (5S).
Para conocer el posible efecto de la temperatura sobre la AA del extracto promisorio obtenido a presión reducida (5S), se realizó un estudio comparativo por seguimiento de los productos de oxidación (HPL y TBARS) frente al extracto obtenido a presión atmosférica (5Satm), ver tabla 21.
De forma general, se observó que el extracto a presión reducida presentó un mejor desempeño en cuanto la protección de la oleína durante los tres días de oxidación, debido a que la concentración de HPL y TBARS es inferior para el extracto obtenido a presión reducida.
Tabla 21. Cinética de oxidación para la oleína producida mediante el método de oxidación acelerado.
Aunque el método de extracción a presión atmosférica permite obtener mayor rendimiento de extracto, vemos que la temperatura tiene un efecto negativo no solamente sobre la actividad antioxidante, sino sobre el CTF y el CTFl. Dicho de otra forma, existen compuestos con AA en el extracto que son sensibles a los efectos de cambios de temperatura, ver tabla 21; por tanto la extracción soxhlet a presión reducida permite obtener un extracto con mayor AA a partir de semillas de aguacate Hass.
Actividad antioxidante en carne de morrillo
Para evaluar la AA en carne de morrilo de los extractos soxhlet, se realizó seguimiento de algunos productos de oxidación (HPL y TBARS), para los días 3, 6 y 9; para el día cero los valores fueron 0,446 ± 0,008 mmol HPL/kg carne; 0,015 ± 0,005 mg MDA/kg carne. Los resultados de A.A. se muestran en las tablas 22 y 23. Se observó que el contenido de los productos de oxidación se incrementa a medida que pasa el tiempo, aunque lo hace en menor proporción si lo comparamos con la cinética de oxidación de la oleína (cinética de oxidación más lenta). Se observó que el comportamiento es diferente para cada extracto en las diferentes etapas de la oxidación.
Tabla 22. Cuantificación de los HPL formados durante la oxidación de carne de morrillo adicionada con antioxidantes y con extractos.
Tabla 23. Cuantificación de los HPL formados durante la oxidación de la carne de morrillo adicionada con antioxidantes y con extractos.
El ACP permitió seleccionar el extracto con mayor potencial como fuente de antioxidantes para proteger la carne de morrillo de la autooxidación lipídica, la eficacia de los extractos fue comparada frente a antioxidantes comerciales (BHT, BHA y GA).
En la tabla 24 se observa la varianza y la varianza acumulada de cada uno de los componentes principales. Explican más del 70% de la varianza del experimento.
Tabla 24. Varianza y varianza acumulada para el ACP.
El peso que tiene cada una de las variables en cada componente, se observa en la tabla 25. De forma general, se observa que CP1 correlaciona de forma positiva y en alto nivel con TBARS y que CP2 lo hace con HPL.
Tabla 25. Valores de loading para los dos primeros componentes principales.
Al representar los puntajes que corresponden a cada extracto a partir de los dos componentes principales en un sistema de coordenadas, se obtuvo que el blanco no ocupa el nivel máximo de oxidación para TBARS ni para HPL, ver figura 23. El BHA y el GA presentaron niveles de protección similares en cuanto a TBARS mostrando diferencias en cuanto a HPL. El BHT mostró no ser tan eficiente en cuanto a la protección frente a la formación de TBARS. Los extractos que presentaron actividad prooxidante significativamente diferente respecto al blanco en cuanto a la formación de TBARS corresponden a los extractos 2E, 5E y 6E (elipse figura 23) y en menor magnitud los extractos 3E, 3S, 4E y 5S (ver rectángulo de la figura 23). Para la formación de HPL, los extractos que presentaron actividad prooxidante fueron los extractos 3E, 3S, 4E y 4S (paralelogramo figura 23). Los que presentaron actividad antioxidante para TBARS fueron 4S, 6S, 1E, 1S y 2S. Se observó que para TBARS los extractos que presentaron actividad antioxidante no hacen distinción en cuanto a polaridad, debido a que encontramos extractos obtenidos con hexano (1E, 1S), acetato de etilo (2S) y etanol (4S y 6S).
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se concluyó que el extracto más promisorio corresponde al 2S, con nivel de protección similar al BHT (ver círculo figura 23). El BHA y el GA mostraron niveles superiores de protección en TBARS, pero no en HPL, los cuales son importantes teniendo en cuenta la varianza explicada del CP2. Para este caso, se obtuvo un rendimiento bajo (0,46 ± 0,04 %) en comparación con los rendimientos de las otras extracciones, cuya media estaba alrededor del 2,8%. El CTF estuvo en 391,1 ± 0,6 mg EAG/100 g muestra, 0,847 ± 0,001 mg EAG/mg extracto, y el CTFl fue de 324,6 ± 1,5 mg Q/100 g muestra; 0,703 ± 0,005 mg Q/mg extracto, destacándose por ser el extracto con mayor valor en cuanto al nivel de flavonoides por masa de extracto frente a los demás extractos de la semilla y del epicarpio. Es importarte resaltar además que no se encuentra correlación entre las variables CTF, CTFl y AA (ver coeficientes de correlación de Pearson, Anexo A, tabla A76).
Figura 23. ACP para el ensayo de oxidación de carne de morrillo.
Conociendo el extracto más promisorio obtenido a presión reducida para la protección de la carne de morrilo, posteriormente se obtiene el extracto a presión atmosférica, para evaluar el efecto de la temperatura sobre el rendimiento de extracción, el CTF y el CTFl. Finalmente se observó un efecto negativo de la temperatura sobre el CTF y el CTFl como se muestra en los resultados promedio de la tabla 26. En la tabla 27 se muestran las mediciones de HPL y TBARS para el ensayo de oxidación lipídica en carne, exactamente igual al ensayo realizado para los extractos obtenidos a presión reducida, es decir, con la carne refrigerada a 4°C, realizando mediciones los días 3, 6 y 9. Los resultados de la tabla 27 mostraron que el extracto a presión reducida presenta mayor eficiencia en cuanto a la protección de la carne de morrillo frente a la oxidación lipídica en comparación al extracto a presión atmosférica, lo que se observó al comparar directamente los valores de HPL y TBARS para cada uno de los días de oxidación.
Tabla 26. Comparación del CTF y CTFl para el extracto más promisorio obtenido a presión atmosférica (2Satm) y a presión reducida (2S).
Tabla 27. Valores de HPL y TBARS en carne para el extracto más activo P. reducida vs. P. atmosférica.
A partir de los resultados anteriores se concluyó que la presión tiene un efecto significativo tanto en la actividad del extracto como en la cuantificación del CTF y el CTFl.
Extracción por fluidos supercríticos (EFSc)
Considerando que la semilla fue la biomasa más activa para la protección de la oleina y de la carne de morrillo frente a la oxidación lipídica (sección 3.1.4), la EFSc se realizó sobre ésta.
Rendimiento
Para determinar los variables que influyen en el rendimiento de extracción, así como sus interacciones, se planteó un diseño central compuesto. Las variables que se estudiaron fueron: presión (X1 – 100, 150 y 200 MPa), porcentaje de cosolvente (X2 – 3, 6 y 9%), composición de cosolvente (X3 – AcOEt:EtOH 1:0, 1:1, 0:1) y temperatura (X4 – 40, 50 y 60°C).
El número de baches de extracción se optimizó bajo las condiciones de presión y temperatura más suaves del diseño, es decir, el tratamiento con los factores de menor nivel: presión: 100 MPa; cosolvente 3%; composición del cosolvente (AcOEt:EtOH) 1:0; T: 40°C, ver tabla 28. Para lograr lo descrito anteriormente, se realizaron baches sucesivos, cada uno con duración de diez minutos, realizando dos lavados con CO2 entre cada bache (60 MPa). Una representación de la cantidad de extracto que se obtiene en función del número de baches permitió definir cuantos baches eran necesarios para establecer un tiempo de extracción adecuado, ver figura 24.
En la parte derecha de la tabla 28 se muestran los rendimientos obtenidos para cada uno de los ensayos del diseño experimental. Los rendimientos toman valores desde 0,54 a 3,63%, los cuales por lo general son similares a los que se obtenían por la metodología soxhlet a presión reducida (rendimientos entre 2,15% y 3,01%).
Para la extracción con fluidos supercríticos los rendimientos inferiores (0,54; 0,68; 0,70; 1,71; 1,73%) tienen en común que se realizaron al valor máximo de temperatura (60°C). Teniendo en cuenta lo anterior, al analizar los resultados de forma descriptiva, se pudo concluir que la temperatura tiene un efecto negativo sobre el rendimiento de extracción. Los máximos rendimientos corresponden a valores cercanos al centro del diseño, o a tratamientos que contienen dos factores en su menor nivel (2,51; 2,52; 2,8; 2,97; 3,63%).
Figura 24. Optimización del número de batches de la EFSc.
Todos los experimentos se realizaron aletatoriamente sin replicación, donde la variable respuesta corresponde al rendimiento de extracción expresado en base seca como porcentaje (gramos de extracto obtenido por gramo de muestra seca por cien). Con el fin de determinar los factores representativos en cuanto al rendimiento de extracción, se realizó una relación múltiple, de la cual se obtuvo una expresión matemática entre la respuesta obtenida experimentalmente y el sistema de variables independientes. El modelo sinergista se muestra a continuación:
Los coeficientes bi de este modelo fueron estimados y representados gráficamente en la figura 25, el intervalo de confianza se expresa como ± desviación estándar. El análisis de varianza del diseño se muestra a continuación en la tabla 29.
Tabla 28. Resultados Diseño central compuesto.
Figura 25. Coeficientes del modelo sinergista para el rendimiento de extracción.
Tabla 29. Análisis de varianza del diseño central compuesto
A partir de los resultados representados en la figura 25, se observó que cuatro coeficientes fueron estadisticamente significativos. (p-valor1). Se observó que el CP1 correlaciona con TBARS (loadings entre 0,800 y 0,848), mientras que el CP2 correlaciona con HPL (loadings entre 0,814 – 0,829).
Tabla 40. Varianza explicada y varianza acumulada para el ACP. Tabla 41. Loadings para los dos primeros componentes principales. La figura 30 permite observar que todos los extractos presentan actividad antioxidante frente a TBARS, mientras que algunos pocos presentan actividad prooxidante en cuanto a la formación de HPL (ver cuadro figura 26). Figura 30. Diagrama de dispersión para el ACP de los extractos obtendos por EFSc adicionados a carne de morrillo. El extracto 2S obtenido a presión reducida se mostró como el más promisorio en cuanto a la protección de la carne de morrillo, debido a la posición que ocupa en la figura 26, ver círculo azul. Los extractos 8, 3 y 14 mostraron ser eficientes en inhibir la formación de HPL en grado superior al antioxidante comercial, no obstante, no son muy eficientes en cuanto a TBARS. El extracto 2S se prefirió sobre el 9 debido a que este último no presentó una protección apreciable frente a HPL, siendo significativa (23,1 %) en el proceso oxidativo. 3.3 Fraccionamiento y análisis por HPLC-MS 3.3.1 Fraccionamiento El extracto más promisorio para oleína de palma (extracto 5 obtenido por EFSc) y para carne de morrillo (extracto 2S obtenido por extracción soxhlet a presión reducida), fueron fraccionados empleando una resina Diaion HP-20 (250—850 &µm). Para el primer caso se fraccionaron 236 mg y para el segundo 400 mg. Luego se rotavaporó cada una de las fracciones, se determinó la cantidad de extracto recuperado (ver tabla 42) y la A.A. Entre los conjuntos de fracciones se observaron diferencias; por ejemplo, el extracto 5 mostró mayor enriquecimiento de compuestos solubles en la fracción metanólica (17,0%) que el extracto 2S (1,7%) y éste presentó un mayor contenido de compuestos de baja polaridad (45,3%) respecto al extracto 5 (23,2%). Tabla 42. Rendimiento de las fracciones para cada uno de los extractos más activos. 3.3.2 Actividad antioxidante en oleína de palma A cada una de las fracciones de interés se le realizó ensayo de AA en oleína, ver tablas 43 y 44 (HPL dia cero 6,80 mmol HPL/kg oleína; TBARS día cero 0,020 mg MDA/kg oleína). El ACP mostró que con dos componentes se logró describir el 94,3% de los resultados; el CP1 correlacionó con TBARS y el CP2 con HPL (ver tablas 45 y 46) Tabla 43. Cuantificación de los HPL generados en oleína. Tabla 44. Cuantificación de los TBARS generados en oleína. Para el ACP se procedió de igual forma que para cuando se evaluó la AA en oleína de palma para los extractos soxhlet (sección 3.1). En la tabla 45 se mostró la varianza (%) y la varianza acumulada (%) para cada uno de los componentes. Al trabajar con dos componentes principales, se logra describir un 94,3% de los resultados de las tablas 43 y 44. Tabla 45. Valores de varianza explicada y varianza acumulada para el ACP. En la tabla 46, se encuentra la matriz de componente rotada, la cual nos permite identificar el peso que tiene cada una de las variables originales sobre cada uno de los componentes. Se observa que el CP1 correlaciona principalmente con TBARS (loadings de 0,87 a 0,97) y el CP2 correlaciona principalmente con HPL (loadings de 0,74 a 0,98). Tabla 46. Matriz de componentes rotada. Nuevamente se observó que existe ortogonalidad marcada entre las variables HPL y TBARS, por lo que se hace necesario hacer seguimiento a las especies intermediarias y finales de la oxidación para tener una idea más clara sobre el proceso oxidativo que se lleva a cabo en la oleína. Al calcular las puntuaciones para cada una de las fracciones y/o extractos a partir del reemplazo de los valores de cada variable tipificada y representarlos gráficamente en un sistema de coordenadas, se obtiene la figura 31. En la figura 31 se observa que todas las fracciones inhibieron la formación de TBARS, mientras que para HPL, las fracciones 3 y 8 mostraron actividad prooxidante al compararse (ver elipse figura 31). La fracción más activa corresponde a la más polar, es decir a la obtenida empleando agua desionizada (ver circulo, figura 31); considerando la masa recuperada de la fracción 1 por masa de extracto, así como la A.A. similar entre ésta y el extracto 5, no se considera práctico realizar el fraccionamiento respectivo. Con la información anterior se concluye que la fracción 1 aporta de manera significativa a la AA que presentó el extracto 5, por tanto dicha fracción se sometió a estudio de HPLC-MS. Figura 31. Diagrama de dispersión para la AA en oleina para las fracciones del extracto más activo. 3.3.3 Actividad antioxidante en carne de morrillo Los resultados de oxidación lipídica en carne de morrillo se relacionan en las tablas 47 y 48. Para el dia cero se tiene HPL 0,36 ± 0,01 mmol HPL/kg carne, TBARS 0,009 ± 0,001 mg MDA/kg carne. Tabla 47. Cuantificación de los HPL en carne de morrillo Tabla 48. Cuantificación de los TBARS en carne de morrillo El ACP mostró una varianza del 83,54% (tabla 49) al trabajar con dos componentes principales, donde el CP1 correlaciona con TBARS y el CP2 con HPL, (ver tabla 50). Nuevamente se observó que existe ortogonalidad marcada entre las variables HPL y TBARS, por lo que se hace necesario hacer seguimiento a las especies intermediarias y finales de la oxidación para tener una idea más clara sobre el proceso oxidativo que se lleva a cabo en la oleína. Tabla 49. Valores de varianza explicada y varianza acumulada para cada componente del ACP. Tabla 50. Matriz de componentes rotada ACP. Al calcular las puntuaciones para cada una de las fracciones y/o extractos a partir del reemplazo de los valores de cada variable tipificada y representarlos gráficamente en un sistema de coordenadas, se obtiene la figura 32. Se observa que todos los extractos presentan actividad antioxidante para la formación de TBARS. Para HPL solamente la fracción 5 presenta actividad prooxidante (cuadrado, figura 32). La fracción más promisoria para la protección de la carne de morrillo frene a la oxidación resultó ser la fracción más polar, la primera fracción, obtenida con agua desionizada (círculo, figura 32) que se prefirió sobre el extracto 7, debido a la diferencia de protección que presentaron en CP1. Considerando la masa recuperada en la fracción 1 por masa de extracto y la A.A. similar entre ésta fracción y el extracto, no se considera práctico realizar el fraccionamiento. Figura 32. ACP para las fracciones del extracto más activo para carne de morrillo cruda. Con la información anterior, se decidió efectuar el análisis por HPLC-MS de la fracción 1 procedente del extracto 5 y de la fracción 1 procedente del extracto 2S, con el fin de identificar de forma preliminar los compuestos responsables de la AA. 3.3.4 Análisis por HPLC-MS Teniendo en cuenta que las fracciones 1 (F1) provenientes de los extractos 5 (F1-5) y 2S (F1-2S) fueron las más activas, tanto para OP como para CR, respectivamente, dichas fracciones se sometieron a análisis por HPLC-MS. Los cromatogramas obtenidos presentaron gran similitud, ver figuras 33 y 34, en cada caso se observan cuatro señales claramente diferenciadas en 38,8, 50,4, 51,6 y 54,4 min, aproximadamente. Figura 33. Cromatograma de F1-5. Figura 34. Cromatograma de F1-2S. Al examinar los espectros de masas de las señales mencionadas se observó total coincidencia entre las correspondientes de F1-5 y F1-2S, ver figuras 35 a 38. El espectro de masas para el compuesto que eluye a menor tiempo de retención (38,8 min) presentó tres señales m/z (242,2853, pico base; 131,0024; 186,2203), en la tabla 51 se encuentra el diagnóstico para cada una de las señales. Con base en dicha información y al estudio de Hurtado et al. (2011), de forma preliminar, se puede proponer que este compuesto es el ácido pantoténico. En el espectro de masas se observa un aducto que forma el compuesto con acetonitrilo (m/z 131,0024), fase móvil empleada en el análisis; la señal m/z 186,2203 corresponde a la pérdida de agua y un grupo metilo; finalmente el aducto que el compuesto forma con el sodio corresponde a m/z 242,2853. Tabla 51. Análisis del espectro de masas del compuesto con tr 38,8 min. Figura 35. Espectro de masas del compuesto con tr 38,8 min. El ácido pantoténico se ha valorado como antioxidante principalmente al formar parte de infusiones de yerbamate (Ilex paraguariensis) (Ismail et al., 2000), considerándose indispensable su consumo en la dieta, especialmente de infantes (Akobeng, 2007), por lo que se recomienda su consumo oportuno (Dreher, 2013). Para el siguiente compuesto (tr= 50,4 min) el espectro de masas mostró cuatro señales m/z (203,1242; 284,3306; 372,3505; 412,3226), ver figura 36; siendo la última de ellas el pico base. El análisis de las pérdidas en masa de los picos, mostró que probablemente el pico base se deba al aducto [M+Na]+; no se observa el aducto con hidrógeno y se tiene una señal debida posiblemente a la pérdida de un radical hidroxilo [M-OH]+; hasta donde se tiene conocimiento, en semillas de aguacate no se ha reportado compuestos con peso molecular de 389,3. Por lo tanto, con ayuda del software mMass V.5.0 se proponen una serie de fórmulas moleculares, éstas suponen la presencia de uno o tres átomos de nitrógeno (tolerancia máx. 0.1), debido a que a la fecha no se han reportado compuestos altamente nitrogenados en dicha biomasa; adicionalmente se debe tener en cuenta el grado de insaturación y el número de atomos de oxígeno (ver tabla 52). Finalmente, dado que los datos provienen de un equipo de alta resolución, se determinó el error de las fórmulas propuestas. Figura 36. Espectro de masas del compuesto con tr 50,4 min. Tabla 52. Análisis del espectro de masas del compuesto con tr 50,4 min. Para el compuesto con tr 51,6 min se tienen tres señales m/z (203,1248; 279,0939; 441,2651), siendo el pico base m/z 279,0939, ver figura 37. El pico base corresponde a la molécula protonada; el aducto con el sodio a m/z 301,12; y el aducto bimolecular se fragmenta perdiendo dos unidades de 2-pentenoilo, m/z 441,2651. Lo anteriormente descrito se resume en la tabla 53. Al realizar la revisión en literatura, se determinó que puede corresponder al ácido linolénico, reportado previamente en frutos de la variedad Hass por Hurtado et al. (2011). Figura 37. Espectro de masas del compuesto con tr 51,6 min Tabla 53. Análisis del espectro de masas del compuesto con tr 51,6 min Diferentes isómeros del ácido linolénico han mostrado eficiencia en el control del estrés oxidativo y la peroxidación lipídica en ratas (Saha et al., 2012), y se ha estudiado el enriquecimiento de ciertos alimentos como el pan y la harina (Costantini, L. et al., 2014) en este tipo de isómeros, especialmente el omega-3, el isómero más común encontrado en semillas de plantas, donde actualmente se discute la posibilidad de actuar como anti-cancerígeno, regulación del metabolismo de lípidos, anti-inflamatorio y anti-obesidad (Yuan et al., 2014). El compuesto con tr 54,4 min presentó un alto grado de fragmentación, figura 38. El ion de la molécula protonada corresponde al pico m/z 399,2524; el aducto con el sodio a m/z 421,2337, que es el pico base; el aducto bimolecular se fragmenta perdiendo el grupo carboxilo –COOH y tres unidades de masa 44,03, dando lugar a las señales m/z 620,4401; 576,41101 y 532,3825, que corresponden a pérdidas sucesivas de unidades –CH2-CH2-O-, similitud que se tiene con el comportamiento del óxido de polietileno, ver tabla 54. Al hacer la revisión bibliográfica, se encuentra que este compuesto puede corresponder al ácido 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-1,23-dioico, reportado previamente para la variedad Hass (Hurtado et al., 2011). Figura 38. Espectro de masas del compuesto con tr 54,355 Para este ácido dicarboxilico hasta la fecha no se han encontrado reportes de algún tipo de actividad. Tabla 54. Análisis del espectro de masas TR=54,4 min Con la información anterior, es posible afirmar, de manera preliminar, que en las fracciones obtenidas de los extractos de semillas de aguacate Hass (P. americana) están presentes los ácidos pantoténico, linolénico y 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-1,23-dioico; dichas fracciones presentan protección contra la oxidación lipídica de oleína de palma-OP y de carne cruda de res-CR. 1. A partir tanto del epicarpio como de las semillas del aguacate Hass (Persea americana Mill. var. Hass) es posible obtener extractos que inhiben o retardan la oxidación lipídica de oleína de palma-OP y de carne de res cruda-CR. 2. El extracto obtenido de las semillas del aguacate Hass empleando EFSc (100 MPa, 3% EtOH, 40°C – Extracto 5) presentó mayor protección contra la oxidación lipídica de OP; dicho extracto tuvo un mejor comportamiento que el BHT, BHA y GA, antioxidantes comúnmente empleados en la industria de grasas y aceites. 3. El extracto obtenido de las semillas del aguacate Hass empleando acetato de etilo posterior a una extracción con hexano (extracto 2S) presentó mayor protección frente a la oxidación de CR, superior a la obtenida empleando BHT. 4. Algunas fracciones obtenidas a partir de los extractos 5 y 2S presentaron una A.A. similar a la de los extractos de origen sobre OP y CR, respectivamente; por tanto es recomendable emplear en cada caso los respectivos extractos crudos. 5. El análisis por HPLC-MS de las fracciones más activas de los correspondientes extractos permitió, de forma preliminar, determinar la presencia de los ácidos pantoténico, linolénico y 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-1,23-dioico. Una vez alcanzados los objetivos planteados en el proyecto de tesis de maestría, surgen una serie de sugerencias que amplían la temática abordada para llegar a conclusiones más profundo; por lo tanto se recomienda a futuros interesados en el tema: 1. Efectuar un estudio estructural de los compuestos, de forma que se pueda afirmar con plena seguridad la composición química de la fracción más activa, además se requiere evaluar la actividad antioxidante en oleína y carne de res de los compuestos identificados, con el fin de determinar su aporte. 2. Determinar la inocuidad de los extractos activos sobre los alimentos, lo cual es una directriz a seguir para aditivos alimentarios. 3. Evaluar la factibilidad económica del proceso a escala piloto e industrial, para conocer las ventajas de emplear dichas clases de extractos como aditivos en alimentos. 4. Realizar un estudio similar sobre otras variedades de aguacate (P. americana) con el fin de identificar similitudes y diferencias en cuanto a composición y/o concentración de ciertos metabolitos secundarios con actividad antioxidante; además se requiere un estudio en iguales variedades pero con diferentes puntos geográficos de siembra de las plantas, debido a que las variables medio ambientales influyen en la biosíntesis de tales metabolitos, y finalmente es importante realizar un estudio sobre los excedentes industriales, con el fin de reducir el impacto ambiental que producen dichos residuos. 5. Realizar un estudio sensorial sobre la OP y la CR con los extractos adicionados con el fin de determinar en qué medida se afecta el gusto por parte del consumidor. Akobenga, A., Richmondb, K., Millera, V., Thomasa, A. (2007). Effect of exclusive enteral nutritional treatment on plasma antioxidant concentrations in childhood Crohn"s disease. Clinical Nutrition, 26, 51–5. 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