Actividad antioxidante de los residuos del aguacate Hass

El presente trabajo exploró la posibilidad de obtener extractos, a partir de semillas y epicarpio de aguacate Hass (Persea americana Mill. var. Hass), capaces de proteger la oleína de palma (OP) y la carne de res cruda (CR) de la oxidación lipídica; se empleó extracción soxhlet (E.Sox.) a presión reducida (Pred) usando tanto de forma directa como sucesiva hexano, acetato de etilo y etanol. En el caso de la oleína, con el extracto más activo se realizó un ensayo acelerado de oxidación durante 3 días, con una alta correlación frente al ensayo de oxidación convencional (Pearson=0,93), por lo que éste se empleó en evaluaciones posteriores de actividad antioxidante (AA) sobre OP. Posteriormente se evaluó la AA del mejor extracto contra el correspondiente obtenido mediante E.Sox. a presión atmosférica (Patm, 560 mm Hg). Tanto para OP como para CR se encontró que la semilla fue más promisoria que el epicarpio sometidos a extracción soxhlet a presión reducida. Posteriormente esta biomasa fue sometida a extracción con fluidos supercríticos (EFSc) con cosolvente. El extracto que mejor protegió la OP contra la oxidación lipídica fue obtenido con CO2 a 100 MPa, 40°C con 3% de EtOH como co-solvente (extracto 5); para CR el mejor extracto fue obtenido mediante extracción soxhlet a presión reducida con AcOEt luego de desengrasar con hexano. Finalmente los extractos con mayor AA en cada matriz grasa fueron sometidos a fraccionamiento por cromatografía en columna, empleando Diaion HP-20 como fase estacionaria. La AA de los extractos fue similar a la de las fracciones, por lo que se recomienda no fraccionar los correspondientes extractos; al someter las fracciones más activas de los respectivos extractos a análisis por HPLC-MS, se determinó, de forma preliminar, la presencia de los ácidos pantoténico, linolénico y el ácido 3,6,9,12,15,18,21 heptaoxatricosano-1,23-dioico.

Palabras clave: Oxidación lipídica, extracción soxhlet, extracción con fluidos supercríticos, Persea americana Mill.

Abstract

This paper explored the possibility of obtaining extracts from seeds and epicarp of Hass avocado (Persea americana Mill. var. Hass), they were able to protect palm olein (PO) and raw beef (CR) of lipid oxidation; soxhlet extraction (E.Sox.) was used under reduced pressure (Pred) using both, directly and successively hexane, ethyl acetate and ethanol. For olein, with the most active extract, accelerated oxidation for 3 days, with a high correlation with the conventional oxidation test (Pearson=0,93) was carried out, so this test was used in subsequent evaluations of antioxidant activity (AA) on OP. Subsequently the AA from the best extract was evaluated against the corresponding obtained by E.Sox. at atmospheric pressure (Patm, 560 mm Hg). For OP and CR was found that the seed was more promising than the epicarp under soxhlet extraction at reduced pressure. Later this biomass was extracted with supercritical fluids (EFSC) with cosolvent. The extract better protected against OP lipid oxidation was obtained with CO2 at 100 MPa, 40 ° C with 3% EtOH as co-solvent (extract 5); for CR the best extract was obtained by Soxhlet extraction with AcOEt at reduced pressure after the biomass was degreasing with hexane also at reduced repressure. Finally, the extracts with better AA in every fat matrix were subjected to fractionation by column chromatography using Diaion HP-20 as stationary phase. The AA for the extracts was similar to the fractions, so it"s recommended not divide the corresponding extracts; by subjecting the most active fractions of the respective extracts to HPLC-MS analysis was determined in a preliminary manner, the presence of pantothenic acid, linolenic acid and 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosane-1,23-dioic acid.

Keywords: lipid oxidation, soxhlet extraction, supercritical fluid extraction, Persea americana Mill

Lista de Símbolos y abreviaturas

___________________________________________________

Introducción

En nuestro país, algunas frutas son sometidas a procesos industriales, obteniendo así, un gran número de productos terminados. A partir de dichos procesos y del consumo en fresco por parte de la población, se genera una cantidad considerable de residuos, de los cuales recientemente se ha motivado su estudio como fuente de metabolitos con diferentes propiedades de interés para la industria alimentaria, como es el caso de la actividad antioxidante, parte central del presente trabajo. No obstante, también pueden presentar otros tipos de actividad, como son: citotóxica, diurética, hipocolesterómica, larvicida, insecticida, entre otros (Jaswir et al., 2000; Karre et al., 2013; Pahua et al., 2012).

Respondiendo a la anterior expectativa, el presente trabajo propone nuevas formas de aprovechamiento de los residuos del fruto del aguacate Hass (P. americana), mediante la obtención de extractos con actividad antioxidante aplicables en matrices grasas alimenticias (Kosinska et al., 2012). Para lograr lo anterior, se obtienen extractos de epicarpio y de semillas de aguacate, empleando diferente técnicas. Cada uno de los extractos, por separado, fueron evaluados como agentes protectores frente a la oxidación de OP (Bansal et al., 2010; Muik et al., 2005) y CR (Farouk et al., 2014), realizando un estudio comparativo mediante ACP.

Marco teórico

Generalidades del aguacate

Se considera que la especie que dio origen al aguacatero proviene de la zona montañosa del occidente de México y Guatemala. Su distribución natural va desde México hasta Perú, pasando por Centro América, Venezuela, Colombia y Ecuador (Bernal et al., 2008).

Después del descubrimiento y conquista de América el cultivo del aguacate fue diseminado a Centro América, Colombia y Perú, y finalmente a otros lugares del mundo, como es Europa, Sur África, Sur América y Asia (Bernal et al., 2008).

El fruto del aguacate es una baya que posee un endocarpio delgado y un mesocarpio carnoso y oleaginoso, rodeado del epicarpio que es de textura rugosa, en el caso de la variedad Hass, ver figura 1. En Colombia, el aguacate Hass de mayor aceptación proviene de los municipios de La Ceja, Retiro, Guarne, San Vicente, Rionegro, Marinilla, Sonsón y Abejorral (Antioquia) (DANE, 2013).

Figura 1. Descripción del fruto del aguacate.

Taxonomía y morfometría del fruto

Nombre científico: Persea americana Miller variedad Hass

Reino: Vegetal

División : Spermatophyta

Subdivisión: Angiospermae

Clase: Dicotyledoneae

Subclase: Dipétala

Orden: Ranales

Familia: Lauraceae

Genero: Persea

Especie: Persea americana Miller

Variedad: Hass

Los frutos de aguacate Hass son de tamaño pequeño, su peso oscila entre 150 a 400 g, es de forma ovoide periforme, con epicarpio rugoso, de color verde que en estado de madurez consumible se torna de color pardo intenso (a los 15 días de recolección, aprox.), el contenido de grasa de este fruto es de 17 a 21% en base húmeda. En Colombia se cultiva en climas fríos en alturas de 1800 a 2600 msnm, la relación en peso de epicarpio: semilla: pulpa es 8,5:11,5:70, su pulpa es abundante y de color verde claro, la semilla es pequeña; dadas sus características sensoriales, su intensidad de producción y su tardía época de maduración esta variedad es la de mayor volumen de producción y comercialización en el mundo. Además, hay que indicar que el fruto puede mantenerse bastante tiempo en el árbol sin disminuir apreciablemente su calidad y se comporta bien en el transporte debido a su corteza tosca y gruesa, y los parámetros de calidad para la exportación del fruto están referidos a esta variedad (Bernal et al., 2008).

Para el presente trabajo, los frutos de aguacate sobre los cuales se realizó el estudio fueron sometidos a un estudio morfométrico con el propósito de verificar que éstos corresponden a la variedad Hass. El estudio morfométrico implicó medidas de la longitud, ancho, peso, grosor del epicarpio, peso del epicarpio, ancho de la semilla, peso de la semilla, la relación en peso del epicarpio respecto al fruto global (w/w) y finalmente la relación de la semilla respecto al fruto global (w/w). Los resultados se resumen a continuación en la tabla 1. También se determinó el porcentaje de humedad por gravimetría, ver tabla 2. A partir de los reportes por otros autores (Rodríguez et al., 2011a), se concluyó que se está trabajando con la variedad Hass.

Tabla 1. Resultados estudio morfométrico del aguacate Hass.

Tabla 2. Porcentaje de humedad para la semilla y epicarpio del fruto de aguacate Hass.

El consumo del aguacate, beneficios

A partir de la pulpa se obtienen ácidos grasos furánicos y alcoholes grasos polihidroxilados, que son de utilidad en cosmética (Parker and Parker, 2003); se ha determinado que el consumo de 68 gramos de pulpa suministra fibra dietaria (4.6 g), azúcar total (0.2 g), potasio (345 mg), sodio (5.5 mg), magnesio (19.5 mg), vitamina A (43 µg), vitamina C (6.0 mg), vitamina E (1.3 mg), vitamina K1 (14 µg), folato (60 mg), vitamina B-6 (0.2 mg), niacina (1.3 mg), ácido pantoténico (1.0 mg), riboflavina (0.1 mg), cloruro (10 mg), luteina/zeaxantina (185 µg), fitosteroles (57 mg), ácidos grasos instaturados (6.7 g) y 114 kcal ó 1.7 kcal/g. Su consumo tiene una influencia positiva en la memoria a corto plazo y reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares. La pulpa también es rica en serotonina 5-hidroxitriptamina (figura 2) (5-HT), que es un neurotransmisor monoamina molécula de señalización que juega un papel crucial en el desarrollo de los circuitos neuronales y plasticidad, compuesto que se ha reportado en otras frutas como bananas, ciruelas, piña, kiwi y tomate. El aceite de aguacate tan apetecido en la industria cosmética y alimentaria contiene 71% de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), 13% de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) y 16% de ácidos grasos saturados (SFA) (Dreher and Davenport, 2013).

Figura 2. Serotonina 5-hidroxitriptamina (5-HT).

El ácido graso principal identificado y cuantificado en el aguacate fue el ácido oleico (aproximadamente 57% del contenido total de ácidos grasos), encontrándose también ácido linoleico, palmítico, cis-vaccenico (omega 7), y ácidos-?-linolénico (de la serie omega 6). El esterol principalmente encontrado (alrededor de 89% del contenido total de esteroles) fue el ß-sitosterol (figura 3) junto al estigmasterol y campesterol. El pigmento más abundante hallado fue la crisantemaxantina [(3S,3'S,5R,8S,9cis)-5,8-Dihydro-5,8-epoxy-ß,ß-carotene-3,3'-diol] (figura 4) (Dembitsky et al., 2011).

Figura 3. ß-sitosterol, principal esterol encontrado en pulpa de aguacate.

Figura 4. Crisantemaxantina, pigmento mayoritario en pulpa de aguacate.

Estudios han mostrado que fitoquímicos extraidos del fruto (pulpa) inducen la interrupción del ciclo celular, inhiben el crecimiento e inducen la apoptosis en líneas celulares precancerosas y cancerosas, sugeriendo una estrategia en la dieta para la prevención del cáncer (Ding et al., 2007). Además se ha encontrado que el contenido de glutatión y de fenoles totales aumenta a medida que madura el fruto, observando comportamiento similar en su actividad antioxidante (FRAP, DPPH) (Wang et al., 2012) e hipolipidémica (Padmanabhan and Arumugam, 2014).

Aprovechamiento de los residuos de aguacate

Después de la transformación industrial, aprovechamiento o consumo del fruto, se tienen materiales residuales (semilla y epicarpio) que podrían ser fuente potencial para complementos alimenticios por los metabolitos presentes en ellos (Ayala et al., 2011). Los Aztecas utilizaban cocciones de la semilla como tratamiento micótico e infecciones parasitarias, también, ciertas preparaciones de la semilla reducen el dolor al ser aplicado como tónico (Del Refugio et al., 2004).

Estudios fitoquímicos previos realizados sobre la semilla del aguacate se han identificado diferentes clases de metabolitos entre los que se encuentran glucósidos del ácido abscísico, importantes en la maduración del embrión (Del Refugio et al., 2004), fitosteroles, triterpenos (Werman et al., 1990; Lozano et al., 1993), ácidos grasos con enlaces oleofínicos y acetilénicos (Kashman et al., 1969), ácidos furanoicos (Farines et al., 1995), dímeros de flavanoles (Geissman and Dittmar, 1965), proantocianidinas oligoméricas (Thompson et al., 1972; Valeri and Gimeno, 1953), polifenoles y antocianinas (Hurtado et al., 2011; Wang et al., 2010). Por otra parte, los extractos de semillas obtenidos empleando acetona/agua/ácido acético han mostrado actividad frente al ensayo de absorbancia del radical oxigeno (ORAC) (Wang et al., 2012) y la inactivación del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (Wang et al., 2010). Los extractos de la semilla empleando cloroformo como solvente, fueron activos frente a la proliferación de líneas de células epiteliales orales (Ding et al., 2007).

A continuación en la tabla 3, se resumen los últimos trabajos realizados sobre los residuos de aguacate Hass, junto al método de extracción empleado, el potencial uso de los extractos y el tipo de compuestos presentes en dichos extractos.

Tabla 3. Estudios realizados sobre residuos del aguacage Hass

Aunque la semilla del aguacate Hass representa un porcentaje considerable del total del fruto, la investigación sobre los efectos biológicos y fitoquímica de la semilla está en las etapas incipientes. Actualmente, la semilla representa un recurso infrautilizado y es tema de preocupación en cuanto a generación de residuos para los procesadores del aguacate (Restrepo et al., 2012). Hay información etnofarmacológica especialmente en los países de América del Sur sobre el uso de estas semillas para el tratamiento de ciertas enfermedades, donde en la actualidad se cultiva en gran escala. Recientemente se ha encontrado que las semillas de aguacate pueden mejorar la hipercolesterolemia, y ser útiles en el tratamiento de la hipertensión, afecciones inflamatorias, diabetes y osteoartítaricas. También se han encontrado que poseen actividad insecticida, fungicida y antimicrobiana. Históricamente, también se utilizaron extractos de semillas de aguacate como tinta para la escritura, junto al tinte producido cuando se usa una polifenol oxidasa sobre los mismos extractos (Dabas et al., 2013).

Antioxidantes

Las grasas y aceites presentes en los alimentos se deterioran a través de varias reacciones de degradación como se muestra en la presente sección, estas reacciones se dan por efecto del calor y del almacenamiento a largo plazo, lo cual se traduce en una disminución del valor nutricional del alimento y de la calidad sensorial. Un retraso de estos procesos de oxidación beneficiaría a la cadena de producción de alimentos (Pokorny et al., 2001). Existen diferentes definiciones de antioxidantes (Wanasundara and Shahidi, 2005), no obstante, en un sistema biológico, un antioxidante puede ser definido como "cualquier sustancia que cuando está presente en bajas concentraciones en comparación al sustrato oxidable, retarda significativamente o previene la oxidación del sustrato"(Halliwell et al., 1995); como sustrato oxidable se puede considerar a un alimento, el cual tiene una variedad compleja de biomoléculas susceptibles a la oxidación, tales como proteínas y lípidos.

Antioxidantes en alimentos

En grasas y aceites, los antioxidantes retardan el inicio de la oxidación o disminuye la velocidad de oxidación; por tanto, el uso de antioxidantes en alimentos incrementa la vida útil o vida media del material (Wanasundara and Shahidi, 2005). La oxidación de lípidos produce compuestos con diferentes olores y sabores para luego afectar otras moléculas del alimento.

Oxidación de grasas y aceites y mecanismos de acción de los antioxidantes

La oxidación de los lípidos es la causa principal del deterioro de la calidad del alimento, produciendo malos olores, pérdida de aminoácidos esenciales y el deterioro de las vitaminas liposolubles (Shahidi and Zhong, 2005). En grasas y aceites, el proceso de oxidación, es similar a la oxidación de cualquier compuesto orgánico insaturado, se requiere de un proceso de iniciación para generar los radicales libres a partir del sustrato. A continuación se esquematiza un proceso general de oxidación de un lípido, "R" es un grupo alquilo de una molécula de lípido insaturada. "H" es un átomo de hidrógeno a-metilénico. "RO·" es un radical alcóxilo, "ROO·" radical peroxilo, "I" es un iniciador.

Figura 5. Reacciones generales del proceso de autooxidación.

La autoxidación es el deterioro oxidativo de un lípido por medio de un proceso auto-catalítico por medio de un mecanismo de radicales libres. Este mecanismo incluye reacciones de iniciación, propagación y terminación, a continuación describiremos en detalle cada una de ellas:

El proceso de iniciación genera radicales libres a partir del sustrato, el átomo de hidrógeno a-metilénico se abstrae de la molécula del lípido insaturado para generar un radical lipídico (R(Figura 5, ecuación [1]). El radical lipídico es altamente reactivo y reacciona rápidamente con oxígeno produciendo un radical peroxilo (ROO(Figura 5, ecuación [2]). La oxidación directa de lípidos por oxígeno triplete (3O2) es prohibida por el espín, esto es debido a la dirección opuesta del espín del lípido en el estado basal de multiplicidad singulete y el oxígeno de multiplicidad triplete; sin embargo, cuando están presentes iniciadores, esta barrera de espín puede ser superada. El oxígeno en estado basal puede ser activado por la presencia de metales o complejos metálicos que pueden iniciar la oxidación por formación de radicales libres u oxígeno singulete. Otra forma de favorecer la oxidación de los lípidos es por acción de luz en presencia de fotosensibilizadores (clorofila, hemoproteinas, rivoflavina), temperatura, y/o la presencia de lipoxigenasa. Posteriormente, en las reacciones de propagación, el radical peroxilo reacciona con otra molécula de lípido insaturada para formar un hidroperóxido (ROOH) y un nuevo radical lipídico (figura 5, ecuación [3]). Como se genera un nuevo radical en cada paso, se incorpora cada vez más oxígeno al sistema aumentando la concentración de radicales peroxilo, obteniendo por lo tanto un mecanismo cíclico auto-catalizado. Los hidroperóxidos son inestables y se pueden degradar a la formación de radicales que aceleran las reacciones de propagación, estos son pasos de ramificación (figura 5, ecuaciones [4] y [5]). Esta reacción en cadena procede hasta que dos radicales se combinan para formar un producto no radicalario. La degradación de los hidroperóxidos puede generar nuevas moléculas que tienen olores y sabores desagradables, asociada a la rancidez oxidativa de lípidos insaturados, tales cambios sensoriales son notados cuando la oxidación de los lípidos ha avanzado hasta etapas avanzadas. El malondialdehído es uno de los productos finales del proceso de oxidación lipídica, el cual es aceptado como un indicador de la peroxidacion lipídica (Alam et al., 2013).

Recientemente se determinó que los extractos obtenidos a partir de los residuos (semilla y epicarpio) de la pulpa del aguacte Hass presentan actividad antioxidante frente a la oxidación lipídica en paté de carne de cerdo cruda (Rodriguez et al., 2011a; Rodriguez et al., 2011b) y cocida (Rodriguez et al., 2012).

Clasificación de los antioxidantes

Los antioxidantes pueden ser agrupados de forma general de acuerdo a su mecanismo de acción: antioxidantes primarios o de ruptura de cadena y secundarios o antioxidantes preventivos, aunque algunos antioxidantes muestran los dos mecanismos de actividad, a los cuales son referidos como antioxidantes multi-función.

Antioxidantes primarios

Los antioxidantes primarios también son referidos como tipo I, o antioxidantes de ruptura de cadena, los cuales pueden actuar como aceptores/secuestradores de radicales libres y retardar o inhibir los pasos de iniciación o interrumpir los pasos de propagación de la oxidación. Los antioxidantes primarios no pueden inhibir la oxidación fotosensibilizada o la eliminación de oxígeno singulete, la figura 6 muestra los posibles eventos donde los antioxidantes pueden interferir a lo largo de la ruta de oxidación lipídica. Se ha encontrado que el paso de propagación es el más lento en el proceso de oxidación lipídica, debido a que los radicales peroxilo son encontrados en mayor cantidad que otros radicales, y al tener menor energía que los radicales alcoxilo, son más selectivos, y reaccionan con los átomos de hidrogeno presentes en los antioxidantes primarios. Los radicales antioxidantes producidos (A.) son menos propensos de participar en reacciones de propagación debido a que tienen una muy baja reactividad hacia lípidos insaturados u oxígeno, en lugar de ello, reaccionan con radicales peroxilo y así detiene la cadena de propagación.

La mayoría de los antioxidantes primarios son fenoles mono y polihidroxilados. El radical antioxidante formado es estabilizado por deslocalización del electrón desapareado alrededor del anillo fenólico para formar un híbrido estabilizado por resonancia, ver figura 7.

Figura 6. Posibles interacciones de los antioxidantes primarios y secundarios con la ruta de oxidación lipídica en alimentos.

Figura 7. Híbridos de resonancia del radical fenoxilo de un antioxidante fenólico.

Antioxidantes secundarios

Los antioxidantes secundarios también son clasificados como antioxidantes preventivos, o de clase II, la principal diferencia con los antioxidantes primarios es que no convierten radicales libres hacia moléculas estables, sino que actúan como agentes quelantes de iones metálicos, proporcionando átomos de hidrógeno a los antioxidantes primarios, así como descomponer hidroperóxidos a especies no radicalarias, desactivando oxígeno singulete y absorber radiación UV, o actuando como secuestradores de oxígeno. La tabla 4 muestra algunos ejemplos de compuestos que son considerados antioxidantes tipo II.

Tabla 4. Compuestos que exhiben actividad antioxidantes secundaria

• Agentes secuestrantes/quelantes o desactivadores de metales

Metales pesados con dos o más estados de valencia acortan el periodo de inducción e incrementan la velocidad máxima de oxidación de los lípidos (p.ej. Co, Cu, Fe, Mn, etc), trazas de estos iones metálicos endógenos o exógenos están presentes en los alimentos que contienen lípidos. Los metales de transición pueden existir acomplejados (quelatos) con compuestos presentes en los alimentos, cambiando su actividad catalítica, la quelación puede incrementar la actividad prooxidante haciéndolos menos polares, incrementando su solubilidad en los lípidos o alterando su potencial redox. Los agentes quelantes pueden ejercer actividad antioxidante por prevención del conjunto de reacciones del ciclo redox, ocupando todos los sitios de coordinación del metal, formando complejos insolubles por impedimento estérico entre los metales y los lípidos. La quelación de estos iones metálicos reduce la actividad prooxidante elevando la energía de activación de las reacciones de iniciación. Los agentes antioxidantes secundarios forman enlaces sigma con los iones metálicos reduciendo el potencial redox y estabilizando la forma oxidada; los más comúnmente empleados son: ácido cítrico, EDTA y derivados del ácido fosfórico (polifosfatos y ácido fítico).

• Secuestradores de oxígeno y agentes reductores

El oxígeno singulete es el estado excitado del oxígeno, y su inactivación es una forma efectiva de prevenir la iniciación de la oxidación. Los carotenoides son capaces de inactivar los sensibilizadores fotoactivados por absorción de su energía para formar un estado excitado del carotenoide, transfiriéndola posteriormente a sus alrededores.

• Actividad antioxidante sinérgica

El sinergismo es el efecto cooperativo de los antioxidantes o un antioxidante con otros compuestos para mejorar su actividad antioxidante más allá de la suma individual de sus actividades al usarse separadamente. Dos tipos de sinergismo son obsevados: el primero que envuelve exclusivamente antioxidantes primarios y otro, que envuelve una combinación de antioxidantes primarios con agentes quelantes.

Antioxidantes naturales y sintéticos

Existen tanto compuestos naturales como sintéticos que pueden desempeñarse como antioxidantes primarios. La característica común de todos estos antioxidantes es que son mono o polihidroxifenoles con varias sustituciones en el anillo aromático, ver figura 8.

Figura 8. Estructuras químicas de antioxidantes sintéticos comúnmente usados en grasas y aceites.

Los antioxidantes fenólicos sintéticos son p-sustituídos, mientras que los de origen natural son en su mayoría o-sustituídos; los sintéticos son siempre sustituídos con grupos alquilo para mejorar su solubilidad en grasas y reducir sus toxicidad. La sustitución con un grupo electro-donante en la posición orto o para al grupo hidroxilo del fenol, incrementa la actividad antioxidante del compuesto por efecto inductivo (p.ej. 2,6-ditertbutil-4-metilfenol, BHT). La presencia de un segundo grupo hidroxilo en la posición orto o para del fenol igualmente incrementa su actividad antioxidante (p.ej. TBHQ).

En derivados dihidroxibenceno el radical semiquinoide producido inicialmente puede ser oxidado a una quinona por reacción con otro radical lipídico, como se observa en la figura 9.

Este radical semiquinoide puede transformarse en quinona y una molécula de hidroquinona, contribuyendo a la actividad antioxidante como secuestradores de radicales peroxilo. La tabla 5 resume los antioxidantes primarios comúnmente usados en grasas y aceites para alimentos. Para ser más efectivos, los antioxidantes primarios deben ser adicionados durante el paso de iniciación de la cascada de reacciones de autoxidación.

Figura 9. Mecanismo de actividad antioxidante de un derivado de dihidroxibenceno.

Tabla 5. Antioxidantes primarios comúnmente usados en alimentos.

Evaluación de la actividad antioxidante

La actividad antioxidante de un compuesto o de un extracto es evaluada por la resistencia a la oxidación de los lípidos contenidos en el alimento; por consiguiente, la mayoría de los métodos usados para evaluar la actividad antioxidante hacen seguimiento a los pasos de oxidación de los lípidos, los cuales pueden categorizarse en tres grupos:

• Decaimiento del substrato, compuesto de prueba o consumo de oxigeno

• Formación de productos de oxidación a partir del substrato oxidable

• Formación o decaimiento por el sondeo de radicales libres

La actividad antioxidante es función del tiempo (velocidad de reacción), tipo de sustrato, temperatura, concentración del antioxidante, concentración de otras sustancias (oxígeno, peróxidos, presencia de otros antioxidantes o prooxidantes) y el coeficiente de partición del antioxidante en el sustrato.

En la parte inicial, la oxidación ocurre lentamente, el momento en que se incrementa repentinamente se conoce como periodo de inducción. Los hidroperóxidos lipídicos se han identificado como productos primarios de autoxidacion; su descomposición produce aldehídos, cetonas, alcoholes, hidrocarburos, ácidos orgánicos volátiles y epoxi compuestos, conocidos como productos secundarios de oxidación (Shahidi and Zhong, 2005).

Un número de test físicos y químicos, incluyendo análisis instrumental, han sido desarrollados en los laboratorio y en la industria para hacer seguimiento a la oxidación de los lípidos. Estos incluyen: la ganancia en peso, consumo de oxígeno (headspace), análisis cromatográfico por cambios en reactantes, titulación iodométrica, colorimetría por formación de complejos de hierro, transformada FTIR, espectrometría para dienos y trienos conjugados, TBARS, medidas del índice de estabilidad oxidativa (Rancimat), resonancia electrónica de espín (EPR), Calorimetría Diferencial de Escaneo (DSC) y resonancia magnética nuclear (NMR).

Para la evaluación de la actividad antioxidante en el presente trabajo se emplea el test de almacenamiento empleando métodos acelerados de oxidación, para esto, el alimento se almacena en una estufa a temperaturas determinadas (usualmente 60°C) y se evalúa tanto la formación de productos primarios (hidroperóxidos del ácido linoleico; HPL) como secundarios de oxidación (especies reactivas al ácido tiobarbitúrico; TBARS).

Extracción con fluidos supercríticos

Además del método soxhlet y maceración, que han sido los más usados en la obtención de extractos de los residuos de aguacate Hass, en el presente trabajo se propone obtener extractos empleado fluidos supercríticos, para posteriormente evaluar su actividad frente a la protección contra la oxidación lipídica.

Definición e historia

Un fluido supercrítico (FSc) es una forma de la materia en la que los estados líquido y gaseoso son indistinguibles entre sí, también se puede definir como un fluido que se encuentra en condiciones por encima de sus valores de presión y temperatura críticas (punto crítico)" (De Castro et al., 1993).

El descubrimiento de lo que ahora llamamos punto crítico se remonta a los experimentos de Cagniard de la Tour con el digestor de Papin (figura 10); en 1822, en el contexto de su interés en acústica, colocó un balón pedernal en un digestor parcialmente lleno con un líquido. Tras ebullición un sonido de "chapoteo" fue generado y el balón pedernal penetraba la interface líquido-vapor. Cagniard de la Tour notó que tras calentar el sistema más allá de su punto de ebullición del líquido, el sonido de "chapoteo" cesaba a cierto valor de temperatura. Esto marca el descubrimiento de la fase fluida supercrítica, en esta fase no hay tensión superficial ya que no hay frontera de fase líquido-gas.

Figura 10. Digestor de Papin o Marmita de Papin. Sirve para someter un sistema a una presión elevada.

Propiedades físicas

Los diferentes estados físicos de una sustancia pura pueden ser visualizados en un diagrama tridimensional de presión-volumen-temperatura (PVT), ver figura 11.

Figura 11. Diagrama PVT de una sustancia pura (CO2) y su proyección en el plano PT.

Las superficies representan los diferentes estados –solido, líquido o vapor- que corresponden a valores particulares de presión y temperatura. De acuerdo a la regla de las fases, las regiones de dos fases (sólido-líquido, sólido-vapor y líquido-vapor) de una sustancia pura tienen solamente un grado de libertad. Por consiguiente la presión de equilibrio en cada caso es función de la temperatura. Las proyecciones PT de las líneas de equilibrio sólido-líquido, sólido-valor y líquido-vapor se muestran en la parte izquierda de la figura 11. En particular, la línea líquido-vapor representa la curva de presión de vapor que inicia en el punto triple (PT) donde coexisten las fases sólido, líquido y vapor y finaliza en el punto crítico (PC) (Martínez, 2008).

Las propiedades del punto crítico se pueden entender siguiendo los cambios de las propiedades del fluido a lo largo de la curva de presión de vapor, al incrementar los valores de la temperatura la densidad de la fase líquida disminuye y la densidad del vapor se incrementa debido a una mayor presión de vapor. Eventualmente ambas densidades convergen en el CP y no es posible diferenciar el líquido del vapor por encima de la temperatura crítica, cuando la temperatura y la presión son superiores a sus valores críticos el fluido se encontrará en la región supercrítica.

El punto crítico es característico de cada sustancia. En la tabla 6 se encuentran los valores de presión, temperatura y densidad crítica para algunas sustancias químicas.

Tabla 6. Condiciones supercríticas de algunos compuestos puros (Yépez, 2010).

El FSC que más se emplea en la actualidad es el dióxido de carbono, ya que es barato, no es tóxico, ni inflamable y sus condiciones críticas se pueden alcanzar fácilmente.

El empleo de solventes de altas temperaturas críticas (500K o superiores) puede generar pirolisis de compuestos de alto peso molecular, aunque tienen un mayor poder de solvencia para materiales de peso molecular elevado. Sin embargo tienen baja selectividad y severas condiciones de operación y degradan componentes térmicamente lábiles. Una buena característica de los solventes de baja temperatura crítica comparados con los solventes líquidos convencionales, es que operan a temperatura moderada y su poder de solvencia se manipula por operación de la presión y temperatura de operación y pueden ser separados fácilmente del extracto. Estos son los solventes preferidos por las industrias farmacéuticas y las de productos naturales.

Stahl & Quirin han reportado la extractabilidad de una amplia gama de productos naturales usando CO2, ellos mostraron que: "1) los hidrocarburos y otros compuestos orgánicos lipofílicos de masa molecular relativamente baja son fáciles de extraer; 2) la introducción de grupos funcionales polares, grupos hidroxilo o carbonilo, hacen la extracción más difícil o imposible; 3) azúcares o aminoácidos no pueden ser extraídos; 4) los efectos del fraccionamiento son posibles si hay diferencias marcadas en la masa, presión de vapor o polaridad de los constituyentes de la mezcla" (Stahl et al, 1983).

Las propiedades físicas de los FSC son intermedias entre las de gases y las de líquidos, en la tabla 7 se hace una comparación entre la densidad (?), difusividad (D) y la viscosidad (µ) entre líquidos, gases y fluidos supercríticos (Yépez, 2010).

Tabla 7. Comparación entre las propiedades físicas de los fluidos supercríticos con la de los líquidos y la de los gases.

La densidad y viscosidad de los FSC son inferiores que la de los líquidos (figura 12), sin embargo la difusividad es más alta. Un aumento en la presión que se ejerce sobre el fluido (expresada como presión reducida Pr=P/Pc) conduce a un aumento en su densidad, el cual es pronunciado en cercanías al punto crítico (PC). Debido a que la densidad del FSC está relacionada con su poder solvatante, la variación de la densidad en función de la presión y la temperatura también genera una variación de la solubilidad de los solutos en el fluido (Bruno, 1993).

Figura 12. Variación de la densidad de un fluido supercrítico en función de la presión a diferentes temperaturas.

Por otra parte, se observa que entre mayor sea la temperatura del fluido (Tr=T/Tc) menor será el aumento en su densidad al aumentar la presión, es decir, bajo condiciones isobáricas, la densidad de un fluido supercrítico es inversamente proporcional a la temperatura.

La difusividad de los solutos de un fluidos supercrítico es similar a la que presenta un gas, es decir, la velocidad de transporte de las moléculas de soluto en un fluido supercrítico es alta, lo que hace que los procesos de transporte de masa desde el interior de la matriz de la muestra hacia el exterior de la misma sean rápidos, a diferencia de lo que se observa en el caso de los líquidos. En la figura 11 se observa la variación de la difusividad de un FSC con la temperatura y la presión (aumenta con la primera y disminuye con la segunda respectivamente). También se observa el cambio abrupto en difusividad en las proximidades del PC.

La viscosidad de un FSC, la cual también afecta el transporte de los solutos, varía de la misma forma que la difusividad con la presión y la temperatura (McHugh and Krukonis, 1986), ver figura 14.

Figura 13. Variación de la densidad de un fluido supercrítico en función de la presión a diferentes temperaturas.

Figura 14. Variación de la viscosidad de un fluido supercrítico en función de la presión a diferentes temperaturas.

CO2 como fluido supercrítico