Resumen
El cultivo celular es la técnica que ha permitido conocer el comportamiento in vitro de todo tipo de células, en la actualidad esta técnica es utilizada para la producción de biofármacos, junto con la estandarización de algunos protocolos que facilita su manejo ha permitido grandes avances en la búsqueda de nuevas curas ha enfermedades que antes se creían incurables. En esta revisión se realiza con el fin de dar a conocer los avances en las aplicaciones del cultivo celular a la inmunología, se hace la relación de algunas técnicas de laboratorio que pueden aplicarse sobre estos cultivos y se ejemplifica la utilidad de las mismas, tomando como modelo diversos trabajos que estudian las respuestas del sistema inmunológico frente a diferentes enfermedades haciendo énfasis en el uso de esta técnica en cáncer y la búsqueda de vacunas.
Palabras clave: cultivo celular, inmunología
Introducción
La inmunología es una ciencia que estudia los procesos moleculares y celulares implicados en la defensa de la integridad biológica del organismo a través de la identificación de las sustancias propias y detección de las sustancias extrañas y su destrucción. En cada organismo, los mecanismos de defensa son muy diversos y heterogéneos, aunque siempre existe una actuación integrada de todos ellos. Entendemos por respuesta inmune todos aquellos eventos desarrollados por el sistema inmune al objeto de defender la integridad biológica del individuo frente a cualquier agresión (estimulo antigénico). La Inmunología comprende diversas áreas: Inmunogenética, Inmunobiología, Inmunopatología o Inmunología clínica, Inmunofarmacología, Inmunología veterinaria, etc.
Los seres vivos al entrar en contacto con el ambiente siempre están expuestos a diversos factores adversos como generación de tumores e infecciones de bacterias, virus, hongos, etc. Para enfrentar a estos diferentes factores los organismos disponen de un conjunto de elementos especiales, conocido como sistema inmune. La capacidad de defensa se adquiere antes de nacer y se madura y consolida en los primeros años de la vida fuera del seno materno.
El cultivo masivo de líneas celulares animales es fundamental para la manufactura de vacunas virales y diversos productos biotecnológicos. Una de las aplicaciones más interesantes del cultivo celular ha consistido en la obtención de productos de uso terapéutico que ya han alcanzado el mercado farmacéutico. Los avances logrados en la tecnología de cultivo celular han permitido que productos cada vez más complejos se pongan al alcance del público usuario.
En esta sección se presentan los diferentes productos del cultivo celular en orden creciente de complejidad del proceso involucrado. Los productos biológicos producidos mediante la tecnología del ADN recombinante en cultivo celular incluyen enzimas, hormonas sintéticas, inmunobiológicos (anticuerpos monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancerígenos).
Las aplicaciones del cultivo celular en la inmunología se han dado especialmente gracias a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática.
Discusión
Una de las áreas en las cuales se han observado grandes avances con la utilización de cultivos de células es el diagnóstico de infecciones virales. Dicho diagnóstico es posible al buscar señales de cambios degenerativos conocidos colectivamente como efecto citopático en cultivos en monocapa de diferentes líneas celulares. El observador experto puede emitir un diagnóstico preliminar basándose en la línea celular implicada, en el tiempo de incubación y en la magnitud del efecto citopático, aunque pruebas adicionales son necesarias para la identificación definitiva del virus. (Tavira et al., 2009).
Elemplo de esto son los analisis terapeutico que se han realizado anticuerpos monoclonales contra el Virus del Dengue tipo 2 (DENV-2), recordemos que esta enfermedad es de amplia distribucion y que en la actualidad no se le ha encontrado cura, este estudio tubo como objetivo identificar anticuerpos monoclonales (MAbs) que pueden servir como terapia post-exposición, se investigó en detalle la actividad funcional de un amplio grupo de nuevos anti-DENV-2 mouse MAbs. sitios de unión fueron asignadas por la exhibición de la levadura de superficie y escapar de la neutralización, ensayos de inhibición de células de cultivo se realiza con cepas homólogas y heterólogas, y la actividad profiláctica y terapéutica se evaluó con dos modelos de ratón. (Sukupolvi et al., 2010)
Los resultados optenidos en esta investigacion sugieren:
los anticuerpos producidos contra un genotipo dentro del serotipo DENV-2 puede haber disminuido la potencia inhibitoria contra genotipos heterólogos. Teniendo en cuenta que este paradigma también parece cierto para DENV-1 y DENV-3 , puede ser crítico evaluar si las respuestas de anticuerpos policlonales generados contra cepas de la vacuna, que son inherentemente atenuada frente a la infección natural, neutralizar las cepas de los genotipos heterólogos más divergentes dentro de un serotipo de forma duradera. (Sukupolvi et al., 2010)
In vitro se ha demostrado el papel de los anticuerpos antidengue, sin embargo ha sido difícil demostrar tales fenómenos en el transcurso de infecciones naturales dada la complejidad de los procesos que ocurren durante las infecciones con DENV-2 no ha permitido, hasta ahora, describir con exactitud los fenómenos fisiológicos, bioquímicos e inmunológicos que tienen lugar, lo cual obstaculiza el desarrollo de terapias preventivas y terapéuticas. (Sukupolvi et al., 2010)
El uso de vacunas de cultivo celular reduce el riesgo de reacción alérgica, ya que no contienen los alergenos comunes como los presentes en la vacuna 17D la cual ??puede causar efectos adversos graves viscerotrópica y neurotrópica y anafilaxia. viscerotrópica de la enfermedad es una infección fulminante virus 17D en los órganos del hígado y visceral parecido a la adquirida de forma natural la fiebre amarilla. Neurotrópico enfermedad normalmente que sigue la invasión del cerebro donde el virus de la vacuna puede replicarse. El fundamento para el desarrollo de una nueva vacuna contra la fiebre amarilla ha sido revisado recientememnte cabe señalar que la fiebre amarilla, es una enfermedad letal, que se produce en zonas tropicales de América del Sur y África. Y las vacunas que en la actualidad se utiliza contienen al virus de manera viva atenuada (17D), este medicamento fue desarrollado en 1936 y es ampliamente utilizado, con aproximadamente 20 millones de dosis distribuidas anualmente. (Monath, et al., 2011)
La XRX-001 es una vacuna experimental contra la fiebre amarilla fabricado por Xcellerex de la cepa 17D ??cultivada en células Vero. Virus es purificada a partir de líquido de el cultivo, inactivada con ß-propiolactona, adsorbidos en hidróxido de aluminio 0,2% (alumbre), y se formulen con stabilizers. ha demostrado que la vacuna es altamente inmunogénica en ratones, hámsters y monos, y ha proporcionado protección contra virus de la fiebre amarilla. (Monath, et al., 2011)
Se realizó el primer estudio clínico de XRX-001. Y se encontro beneficios potencial de mejora de la seguridad compensará los títulos de anticuerpos más bajos en las decisiones regulatorias que queda por determinar. Debido a su baja incidencia, una reducción de los efectos adversos graves viscerotrópica y neurotrópica después de la administración de la vacuna inactivada no puede ser directamente demostrado en ensayos clínicos y se requieren estudios post-comercialización. Los próximos pasos necesarios para el desarrollo de la vacuna XRX-001 incluyen la evaluación de la durabilidad de la respuesta de anticuerpos reportados en el presente ensayo y el inicio de un estudio doble ciego, de fase del estudio clínico. (Monath, et al., 2011)
En cuanto a las enfermedades inflamatorias asociadas con la respuesta inmune, un número considerable de pacientes presentan síntomas inflamatorios no característicos, y constituyen un reto diagnóstico y terapéutico. Estos casos no característicos por lo tanto puede representar una etapa temprana, o mostrar una presentación atípica, de un trastorno del tejido conectivo mixto o una infección. La determinación del fenotipo inmune de los linfocitos desangre por citometría de flujo es un procedimiento rutinario de diagnóstico para la evaluación de las enfermedades linfoproliferativas e inmunodeficiencia VIH del paciente(Jones et al., 2008). Es por esto que el método empleado por citometría de flujo es adecuado para laboratorios de diagnóstico clínico, y que promete ser una valiosa fuente de información clínica para pacientes con síntomas inflamatorios inusuales, guiando máspruebas de diagnóstico y proporcionando una base para la terapia Ex juvantibus.
Finalmente en cuanto a las respuestas inmunes producidas por contaminantes del medio ambiente generados por combustión incompleta de fuentes decarbono, se ha podido demostrar que una variedad de hidrocarburos aromáticos policíclicos HAP son cancerígenos e inmunosupresores. De hecho, los HAP cancerígenos, como el benzo [a] pireno, puede suprimir tanto humoral (células B) como celular (mediada por células T) la respuesta inmune (Allan and Sherr, 2010).
La mayoría de estos efectos adversos están mediados por el receptor de aril hidrocarburos (AHR). En algunos casos, la inmunotoxicidad de linfocitos puede estar mediada indirectamente a través de las células accesorias (Allan and Sherr, 2010).
Muchos estudios realizados en modelos animales evalúan los mecanismos por los que los HAP, y otros ligandos Ahr relacionados (por ejemplo, hidrocarburos halogenados aromáticos / Hahs), median la inmunosupresión. Estos estudios revelan que los ligandos Ahr suprimen la inmunidad por su capacidad de compromiso prácticamente en todas las etapas de desarrollo de los linfocitos, activación y función efectora de estudio.
Es por esto que el Ahr juega un papel clave en la regulación inmune y que los ligandos ambientales Ahr pueden comprometer significativamente la inmunidad mediante la alteración de desarrollo y la función de los linfocitos Ahr-dependientes.
Se ha caracterizado los efectos de la infección por El virus BK (BKV) en leucemia promielocítica nucleares PML-RN en su huésped natural, las células RPTE. Los resultados muestran que la infección por BKV provocó una reorganización radical de la LMP-RN, con una disminución en el número PML-NB y un aumento de tamaño. Además, tanto hDaxx y SP100 se encontraron dispersos de PML-RN. Esta reorganización requiere BKV la replicación del ADN, los BKV focos de ADN se encuentran adyacentes a PMLNBs durante la infección tardía. Más importante aún, se presenta evidencia de que la reorganización de la PML-RN es una estrategia que BKV utiliza para desactivar las funciones intrínsecas antivirales de la LMP-RN. En él se ha desarrollado un sistema de cultivo celular en células primarias de RPTE humanos analizar la infección BKV. (Jiang et al., 2011)
BKV crece analíticamente en estas células, y la morfología de las células infectadas por BKV es similar a la observada en PVAN los riñones del paciente. Este sistema proporciona un primer paso hacia obtener una imagen completa del ciclo de vida BKV. Para definir los factores virales responsables de esta reorganización, se analizó la localización celular del antígeno del tumor de grandes BKV (TAG) y el ADN viral. TAG colocalizó con PML-RN durante la infección temprana, mientras que un número de cromosomas BKV fueron junto a la PML-RN durante la infección tardía. Se demostrado que esta por sí sola no era suficiente para reorganizar PML-RN y que la replicación del ADN viral activa se requiere. Derribo de la proteína PML no afectan de manera dramática el crecimiento BKV en el cultivo. Sin embargo, fue capaz de rescatar el crecimiento de un virus simple del herpes ICP0 nulo un mutante cuyo crecimiento defectuoso se debe en parte a su incapacidad para alterar PML-RN. Se tiene la hipótesis de que las funciones de antivirales de la LMP-RN se inactivan través de la reorganización durante el funcionamiento normal infección de BKV. (Jiang et al., 2011)
Anticuerpos específicos del factor de virulencia derivados de la vacunación o empleados como agentes terapéuticos representan un potencial de defensa contra las enfermedades bacterianas. Los resultados obtenidos describen por primera vez recombinante derivado de los anticuerpos monoclonales contra SEB que poseen alta afinidad y especificidad de destino, y el potencial terapéutico para superantígeno shock inducido por tóxicos. Estos anticuerpos prevenir la intoxicación por toxina interfiere con la unión a MHC II y / o TCR. Además de las aplicaciones potenciales para el tratamiento del síndrome de shock tóxico, los anticuerpos monoclonales humanos reconociendo SEB u otros superantígenos bacterianos puede ser útil si se emplea como tratamiento complementario con antibióticos en el tratamiento de infecciones por S. aureus difícil. (Larkin et al., 2010)
Por ejemplo, una combinación de antibióticos y de inmunoglobulinas fue defendida previamente para la lucha contra las infecciones de S. pyogenes. Este paradigma puede ser eficaz contra la meticilina, así como la vancomicina, las cepas resistentes de S. aureus, ya que muchos aislados en los Estados Unidos producen superantígenos diversos que incluyen SEB y SEC. Otros enfoques terapéuticos basados ??en anticuerpos se han sugerido para el tratamiento de las infecciones por S. aureus. (Larkin et al., 2010)
Por ejemplo:
un estudio de fase II que emplea un humanizado IgG1 orientación S. aureus factor aglutinante A (ClfA, una proteína de unión a fibrinógeno) dio lugar a una buena tolerancia por los pacientes y prometedores resultados clínicos preliminares. Una preparación IgIV utilizado clínicamente en los recién nacidos contiene anticuerpos contra los componentes de la superficie microbiana que reconocen. (Larkin et al., 2010)
Además de la caracterización in vitro de los anticuerpos monoclonales, los ensayos biológicos consisten en un cultivo de células humanas fueron utilizados para predecir los efectos fisiológicos (es decir, neutralizar la toxina) los efectos de cada anticuerpo. Los dominios Fc añadido a Fab 1 y 3 tuvieron efectos mínimos sobre la IC50 en cultivos celulares, mientras que nativos de larga duración Mabs 9 y 10 dio lugar a la inhibición mucho mayor en comparación con sus homólogos de Fab. (Larkin et al., 2010)
Por último, los anticuerpos policlonales se mezclaron de sueros humanos y se utilizan actualmente para el tratamiento de diversas enfermedades como el síndrome de Kawasaki, colitis por Clostridium difficile, virus respiratorio sincitial, citomegalovirus, neuropatías crónicas dysimmune, neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica polyradiculo, y la poliarteritis nodosa. (Larkin et al., 2010)
Estos productos IgIV, naturalmente, varían en potencia de proceso por lotes, representan un riesgo potencial para la transmisión de agentes infecciosos, y los mecanismos de acción generalmente no son bien caracterizado. Recombinante por ingeniería monoclonal humano anticuerpos dirigidas a los factores de virulencia específicos, tal como se presenta en este estudio, evitar muchas de estas preocupaciones. (Larkin et al., 2010)
Otros enfoques terapéuticos basados ??en anticuerpos se han sugerido para el tratamiento de las infecciones por S. aureus. Por ejemplo, un estudio de fase II que emplea un humanizado IgG1 orientación S. aureus aglutinación factor A (ClfA, una proteína de unión a fibrinógeno) dio lugar a una buena tolerancia por los pacientes y prometedores resultados clínicos preliminares. Una preparación IgIV utilizado clínicamente en los recién nacidos contiene anticuerpos contra los componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas adhesivas de la matriz (MSCRAMM) que se encuentran en los S. aureus y Staphylococcus epidermidis. En particular, las proteínas de unión del fibrinógeno y ClfA SDrG (S. epidermidis proteína repetir serina-aspartato G) son reconocidos por la IgIV. Es concebible que una combinación de bien caracterizados anticuerpos monoclonales humanos orientación toxina de S. aureus (s) y antígenos de superficie puede ser una más útil para el tratamiento de inmunoterapia las infecciones por S. aureus. (Larkin et al., 2010)
Las líneas celulares continuas humanas derivadas de tumores sólidos se utilizan a menudo para explorar las alteraciones biológicas y funcionales de las células tumorales, la infección por Mycoplasma hyorhinis puede jugar un papel importante en el cultivo de líneas celulares de cáncer de colon humano que da lugar a considerable aumento de la fracción celular de células madre del cáncer CSC y se caracteriza por la expresión de CD133 (Mariotti et al., 2010).
Es bien conocido que el micoplasma puede tener efectos adversos en los cultivos celulares, tales como alteración en los niveles de proteínas y de ARN y síntesis de ADN, la inducción de aberraciones cromosómicas, cambios en la composición de la membrana celular y la modificación de lamorfología celular (Drexler y Uphoff, 2002 citados por Mariotti et al., 2010). Es por esto que los métodos para la detección, eliminación y prevención de la contaminación deben ser incluidos en el panel básico de técnicas de investigación CSC (Mariotti et al., 2010).
En cuanto a las células T reguladoras (Treg) y los mastocitos (MC) que generalmente son abundantes en el cáncer colorrectal (CCR) se puede observar que la interacción entre estos dos es conocido por promover la inmunosupresión o la pérdida de funciones de las Treg y la autoinmunidad (Blatnera et al., 2010).
El aumento de la respuesta inmune anti-tumoral a través de agotamiento o la inactivación de Treg es una opción terapéutica atractiva para el tratamiento del cáncer (Blatnera et al., 2010).
las células T activadas autólogas también ejercen un efecto anti-crónico de células B de leucemia linfática in vitro e in vivo, la leucemia linfocítica crónica (LLC) se deriva de la acumulación de antígeno (Ag) y se asocia con anormalidades inmunológicas graves, tales como hipo-gammaglobulinemia, la discapacidad inmunoglobulina (IgE) la formación de cambio de clase y la disminución de centro germinal, todos los cuales aumentan la susceptibilidad a las infecciones bacterianas (Di Ianni et al., 2009).
La mayoría de los tumores sólidos contienen muchas células no malignas, incluyendo las células inmunes y células endoteliales, que son importantes en la inflamación. Las células inflamatorias proporcionan proteasas que facilitan la invasión tumoral y la remodelación de la matriz. (Huang, 2002 Citado por Shiau et al., 2010). Kallistatin es un inhibidor de la proteasa serina que ejerce una gran variedad de efectos biológicos en las respuestas fisiológicas y patológicas, como la regulación de la presión arterial, inflamación y anti-angiogénesis. Kallistatin puede prevenir la respuesta inflamatoria al reducir la acumulación de macrófagos (Chao, 2006 citado por Shiau et al., 2010).
La entrega kallistatin gen puede ser lograda mediante la administración sistémica de los vectores lentivirales que lleven el gen kallistatin y asi la expresión del gen puede inhibir el crecimiento del tumor y mejorar la supervivencia en modelos murinos. Al tomar ventajas de los efectos anti-angiogénicos y anti-inflamatorio de kallistatin (Shiau et al., 2010).
Las células madre debido a sus funciones inmunomoduladoras, mesenquimales (MSC) tienen un gran potencial en aplicaciones clínicas para prevenir el rechazo en el trasplante de órganos y prevenir la enfermedad injerto contra el huésped en células madre hematopoyéticas (TPH). Dado que las células dendríticas (DC) juegan un papel importante en la modulación de diversas T respuestas de las células, incluyendo el rechazo y la enfermedad del injerto contra el huésped
Estudios recientes han investigado si las CMM modulan la diferenciación de CC del CMH y si este efecto podría ser uno de los mecanismos de inmunidad MSC "funciones-modulación.
los resultados demuestraron que la diferenciación de las CMH en países en desarrollo maduro se inhibe en presencia de MSC.
frecuencias similares de los precursores dendríticas en los cultivos, ya sea con o sin MSC, sugiere que la inhibición de MSC en la diferenciación de los países en desarrollo maduro de HSC puede ser debido a la detención de la maduración en la etapa precursora dendríticas.
Los niveles reducidos de AMP cíclico, monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y b-catenina en las células DC, se detectan, lo que sugiere que la inducción de la apoptosis y la inhibición de la diferenciación podría ser la base para la inhibición de los países en desarrollo maduro de HSC por MSC.
Conclusiones
La aplicación del cultivo de células animales dentro de la biotecnología se ha incrementado en los últimos años ya que las ventajas ofrecidas por éste son permitir el plegamiento correcto, brindar una glicosilación compleja adecuada y totalmente relacionada con la actividad farmacológica y en el caso de su producción, secretar los productos al medio de cultivo.
En la actualidad, estas ventajas permiten hacer del cultivo de células un sistema competitivo a nivel productivo en los países desarrollados ya que por medio de él es posible obtener vacunas, anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes cuyo valor agregado es considerable. En México, debido a la apertura por parte de las empresas farmacéuticas para la generación de productos de origen biotecnológico es necesario brindar información básica a la comunidad farmacéutica del desarrollo de este tipo de cultivos a lo largo de la historia así como de su clasificación y usos más importantes, para facilitar la comprensión de procesos farmacéuticos que utilicen este tipo de sistemas.
Referencias
Blatnera NR, Bonertza A, Beckhove P, Cheonc EC, Krantzc SB, Strouchc M, Weitzd J, Kochd M, Halversonc AL, Bentremc DJ, Khazaiea K, (2010), In colorectal cancer mast cells contribute to systemic regulatory T-cell dysfunction, PNAS, vol. 107, no. 14
Di Ianni M, Moretti L, Terenzi A, Bazzucchi F, Del Papa B, Bazzucchi M, Ciurnelli R, Lucchesi A, Sportoletti P, Rosati E, Marconi PF, Falzetti F, Tabilio A, (2009) Activated autologous T cells exert an anti-B-cell chronic lymphatic leukemia effect in vitro and in vivo, Cytotherapy, Vol. 11, No. 1, 86_96
Jiang, M., P. Entezami, M. Gamez, T. Stamminger, and M. J. Imperiale. 2011. Functional reorganization of promyelocytic leukemia nuclear bodies during BK virus infection. mBio.00281-00291.
Jones CN, Lee JY, Zhu J, Stybayeva G, Ramanculov E, Zern MA, Revzin A, (2008), Multifunctional protein microarrays for cultivation of cells and immunodetection of secreted cellular products, Analytical Chemistry, Vol. 80, No. 16.
Larkin EA, Stiles BG, Ulrich RG (2010) Inhibition of Toxic Shock by Human Monoclonal Antibodies against Staphylococcal Enterotoxin B. PLoS ONE 5(10): e13253. doi:10.1371/journal.pone.0013253
Mariotti et al.: The percentage of CD133+ cells in human colorectal cancer cell lines is influenced by Mycoplasma hyorhinis infection. BMC Cancer 2010 10:120.
Monath, T. P., Fowler, E., Johnson, C. T., Balser, J., Morin, M. J., Sisti, M., et al. (2011). An Inactivated Cell-Culture Vaccine. The new england journa l of medicine , 1326-33.
Shiau et al., (2010) Inhibition of experimental lung metastasis by systemic lentiviral delivery of kallistatin. BMC Cancer, 10:245.
Sukupolvi-Petty S, Austin SK, Engle M, Brien JD, Dowd KA, Williams KL, Johnson S, Rico-Hesse R, Harris E, Pierson TC, Fremont DH, Diamond MS. Structure and Function Analysis of Therapeutic Monoclonal Antibodies against Dengue Virus Type 2. J Virol. 2010,9227-9239.
Tavira, C. A., Ortega, A., González, I. D., Estrada, S., & Meneses, A. (2009). Alcances y Perspectivas del Cultivo de Células. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas , 35-46 .
Autor:
Luz Geidy Yanes Chavez1
Estudiantes de Biotecnología , semestre A de 2011
Departamento de Biología, Universidad del Tolima, Ibagué, Colombia,
Facultad de Ciencias