Artropovacuna

Resumen

Se plantea la posibilidad de utilización de material embrionario de artrópodo para la inducción en mamíferos (incluidos los humanos) de anticuerpos capaces de reaccionar con los "antígenos ocultos" de los artrópodos patógenos .

La actual lucha contra las enfermedades transmitidas artrópodos, está muy limitada por la dificultad de encontrar una solución eficaz de profilaxis y el tratamiento en su caso las medidas de control en la mayoría de los casos son caras, de difícil despliegue y aplicación. Cualquier progreso en este ámbito de control de enfermedades transmitidas por vectores y / o causados por artrópodos por pequeña que pueda parecer, puede representar a salvar muchas vidas humanas y prevenir el sufrimiento así como reducir causando graves pérdidas económicas en el ganado y en las mascotas domesticas.

Identificación y delimitación del problema

La evolución de los Artrópodos durante millones de años, les ha permitido conquistar los más diversos medios adaptándose a una gran variedad de hábitat ,gracias al perfeccionamiento de mecanismos ,funciones y órganos ( locomoción, protección externa y exoesqueleto, ciclos evolutivos, diversidad, órganos sensoriales ,adaptación digestiva etc.)

Uno de los más eficientes y sofisticados supuso la ocultación de los elementos que antigénicamente pudieran ser más vulnerables a las defensas inmunitarias de los hospedadores y en concreto al tubo digestivo y otros órganos de los artrópodos hematófagos a este respecto, cabe destacar el desarrollo del exoesqueleto de quitina. Una protección externa inerte, casi neutra desde el punto de vista antigénico, con múltiples adaptaciones a cada circunstancia. Un mecanismo casi perfecto para conseguir ocultar dichos antígenos.

Es un hecho conocido que la naturaleza economiza sus recursos de forma efectiva durante un proceso evolutivo y que si un elemento, estructura, función u órgano resulta eficiente y supone un avance en la adaptación , éste es conservado y /o perfeccionado en el tiempo , permaneciendo prácticamente inalterable mientras se mantengan las circunstancias que la motivaron. Así, los patrones estructurales en tejidos , órganos y funciones se repiten de forma casi invariable en todo el reino animal y muy especialmente en el de los artrópodos, como ponen de manifiesto fósiles desde el Triásico 225 a 195 millones de años .Jurásico de 195 a 140 m.a. Cretácico de 140 a 65 m.a. Terciario de 65 m.a. a nuestros días.

Esta premisa se considera fundamental a la hora de afrontar el estudio de la respuesta inmune que como defensa los hospedadores puedan desarrollar contra los artrópodos.

En el momento que los artrópodos perfeccionaron un mecanismo por el cual en muy pocas circunstancia dejaban expuesto sus elementos antigénicamente detectables ante las defensas de los hospedadores ,consiguieron un gran salto evolutivo al poder utilizar como recurso alimenticio de alto valor nutritivo la sangre y tejidos de los vertebrados superiores.

Partiendo de la imposibilidad que tiene un hospedador de detectar antígenos de los artrópodos parásitos se puede comprender cómo éstos se sienten vulnerables y prácticamente indefensos a la acción de los mismos ya sea de forma directa (mecánica) o por hemofagia. con la consiguiente patogeneicidad en sus diferentes manifestaciones de morbilidad, mortalidad, perdidas productivas, económicas, etc.

Antecedentes

La lucha actual contra las enfermedades trasmitidas por artrópodos, se encuentra muy limitada tanto por la dificultad de encontrar profilaxis efectivas y tratamientos adecuados como medidas de control que la mayoría de las veces son caras, de difícil implantación y aplicación , otras veces lesivas para el medio ambiente y en general inaccesibles a las economías más desprotegidas.

Se han abierto nuevas líneas de investigación y se están aplicando métodos novedosos en el control de artrópodos como ectoparásitos . Entre los métodos de lucha y control actualmente en uso merece especial atención:

Control químico :

Además de los plaguicidas clásicos ( organoclorados, organofosforados ,carbamatos, piretroides, formamidinas , ivermectinas etc) se están utilizando nuevas moléculas que inhiben o afectan a la nutrición o a las células excretoras en los diversos estadios ., productos químicos que dificultan la aparición de resistencias etc.; en general caros y poco accesibles a las economías mas deprimidas, generan a la larga resistencias y lesivos para el medio ambiente

Control biológico:

Se están utilizando vacunas contra garrapatas Boophilus microplus en Australia (Tick Gard 1989 donde la proteína BM86 aislada del intestino de la garrapata, fue expresada en Escherichia coli .

Este antígeno permanece en forma natural "oculto" al sistema inmunológico del animal, o sea, no juegan ningún papel en la interacción hospedero-parásito para inducir de forma artificial la inmunidad del hospedador (Willansed y Kemp, 1988).

Según Rodríguez (2000), la ventaja de usar antígenos ocultos está en evitar los principales mecanismos que posee el parásito para evadir la respuesta inmune del hospedador. La falta de contacto entre los antígenos ocultos y el sistema inmunológico permite que los parásitos no desarrollen estrategias para escapar a la acción de una repuesta contra ellos, esto los hace especialmente atractivos para el diseño de vacunas contra ectoparásitos (Rodríguez, 2000).

Posteriormente, investigadores cubanos, empleando básicamente la misma tecnología pero expresando la proteína en la levadura Pichia pastoris, produjeron una vacuna denominada Gavac ® (CIGB,Cuba), la cual tiene registro para su aplicación en varios países de Latinoamerica como Colombia, Bolivia, Brasil, México, además de encontrarse en fase de registro en otros países de la región (Valdés et al, 2005).

Los anticuerpos específicos contra éste antígeno que se obtienen en los animales vacunados, junto con otros componentes como el complemento, son ingeridos por las garrapatas junto con la sangre; esto favorece que los anticuerpos se unan al antígeno provocando el daño intestinal y el paso de las sustancias a la hemolinfa del parásito. Ello resulta finalmente en la reducción del número de garrapatas que completan el ciclo biológico y se afecta la fertilidad de los parásitos resultantes.

Por lo tanto el resultado fundamental de este inmunógeno no será la muerte directa de la garrapata en una sola generación, sino el control progresivo del número de garrapatas en generaciones sucesivas mediante la reducción de la capacidad reproductiva de éstos parásitos (Valdés et al, 2005).

Otra formulación que se ha venido desarrollando es la TickVac MK, la cual emplea un antígeno crudo obtenido de la totalidad de la proteína natural de larvas de B. microplus (Betancourt et al, 2004).

También estudios muy interesantes como se ha puesto de manifiesto en trabajos donde se estudia el efecto de la alimentación de Stomoxys calcitrans (Díptera Muscidae)con sangre de Bos Taurus inmunizado con antígenos ocultos de la mosca del establo, sobre la oviposición 2007 (Carlos Ramón Bautista Garfias / Ana Patricia Martín Flores / Isabel Giles hernandez) Universidad Nacional Autónoma de México.

Trabajos similares se han efectuado con la pulga Ctenocephalides felis felis (Heart AW y col 1994….

Mosca lucilia cuprina y la mosca del cuerno Haematobia irritans

(Bautista GR,

y col. 2004……

Control genético:

Mediante la selección de animales que presentan una mayor resistencia natural p.e. Cebú

Benavides, E. 1.988. Selección de animales resistentes a enfermedades .Alternativa Genética para el futuro. Revista Nacional de Zootecnia. Volumen V- No. 28.

Villar,C. 1.991. La resistencia natural de los bovinos a los parásitos una alternativa de control. ICA.

Villar, C. 1.997. Sostenibilidad utilizando ganados criollos dentro de estrategias de control de parásitos. Disertación. Corpoica. Tibaitata.

Control físico o natural :

Actuando sobre el medio ambiente ,dificultando el normal desarrollo o interfiriendo en cualquier etapa del ciclo evolutivo del artrópodo a combatair , p.e desecación de charcas y zonas húmedas, control de pastos y viviendas , barreras físicas como mosquiteras o repelentes de tipo físico

Control integrado:

Se ha comprobado que ninguno de los métodos explicados anteriormente, aplicados de forma aislada, resulta totalmente eficaz en el control de los ixódidos (de Moura Souza et al, 2005; Ortiz y Franco, 2005). Polanco (2001) refiere que sólo un tratamiento integrado donde se combinen armónicamente los diferentes métodos, resulta verdaderamente efectivo en el control de estos ectoparásitos, lo que puede ser aplicado a la mayor parte de los artrópodos causantes de enfermedades.

HIPÓTESIS :proponemos la siguiente hipótesis de trabajo.

Considerando que los Artrópodos comparten un origen filogenético común y que presentan estructuras y órganos que se han mantenido casi invariables durante su historia evolutiva desde hace millones de años hasta nuestros días (José Luis Nieves-Aldrey y Félix Manuel Fontal-Cazalla

Utilizando como inmunógeno material embrionario de otra especie de artrópodo es posible inducir en el hospedador una respuesta inmune eficiente contra los antígenos ocultos de ectoparásitos patógenos.

El único material que en principio podría ser susceptible de un ataque inmunitario por parte del hospedador hacia los artrópodos serían los "Antígenos ocultos" presentes en el epitelio de diferentes estructuras internas (aparato digestivo ,excretor o reproductivo) de éstos.

Las dificultades metodológicas que se deben afrontar son las siguientes.

1) Existencia del exoesqueleto quitinoso que dificultaría la respuesta del sistema inmune del hospedador a los antígenos del parásito.

2) Obtención de una cantidad suficiente de material biológico para inducir la inmunización del hospedador.

3) Necesidad de conseguir epitelio de cada especie para producir una respuesta inmune específica . Su cultivo in vitro resultaría difícil y costoso

4) Posibilidad de que determinados antígenos provoquen en el hospedador reacciones adversas que podrían desarrollar choque anafiláctico.

5) Posible contaminación de los antígenos con elementos patógenos (virus, bacterias, protozoos etc).

La estrategia que se propone consideramos que podría superar las dificultades anteriormente expuestas y además cumpliría 2 requisitos de gran importancia social y económica:

a) Sería asequible para la mayoría de la población de forma fácil , masiva , libre y gratuita tanto para su aplicación en personas como en animales .Como objetivo de bienestar global , sin estar sujeto al control exclusivo de las multinacionales farmacéuticas.

b) Serviría para proteger contra diferentes especies de artrópodos patógenos con relevancia medica, independiente-mente del área geográfica y situación socio-económica de la población afectada.

En la actualidad no existe ninguna terapia similar a la propuesta e salvo los casos que reseñamos como antecedentes que son de utilización limitada a las especies mencionadas.

JUSTIFICACIÓN

Cualquier avance en este campo del control de enfermedades trasmitidas por vectores y /o provocadas por artrópodos por pequeño que parezca , puede representar salvar muchas vidas humanas y evitar sufrimiento así como evitar o disminuir las graves perdidas económicas que provocan en la ganadería sobre los animales domésticos.

Metodología

FUENTE DE ANTIGENOS EMBRIONARIOS

Utilización de material embrionario obtenido a partir de huevos de la mariposa de la seda (Bómbix morís) . Dado que la producción de dicha especie se encuentra perfectamente estudiada y estandarizada , no requiere grandes desembolsos económicos , es asequible a cualquier economía y teóricamente permite obtener grandes cantidades de dicho material.

El material necesario para la inmunización se podría obtener tanto de explotaciones industriales de sericultura como mediante su colecta en pequeñas explotaciones de sericultura en áreas deprimidas , sin recursos económicos .

Los gusanos serán alimentados con hojas de morera y se mantendrán en condiciones idóneas de humedad e higiene.

Los capullos serán retirados a medida que se vayan formando y colocados en una caja adecuada para la eclosión de las mariposas . Las mariposas se pasarán a otra caja de plástico en cuya base se colocarán laminas de platico transparentes , Una vez terminada la cópula y realizada la oviposición. las láminas con los huevos correspondientes a ese día se marcan con rotulador y pasan a una caja de para su maduración dependiendo del día ( D) donde se consiga la mayor formación de material embrionario inespecífico , o sea las tres capas germinativas antes de que se formen órganos concretos ni procesos de queratinización. Suele coincidir con el cambio de coloración del huevo fecundado de amarillo claro a pardo.

Llegados a este punto se guardan en refrigeración para parar la embriogénesis hasta conseguir reunir la cantidad de huevos deseada.

Una vez recolectado todos los huevos en el punto de maduración determinado se procede a extraer el Antigeno ( FC fracción celular completa ) según se especifica más abajo.

OBJETIVOS DE EXPERIMENTACIÓN

Caracterización y uso de los antisueros (según metodología de Trujillo y Saettler (1981). ) en :

• 1. Titulación de los sueros inmunes mediante ELISA indirecto usando como antígeno los extractos de huevo de la mariposa de la seda utilizados en la inmunización.

• 2.  Estudiar mediante técnicas de ELISA la reacción de los sueros inmunes con extractos de diferentes tejidos de los artrópodos parásitos por ej. tubo digestivo de garrapata, pulga y mosquito.

• 3. Identificación tisular de la reacción antígeno anticuerpo mediante técnicas de Inmunofluorescencia en distintos tejidos y órganos de los artrópodos parásitos.

• 4. Comprobar la unión de los anticuerpos a los antígenos del tracto digestivo y otros órganos de artrópodos parásitos alimentados con sangre de los mamíferos (conejos) inmunizados. Esto se hará mediante una técnica conocida como "inmunocitoquimica incompleta", esto es, una técnica inmunocitoquimica convencional en la que se omite la incubación con el anticuerpo primario porque la interacción antígeno-anticuerpo se ha producido "in vivo".

• 5. Estudio del efecto de los anticuerpos sobre la fisiología de artrópodos hematófagos.

• 6. Comprobar que la utilización de material embrionario como origen de los diferentes estructuras internas susceptible de interacción inespecífica Ectodermo ,Mesodermo y Endodermo( Aparato digestivo Estomodeo ,Mesenterón y Proctodeo ) , Sistema excretor ( Tubos de malpighi) , Aparato reproductor ( Espermateca) y Sistema glandular (Glándulas salivares .) genera una respuesta inmunitaria ( producción de Inmunoglobulinas G ) en mamíferos

• 7. Comprobar que efecto produce una inmunización activa con dicho producto sobre animales que sufren la acción de Ectoparásitos.

Sospechamos que en unos casos los anticuerpos actuarían hipotéticamente a nivel del tubo digestivo ( anterior -estomodeo , medio –mesenterón o el posterior -proctodeo ) sobre los epitelios libre o expuestos en los que no estén desarrollada una membrana peritrófica (de tipo mucilaginoso-protectora) o cuticular en otros casos , como sucede en los diferentes especies, provocando : daño en dicho epitelio de revestimiento a estos niveles , indigestiones o procesos de aceleración del transito intestinal con la consiguiente malnutrición. En otros casos se espera que los antígenos ocultos se encuentren en órganos como el aparato reproductor y sean afectadas las espermatotecas ,oviductos ,glándulas accesorias o incluso ovarios y la consiguiente merma en la oviposición . Pudieran ser afectadas las glándulas salivales provocando procesos de obstrucción o estrechamiento de los conductos excretores dificultando la secreción de sustancias relacionadas con la lubricación de las diferentes piezas bucales , de sustancias analgésico-anestésicas o de anticoagulantes etc.

No se descarta un posible efecto REPELENTE sobre los artrópodos que puedan detectar de alguna manera mediante sus potentes quimiorreceptores (olfativos y gustativos ) que ese hospedador pueda representar un riesgo por las causas anteriormente expuestas. Se sabe que ciertos animales son más resistentes que otros a sufrir los efectos ( picadura , fijación, etc.) y se sospecha que sea debido al rechazo que provoca (repelencia) sobre el vector en cuestión el cual detecta que esa posible fuente de alimentos no es del todo adecuada ya sea por haber tenido un contacto previo o por un efecto de "repugnancia" al mismo.

Realizaremos este estudio en vertebrados superiores con especial afectación por : pulgas , garrapatas , ácaros auriculares en gatos o perros y sarna demodésica u otras en perros y mosquitos culicoides en équidos como posibles causantes de las " rasquiñas"

• 8. Comprobar según el diseño y el protocolo de la investigación en los diferentes lotes de animales (sujetos de la aplicación) y atendiendo a las variables establecidas si los efectos producidos se ajustan a los esperados.

• 9. Comprobar mediante la titulación de anticuerpos las distintas respuestas a los casos anteriores. Para tal fin se utilizaría un método ELISA ( ensayo inmunoenzimático indirecto) para determinar el titulo de anticuerpos anti-material embrionario del gusanos de seda BÓMBIX MORI obteniendo suero de los animales inmunizados el día 60 postinmunización con antigenos embrionarios ,suero de conejo anti IgG de las diferentes especies a estudiar (canino , felino, equino) conjugado con peroxidasa y ortofenilendiamina como sustrato . La lectura se efectúa con un lector de ELISA utilizando un filtro de 492nm.

• 10. Aplicar técnicas de Inmunofluorescencia sobre cortes histológicos de diferentes especies de artrópodos ( garrapatas, pulgas, mosquitos) alimentados con sangre de animales inmunizados y comprobar que dichas inmunoglobulinas se fijan a los antígenos del epitelio de los distintos "órganos dianas" de estos .

Comprobar en estudios posteriores mediante técnicas de inmunocitoquimica (Proteína A-oro) en microscopía electrónica los puntos exactos de donde dichas IgG actúan a nivel histológico.

OBJETIVOS APLICATIVOS.:

Si como resultado de las investigaciones se obtienen los resultados esperados o satisfactorios.

Se plantea en definitiva la utilización de dicho material inmunógeno para su implantación en todos los ámbitos que se requiera (uso en animales y personas )

Para ello por una parte la obtención de grandes cantidades LIOFILIZADAS producidas en explotaciones de alto rendimiento y su posterior aplicación como

• 1- Vacunación normal con o sin adyuvantes por vía subcutánea

• 2-  Mediante un sistemas de fácil manejo , almacenamiento, distribución y aplicación de dicho producto para su utilización por otras vías como la nasal ,conjuntival o percutánea ( por frotamiento /excoriación) , pensando en los países donde los medios económicos no permitan el uso extra de ( jeringuillas, agujas, frigoríficos, personal sanitario etc)

O en zonas endémicas o enzoóticas de economía muy deprimida se plantea la posibilidad de obtener macerado fresco total de huevos embrionados a partir de la producción en pequeñas explotaciones, que podrían crearse en aldeas y utilizando para su conservación un producto tan natural como la miel para su aplicación por vía percutanea previa frotamiento/escoriación de la piel

Estudio de las variables

Dependientes del material inmunógeno

• 1. Tipo de material : se plantean varias opciones

FC ( fracción celular ) : FCC material completa del huevo embrionado : Los huevos de la mariposa de la seda (estadío D idóneo) se homogenizarán a 4ºC en solución salina amortiguadora de fosfatos ( SSAF) a 4ºc y pH 7,2, con antibióticos ( penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100 microgramos/ml y un coctel de inhibidores de proteasas mantenido en agitación durante 1h a 4ºC en un homogeneizador de cristal

O de forma específica las diferentes fracciones : FCE la fracción celular ectodérmica : FCM fracción celular mesodérmica y FCEn fracción celular endodérmica ,que se obtienen por el método de micro centrifugación o ultracentrifugación (se determinará previamente con la utilización de métodos de microscopia y tinción para determinar cual es la fracción más rica en material en cada momento del proceso de embriogénesis atendiendo al ciclo de esta especie durante la maduración del huevo)

C (conservación) :C1 congelación ;C2 liofilizado C3 en miel (solo por via percutanea)

V ( vía de aplicación) : Vsc subcutánea ; Vc conjuntival ;Vn nasal ; Vpc percutanea

D (día) Momento idóneo de su obtención: dado que el periodo embrionario para esta especie Bómbix mori con un ciclo evolutivo completo de 60 días es de unos 7 días a temperatura de 20 a 25 ºC habrá de establecerse el momento donde la concentración celular es mayor, en tal caso se hace necesario un estudio microscópico para establecer el mismo y al mismo tiempo establecer varios lotes identificados como: D3 , D5 y D7 ( día 3 ,5 y 7) por ejemplo.

P peso Cantidad de material estimado para poder tener una respuesta inmunitaria idónea. Habrá de establecerse varios lotes según la cantidad utilizada medida en microgramos de FC fracción celular obtenida ultracentrifugación a 3000 g durante 30 min. Luego de recolectar el sobrenadante (Antig-embrionario) se determina la cantidad de proteínas por el método lowry et al.( Lowry OH, como indicador de la concentración celular d y lo indicaremos como P1, P2 , P3 ( peso 1,2 y 3)

Dependientes del sujeto de aplicación y criterios de inclusión ,exclusión

• 1. Animales domésticos : (ubicados en centros de acogidas por ser vagabundos y de propietarios voluntarios ) perros , gatos ,caballos ; parasitados externamente (ectoparásitos visibles en infestación ponderable a simple vista (pulgas y garrapatas) , por raspado (sarna demodésica en perros) o por frotis auricular ( sarna auricular en gatos o perros ) por lesiones cutáneas (alopecias , eczemas, eritemas , pústulas , descamaciones etc.) , por signos clínicos como rascado, perdidas de peso ,stres ,

Se escogerán los animales más afectados, más sensibles, con mayor numero de manifestaciones clínicas y que vivan en ambientes poco controlados ,con medidas higiénico-sanitarias deficientes. Se ponderará mediante lista de chequeo confeccionada a tal efecto como influye la inmunización del sujeto objeto de estudio en el tiempo ( ensayo longitudinal) y se valorará la mejoría o curación con respecto a la situación inicial o de partida y sin la utilización de tratamientos externos ni cambios en el hábitat o condiciones higiénico-sanitarias. etc) se descartan los más resistentes , tratados con productos antiparasitarios , los que vivan en ambientes controlados y con correctas medidas higiénico-sanitarias .

• 2. Animales de experimentación. ( en animalario del laboratorio) con ambiente controlado de alimentación, temperatura, etc. Ponderándose todas las constantes de forma más exhaustiva. Siendo el objeto de estudio cobayas distribuidas en varios lotes (lote control y otros dependientes de las Variables seleccionadas FC ; C ;P ; V ; D estudiándose los efectos frente a la acción de distintos artrópodos parásitos y principalmente el posible efecto repelente.

Se determinarán los valores significativos resultantes del ensayo por una parte , se procede a la titulación de anticuerpos La IgG se purifican según el método descrito por Butler;18 se comprueba su pureza por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de duodecil sulfato de sodio (SDS)19 y se determina su concentración por los métodos espectrofotómetricos;18 de Lowry y otros20 y del ácido bincinconínico.12 (los anticuerpos secundarios anti-IG de mamíferos están disponible comercialmente por lo que no hay que producirlos, se compran.

Algunas consideraciones sobre las técnicas a utilizar en el ámbito del trabajo de laboratorio con técnicas habituales en inmunología básica

Titulación de los sueros inmunes mediante ELISA indirecto.

Los métodos de inmunización están bien establecidos y, en general, es relativamente fácil obtener anticuerpos específicos contra sustancias inmunogénicas (p.e. proteínas) que son, en general, las que poseen elevada masa molecular. Sin embargo, las sustancias (moléculas neutras, iones, etc.) de masa molecular inferior a 5000 D, tales como aminoácidos, plaguicidas, péptidos, etc., no son inmunogénicas por sí mismas y deben unirse a moléculas portadoras o "carriers" para inducir respuesta inmune, es decir, producir anticuerpos contra ellas. La bibliografía especializada recoge ampliamente estos aspectos.

El método inmunoenzimático (ELISA) para la detección de anticuerpos, se utiliza para la cuantificación de muy pequeñas cantidades de éstos, que habitualmente no son detectables por los métodos convencionales; además esta técnica presenta la característica de una alta especificidad y sensibilidad, así como rapidez, lo que posibilita el estudio de grandes poblaciones en corto tiempo, en forma rutinaria y sencilla

Por otra parte, su cuantificación se basa en la reacción enzima-sustrato que produce un cambio de coloración que se evalúa mediante un espectrofotómetro lo que evita resultados subjetivos.

Por lo general, un esquema que incluya un sonicado de células completas como antígeno en un ELISA indirecto va a tener una buena sensibilidad

Características de las que depende la antigenicidad

-PM: debe ser mayor de 10KD, sin embargo hay moléculas como la de la insulina

( PM:6KD) y el glucagon (PM: 3.8KD) que pueden generar RI si son inoculadas con un adjuvante.

Otras sustancias de bajo PM como es el caso de los haptenos en cambio, deben inyectarse acopladas a una molécula inmunogénica llamada carrier para transformarse así en antigénicas.

Inmunogenicidad de especie: por ej. los polisacáridos neumococcicos son buenos inmunógenos para el hombre pero no para el conejo.

-Relación propio-no propio: para ser inmunógeno, un Ag. no debe pertenecer a la especie animal de la cual se pretende obtener la respuesta inmune hacia él.

–Grupos químicos: – los radicales ácidos o básicos fuertes en las proteínas las hace

mas inmunogénicas (principalmente los ácidos).

– la presencia de aminoácidos como tirosina o fenilalanina, ( la gelatina no los posee y por ello solo es antigénica cuando se inyecta con adyuvante).

-Rigidez de la molécula: las largas cadenas de las moléculas de los hidratos de carbono son fácilmente distorsionables y por lo tanto no generan una buena respuesta inmune. La alta especificidad de los grupos aromáticos en los aminoácidos de síntesis es debida a la rigidez del benceno. A su vez la posición de estos grupos también es significativa para la especificidad dado que los derivados D o L pueden diferenciarse serológicamente.

La mayoría de los antígenos son proteínas de alto PM, con aminoácidos particulares (sobre todo con grupos aromáticos) y estructura definida.

En los hidratos de carbono la antigenicidad esta dada por la condensación de 2 o más grupos de hexosas.

Los ácidos nucleícos se tornan antigénicos sí se les rompe la doble hélice por ej. por calentamiento y enfriamiento rápido.

Los ácidos grasos no son antigénicos pero si los son los lípidos complejos sobre todo los asociados a glúcidos y proteínas ( ej. lipopolisacáridos).

En orden de antigenicidad tendríamos:

1º proteínas

2º hidratos de carbono

3º lípidos ( principalmente fosfo y gluco-lípidos) y ácidos grasos.

En la interacción in vitro de un Ag. con su correspondiente Ac. se distinguen 2 etapas:

1º Interacción primaria: es la mera unión de un Ag. y su correspondiente Ac. No es visualizable directamente y no es demasiado influenciada por la temperatura, la concentración salina o la fuerza iónica ni la agitación. Sólo depende de la complementaridad ya que cuando mayor sea ésta mayores serán las fuerzas de unión

( afinidad) y menores serán las fuerzas de repulsión (ej. repulsión estérica).

Los ensayos inmunológicos basados en la interacción primaria son, por ej. ELISA, RIA (radioinmunoensayo), IF (inmunoflorescencia).

En estos ensayos la visualización del complejo se hace marcando uno de los reactivos

( Ag. o Ac.), con alguna sustancia detectable.

En el caso del ELISA ¡la marcación se realiza con una enzima como por ej. la peroxidasa, de manera que al agregar un cromógeno y el sustrato de dicha enzima, se puede calcular la cantidad de complejos formados midiendo la intensidad del color producido.

 En IF (inmuno fluorescencia) marcamos con una sustancia fluorescente.

Podemos hacerlo directamente sobre un corte de tejido, impronta etc. y la observación se realiza directamente con microscópio de fluorescencia.

También podemos marcar una suspención celular, en cuyo caso la medición se hará por ej. por citometria de flujo, esta técnica se usa actualmente en clínica para cuantificar células inmunes en el monitoreo del HIV,

Todas las técnicas de interacción primaria pueden ser

Directas : marcamos uno de los reactivos del complejo.

Indirectas: la marca estará en un 2º Ac. dirigido contra alguno de los componentes del complejo.Esta es mas sencible que la anterior ya que al aumnetar el tamaño del sistema podemos detectar menores cantidades.

Los tipos de reacciones de precipitación son:

  a) En medio líquido:

Cualitativa: se usa poco ya que existen mejores métodos para detectar presencia o ausencia, además, debido a lo que mencionamos antes sobre la posible existencia de mas de un complejo en la mezcla, para utilizar este método debemos asegurarnos de que uno de los reactivos este puro.

Semicuantitativa: tampoco se usa, constituye un método poco práctico.

Cuantitativa: esta es la primera técnica que permitió medir en masa la cantidad de Ag. o Ac. presente en una solución.

Por ej. queremos medir la masa de Ac. anti proteinas embrionarias de tubo de epitelio de tubo digestivo del gusano de seda en un suero.

Disponemos del polisacárido purificado (esto es importante para asegurarnos de tener un solo sistema reaccionante). Se colocan en una serie de tubos cantidades crecientes del antisuero y constantes del polisacárido, se incuba la mezcla 1hr a 37ºC y luego se centrifuga, lavamos el precipitado para eliminar las proteínas contaminantes y lo resuspendemos, finalmente medimos la cantidad de proteínas por ej. por absorbancia a 280nm. En este caso como el Ag. no es proteico, la medida obtenida corresponderá solo a los Ac. presentes en el suero.

Si ambos reactivos fueran proteicos, el cálculo se haría restando la cantidad agregada del reactivo conocido.

Para obtener la masa debemos tener una curva de calibración: masa de proteína vs DO y, a partir de la DO medida en nuestros tubos, obtenemos la masa incognita.

La medición de DO se realiza en el tubo de máximo precipitado, donde sabemos que todo el Ag. y Ac. presentes formará parte del mismo.   

b) En medio sólido ( precipitación en gel) :

Se usa como soporte de la reacción un gel de manera que las moléculas difundirán libremente a través de él de manera que, a lo largo del recorrido se irá formando un gradiente de concentraciones que hará que en un determinado punto los reactivos se encuentren en su relación de equivalencia, en ese punto se producirá un precipitado que sobre el gel se verá como una nítida banda blanca que permanece estable mientras un mayor flujo de reactantes no provoque su re disolución.

Como se recordara, en la precipitación en medio líquido no era posible distinguir en el precipitado la presencia de más de un sistema reaccionante, en el caso de que las moléculas estén disueltas en un medio gelificante sumamos a los fenómenos de la precipitación, los de la difusión simple, de manera que aquellos complejos cuyos coeficientes de difusión sean distintos formaran bandas en distinta posición. De esta manera podemos resolver la existencia de más de un complejo reaccionante en la mezcla. Sin embargo no podremos separar complejos con igual coeficiente de difusión, y decimos que cada banda que se forme estará compuesta por lo menos por 1 sistema .

Como soporte se usan medios semi sólidos como agar blando (agar 1% en solución salina) agarosa 0,5% etc. Todos aquellos que permitan una libre difusión de macromoléculas.

La precipitación en gel puede ser:

  – Cualitativa: existen diferentes esquemas que nos permiten detectar la presencia de un Ag. o un Ac. (según el caso).

  – Difusión simple monodimensional ( método de Oudin): Se coloca en un tubo de ensayo agar fundido mezclado con un vol. igual del antisuero a analizar (en este caso queremos detectar la presencia de un Ac.)

Se deja solidificar y se añade la solución de Ag., este va a difundir por el agar formando, como dijimos, un gradiente de concentración decreciente hacia el fondo del tubo, significa que en determinada zona Ag. y Ac. alcanzarán la relación de equivalencia, formándose ahí la banda de precipitado.

Se formarán tantas bandas como sistemas haya, siempre que la velocidad de difusión sea distinta para cada uno de ellos.

Se ha intentado utilizar este sistema con fines cuantitativos, ya que la distancia a la que se forma la banda es directamente proporcional a la concentración del reactivo que difunde, entonces mediante distintas fórmulas matemáticas se puede calcular la concentración en función de la distancia recorrida.

– Difusión doble monodimensional ( método de Oakley Fulthorpe): En este caso colocamos en la parte inferior del tubo un vol. de agar 1% fundido, mezclado con un vol. igual del antisuero, dejamos solidificar y agregamos igual vol. de agar 0,5%, dejamos solidificar y por ultimo agregamos agar 1% donde se encuentra disuelto el Ag.

Tanto el Ag. como el Ac. migrarán hacia la zona media de menor concentración, de manera que, otra vez, se formarán gradientes que harán que en deteminado punto los reactivos estén en equivalencia y precipiten.

Vemos acá, que si la concentración de Ag. y Ac. están en relaciones óptimas (equivalentes) la banda se formará en un punto intermedio del tubo, mientras que si, por ej. la cantidad de Ag. esta en exceso necesitará recorrer una mayor distancia para alcanzar una dilución tal que se encuentre en equivalencia con el Ac. y así la banda se formará más cerca del fondo. Lo contrario ocurrirá cuando la cantidad de Ac. sea la que esta en exceso

Difusión doble bidimensional (método de Oüchterlony) : Constituye un método muy completo ya que permite obtener mas información que los anteriores.

Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeñas cantidades de Ag. y Ac.

En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitación cuyas características dependerán de varios factores.

 Igual que en el caso anterior, cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estén cerca de la de quivalencia la banda se formará a mitad de distancia entre ellos.

Además, nos permite tener idea de los PM de cada reactivo ya que al tratarse de una difusión radial, la concavidad de la banda estará hacia el lado del pocillo donde se halla colocado el reactivo de mayor PM, y viceversa, si ambos PM son semejantes la banda será recta.

Por otro lado, la posibilidad de hacer varios pocillos en una placa permite obtener información sobre similitud de los Ag. reaccionantes.

Recordemos que las macromoléculas antigénicas tienen en su superficie zonas llamadas determinantes antigénicos y que son los sitios reconocidos por el Ac.

Así, dos Ag. emparentados ( por ej. dos albúminas de distinta especies) tendrán probablemente determinantes antigénicos comunes a ambos.

Mediante la técnica de Ouchterlony podemos determinar la existencia o no de determinantes comunes entre Ag. según las características de las bandas formadas

La reacción de identidad (I), corresponde a los Ag. que comparten todos los determinantes antigénicos, es decir que estamos ante la misma molécula, en la de no identidad (II), ningún determinante es compartido y por lo tanto son Ag. distintos mientras que en la identidad parcial ( III), hay determinantes en común, o sea que hablamos de Ag. emparentados, esto se ve como un espolón dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. Nótese que en este caso último, ab es una sola molécula