Otra vez nos referimos a un sistema reaccionante con un determinado coeficiente de difusión. En caso de que los sistemas sean varios tendremos también distintas bandas según las velocidades de difusión de cada uno. Esto nos va a permitir determinar la pureza de una solución antigénica, recordando siempre que cada banda corresponderá a, por lo menos, un sistema.
Otra utilidad de este método es la de testear los pasos de purificacion por ej. de una proteína , a partir del material a purificar ( 1) vemos la desaparición de bandas en los distintos pasos, asi el resultante del 1º paso, pocillo 2, presenta una banda menos que el 1, y en el pocillo 3 ya vemos solamente la banda continua correspondiente a la albúmina, es decir que el paso 4 no sería necesario. En el pocillo central debemos colocar un antisuero total que nos revele todas las proteínas del suero a purificar. En este ejemplo será antisuero humano total.
Como control debemos colocar un pocillo con albumina humana purificada para verificar su identidad con la banda presente en el ultimo paso de purificación. La banda de albumina esta representada por la linea continua que rodea el pocillo central.
– Semicuantitativo:En este tipo de pruebas se busca determinar la cantidad de un determinado reactivo .
Cuando la cuantificación es relativa, el resultado depende del método usado, los reactivos empleados etc., entonces hablamos de ensayos semicuantitativos.
En inmunología el resultado de estos ensayos se expresan como "título".
El título se define como la inversa de la última diluc
ión que da resultado positivo.
La metodología empleada consiste en colocar sobre un porta objetos, agar 1,5% en sol. fisiológica y sobre él realizar perforaciones delimitanto pocillos en los que se colocarán los reactivos, uno de ellos en concentración constante y el otro, el que se va a cuantificar, en diluciones crecientes.
Cuantitativo: En estos casos la cuantificación se realiza en masa, es decir que el resultado obtenido no debe variar de una técnica a otra ya que representa una medida absoluta.
La técnica de precipitacion usada en este caso es una difusión simple en placa o inmunodifusión radial ( Mancini ).
Consiste en una placa de agar o agarosa al 3% en solución salina, en el que se encuentra disuelto el Ac.Sobre el agar se realizan perforaciones en las que se colocan las muestras a dosar.
Como mencionamos en párrafos anteriores, la distancia a la que difunde un Ag. hasta alcanzar la relación de equivalencia con su correspondiente Ac. y precipitar, es proporcional a la concentración del mismo. Entonces, cuando los sistemas son equivalentes, aparece alrededor del pocillo un circulo de precipitación.
Debido a que la concentración del reactivo disuelto en el agar es constante, el diámetro del círculo descripto por la banda de precipitación será directamente proporcional a la concentracion del reactivo que difunde.
Para realizar el ensayo, se colocaran en una serie de pocillos cantidades conocidas de un estandar del Ag. a dosar y en los otros la o las muestras incógnitas.
Luego se incuba la placa a temperatura ambiente hasta que el diámetro de los halos no se modifique (48-72 hs).
Se mide el diámetro de los halos y con aquellos correspondientes a los estandares se construye una curva de calibración relacionando la superficie de los mismos (el r2 o d2) con la concentración. Con la medida de los halos de las muestras incógnitas y mediante esta curva, se calcula la concentración de las mismas.
Este método, en el cual el precipitado alcanza su punto de equilibrio y ya no se modifica, constituye la llamada determinación de alta precisión.
Se puede realizar una determinación rápida de orientación en la cual se incuba la placa entre 16 y 20 hs. y se gráfica diámetro vs. log de la concentración de Ag.
Fuente
Inmunología e inmunoquímica. Ricardo Margni.
Tratado de Microbiología. David Dulbecco.
Enzimainmunoensayo (ELISA)
Existen muchas variantes de ELISA y su diseño depende de lo que se quiera determinar. La más comúnmente utilizada es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en una muestra problema, utilizando como conjugado un Ac-antiIg marcado con una enzima. La prueba se realiza en placas de poliestireno de 96 pocillos. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y ésta a su vez será proporcional a la cantidad de Ac que se encuentren en la muestra problema. Se puede estimar a simple vista (cualitativo) o mediante espectrofotometría, expresándose como densidad óptica.
Esta prueba de enzima ligada a un inmunoabsorbente se utiliza principalmente para la cuantificación de la concentración de anticuerpos.
Los ELISA más aplicados en veterinaria son los ELISA directo y ELISA sandwich.
En el ELISA directo se liga un antígeno a los pocillos de la placa o en el ELISA sandwich se liga un anticuerpo monoclonal o policlonal como captura de antígeno. Generalmente en medicina veterinaria son anticuerpos específicos ligados a un ligando sólido que interacciona con el suero problema. Para poner en evidencia esta interacción se adiciona subsiguientemente anticuerpos específicos antiespecie ligados a una enzima que puede ser una peroxidasa o una fosfatasa. Para que la enzima actúe y pueda ser revelada se le adiciona un sustrato adecuado. Posteriormente se realiza la lectura midiendo las densidades ópticas en un lector de ELISA. En cada placa se colocan controles del sistema y controles positivos y negativos de absorbancia conocida.
Un gran número de pruebas ELISA han sido desarrolladas tanto para humanos como para las diferentes especies animales. Las principales ventajas de estos métodos son su flexibilidad que lo hacen ajustable a los niveles de sensibilidad, especificidad y discriminación necesarios a cada situación en particular, así como su uso para muchas otras enfermedades. Diversos antígenos han sido ensayados: células enteras, sonicados, LPS, proteínas, entre otros.
Inmunohistoquímica (IHQ) e Inmunocitoquímica (ICQ)
Cuando el ELISA se realiza sobre cortes de tejidos o células, se denomina inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, respectivamente. Estas pruebas se realizan sobre tejidos o células de manera similar a las IF, y pueden ser directas o indirectas. En el último caso, el conjugado es una Ig marcada con una enzima que convierte un sustrato incoloro en un producto de reacción coloreado. Esta prueba se lee con microscopio de luz, observándose una reacción positiva como un precipitado de color sobre las estructuras histológicas que contengan el Ag buscado.
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Autor:
Antonio Carmona Vega
Frco. Javier Romero Sanchez
LEMA: ARTROPOVACUNA UN NUEVO ENFOQUE EN EL ESTUDIO DE LA PROTECCIÓN HUMORAL DE LOS VERTEBRADOS SUPERIORES CONTRA LOS ARTROPODOS CAUSANTES DE ENFERMEDADES
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
NOVIEMBRE 2008
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