Experimentos recientes han demostrado que existe una interacción física entre el core y el dominio SH2 de la proteína STAT1 perteneciente a la vía de señalización del IFN tipo I, por lo que se dificulta la transducción de la señal generada por esta citoquina así como un componete esencial en la respuesta antiviral (Lin y cols., 2006).
Las glicoproteínas de la envoltura del virus son comúnmente halladas en asociación transiente con dos tipos de chaperonas (y asociadas a oxidorreductasas):GRP94 y GRP78 (calnexina/calreticulina) con ERp57 y BiP junto a PDI (Oliver y cols., 1999; Molinari y Helenius, 2000). Además, se ha observado que la proteína E2 está más estrechamente unida a la GRP78. Dada la sobreexpresión de esta chaperona, la cual es un censor del estrés en el RE, se ha observado un decremento de la sensibilidad de las células a la apoptosis inducida por linfocitos T citotóxicos CD8+ (LTC); esta actividad de E2 puede estar involucrada en la patogénesis de enfermedades inducidas por el VHC (Dubuisson y Rice, 1996). Adicionlamente, fue mostrado que E2 interactúa con la proteína quinasa inducida por interferón (PKR) y activada por ARN de doble cadena. El dominio de fosforilación homólogo (12 aminoácidos) de PKR-eIF2α(factor de iniciación de la traducción) en E2 parece estar involucrado en esta interacción (Taylor y cols., 1999). Este dominio fue esencial para el bloqueo de la habilidad inhibitoria de la replicación viral de PKR, sugiriendo que la interacción de E2 con PKR puede estar relacionada con la resistencia viral al IFN.
La presión inmunitaria sobre las glicoproteínas E1 y E2, especialmente la región hiper varianble 1 (RHV 1) causa mutaciones y cambios radicales antigénicos que permiten evitar la inmunovigilancia (Hoofnagle, 2002). Tanto es así, que se plantea que la tasa de mutación de la RHV 1 disminuye cuando el hospedero es inmunodeficiente o está inmunosuprimido (Kato, 2001). La variabilidad de las secuencias de E2/ NS1 ha sido asociada con el recrudecimiento de la hepatitis y la resistencia a la terapia con IFN (Enomoto y cols., 1994). El tratamiento con IFN pudiera acentuar las presiones selectivas inmunitarias normales contra E2/ NS1 (Booth y cols., 1998). A esto se suma que las mutaciones en los epítopos de células T están involucradas en el escape a la inmunidad celular (Weiner y cols., 1995). Así cuando el inóculo es suficientemente diverso y tras la primera ronda de replicación en el hígado, el espectro antigénico de la progenie viral puede ser tan amplio como para desbordar la capacidad de la respuesta inmunitaria neutralizante, lo que resulta en el escape de una parte de la progenie, que llegará de nuevo al hígado. Si las sucesivas rondas de replicación que tienen lugar a continuación generan una diversidad antigénica suficiente en las sucesivas progenies virales, el fenómeno de escape se repite, y la diversidad se amplifica hasta alcanzar un grado que sobrepasa de forma definitiva la capacidad de respuesta del sistema inmunitario.
Investigaciones recientes han demostrado que el CD81, considerado el principal receptor de entrada del virus, y su interacción con la glicoproteína E2 alteran las funciones celulares de las células T y las citocidas naturales (NK, del inglés natural killer) (Crotta y cols., 2002; Nattermann y cols., 2004). Adicionalmente, se ha demostrado que las tetraspaninas también intervienen en la regulación de la migración de las células dendríticas, lo que contribuyó a que posteriormente se demostrara que el CD81 en interacción con E2 altera la migración de las células dendríticas intrahepáticas hacia tejidos linfoides para la presentación del antígeno a células T (Nattermann y cols., 2006).
Una región de NS5A está asociada con la sensibilidad al IFN, y se ha demostrado que esta región designada como región determinante de sensibilidad al IFN (ISDR, del inglés Interferon Sensivity-Determinig Region), es útil para la predicción de la respuesta al IFN debido a la aparición de mutaciones dentro de esta región discreta (Enomoto y cols., 1996). Se ha observado que NS5A reprime la PKR a través de una interacción directa con el dominio catalítico de la proteína y altera su dimerización in vivo, lo cual provoca la inhibición de la fosforilación de eIF-2αmediada por PKR y por tanto, la inhibición de la secreción de IFN-α por la célula (Zech y cols., 2003). También se ha visto que NS5A se asocia con p53 y suprime la transcripción del gen p21 regulador del ciclo celular de alguna forma dependiente de p53 (Kato, 2001).
1.3 Respuesta inmunológica
Los anticuerpos (Acs) generalmente son esenciales en la defensa del hospedero contra patógenos dentro del espacio extracelular; dichas proteínas participan en mecanismos efectores dentro del aclaramiento viral que incluyen neutralización, activación del complemento, la opsonización y la toxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Existen evidencias limitadas acerca del papel de la respuesta de anticuerpos anti-VHC.
La respuesta de anticuerpos (Acs) ha sido un elemento importante de la inmunidad adaptativa para la protección frente a muchas infecciones virales. Aunque existen trabajos que dan fe de la importancia de esta respuesta (Ishii y cols., 1998; Zein y cols., 1999), las evidencias acerca del papel de la respuesta de anticuerpos anti-VHC es limitada.
La respuesta humoral contra este patógeno se desarrolla lentamente, y generalmente en la infección primaria es débil, con excepción de la respuesta contra core (Chen y cols., 1999). Es característico de este tipo de respuesta, la restricción de los anticuerpos a la subclase IgG1, fuera del usual cambio a las subclases IgG3 o IgG4 que ocurre típicamente con la maduración de la respuesta humoral antiviral (Chen y cols., 1999). Se ha demostrado que anticuerpos anti-core del isotipo IgG se restringen a la subclase IgG 1 (Netski y cols., 2005), y están presentes en el 95% de los pacientes con infección crónica; el 12% de los mismos presentan respuesta de subclase IgG2, el 70% respuesta de subclase IgG3 y el 19% presentan repuesta IgG4 (Taura y cols., 1995). Sorprendentemente, se ha asociado al desarrollo de anticuerpos de subclase IgG2 con el aclaramiento viral. En un estudio con un pequeño número de individuos, la respuesta IgG2 contra los antígenos core y NS3, fue muy frecuente en aquellos que aclararon la infección viral con respecto a aquellos que desarrollaron infección crónica (Zein y cols., 1999). De forma similar, la razón entre los Acs de subclase IgG2 e IgG1 contra core y NS5 fue mayor que 1.0 en aquellos que aclararon la infección, sin embargo fue menor que este valor para aquellos individuos que presentaban infección crónica. El predominio de esta subclase (IgG2) se ha asociado con un patrón de respuesta Th1 en respuesta de células T CD4+ (Tsai y cols., 1997).
Se ha demostrado que se generan Acs contra, virtualmente, todos los Ags virales durante el curso de la infección (Farci y cols., 1991) y se ha encontrado que aquellos dirigidos contra las proteínas de la superficie del VHC (E1 y E2) se producen más frecuentemente en las infecciones persistentes que en las autolimitadas (Prince y cols., 1999). Las regiones inmunodominantes son las proteínas de la cápsida, NS3 y NS4 (Neville y cols., 1997).
La respuesta de anticuerpos neutralizantes generalmente constituye la primera línea de la defensa adaptativa contra la infección viral. En individuos con hepatitis crónica la aparición de altos títulos de Acs neutralizantes coincide con la desaparición del virus y la resolución clínica de la hepatitis (Ishii y cols., 1998).
Los Acs contra las proteínas de la envoltura son los candidatos fundamentales para la neutralización viral; se ha demostrado que en chimpancés, la RHV I, es un dominio de neutralización crítico del VHC y se sugiere que los Acs anti-RHV I funcionan como Acs neutralizantes. Mas su presencia en los pacientes crónicos y el hecho de que los chimpancés pueden ser infectados repetidamente por cepas idénticas, hace pensar que no siempre la actividad de neutralización es efectiva in vivo (Esumi y cols., 1999).
Se han llevado a cabo estudios vacunales con Ags recombinantes E1-E2 para inducir Acs neutralizantes. Aunque luego de la vacunación se observó la protección en los chimpancés, contra retos en bajas dosis, esto fue solo en períodos de altos títulos de Acs anti-E1-E2 (Choo y cols., 1994). Por lo tanto, se ha sugerido que la eliminación del virus después de la infección no está mediada por Acs neutralizantes (Prince y cols., 1999) y que de hecho, las fuertes respuestas de células T se correlacionan mejor con la eliminación del virus y la recuperación, tanto en humanos como en chimpancés (Cooper y cols., 1999; Takaki y cols., 2000). Logvinoff y colaboradores, demostraron que la mayoría de los individuos con infección persistente poseen respuestas de anticuerpos capaces de neutralizar pseudotipos de partículas retrovirales (VHCpp), las cuales expresan glicoproteínas heterólogas de la envoltura del VHC.
Sin embargo, sólo la minoría de los individuos con infecciones agudas que fueron estudiados demostraron alguna actividad neutralizante (Logvinoff y cols., 2004). Posterior a esta evidencia, se reportó un estudio con un paciente infectado en 1977 y del cual se tienen muestras de suero desde esa fecha. Los resultados mostraron que la repuesta de anticuerpos neutralizantes fallaba a la eficiente neutralización de las VHCpp que expresaban la glicoproteínas de las secuencias dominantes in vivo, en el tiempo correspondiente a la extracción del suero. Adicionalmente, todas la VHCpp derivadas de este paciente eran neutralizadas por anticuerpos séricos provenientes de dos individuos crónicos (von Hahn y cols., 2007). Los Acs neutralizantes contra el VHC puede ejercen una presión selectiva que conlleva a la aparición de nuevas variantes del VHC que escapan a la respuesta inmune (Farci y cols, 1994). Aunque continuamente pudieran producirse Acs neutralizantes contra estas variantes, el virus seguirá mutando. Por lo que los Acs neutralizantes y la infección por VHC pueden co-existir en pacientes crónicamente infectados (Borgia, 2004).
A pesar de las evidencias circunstanciales sobre el papel de los anticuerpos neutralizantes, los individuos con hipoganmaglobulinemia son capaces de eliminar la infección viral a una velocidad similar a los individuos que autorresuelven la enfermedad y que no presentan dicha patología (Bjoro y cols., 1994). Adicionalmente, en estudios realizados utilizando pseudotipos de partículas retrovirales que expresan las glicoproteínas del VHC, y sistemas de ensayos basados en partículas semejantes a virus (VLPs, del inglés Virus-Like Particles) ensambladas con las proteínas estructurales del virus, no fue encontrado aclaramiento viral (Logvinoff y cols., 2004; Steinmann y cols., 2004). No obstante, se ha documentado la existencia de Acs neutralizantes de subtipo IgM específicos contra el VHC, en el tiempo de la seroconversión en pacientes que fallan al control de la infección. Conjuntamente fueron encontrados Acs capaces de neutralizar pseudotipos autólogos (específicos del hospedero) y heterólogos (otros genotipos y subtipos no presentes en el hospedero), en aquellos individuos que resolvieron la infección aguda (Logvinoff y cols., 2004). Recientemente, anticuerpos neutralizantes mostraron la capacidad de prevenir la replicación en sistemas de cultivo in vitro (Yi y cols., 2006), y la modulación de la infección por el VHC in vivo (Eren y cols., 2006).
Los estudios en chimpancés sugieren que la infección por el VHC no genera una respuesta inmune esterilizante; sin embargo, genera una respuesta que controla la infección en términos de su duración, de replicación viral (niveles de ARN en suero) y el grado de hepatitis (elevación en los niveles de alanina aminotransferasa, ALAT), esta respuesta parece ser mediada por células, ya que no se detectaron Acs contra los antígenos (Ags) de superficie en los animales estudiados (Major y cols., 2000).
Los bajos niveles de ARN, el pobre reconocimiento de los antígenos por los linfocitos T auxiliadores (Th, del inglés T helper), una pobre secreción de citoquinas e inadecuada expansión, crecimiento y respuesta de las células pueden explicar la demora en el desarrollo de la respuesta inmune.
Se considera que la respuesta inmune celular contribuye a controlar el virus en primera instancia y potencialmente conduce a la inflamación hepática durante la enfermedad crónica. En los pacientes que resuelven la infección se genera una respuesta temprana, fuerte y multiespecífica de linfocitos T auxiliadores, así como de linfocitos T citotóxicos (LTC), que se mantiene después de la resolución de la viremia y la normalización de los niveles de ALAT (Lechner y cols., 2000). No se conoce si esto representa una verdadera respuesta de memoria o si la persistencia viral en sitios desconocidos, lleva a la estimulación continua de la respuesta inmune (Diepolder y cols., 1996).
Se considera que los linfocitos T CD4+ son críticos para la efectividad de las respuestas tanto humoral como celular, contra el VHC (Elliot y cols., 2006). Varios experimentos llevan a considerar que una respuesta fuerte y multiespecífica de células T CD4+, producida en una etapa temprana de la infección está asociada con la resolución de la enfermedad, mientras que una respuesta limitada en una etapa más avanzada se relaciona con la cronicidad de esta enfermedad infecciosa (Day y cols., 2002; Thimme y cols., 2002).
En individuos que autorresolvieron la enfermedad se detectó una respuesta linfoproliferativa contra un promedio de 10 a 37 epítopos definidos pertenecientes a las proteínas core, NS3, NS4 y NS5, en comparación con la respuesta contra solo un epítopo en pacientes que presentaban infección crónica (Day y cols., 2002). Los LTC específicos para el core pueden reconocer y lisar las células que expresan dicha proteína proveniente de la mayoría, sino de todos los genotipos del VHC (Nelson y cols., 1997). Más aún, no se detectan mutaciones dentro de la proteína de la cápsida, a pesar de la presencia de LTC específicos (Christie y cols., 1999), lo que sugiere que las respuestas inmunes contra esta proteína no llevan a la aparición de variantes que escapan al sistema inmune (Polakos y cols., 2001). Además, la presencia de LTC específicos para la proteína de la cápsida ha estado asociada con la subsiguiente respuesta de los pacientes a la terapia con IFN (Nelson y cols., 1998). De esta forma, una vacuna capaz de generar LTC específicos para la proteína de la cápsida, pudiera aumentar la tasa de respuesta de los pacientes frente a la terapia (Polakos y cols., 2001). En los pacientes que eliminan la infección viral, las proteínas no estructurales (NS3, NS4 y NS5) constituyen los principales blancos de la respuesta T auxiliadora (Rosen y cols., 2002; Schulze y cols., 2005).
Las causas de la aparente falla de la repuesta de células T CD4+ en pacientes que desarrollan infección crónica no se comprende muy bien aún. Algunas teorías incluyen el agotamiento y/o la anergia de estas células. El agotamiento puede resultar de la alta velocidad de producción de los viriones, la cual puede exceder la capacidad de la respuesta inmune, lo que resulta en una sobre-estimulación de los linfocitos T, y por tanto, una afectación de la activación. La anergia puede resultar por la alta y sostenida concentración antigénica que conlleva a la tolerancia de la respuesta inmune (Brooks y cols., 2005).
Evidencias recientes afirman el papel de los linfocitos T CD4+CD25+Foxp3+ reguladores (TREG) en la supresión funcional de la respuesta de linfocitos T CD4+ en la infección por el VHC (Sugimoto y cols., 2005). La frecuencia y la actividad funcional de los TREG en pacientes con infección crónica, que tienen células T CD4+ inactivadas, fueron significativamente mayores que en pacientes que aclararon la infección por el VHC, evidenciando que la supresión es VHC-específica. Además, se ha demostrado la prevalencia de la secreción de interleukina (IL) 10 y factor transformador del crecimiento-β (TGF- β, del inglés Transformig Growth Factor) inducida por el virus, en la cronicidad, las cuales son características de los TREG (Ulsenheimer y cols., 2003). Estudios en chimpancés con infección aguda demostraron que la frecuencia y la actividad supresora de las células CD4+CD25+Foxp3+ comenzaba a observarse en la medida que evolucionaban a la cronicidad (Manigold y cols., 2006).
En conjunto con la respuesta de células T CD4+, una respuesta potente y multiespecífica de células T CD8+ generada en una etapa temprana de la infección se ha relacionado con el aclaramiento viral (Cooper y cols., 1999; Gruner y cols., 2000; Lauer y cols., 2004). Sin embargo, la presencia en el hígado de LTC es suficiente para generar el daño, pero no siempre para eliminar la infección. No es casual que en pacientes con hepatitis crónica predomine un perfil de respuesta Th1 (Sobue y cols., 2001).
Una respuesta de LTC dirigida contra múltiples epítopos de las proteínas virales fue observada en chimpancés que autorresolvieron la infección, mientras que animales que desarrollaron la cronicidad generaron una respuesta limitada (Cooper y cols., 1999). Cucchiarini y colaboradores en el 2000, demostraron una alta prevalencia de la respuesta de LTC dirigida contra diversos epítopos, tanto de las proteínas estructurales como no estructurales, en pacientes que aclararon la infección con respecto a los que no la aclararon; mientras que Shata y colaboradores en el 2002, observaron una respuesta temprana y amplia contra epítopos de core y NS3 en chimpancés que autorresolvieron la enfermedad, no comportándose de igual forma en los crónicos. Adicionalmente, se ha reportado que las células T CD8+ de pacientes que progresaron a la infección crónica perdieron el reconocimiento de al menos un epítopo blanco en la infección primaria, observándose hasta una reducción de un 85% en la magnitud de la respuesta, además ninguna especificidad a nuevos epítopos fue observada en estos pacientes con infección persistente (Cox y cols., 2005).
Existen datos conflictivos indicando la constancia de una respuesta de linfocitos T CD8+ VHC-específica seguida del aclaramiento viral. Se realizó un estudio donde se mostró que la respuesta de LTCs persiste en individuos crónicos y no en pacientes que solucionaron la enfermedad, lo que sugiere que el mantenimiento de la viremia es crítico para la persistencia de esta respuesta celular (Chang y cols., 2001). Adicionalmente, las células de memoria tanto CD4+ como CD8+ son encontradas en ausencia del antígeno en modelos experimentales (Mullbacher, 1994; Veiga-Fernandes y cols., 2000), lo que probablemente no ocurre en el contexto del sistema inmune humano (Zinkernagel, 2002). Variantes del VHC con alteraciones del tropismo celular quizás son retenidas en el hígado, pero en células diferentes a los hepatocitos, así como en células dendríticas en el drenaje de los nódulos linfáticos, en células mononucleares de sangre periférica, o en determinados "sitios santuarios" como el cerebro (Crovatto y cols., 2000; Laporte y cols., 2003; Forton y cols., 2004). Reportes recientes sobre pacientes que resolvieron la infección, pero que retuvieron bajos niveles de virus en células mononucleares de sangre periférica, sugieren que después del aclaramiento, algunos individuos pueden mantener bajos niveles de viremia, permitiendo la constante exposición antigénica, pero sin manifestaciones de hepatitis crónica (Pham y cols., 2004; Radkowski y cols., 2005; Gerotto y cols., 2006).
Utilizando tetrámeros del antígeno leucocitario humano (HLA, de inglés human leucocitary antige) clase I, se pudo demostrar que los linfocitos T CD8+ son detectables con mayor frecuencia en el hígado que en sangre periférica (Grabowska y cols., 2001), y en individuos autoresueltos, más que en individuos crónicos (Lauer y cols., 2004). Similarmente se ha demostrado una disminución de la producción de IFN-γ y TNF-α por los LTCs VHC-específicos en pacientes con infección aguda, los cuales avanzan a la infección crónica (Spangenberg y cols., 2005). Datos recientes indican que la vía PD-1/PD-1 ligando juega una papel clave en el agotamiento de estas células (Barber y cols., 2006).
Las razones de la persistencia viral debido a una limitada respuesta de LTCs aún siguen sin esclarecerse. Sin embargo, se considera que el desarrollo de mutantes que escapan al sistema inmunológico resultado de la alta velocidad de replicación y de errores de la ARN polimerasa ARN dependiente, juega el mayor papel en este fenómeno viral. Se han descrito mutaciones que permiten escapar de los LTC, en proteínas del VHC tales como NS3 (Weiner y cols., 1995) y E2 (Tsai y cols., 1998). Erickson y colaboradores en el 2001, obtuvieron evidencias de una mutación en múltiples epítopos restringidos por HLA clase I dentro de los primeros meses de la infección crónica en chimpancés, no siendo así en epítopos no restringidos por esta molécula. El análisis intensivo de la respuesta de linfocitos T CD8+ en un caso-control de individuos HLA-B27+ con infección, tanto aclarada como crónica, permitió la identificación de epítopos restringidos por HLA-B27, que fueron reconocidos por la mayoría de los casos aclarados, indicando un presión selectiva alelo-específica a nivel de población (Neumann y cols., 2006). Se ha observado que las respuestas de células T CD8+ dirigidas contra mutantes de escape inmunológico en chimpancés, se relacionan con una disminución de la diversidad de receptores de células T (TCR, del inglés T Cell Receptor) comparado con la respuesta contra epítopos sin variación de secuencia (Meyer-Olson y cols., 2004). Esta limitada diversidad del TCR estuvo presente antes de que se detectara los mutantes de escape viral, lo cual indica que el bajo repertorio de TCRs directamente facilita el desarrollo de mutantes y de esta forma, la persistencia de la infección.
Se ha establecido la existencia de clones celulares CD3+, CD8+ y CD56+, capaces de lisar hepatocitos autólogos y alogénicos. La presencia del fenotipo CD56+ característico de las NK justifica la no restricción por el complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC, del inlgés major complex histocompatibility) de la actividad citolítica y llama la atención sobre la posible trascendencia de la respuesta inmune innata en el curso de la infección y en la patogénesis de la enfermedad. A su vez, linfocitos CD3+, CD16+, CD56+, fenotipo de células B y T maduras, no restringidos por el HLA-I se encuentran en mayor proporción en pacientes crónicos en comparación con los controles (González-Peralta y Lau, 1995). Se supone que existe un corto período de tiempo en que los LTC, actuando junto a los linfocitos CD4+ y posiblemente a las NK, son efectivos en el control antiviral; más allá de esto, si el virus persiste, su número y función efectora se ven afectadas (Lechner y cols., 2000).
1.4 Secreción de citoquinas
En relación con el patrón de citoquinas secretadas por las células T CD4+ en el paradigma respuesta auxiliadora 1/ respuesta auxiliadora 2 (Th1/Th2), en células aisladas de pacientes, tanto aquellos que autorresolvieron la infección, como los crónicos, se ha demostrado que esta relación varía, aunque predomina la respuesta Th1 (Darling y Wright, 2004; Gramenzi y cols., 2005). Sin embargo, este patrón de secreción de citoquinas es más frecuente en individuos que aclararon la enfermedad, sugiriendo una asociación entre la producción de citoquinas antivirales, como el IFN-γ, y la defensa antiviral por activación de células T y de fagocitos (Gramenzi y cols., 2005). Se ha visto que estas respuestas Th1 dependen de la secreción de IFN-gy TNF-α por las células T auxiliadoras y de IL-12 producida por macrófagos y las células dendríticas (Esser y cols., 2003).
Los individuos infectados por el VHC producen IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10 (Tsai y cols., 1997; Alvarado-Esquivel y cols., 1999). Además, la mayoría de las células T que infiltran el hígado en individuos con hepatitis C son capaces de secretar IFN-g(Bertoletti y cols., 1997; Alvarado-Esquivel y cols., 1999). Esta respuesta al parecer es mayor en pacientes respondedores al IFN-g(Alvarado-Esquivel y cols., 1999). Los niveles séricos de TNF varían con la severidad de la enfermedad hepática (Torre y cols., 1994; Nelson y cols., 1997; Alvarado-Esquivel y cols., 1999). Los niveles de IL-12 e IFN-γ están fuertemente incrementados en pacientes infectados; mientras que los niveles de IL-4 y IL-6 están significativamente disminuidos (Cribier y cols., 1998). La IL-12 que es una citoquina producida por las APC, es una molécula clave en la regulación de la respuesta inmune del hospedero contra la infección. Esta interleuquina es un factor útil y probablemente obligatorio para la generación y proliferación de linfocitos T auxiliadores (Fan y cols., 2000).
1.5 Tratamientos antivirales
Interferones y análogos de nucleótidos
En la actualidad existen varios tratamientos antivirales. Dentro de ellos el tratamiento con interferón, ribavirina y las combinaciones probadas entre ambos, constituyen las terapias más estudiadas y empleadas hasta la fecha. Los interferones son citoquinas con varias funciones entre las que se incluyen: inducción del estado antiviral en las células blanco, inducción de la secreción de otras citoquinas, reclutamiento de las células de la respuesta inmune e inducción de la diferenciación celular. La eficacia de la terapia con IFN-α para el tratamiento de la hepatitis C crónica está limitada por las características de esta molécula: estabilidad reducida, vida media corta e inmunogenicidad.
Varios estudios han mostrado las ventajas de la modificación del IFNα-2a de 40 kD y el IFNα-2b de 2 kD con polietilénglicol (polímero seguro y no tóxico utilizado en la modificación química de varias moléculas). Se ha observado entonces: menos fluctuaciones en las concentraciones plasmáticas, menos toxicidad, disminución de la inmunogenicidad y antigenicidad, y aumento de la estabilidad fisiológica y química de ambos interferones (PEGASY ® peginterferón alfa2a (40 kDa) Monografía Roche). En este caso, los niveles de respuesta virológica se duplican sostenidamente con una sola dosis a la semana (Heathcote y cols., 2000).
La ribavirina (1-β-D-ribofuranosil-1, 2, 4-triazol-3-carboxamida) es un análogo de nucleótidos purínicos sintetizado por primera vez en 1970. La monoterapia con esta entidad química reduce los niveles de ALAT, pero no reduce los niveles de ARN viral en pacientes con hepatitis C crónica. Se ha propuesto que la ribavirina además de tener función inmunomoduladora, puede actuar en la inhibición de la inosina monofosfato deshidrogenada, la enzima de la reacción limitante en la biosíntesis de nucleótidos de guanina. Por tanto puede actuar como un agente mutagénico con la subsiguiente inhibición de la ARN polimerasa NS5B (Davis y cols., 1998).
Las fluctuaciones en las concentraciones de IFN-α observadas de una dosis a otra pueden conducir a un rebote viral, por lo que se hace necesaria una administración frecuente de IFN-α para alcanzar las concentraciones plasmáticas terapéuticas efectivas del tratamiento (Lam y cols., 1997). En la actualidad, 24 semanas de tratamiento y 800 mg de dosis de ribavirina parecen ser suficientes para personas infectadas con el VHC del genotipo 2 y 3, mientras que pacientes con genotipo 1 necesitan 48 semanas de tratamiento y dosis estándar de ribavirina. Adicionalmente, el rango de respuesta entre pacientes del genotipo 2 o 3 es dos o tres veces mayor que el rango de respuesta en pacientes con genotipo 1 (Diago y cols., 2001).
Recientes terapias inmunomoduladoras revelan la gran lista de entidades químicas que se han encontrado con efecto antiviral. Algunas con un perfil de seguridad superior a la ribavirina y mucho más tolerada, como la levovirina (un análogo de la ribavirina pero con figuración L en la unión del anillo ribofuranosil y el heterociclo triazol) (Rossi y cols., 2001). Otras aún en estudios clínicos, como son: la viramidina (Gish, 2006), el merimepodib (VX-497)(McHutchison y cols., 2005), la timosina α-1 (ZADAXIN) (Billich, 2002), la amantadita (Chan y cols., 2002), el mofetil micofenolato (Herrine y cols., 2005), el espectro de análogos de nucleósidos ZX-2401 (Ojwang y cols., 2005), agonistas de los TLR7 (del inglés, Toll Like Receptor) (Horsmans y cols., 2005), del TLR9 (McHutchison y cols., 2005) y del TLR7/8 (Pockros y cols., 2003).
Inhibidores de proteasas
Otras variantes antivirales en estudio incluyen inhibidores de la serín-proteasa NS3/NS4, de la ARN polimerasa NS5B, del sitio de reconocimiento ribosomal y de los factores de replicación del hospedero. Dentro de las variante de los inhibidores de la serín proteasa se encuentran varios péptidos miméticos como son: el BILN 2061, el SCH 503034 y el VX-950 que en mayor o menor grado reducen los niveles de ARN viral y de las aminotransferasas hepáticas (Hinrichsen y cols., 2004; Zeuzem y cols., 2005; Reesink y cols., 2006). Entre los inhibidores de la ARN polimerasa se han estudiado el análogo de nucleósido R1479 y la valopicitabina (NM-283) (Klumpp y cols., 2005). Entre los inhibidores de los factores de replicación del hospedero se encuentran la lovastatina, una droga capaz de inhibir la prenilación de la proteína FBL2 requerida para el ensamblaje del complejo de replicación (Wang y cols., 2005), y la ciclosporina un inhibidor de la ciclofilina B (CyPB), una peptidil-prolil cis-trans isomerasa que se une a la polimerasa viral y es capaz de potenciar la replicación (Watashi y cols., 2005).
Recientemente una molécula apoptótica modificada fue desarrollada específicamente para eliminar las células infectadas. Una molécula precursora, creada para albergar un sitio de clivaje NS3 serín-proteasa, libera la proteína pro-apoptótica BIP después del procesamiento proteolítico en células que expresan el complejo VHC NS3-4. La observación de que la serín-proteasa NS3 puede clivar sustratos extraños in trans es bastante poco esperada y levanta perspectivas interesantes para la eliminación específica de las células infectadas con HCV como nueva estrategia antiviral (Brass y cols., 2004).
Ribozimas y oligonucleótidos de polaridad negativa
Las ribozimas son pequeñas moléculas de ARN con actividad endorribonucleasa intrínseca. La especificidad de estas moléculas de debe a la presencia de secuencias complementarias que flanquean el sitio activo. En contraste, los oligonucleótidos de polaridad negativa requieren la ARNasaH de la célula del huésped para mediar la ruptura de la secuencia blanco complementaria. Modificaciones químicas de las ribozimas y los oligonucleótidos previenen su degradación por nucleasas celulares. El sitio de reconocimiento ribosomal (IRES, del inglés Internal Ribosomal Entry Site) altamente conservado dentro de la región no traducida del extremo 5´ del genoma del VHC, representa un blanco atractivo para las estrategias de ruptura de secuencias específicas. Un efecto inhibitorio de las ribozimas dirigidas al IRES del VHC ha sido demostrado en un sistema quimera VHC-poliovirus, sin embargo los resultados no son muy alentadores y conllevan a efectos adversos (Brass y cols., 2004).
Varios oligonucleótidos dirigidos al IRES han sido mostrados para inhibir la iniciación de la traducción en el sistema libre de células, en experimentos en cultivos celulares y en un modelo de animal pequeño. Reportes recientes afirman que un fosfotioato-oligodeoxinucleótido de polaridad negativa (ISIS-14803) capaz de inhibir la biosíntesis de proteínas brindando resultados prometedores. (McHutchison y cols., 2006).
ARN de interferencia
Los ARN pequeños de interferencia (siRNA, del inglés small interfering Ribonucleic Acid) son pequeñas moléculas doble cadena que median la degradación de secuencias específicas de RNA monocatenario y resulta en un "knock down" (disminución) de la codificación del producto génico. Este proceso post-transcripcional silenciado es importante para varias funciones celulares como por ejemplo la protección contra virus y transposones en plantas e insectos. Varios estudios han mostrado recientemente que la replicación del ARN del VHC puede ser eficientemente inhibida por siRNA en el sistema replicón. La aplicabilidad clínica de esta propuesta dependerá de la eficiente liberación y estabilidad del siRNA.
Se han reportado estudios de ARN de interferencia contra los genes de la ARN polimerasa, del core, E2, NS3 y NS5A (Prabhu y cols., 2005). Así mismo se han ensayado ARN de interferencia dirigidos contra los genes de los cofactores de replicación del hospedero alfa-subunidad 7 de proteosoma y el Hu antígeno R (Korf y cols., 2005)
1.6 Estrategias vacunales contra el virus la Hepatitis C
La infección aguda no es considerada un problema de salud a nivel mundial a diferencia de la infección crónica (Abrignani, 1999), por lo tanto, la meta más realista si bien es buscar una vacuna que prevenga la infección, es buscar además una formulación que evite la progresión a la cronicidad. En la búsqueda de una vacuna efectiva frente al VHC se han estudiado disímiles estrategias: subunidades proteicas, partículas semejantes a virus, vacunas peptídicas, vectores virales recombinantes y vacunas de ADN.
En el enfoque de vacunas de subunidades se han empleado fundamentalmente las proteínas estructurales, llegándose a evaluar varias combinaciones en chimpancés. Se tienen evidencias preliminares, de que una vacuna constituida por el heterodímero formado por las glicoproteínas recombinantes de la envoltura del VHC (E1 y E2/p7) (Choo y cols., 1994), puede generar respuestas de Acs y de células T CD4+. Se demostró que ambas respuestas pueden prevenir la cronicidad en chimpancés, aunque solo específica para el aislamiento viral homólogo. También se ha logrado la protección total frente al reto homólogo en chimpancés luego de la inmunización de los mismos con las proteínas E1 y E2 junto a péptidos sintéticos de la RHV 1 (Goto y cols., 2001).
Por ser la más conservada entre todas las proteínas del VHC, la proteína de la cápsida es un candidato promisorio para la inducción de la protección contra la infección por este virus. En un esquema de inmunización en macados, se inoculó esta proteína adyuvada con formulaciones no clásicas de ISCOM (complejos inmunoestimuladores) obteniéndose fuertes respuestas CD4+ y CD8+, así como respuestas humorales satisfactorias (Polakos y cols., 2001). Una variante de esta proteína, truncada hasta el aminoácido 120, obtenida en Escherichia coli (E. coli) (Lorenzo y cols., 2000), ha mostrado su inmunogenicidad, obteniéndose en ratones BALB/c títulos de 1:100000 y un perfil de secreción de citoquinas indicativo de la inducción de una respuesta celular (Alvarez-Obregón y cols., 2001).
Una variante que incluyó a la proteína E1 truncada en el extremo C-terminal adyuvada en hidróxido de aluminio, ha sido probada en 19 pacientes con infección crónica. Los resultados mostraron una mejoría histológica, un aumento en los títulos de anticuerpos anti-E1 en todos los pacientes y respuestas linfoproliferativas aproximadamente entre el 90 y el 100% de los individuos, aunque no se obtuvo reducción de los títulos de ARN viral (Nevens y cols., 2003). En el subsiguiente tratamiento en Fase II probado en 35 pacientes incluyendo un grupo placebo, se demostró la seroconversión contra E1 en todos los pacientes y la inducción de una respuesta proliferativa de células T en el 88 % de los casos después de la sexta dosis, lo cual no fue suficiente para la disminución sostenida de la carga viral.
El enfoque de partículas semejantes a virus ha sido probado en ratones (Lechmann y cols., 2001) obteniéndose respuestas celulares y humorales que abogan por la potencialidad de este tipo de candidatos vacunales. En ratones también se han generado respuestas inmunes contra la cápsida, E2 y las proteínas no estructurales luego de la inmunización con péptidos (Hiranuma y cols., 1999).
Recientemente una vacuna peptídica (IC41) basada en cinco péptidos sintéticos del VHC que incluyen epítopos de células T y que utiliza el adyuvante sintético constituido por poly-L-argininas, ha demostrado ser segura en 128 individuos sanos (HLA-A2+) y capaz de inducir una respuesta de linfocitos T CD4+ y CD8+ secretora de IFN-γ (Christa Firbas y cols., 2006).
Una estrategia novedosa, estudiada en la actualidad por muchos laboratorios, es la vacunación terapéutica con células dendríticas. La estimulación ex vivo y la maduración de las células dendríticas en presencia de la proteína core y algunos péptidos o de la NS3, indujo una potente respuesta tanto humoral como celular en ratones (Encke y cols., 2005; Yu y cols., 2006). A su vez, otros experimentos se han llevado a cabo en los que fue transferido un vector adenoviral, que contenía los genes que codifican para la proteína core y la NS3, a células dendríticas aisladas de pacientes sanos o pacientes que aclararon la infección. Esta estrategia indujo altos índices de respuestas tanto de anticuerpos como de células en ratones (Li y cols., 2006).
Estudios pre-clínicos en ratones, mostraron que la inmunización con una levadura recombinante (Saccharomyces cerevisiae) que expresa la proteína de fusión NS3-Core (GI-5005), era capaz de inducir una linfoproliferación VHC-específica así como una respuesta LTC asociado a un patrón Th1de secreción de citoquinas. Después de que la administración terapeútica demostrara su capacidad de erradicar células tumorales que expresaban NS3 en ratones, comenzó un estudio clínico fase I en pacientes crónicos (Haller y cols., 2007).
1.7 Aplicación de la inmunización con ADN en el desarrollo de vacunas contra el VHC
Varios estudios dan fe de la utilidad de la inmunización con plasmidios como estrategia para expresar endógenamente proteínas no propias al organismo, y desencadenar respuestas inmunitarias contra los mismos. Se ha demostrado que esta tecnología puede inducir una respuesta tanto celular como humoral en varios modelos animales, siendo esto una estrategia atractiva para el desarrollo de una vacuna contra el VHC (Dueñas-Carrera, 2004).
La implementación de una vacuna efectiva en modelos animales depende en gran medida de la habilidad de estimular la respuesta de células T restringida al HLA (Dueñas-Carrera, 2004). Con el objetivo de potenciar aun más la repuesta inmune se ha probado mezclar el ADN con diferentes aditivos. En varios casos se ha utilizado el binomio ADN-proteínas recombinantes, ya sea inmunizando en un régimen de sensibilización con ADN y dosis de recuerdo con la proteína o con ambos compuestos simultáneamente. Particularmente, se ha obtenido un incremento de IgG2a y de la respuesta de células T CD8+ al evaluar el efecto de la mezcla E2-ADN, respecto al uso de ambos componentes por separado, en ratones (Song y cols., 2000). Por otro lado, se ha experimentado que la inmunización con una mezcla en la que se combina una variante de la proteína core truncada hasta el aminoácido 120, con un plasmidio que codifica los primeros 650 aminoácidos de la poliproteína del aislamiento viral cubano, genotipo 1b, induce una potente respuesta humoral y celular. Estas respuestas fueron capaces de proteger frente al reto en ratones con virus vaccinia recombinante que expresa la proteína core (Alvarez-Lajonchere y cols., 2006).
Recientemente, dos chimpancés vírgenes fueron inmunizados aplicando dosis de sensibilización con ADN y dosis de recuerdo con las proteínas estructurales del VHC (Core, E1 y E2), así como, con la proteína no estructural NS3 y posteriormente expuestos al subtipo 1b (heterólogo) del VHC J4. Resultó que uno de los chimpancés resolvió rápidamente la infección, mientras que el otro la controló sin problemas (Rollier y cols., 2004). Aunque la vacunación indujo Acs, IFN-gpéptido-específico, respuestas linfoproliferativas proteino-específicas y respuesta de células CD4+ en ambos animales, las especificidades fueron marcadamente diferentes. El chimpancé que aclaró rápidamente la infección por el VHC desarrolló respuestas que fueron menores en magnitud, pero dirigidas hacia un patrón de respuesta de citoquinas tipo Th1 para E1 y NS3. Fue observado que la producción de IFN-g específico para E1 y NS3 por células T en estadíos tempranos de la infección, puede ser clave para la inducción de inmunidad protectora por vacunación. Además se hace extensivo el papel de una fuerte respuesta tipo Th1 en la inmunidad inducida por una vacuna profiláctica contra el VHC.
La inmunización conjunta de plásmidos que expresan Ags estructurales y plásmidos que expresan Ags no estructurales del VHC; ha confirmado que la inmunidad inducida por inmunización con ADN a pesar de desarrollarse lentamente, alcanza importantes niveles (Pancholi y cols., 2003). Los Acs y la respuesta celular contra NS3 no es frecuentemente encontrada en pacientes crónicamente infectados pero sí se ha observado en pacientes con infección aguda autolimitada y pacientes sanos que se caracterizan por una protección esterilizante (Isaguliants y cols., 2003).
Otra variante muy estudiada en la vacunación con ácidos nucleicos es la co-inmunización con plásmidos que expresan citoquinas, así como las estrategias de sensibilización/recuerdo. Ambas vertientes han sido evaluadas para aumentar la respuesta inmune específica contra las proteínas del VHC (Dueñas-Carrera, 2004). En estudios recientes se ha observado que la interleuquina 23 (IL-23) induce una duradera respuesta de CTL y Th1 contra E2 después de la vacunación con un plásmido que expresa esta proteína. La inmunidad mediada por esta citoquina fue mucho más potente que la respuesta mediada por la IL-12. La IL-23 posee actividad biológica similar a la IL-12, pero se diferencia en la capacidad de estimular células T memorias in vitro (Ha y cols., 2004). Otras citoquinas tales como la IL-18 han sido recientemente probadas y demostrado su efecto adyuvante en la vacunación con ADN (Lee y cols., 2003).
1.8 Referencias bibliográficas
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