Evaluación fitoquímica y antibacteriana de tintura 20 %

Resumen

En este trabajo se realizó la evaluación fitoquímica y antibacteriana de tinturas y extractos secos, obtenidos de las hojas y corteza del fuste de la Mammea americana (Mamey amarillo). En el tamizaje fitoquímico se emplearon técnicas simples y rápidas, que requirieron un mínimo de equipamientos y reactivos para las determinaciones de los diferentes compuestos, identificándose los metabolitos secundarios presentes en las tinturas al 20 % y en los extractos. Los metabolitos predominantes obtenidos en las tinturas al 20 % son alcaloides, coumarinas, taninos, quinonas y flavonoides, comportándose de manera similar en los extractos secos. Las tinturas al 20 % y extractos secos obtenidos a partir de los órganos evaluados tienen actividad frente a Staphylococcus aureus (ATCC) con tendencia a dosis-dependencia, con halos de inhibición de 11,3 -12,7 mm, en hojas, y 12.7-15,0 mm, en la corteza del fuste para la máxima concentración evaluada (720 &µg/disco).

Palabras claves: Mammea americana, tamizaje fitoquímico, actividad antibacteriana, extractos, diversidad.

Phytochemical and antibacterial evaluation of 20% tintures and dry extracts, obtained from american Mammea (yellow Mammee)

Abstract

In this work it was carried out the phytochemical and antibacterial evaluation of tintures and dry extracts, obtained from american Mammea (yellow Mammee) leaves and stem bark. In the phytochemical screening they were used simple and quick techniques requiring a minimum of equipments and reagents for the compound determinations, being identified the secondary metabolites present in the 20% tintures and in the extracts. The predominant metabolites obtained in the 20%tintures are alkaloids, coumarines, tannines, quinones and flavonoids. This occurs in a similar way in the dry extracts. The 20% tintures and dry extracts obtained from the evaluated organs show activity against Staphylococcus aureus (ATCC) with tendency to dose-dependence, with halos of inhibition of 11,3 -12,7 mm, in leaves, and 12,7–15,0 mm, in the stem bark for the evaluated (720 &µg / disk) maximum concentration.

Key words: Mammea americana, phytochemical screening, antibacterial activity, extracts, diversity.

1. INTRODUCCIÓN

La situación económica actual, el deterioro del poder adquisitivo de las clases más desposeídas, la crisis de los servicios de atención a la salud y una medicina cada día más costosa, han hecho que se incremente el uso de las plantas como una alternativa válida para enfrentar el proceso salud-enfermedad, práctica que se ve reforzada por el hecho de ser medicamentos de eficacia comprobada. En relación con el uso de las plantas existe un gran desconocimiento sobre como emplearlas, sus principios tóxicos y su dosificación para lograr efectos terapéuticos.

Su uso además, deja al descubierto un proceso mágico, folklórico y científico, que solamente alguien conocedor de esta tríada, puede relacionar para poder llegar a un buen diagnóstico en caso de ingestión accidental, o de suministro inadecuado de brebajes elaborados con plantas para alguna afección en el niño y/o en el adulto1.

Las plantas medicinales tienen propiedades curativas que ya eran conocidos en la antigüedad, aunque también se han añadido al arsenal terapéutico otras plantas cuya utilidad ha sido descubierta recientemente. Hasta el desarrollo de la química, y, particularmente, de la síntesis de compuestos orgánicos a lo largo de los siglos XIX y XX, las plantas medicinal eran prácticamente la única fuente de principios activos capaces de mejorar el estado de salud de las personas. Las plantas medicinales continúan teniendo una gran importancia para personas que no tienen acceso a las medicinas modernas y, además, muchos medicamentos modernos dependen en gran medida en los mismos principios activos. Éstos difieren de unas plantas a otras debido a su biodiversidad, ya que el código genético de cada especie vegetal contiene información para producir compuestos químicos diferentes2.

Mammea americana (Mamey amarillo), es una de las plantas que popularmente se le atribuyen propiedades medicinales en la curación de diversas enfermedades, como: antiparasitaria3 e insecticida4, utilizando para este, el látex de la semilla contra el Aedes Aegypti, eliminando las larvas de ese vector. Se come la fruta para tratar la anemia, la resina y la decocción de la corteza se utilizan contra los parásitos, infecciones micóticas y eczemas. La infusión de sus hojas es un antifebrifugo5.

Es importante que estas se validen científicamente y propiciar un incentivo adicional para su multiplicación y propagación; de esta manera, la planta podría ser aprovechada no solo de forma popular a partir del conocimiento tradicional comprobado, sino también en los servicios de salud especializados.6, 7

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Selección y tratamiento del material vegetal

Se seleccionó la planta Mammea americana (Mamey amarillo), atendiendo a los reportes populares sobre su empleo en la curación de diversas afecciones de la piel, sus efectos terapéuticos no han sido validados experimentalmente, considerando la disponibilidad de la misma y que su acción antibacteriana no ha sido reportada hasta el momento.

El material vegetal fue recolectado el 17 de abril de 2010, en la localidad Los Rondones, municipio Jiguaní, provincia de Granma, a las 8:00 A.M. a una temperatura de 23,5 ºC la identificación fue realizada por el Departamento de Botánica de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Granma.

El material fue lavado, con el propósito de eliminar la parte del material el cual no reunía las condiciones para su posterior estudio, según NRSP 309 del MINSAP (8).

Se tomaron muestras en estado adulto(hojas y corteza del fuste) las cuales fueron lavadas y desinfectadas con una disolución de hipoclorito de sodio al 2% (9), secado a la sombra a temperatura ambiente y extendido en bandejas perforadas, volteándose diariamente durante 7 días, luego se sometió a temperatura de 60 0C durante una hora en un horno estufa con circulación de aire (WSU 400, Alemana), triturándose hasta obtener un polvo grueso de 1 a 2 mm de diámetro, utilizando un tamiz circular (TGL 0-4188 WEB Metallwebwrei Neustadt-Orla, Alemania) y la corteza del fuste fue cortada previamente en fragmentos pequeños de 1 a 1,5 mm de diámetro, lo que fueron previamente cortados en fragmentos de 0,5 a 1cm de largo y finalmente molinar hasta obtener una partícula de 3,5 mm, que se empleó en la elaboración de los extractos y tinturas.

2.2. Formulaciones

2.2.1. Tintura al 20%:

Las tinturas 20% fueron obtenidas a partir de los polvos, en hojas (tamaño de partícula menor de 2 mm de diámetro), y en la corteza del fuste, utilizando como menstruo una solución etanólica al 70 % (v/v) en agua destilada. Se utilizaron 50 g de la droga cruda para obtener 250 mL de tintura al 20%. El método de extracción empleado para la obtención de las tinturas fue la maceración de la droga pulverizada en zaranda (MLW, Alemania) a 60 rpm durante 15 min a intervalos de 10 h, por un tiempo de siete días, según la Norma Ramal de Salud Pública 312 (1998), 11 la Norma Cubana de Salud Pública 313 (1998) ,12 y el Programa de Medicina Tradicional y Natural (1999). 13

2.2.2. Extracto seco a partir de la tintura:

Los extractos secos de las partes estudiadas de la planta Mammea americana (Mamey amarillo) fueron obtenidos a partir de las tinturas al 20% por rotoevaporación del solvente a 50oc en un Rotovaporador (KIKA LABORTECHNIK HB4 Basic), hasta obtener una masa consistente, la cual fue secada en una estufa, con recirculación de aire a 40ºC, hasta obtener una masa consistente y preservados en frasco color ámbar.

Luego a cada una de estas fracciones se le realizó tamizaje fitoquímico y pruebas microbiológicas.

2.2.3. Evaluación de la actividad antibacteriana

Para la evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos secos de la corteza del fuste y de las hojas de la Mammea americana (Mamey amarillo) se empleó el método de difusión en agar por diseminación superficial en discos (Bauer-Kirby) adoptado por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) como norma de aceptación general14, en el ensayo de actividad antibacteriana se utilizaron cepas de referencia internacional, depositadas en el American Type Culture Collection (ATCC), estas fueron: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 29737), E.Coli (113-3) y cepas comerciales como Bacillus Suptilis a concentraciones de 180, 360 y 720 &µg /disco, respectivamente.

2.2.4. Análisis estadístico

Se empleó un ANOVA de clasificación simple en la comparación de varias muestras por el test de Fisher, en los casos en que hubo diferencias estadísticamente significativas para un valor de p<0.05 se realizó un test de rangos múltiples para determinar las medias que diferían. El método utilizado para discernir entre las medias fue el procesamiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Tamizaje fitoquímico de tinturas a 20% y extractos secos de las hojas y corteza del fuste de la Mammea americana

En el resultado del tamizaje fitoquímico realizado a las tinturas al 20% y extractos secos, de las diferentes partes de las plantas en estudio (tabla 4), se puede observar una alta variedad de metabolitos secundarios, destacándose un alto contenido de alcaloides, coumarinas y quinonas, los demás metabolitos se encuentran en menor proporción.

Tabla 1. Resultados del tamizaje fitoquímico de la tintura 20% y extracto seco

A partir de las tinturas al 20 % se obtuvieron los extractos secos, por evaporación total del solvente (etanol 70 % (v/v)) a 50 ºC mediante roto-evaporación al vacío.

Tanto en la tintura 20% como en el extracto seco de hojas y corteza de Mammea americana, se encontraron alcaloides y coumarinas, excepto en el extracto seco de las hojas. También hubo presencia de taninos, quinonas y flavonoides. En el caso de las tinturas al 20 % en las parte de las hojas fue más abundante las coumarinas y en la corteza del fuste fue donde mejor hubo presencia de metabolitos, pues hay abundancia de alcaloides, coumarinas y quinonas. En el extracto seco de la corteza del fuste hubo presencia alcaloide, coumarinas, taninos, quinonas, flavonoides y alcaloides. Se destacan en ambas partes de la planta la presencia de alcaloides y quinonas, metabolitos reportados como responsables de diferentes actividades biológicas en las plantas como la antibacteriana. Al realizar una comparación en cuanto a la cantidad de familias químicas presentes en los extractos secos de las partes de la planta evaluadas se llega a la conclusión que existe un balance entre todas ellas. Los mejores resultados en cuanto a cantidad de familias de metabolitos secundarios correspondieron a la tintura 20 %de la corteza del fuste.

A partir de los resultados obtenidos hasta el momento se llega a la conclusión que los compuestos químicos pertenecientes a la familia de los alcaloides, coumarinas, taninos, quinonas y flavonoides se encuentran en los extractos evaluados. Por tanto es posible emplear los extractos secos de las partes evaluadas de la Mammea americana en la evaluación de la actividad antibacteriana de los mismos.

Se evidencia que la gentamicina presenta halos de inhibición entre 20-24 mm de diámetro frente a las cepas Staphylococcus aureus (ATCC 29737) por lo que es sensible y no mostró halos de inhibición frente a Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) por lo que es resistente (R). 15 Los controles negativos (etanol al 70 % y DMSO) no inhibieron el crecimiento de ninguna de las cepas bacteriana evaluadas por lo que los resultados obtenidos no estarán influidos, en principio, por el solvente. Al realizar el análisis de los resultados de la actividad antibacteriana de las tinturas al 20 % se evidencia que frente a Staphylococcus aureus (ATCC 29737) tuvieron resultados positivos en las hojas y corteza del fuste.

Todos los extractos secos mostraron actividad antibacteriana frente a las cepas de Staphylococcus a las concentraciones 180 &µg/disco de 360 &µg/disco y 720 &µg/disco con halos de inhibición entre 11 -13 mm de diámetro.

A pesar de esto no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ellos a la máxima concentración evaluada (720 &µg/disco), sin embargo hubo diferencias estadísticamente significativas entre los halos de inhibición de todos los extractos vegetales evaluados y la gentamicina. Estos resultados no son desalentadores por cuanto se debe tener en cuenta la diferencia de concentraciones entre los discos de gentamicina y los que contienen las tinturas al 20 % y los extractos secos de Mammea americana. En este sentido, los discos comerciales contienen el principio activo con altos niveles de pureza, en tanto para los discos de papel de filtro que contienen los extractos vegetales las concentraciones reportadas se refieren a la masa de sustancias solubles en etanol al 70 % (m/v). Se planteó anteriormente que estas muestras contienen varias familias de metabolitos secundarios, tales como alcaloides, coumarinas, taninos, quinonas y flavonoides. Por tanto, es probable que si se logra el aislamiento y purificación del (o los) principio (s) activo (s), se requiera de concentraciones menores para lograr resultados semejantes a los obtenidos con la gentamicina. Estos resultados sugieren que la planta de Mammea americana presenta metabolitos secundarios, solubles en etanol al 70 % (m/v), con actividad antibacteriana que están distribuidos en todos los óranos de la planta.

Con el objetivo de determinar si existe una relación entre la concentración del extracto seco y la actividad antibacteriana de estos, se probaron tres concentraciones (180, 360 y 720 &µg/disco) para cada uno de ellos. A pesar de esto se pudo evidenciar que se tiende a la dosis-dependencia entre las concentraciones evaluadas y los diámetros de los halos de inhibición para cada muestra. Estos resultados concuerdan con la mayoría de los principios activos que se conocen, para los cuales se cumple que a mayores concentraciones de principio activo es mayor la actividad biológica de estos. 16

Ninguna de las tinturas al 20 % ni extractos secos de los clones de Cacao evaluados mostró actividad antibacteriana frente a Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). En otros estudios realizados por AlimIsmihan et al,17en el aceite esencial de Cyclotrichium niveum (Boiss.) contra bacterias Gram (+) y Gram (-) frente a nueve microorganismos, cuatro de ellos presentes en este trabajo, demuestran que el más resistente es el P. aureginosa, aunque es de destacar que en los aceites esenciales de la planta se encuentran mayormente los metabolitos concentrados, por esta razón los halos de inhibición del resto de los microorganismos fue mayor con respecto al de este trabajo.

Adicionalmente, en estudios realizados por Mothana et al. (2009)18 con 26 plantas encontraron que solo 4 de ellas mostraron actividad antibacteriana frente a P. aeruginosa. Se han descrito varios mecanismos de resistencia de P. aeruginosa que podrían explicar la ausencia de actividad de los extractos vegetales evaluados frente a esta cepa. Estos incluyen baja permeabilidad de la pared celular a los agentes antibacterianos, capacidad genética de expresar un amplio repertorio de mecanismos de resistencia, por mutaciones en los genes cromosomales que regulan la expresión de genes de resistencia y por la adquisición de genes de resistencia foráneos vía plásmidos, transposones y bacteriófagos. 19

Se empleó la cepa Bacillus subtilis (ATCC 6633) como bacteria gram-positiva que pertenece al género Bacillus y que aunque en raras ocasiones se puede encontrar como causante de meningitis, endocarditis y conjuntivitis en pacientes inmunocomprometidos, es el modelo biológico de preferencia en diferentes investigaciones. Esta bacteria constituye el homólogo de Escherichia coli en las bacterias gram-positivas. Ninguno de los extractos vegetales evaluados mostró actividad antibacteriana frente a esta cepa de Bacillus subtilis, tampoco para la cepa de E. coli.

Las plantas presentan metabolitos secundarios, tales como alcaloides, coumarinas, taninos, quinonas y flavonoides. Estas familias de metabolitos secundarios son las más probables responsables de la actividad antibacteriana dado que todos los extractos fueron positivos al ensayo realizado.

El mayor halo de inhibición del crecimiento bacteriano los mostró el extracto seco del de la coerteza con 15 mm, para la concentración de 720 &µg/disco frente a las cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 29737).

Conclusiones

• Los metabolitos predominantes en tinturas 20% y extractos secos son alcaloides, coumarinas, taninos, quinonas y flavonoides.

• Las tinturas al 20% y extractos secos tienen actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus (ATCC 29737) con halos de inhibición entre 11 -13 para las hojas y 13,7 -15,0 para la corteza del fuste, con tendencia a dosis-dependencia, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos en las hojas, en la corteza del fuste existe diferencias significativas para la máxima concentración evaluada (720 &µg/disco).

• Existen diferencias estadísticamente significativas de las tinturas 20% y los extractos evaluados con respecto al control positivo.

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Autor:

Lic. Harold Remón Rodríguez 1

Lic. Yuniel Capote Martínez 2

DrC Manuel Almeida Saavedra 3

Dra. C. Galina Morales Torres 3

DrC. Quirino Arias Cedeño 3

DrC Melquíades Ramos Escalona 1

1 Departamento de Ciencias Básicas. Facultad de Ciencias Técnicas. Universidad de Granma, Carretera a Manzanillo Km. 17 ½, Bayamo, Granma, Cuba.

2 Laboratorio de Líquidos orales. Carretera de Santiago de Cuba, Bayamo, Granma.

3 Centro de estudio de Química Aplicada. Facultad de Ciencias Técnicas. Universidad de Granma. Universidad de Granma, Carretera a Manzanillo Km. 17 ½, Bayamo, Granma, Cuba.