Terapéutica celular en la cardiopatía isquémica

1. INTRODUCCIÓN

Disponer en el laboratorio de células capaces de diferenciarse – o sea, formar los diferentes tejidos del organismo – fue un problema que ha desvelado a los científicos durante años. Finalmente, en 1998, los investigadores norteamericanos James Thomson y John Gearhart anunciaron que podían hacer crecer en el laboratorio Células Troncales – o Progenitoras, también denominadas Madres – de origen humano. Se abrió así la puerta al diseño de nuevas estrategias terapéuticas médicas, y contribuir a una mayor eficacia en los tratamientos y el trasplante de órganos.

2. CONCEPTOS GENERALES

2.1. DE LA TOTIPOTENCIALIDAD A LA ESPECIALIZACIÓN

La célula huevo -o cigoto- producto de la fecundación, es Totipotencial, o sea que es capaz de generar por sí misma un individuo. Cuando el cigoto llega al estadio Bicelular –es decir que se duplicó una vez-, cada una de estas células puede potencialmente formar un feto. Aproximadamente cuatro días después de la fecundación, las células que se han dividido por mitosis, produjeron un aumento del número de células y una reducción de su tamaño, ya que el volumen total del embrión sigue siendo la del cigoto. Éstas células se denominan Blastómeras, y comienzan a especializarse. Cuando el embrión esta formado por aproximadamente 16 células se llega al estadio de mórula, a partir de esta etapa,

las células que constituyen el macizo celular interno darán origen al embrión propiamente dicho, mientras que la capa celular circundante contribuirá a la formación de la placenta.

Las blastómeras del macizo celular interno poseen la capacidad de generar todos y cada unos de los Tejidos y órganos del individuo en formación –o sea, que son Células Troncales, Madres o Progenitoras– pero no pueden formar todos los tipos celulares necesarios para el desarrollo fetal, como la placenta. Como su potencial no es total (no son Totipotenciales) se las denomina Pluripotentes (cuadros 1-2).

A medida que éstas células Pluripotentes se van dividiendo y diferenciando van perdiendo Potencialidad evolutiva, esto es, la capacidad de generar muchos tejidos diferentes, cuando alcanzan el máximo grado de diferenciación quedan circunscriptas a formar un único tipo celular. Por ejemplo, en la tercera semana del desarrollo embrionario humano ocurre el proceso de Gastrulación, durante el cual se forman las tres Capas Germinativas –el Endodermo, el Mesodermo y el Ectodermo. A partir de este momento, y siempre en condiciones normales, las células endodérmicas solo formarán tejidos de ese origen, ya que no tiene la potencialidad de producir tejido mesodérmico o ectodérmico. Éstas células progenitoras mas especializadas son denominadas Células Multipotentes.

Un grupo de células Multipotentes son aquellas que se ubican en la médula Ósea (figuras 1 – 2), y que darán origen a los glóbulos rojos, blancos, y a las plaquetas; son las Células Progenitoras Sanguíneas.

Al finalizar el desarrollo embrionario, algunas células conservan Potencialidad evolutiva, forman parte del tejido al cual dan origen, y son Multipotentes, se las denomina Stem Cell o Células Troncales, Progenitoras o Células Madre Adultas, para diferenciarlas de las que se encuentran en tejidos embrionarios.

Hasta hace poco se consideraba que las células progenitoras presentes en tejidos adultos –tales como las sanguíneas o las neurales- estaban restringidas a dicho tejido. Existen actualmente importantes evidencias que demuestran que células progenitoras adultas obtenidas de un tejido pueden contribuir a formar un tipo celular diferente cuando son expuestas a factores ambientales apropiados (es decir que son pluripotenciales).

Es importante destacar que para que una célula madre pueda considerarse pluripotencial tiene que cumplir con las siguientes condiciones:

Una única célula debe ser capaz de diferenciarse en células especializadas procedentes de cualquier capa embrionaria;
Demostrar la funcionalidad in vitro e in vivo de las células de las células en las que se ha diferenciado y, finalmente
Que se produzca un asentamiento claro y persistente de estas células en el tejido diana, tanto en presencia como en ausencia de daño en los tejidos en los cuales se injerta.

Se sabe que las Células Progenitoras Embrionarias (Stem Cell Embrionarias) tienen mayor potencialidad para dividirse y diferenciarse que las Células progenitoras Adultas (Stem Cell Adultas). Sin embargo, las células embrionarias presentan dos inconvenientes fundamentales para ser útiles en medicina: por un lado deben obtenerse de embriones humanos, lo que origina conflictos éticos y, por el otro, éstas células tienden a diferenciarse espontáneamente en todos los tipos de tejidos, lo que hace necesario aprender cómo hacer para que se diferencie solo en un tipo celular deseado.

Las Células Progenitoras de la mayoría de los tejidos de los mamíferos se replican y se diferencian por mecanismos asimétricos: cada célula progenitora origina otra célula progenitora y una célula hija diferenciada.

Durante la división asimétrica las células hijas adquieren diferentes potenciales de desarrollo por la segregación desigual de factores citoplasmáticos o por influencias diferenciales del medio. Los denominados Factores de Transcripción (FT) –proteínas que interactúan con el ADN presente en los cromosomas de la célula- regulan las divisiones asimétricas de las células progenitoras. Cada linaje es controlado por una combinación única de FT.

Se sabe que existe una compleja interrelación de señales entre las células progenitoras, sus hijas en diferenciación, células vecinas y el nicho o microambiente en el que se encuentran.(1)

2.2. CUÁLES SON LOS MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA PLURIPOTENCIALIDAD?

Como ya se ha dicho, la existencia de Células Madre Adultas o Stem Cell en diferentes tejidos, hematopoyético, neuronal, epidérmico, gastrointestinal, músculo esquelético, músculo cardíaco, hígado, páncreas o pulmón, no admite controversia, y actualmente se cuenta con la evidencia de que éstas células no solo pueden generar células maduras de dicho tejido al que pertenecen sino también tejidos derivados de otras capas embrionarias, cuyo caso mas típico es el de las células Madre Hematopoyéticas capaces de diferenciarse en tejidos como hepatocitos, músculo cardíaco, endotelio, o en tejidos derivados de las tres capas embrionarias. Este fenómeno es llamado Versatilidad o Capacidad de Transdiferenciación de las células madre adultas. Pero cuando son trasplantadas células madre adultas, los mecanismos involucrados (figura 4) en la diferenciación de estas células no son tan claros, existiendo actualmente cuatro hipótesis (7-10):

La mayor parte de los estudios publicados hasta el momento, a excepción del trabajo de Verfaillie, no han sido capaces de demostrar a nivel Clonal (una célula que de origen a dos poblaciones de células diferentes) la pluripotencialidad, lo que podría hablar de una heterogeneidad de la población celular estudiada, cada una con una potencialidad diferente;
Procesos de Fusión entre las células madre trasplantadas y las células residentes, lo que suele acompañarse de la formación de células con características de ambas poblaciones, y generalmente con doble dotación cromosómica;
Desdiferenciación de las células madre en células de distinta estirpe
Persistencia en el organismo adulto de células madre indiferenciadas remanentes de tejido embrionario con capacidad pluripotencial.

3. REGENERACIÓN MIOCARDICA

3.1. CONCEPTOS GENERALES

La posibilidad de inducir el desarrollo de cardiomiocitos en el corazón adulto se ha considerado una estrategia prometedora en el tratamiento de enfermedades como la insuficiencia cardiaca, la hipertrofia o la cardiopatía isquémica (3).

El concepto clásico que se ha mantenido a lo largo de muchos años sobre la incapacidad del corazón adulto para renovar sus células debe ser revisado a la vista de los resultados que se están obteniendo en diferentes modelos experimentales (24).

Los cardiomiocitos se generan a partir de un precursor celular que se divide y da lugar a grupos de células del mismo tipo. Durante la vida fetal, esta s células empiezan a diferenciarse y aparecen en su citoplasma las miofibrillas contráctiles. Estos cardiomiocitos fetales contráctiles conservan todavía la capacidad de dividirse a pesar de encontrarse en un estado diferenciado y, en el caso de los seres humanos, esta capacidad se mantiene hasta los 3 – 4 meses de vida postnatal. Se supone que a los pocos meses del nacimiento ya poseemos el número máximo de miocitos cardiacos que podemos llegar a tener, y que a partir de este momento las células que se pierdan ya no van a poder ser reemplazadas, lo que conduce a una disminución progresiva de su número hasta la muerte. Éste es el modelo de crecimiento que se ha considerado válido para las células musculares cardíacas y para las neuronas del sistema nervioso central. Este concepto del corazón como órgano no regenerativo está basado en observaciones superficiales y no esta de acuerdo con los datos recientemente obtenidos en animales experimentales y en humanos, los que demuestran que el corazón es un órgano en regeneración continua (2), que aumenta la producción de nuevas células musculares en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos y patológicos.

Desde hace varios años se piensa que existe una débil capacidad de proliferación de los miocitos en el corazón postnatal. Los cardiomiocitos en mitosis representan aproximadamente 14 x 106 células en el corazón normal, que se multiplican por 10 en el caso de un infarto agudo de miocardio. Se ha calculado que en el ventrículo izquierdo de un hombre de 45 años hay aproximadamente 5,5 x 109 miocitos cardiacos con un índice mitótico de 14 x 106 células; esto significa que 81.000 células están en mitosis en un momento dado. Las mitosis duran aproximadamente entre media y una hora y anualmente se producen un número importante de nuevos cardiomiocitos. Esta situación implica que de por sí el infarto agudo de miocardio trae aparejada una proliferación de miocitos en el área circundante.

Cuando el miocardio requiere un aumento en su capacidad contráctil puede satisfacer esta demanda incrementando el número de sarcómeros en las células existentes (hipertrofia), produciendo nuevos cardiomiocitos (hiperplasia) o una combinación de ambos. Los estímulos para que se produzca un crecimiento celular en forma hipertrófica o hiperplásica están muy relacionados.

La hipertrofia es un aumento del tamaño celular y es responsable de la mayor parte del crecimiento normal del corazón durante el desarrollo del individuo. El estímulo que provoca este crecimiento hipertrófico es el aumento de la tensión de la membrana celular, es decir, el estiramiento mecánico de su pared (que puede tener lugar durante el ejercicio o en respuesta a una hipertensión arterial leve) lo que, a su vez, desencadena una serie de respuestas bioquímicas: expresión de una batería de genes capaces de responder muy rápidamente, los protooncogenes, que estimulan la transcripción de genes de la contracción. Todo este proceso conduce al crecimiento celular y a la hipertrofia cardiaca. Si el estímulo mecánico sobre la pared celular se incrementa aún más, la contractilidad disminuye y se produce una alteración del metabolismo del calcio, que acaba por inducir la muerte celular.

La conexión bioquímica para trasladar el mensaje desde la membrana al núcleo celular la efectúa la angiotensina, ésta a su vez induce la expresión de una batería de protooncogenes.

La estimulación del receptor de la angiotensina, tanto el de tipo I como del tipo II, induce un aumento del calcio citoplasmático que, a su vez, produce la activación de una molécula denominada calcineurina, ésta desfosforila una factor citoplasmático de transcripción llamado NF-AT (factor nuclear de linfocitos T activados) y éste factor desfosforilado se transloca al núcleo y facilita la transcripción de los genes involucrados en la respuesta hipertrófica.

El calcio citoplasmático es el mensajero que actúa como intermediario entre la angiotensina y la calcineurina. El calcio es una molécula clave en el tráfico de señales intracelulares y su incremento puede poner en marcha numerosas cadenas metabólicas, entre ellas la activación de la apoptosis (mediante la inducción de la expresión del gen de la proteína p53). Este gen representa un punto de convergencia de muchos estímulos proapoptóticos y su función consiste en proteger a la célula contra la neoplasia.

En el proceso de desarrollo fisiológico del corazón, desde el momento del nacimiento hasta que se alcanza la edad adulta, existe un equilibrio entre los estímulos que promueven el crecimiento en tamaño de los miocitos y los que pueden conducir a la muerte celular programada y la necrosis. Diversos estudios refuerzan este concepto, y el hecho de que determinados procesos patológicos puedan provocar la muerte de miocitos y otras células cardiacas de forma tan importante pone en cuestión el concepto de que el miocardio no presenta recambio celular, y de que las células que existen poco después de nacer son las que se mantendrán a lo largo de la vida del individuo. Los datos que se han obtenido usando modelos animales sobre la tasa de muerte celular y el número total de células que configuran la masa ventricular apoyan la hipótesis de un recambio activo entre los miocitos cardíacos.

Estos datos son incompatibles con el concepto clásico que se ha mantenido hasta nuestros días sobre el bloqueo del ciclo celular en miocitos del corazón adulto.

El responsable del bloqueo del ciclo celular es un antioncogén conocido como la proteína del retinoblastoma, cuando esta molécula interacciona con los factores de transcripción específicos que encajan en su estructura el ciclo celular se detiene.

Por el contrario, cuando la proteína del retinoblastoma está inactivada porque la hendidura que interacciona con los factores de transcripción no puede utilizarse porque esta fosforilada, se sigue produciendo división celular.

En modelos animales, el análisis de las proteínas que se expresan en el desarrollo fetal ha revelado que no se detecta la proteína del retinoblastoma y que, en su lugar, se expresa la proteína p107, implicada de manera directa en la diferenciación celular. Es decir, que durante la vida fetal el corazón tiene miocitos capaces de diferenciarse gracias a la presencia de la p107, que es muy abundante en esta etapa, pero son células que no tienen todavía bloqueado su ciclo celular por la ausencia de la proteína del retinoblastoma. La hipótesis es que en el corazón adulto persiste un número residual de células que mantiene estas características fetales en su patrón de expresión proteica. Esta idea se halla documentada experimentalmente, y los resultados han demostrado, una vez más, que los miocitos cardiacos adultos se reproducen y que su tasa de división celular es mayor cuanto más viejo es el animal. Resultados demuestran que en el plazo de 4 – 6 meses se reemplazan aproximadamente una tercera parte de las células cardíacas, lo que significa que en 2 – 3 años se regenera el órgano completo.

3.2. INDUCCION DEL DESARROLLO DE CARDIOMIOCITOS

La regeneración miocárdica como alternativa al trasplante es una idea que se desarrolló a partir de un trabajo pionero del grupo de Cossu (18). En este trabajo se utilizaron ratones a los que se había eliminado por completo las células de la médula ósea por irradiación, en su lugar se trasplantaron células enzimáticamente marcadas procedentes de la médula ósea de ratones transgénicos. De manera sorprendente, estos animales trasplantados presentaron fibras musculares esqueléticas que procedían del animal donador. Este hallazgo histológico se produjo en todos los músculos esqueléticos del animal receptor.

A partir de estas observaciones distintos grupos de investigación han introducido las células madre de raton en animales consanguíneos que han sufrido un infarto de miocardio (figura 3). Los resultados obtenidos en los cortes histológicos demuestran que en la zona de miocardio infartado puede regenerarse a partir de éstas células madre. Cuando las células se introducen en el borde de la zona de necrosis es posible obtener un crecimiento en continuidad con el tejido normal que reemplaza la zona necrótica en el plazo de 2 semanas. Además, no solo regeneran los cardiomiocitos, sino también las células endoteliales y las células musculares lisas. Estos animales presentaron una mejoría significativa de su función ventricular.

De la misma manera, se cuenta con la evidencia que en los seres humanos los cardiomiocitos se dividen luego de un infarto de miocardio. Todos los resultados indican que le corazón adulto tiene una subpoblación de miocitos que no han terminado su diferenciación; esos miocitos sufren división mitótica nuclear luego de un infarto. El número de miocitos en mitosis es significativamente mayor en la zona lindante al infarto que en el miocardio distante a él.

En animales en los que se les provoca enfermedad coronaria, se demostró el incremento de la replicación del DNA y el aumento de la actividad mitótica miocítica, esta respuesta tiene un pico a los 7 – 14 días luego de la oclusión coronaria para decrecer posteriormente. Fenómeno similar ocurre en seres humanos, sugiriéndose que en la insuficiencia cardiaca crónica se afecta progresivamente la actividad mitótica cuando la causa es el infarto de miocardio.(3)

Esta proliferación celular puede originarse desde cardiomiocitos residentes o desde Stem cells circulantes, luego del infarto.

4. CARDIOMIOPLASTIA CELULAR

4.1. CONCEPTOS GENERALES

En contraste con otras enfermedades cardiovasculares, la mortalidad y la morbilidad de la Insuficiencia cardiaca congestiva no han descendido, a pesar de los importantes progresos en los tratamientos farmacológicos.

El objetivo del tratamiento médico durante un infarto agudo de miocardio es establecer la reperfusión y salvar la mayor cantidad posible de miocardio, si ésta no es realizada rápidamente, la Disfunción ventricular izquierda, diastólica y luego sistólica, el remodelado ventricular y finalmente la Insuficiencia cardiaca congestiva son las consecuencias de la muerte de los cardiomiocitos, con elevación de las presiones de llenado ventricular que incrementan el estrés parietal, y la consecuente liberación al medio de neurohormonas y mediadores deletéreos.

Luego del infarto agudo de miocardio, el remodelado ventricular es en parte determinado por la neovascularización, al incremento de la apoptosis, especialmente en el borde de la zona infartada, y la hipertrofia de los cardiomiocitos marginales al infarto, éstos son parte de los mecanismos adaptativos que tratan de compensar la muerte de miocardio.

Aunque células derivadas de cardiomiocitos residuales y células madre circulantes pueden tener la capacidad de regenerar parte del miocardio (2), su habilidad para minimizar los efectos deletéreos del remodelado ventricular y recuperar función cardiaca son limitadas. Por lo tanto, el próximo paso lógico sería repoblar la escara necrótica miocárdica con células Progenitoras o Stem Cell (10) con la finalidad de regenerar cardiomiocitos y revertir el remodelado ventricular, reestableciendo la contractilidad regional miocárdica.

Actualmente existen tres áreas de investigación en este campo:

La utilización de mioblastos de músculo esquelético, obtenidos mediante biopsia de tejido de cuádriceps crural o bíceps braquial. Luego de separadas las células por medios físicos y químicos, son cultivadas con nutrientes y estimuladores para lograr, al cabo de 7 a 30 días, una cantidad suficiente para ser inoculadas.
La utilización de células madre de médula ósea (stem cells de la literatura inglesa).
El uso de factores quimiotácticos y estimulantes para el crecimiento de células madre (stem cell factor).

Estudios recientes han demostrado que el trasplante de células cultivadas en el miocardio no viable ofrece una nueva posibilidad de restauración de la disfunción cardiaca, ya que se demostró que las células implantadas sobreviven y proliferan dentro del corazón nativo.

Una de las cuestiones pendientes es qué tipo de células o qué combinación celular serían apropiadas para la regeneración miocárdica (7-8-10).

Tomando en cuenta situaciones no resueltas que incluyen disponibilidad, problemas inmunológicos derivados de su aplicación clínica, potencialidad en la génesis tumoral de las células producidas comercialmente por laboratorios de biología celular, y cuestiones éticas inherentes a su utilización, las células mas empleadas en los Cardioimplantes son:

Células Musculares Esqueléticas, son capaces de regenerarse después de una injuria debido a la presencia de células satélites (mioblastos). Este tipo celular es muy resistente a la isquemia, se multiplican después de la injuria y presentan un alto poder para mitosis múltiples. En su diferenciación terminal, los mioblastos de músculo esquelético forman miotubos multinucleados (proceso éste de Fusión) crucial para el desarrollo de músculo esquelético y, en el adulto, para la hipertrofia y el reparo muscular.
Células de la Medula Ósea. Hay cuatro líneas celulares que pueden aislarse de la medula ósea:

Células madre Hematopoyéticas (HSC)
Células madre Mesenquimáticas (MSC)
Células Progenitoras Adultas Multipotentes (MAPC)
Células Progenitoras Endoteliales

A su vez, las MSC (también llamadas Células del estroma de la medula Ósea) son capaces de dar múltiples líneas celulares.

Células Madre en sangre Periférica, son similares a las obtenidas por aspiración de la Medula Ósea, éstas células autólogas mononucleares pueden movilizarse previamente por la administración de citoquinas en forma de Factores estimulantes de crecimiento (Ej., G-CSF o Granulocyte Colony- Stimulating Factor), y por Estatinas.
Células Endoteliales Vasculares, pueden recogerse de arterias o venas autólogas con el fin de ser utilizadas para producir Angiogénesis y Neovascularización. Esta posibilidad tiene la ventaja de iniciar y promover angiogénesis, y producen un extenso plexo capilar, pero no pueden promover la formación de vasos suficiente para regenerar el miocardio isquémico. La asociación de terapia celular miogénica y angiogénica podría ser beneficiosa, ya que la prevascularización de escaras miocárdicas indudablemente debe mejorar las condiciones locales para la sobrevida de las células implantadas (Precondicionamiento).

El 50% de los casos practicados en el mundo responden al empleo de Células Madre de la Medula Ósea y el otro 50% al de Mioblastos. Existen, sin embargo, diferencias cualitativas entre miogénesis y angiogénesis; según el Dr. Juan Carlos Chachques, uno de los precursores de la Terapia Celular, del Hospital George Pompidou, de París, los mioblastos regeneran el miocardio y reemplazan una cicatriz, que se convierte en tejido viviente de tipo muscular. "La vía de la miogénesis mejora la elasticidad de la pared del ventrículo, disminuye la fibrosis y el tamaño del infarto". Por su parte, las células madre se diferencian en Angioblastos que producen neovasos, "estos vasos ayudan a mejorar la zona intermedia entre el infarto el área sana". Considera que la combinación de la miogénesis y la angiogénesis será el camino por el que avanzará la Terapia celular del miocardio.

El máximo beneficio del transplante celular sería en un corto período luego del infarto de miocardio, pues, existen mecanismos endógenos de reparación, en los que la inflamación y la hipoxia tisular estimulan la liberación de mediadores (Figura 5) :

Granulocyte colony – stimulating factor, que movilizan a las células Madre desde la medula ósea a la circulación;
Stem cell factor, que al igual que el anterior movilizan a las células Madre desde la medula ósea a la circulación;
Vascular endothelial growth factor (VEGF), estimula la formación de neovasos, signo local crucial para el reclutamiento de células progenitoras desde la circulación, asistiendo a los mecanismos de reparación miocárdicos;
Stromal cell – derived factor – 1, (SDF-1), que también reclutan células progenitoras para asistir a los mecanismos de reparación miocárdicos.

Éstos mediadores, junto al incremento en la permeabilidad vascular y a la expresión de moléculas de adhesión locales, facilitarían el anclaje de las células transplantadas.

4.2. SELECCION DEL PACIENTE PARA EL IMPLANTE CELULAR

La indicación para el implante celular (tanto de mioblastos como de stem cells) recae en pacientes con:

Disfunción sistólica del VI con una Fey ≤ 40%, analizada por ecocardiografía y ventriculografía radioisotópica
Cardiopatía isquémica, con antecedentes de infarto de miocardio (tanto del ventrículo izquierdo como del derecho), presencia de escaras aquinéticas y disquinéticas, no viables, demostradas por diferentes métodos. Estas escaras no deben tener posibilidades de revascularización.
Indicación concomitante de cirugía coronaria en área remota (diferente del área trasplantada) con evidencias de viabilidad e isquemia y anatomía coronaria NO pasible de angioplastía percutánea.
Clase funcional II – III (NYHA)
Espesor de la pared ventricular > 5 mm
En cardiomiopatía dilatada de origen no isquémico que son causas de insuficiencia cardiaca. La cardiomioplastia celular puede mejorar la función cardiaca, y las células implantadas poseen una mayor sobrevida en el miocardio receptor, porque la irrigación miocárdica en esta patología no está significativamente deteriorada.

La inyección celular precoz, luego del infarto puede beneficiar la formación de una escara fibrotica amplia, sin embargo parece ser razonable realizar el implante luego de que la reacción inflamatoria se halle en retroceso.

4.3. QUÉ PACIENTES QUEDAN EXCLUIDOS?

a. Los pacientes con enfermedades musculares esqueléticas deben ser excluidos del implante de mioblastos

b. Pacientes con historia de taquicardia ventricular o fibrilación ventricular, así como aquellos que tienen un cardiodesfibrilador implantado, o son candidatos a su colocación deben evaluarse cuidadosamente ya que el implante de células conlleva el riesgo de inducir arritmias como potencial complicación

c. Infarto agudo de miocardio < 4 semanas

d. Deben excluirse pacientes que cursen enfermedad infecciosa activa, pruebas de enfermedad viral (+), como Ej., HIV, HVB, HVC

e. Enfermedades graves neoplásicas

f. Mujeres embarazadas

4.4. EL TRASPLANTE CELULAR DE MIOBLASTOS ESQUELETICOS

La mejoría de la función miocárdica observada experimentalmente en ratones, llevó al grupo francés dirigido por Philipe Menasché a iniciar su experiencia clínica en seres humanos (5), así el 15/6/2000 realizaron el primer implante celular en un hombre de 72 años en insuficiencia cardíaca postinfarto alejado. El implante se realizó al mismo tiempo que la cirugía de revascularización de miocardio en áreas alejadas, logrando la activación contráctil y metabólica, con mejora de la Fey y de la clase funcional.

Se cumplen desde entonces, en todo el mundo, estudios en fase I con resultados muy alentadores. Basado en estos estudios, a fines del 2002 se inició un Estudio multicéntrico randomizado en Fase II (MAGIC, Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopaty) que aportará conclusiones muy importantes.

4.4.1. METODOLOGÍA DEL IMPLANTE DE MIOBLASTOS ESQUELÉTICOS (9)

4.4.1.1. BIOPSIA MUSCULAR

Para el procedimiento de cultivo se extraen 600 ml de suero autologo, la ½ antes de efectuar la biopsia.

Se obtiene una muestra para biopsia de 10 a 15 gramos de músculo esquelético del muslo (músculo vasto lateral) bajo anestesia local. Se fragmenta la muestra y se traslada en medio de preservación al laboratorio de Cultivo, para análisis histológico de la muestra.

Los mioblastos provienen del músculo esquelético y se denominan también Células Satélites, son de fácil multiplicación y las más estudiadas. Ubicadas en la membrana basal en carácter latente, hasta que un estímulo hace disparar su replicación. Estos se hallan en línea celular que se extiende desde la célula mesodérmica indiferenciada hasta las células diferenciadas cardiacas, esqueléticas y de músculo liso. Son células resistentes a la isquemia, lo que permite su crecimiento y multiplicación en un medio óptimo de nutrición.

4.4.1.2. PROCESO DE CULTIVO

Decontaminación de la muestra con concentraciones crecientes de antibióticos,

separación de tejidos aledaños,

digestión enzimática del macerado con enzimas (colagenasa, tripsina),

filtración y centrifugación,

resuspensión del remanente en medio de crecimiento con 10 – 20% de suero autólogo,

sembrado e incubación a 37ºC en cámaras húmedas con 5% de CO2,

expansiones necesarias hasta llegar a 200 millones de células,

tiempo de cultivo de 3 a 4 semanas.

El día del implante se recolectan mioblastos y se resuspenden en una solución de ClNa y Albúmina recombinante al 0,5%.

Ensayos microbiológicos e identificación cualitativa y cuantitativa de mioblastos,

y su traslado a una temperatura de 4ºC.

Los cultivos celulares en suero autologo, evitan la fijación de proteínas animales en la superficie celular (que ocurría cuando se utilizaba suero bovino) y que actuaba como antígeno produciendo efectos adversos (fibrosis, circuitos de reentrada, arritmias graves), además se evita el riesgo de la contaminación con priones, virus y zoonosis.

4.4.1.3. VIAS DE ABORDAJE PARA EL IMPLANTE DE MIOBLASTOS

La mortalidad celular que sigue a un implante, parece ser muy importante cuando se colocan en el centro de una escara altamente fibrotica (baja disponibilidad de nutrientes y oxígeno).

El implante se realiza en las áreas periféricas de las escaras (zonas intermedias entre tejido normal y fibrótico).

La impregnación con amiodarona tres semanas antes del implante previene la aparición de arritmias.

La corticoterapia perioperatoria se utiliza para controlar un proceso inflamatorio excesivo.

Las siguientes son las técnicas aplicadas para el implante (figura 6):

INTRAMIOCARDICO, sea por vía EPICARDICA (quirúrgico durante la cirugía de revascularización, o por toracoscopía);

ENDOVENTRICULAR, por cateterismo, utilizando como guía del procedimiento el Mapeo ventricular electromecánico 3D (Catéter Percutáneo NOGA System), o la Fluoroscopia biplana y guía ultrasónica.

INTRAVASCULAR, que puede ser INTRACORONARIA,

INTRAVENOSA CORONARIA,

INTRAVENOSA SISTÉMICA.

4.4.1.4. SEGUIMIENTO

Los estudios realizados para comparar la motilidad regional entre el preoperatorio y el postoperatorio se realizan con Ecocardiografía Colorkinesis a los 90 días del implante, y con un seguimiento promedio de 9 ± meses.

Se utilizan también la Ventriculografía radioisotópica y la Resonancia Magnética Nuclear.

4.4.1.5. RESULTADOS

Los estudios ecocardiográficos demostraron una mejoría en el índice de motilidad parietal, una reducción significativa del tamaño de la escara del infarto, mayor engrosamiento sistólico de los segmentos implantados.

La Ventriculografía radioisotópica ha demostrado un incremento en la fracción de eyección del ventrículo izquierdo.

Las pruebas de viabilidad del miocardio demostraron áreas nodulares de regeneración.

Los pacientes lograron una mejoría de la clase funcional (NYHA).

4.4.1.6. MECANISMOS DE ACCIÓN

Varios factores, en forma directa o indirecta, contribuyen a lograr beneficios estructurales y funcionales. El implante de mioblastos incrementa la elasticidad regional y modifica la matriz celular con la finalidad de prevenir el remodelado ventricular, contribuyendo a evitar el adelgazamiento de la escara y la debilitación del ventrículo. Reducción del tamaño y fibrosis de las escaras.

No se ha dilucidado aun el mecanismo que demuestre la transmisión y propagación de los impulsos eléctricos desde el corazón nativo a las células implantadas, considerando al estímulo mecánico de los cardiomiocitos circundantes el responsable para producir la contracción.

4.5. TRANSPLANTE DE STEM CELLS DE LA MEDULA ÓSEA y CIRCULANTES

Entre los numerosos trabajos experimentales que avalan su uso, cabe mencionar el de Orlic y Anversa (6), quienes implantaron células madre de la médula ósea que expresaba una proteína verde fluorescente que permitía la identificación de sus progenies en animales con infarto experimental. A los 9 días, los autores observaron que el 68% del área miocárdica afectada estaba ocupada por células con características de cardiomiocitos, células musculares lisas y células endoteliales, con una mejoría concomitante de la función cardiaca. Así demostraron que las células de la médula ósea pueden generar miocardio de novo y reducir el remodelado postinfarto.

La mayoría de los datos con que se cuenta acerca del Transplante de Stem Cells en el infarto de miocardio surgen de estudios preclínicos en animales, actualmente se encuentran en marcha estudios clínicos randomizados, particularmente, en nuestro país, el grupo del Dr. Trainini JC, lleva adelante el implante de Mioblastos esqueléticos y el transplante de Stem Cells de la médula ósea (cresta ilíaca).

El implante de células de la médula ósea movilizadas (células CD 133+), protocolo basado en la utilización de una subpoblación de células de la médula ósea, las CD 133+, son progenitoras presentes en pequeño porcentaje en la médula humana, y con una tendencia a diferenciarse en verdaderos hemangioblastos y células musculares.

Las células que expresan el antígeno de superficie AC 133 son ricas en progenitores de angioblastos y pueden ser aisladas por biopsia de la médula ósea o movilizadas de la sangre periférica con G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos).

El modo de implante de las Stem Cells es similar al de los mioblastos esqueléticos, con una mayor tendencia a la vía Intracoronaria luego de su angioplastía.

El seguimiento de los pacientes implantados es similar también a los del grupo de mioblastos.

Los resultados obtenidos parecen ser mucho mas alentadores debido a que no solos se diferencian en cardiomiocitos, sino que también producen neovascularización.

Se llevan a cabo estudios no solo con el implante de stem cells en el postinfarto alejado, sino en el Infarto agudo de miocardio, en el que se realiza una angioplastía primaria, con la infusión intracoronaria (a los 4 – 8 días de la APTC) de células progenitoras circulantes y de stem cells de la médula ósea.

Así tenemos que, después de un año de estudio del TOPCARE – AMI (Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction) demostró el aumento de la regeneración e incremento de la función miocardica en pacientes que habían sufrido un infarto agudo de miocardio. Estos resultados fueron publicados en el Journal of the American College of Cardiology (septiembre del 2004).

El TOPCARE – AMI (15) investigó la seguridad, factibilidad y efectos potenciales en los parámetros de función miocárdica tras la infusión intracoronaria de Células Progenitoras Circulantes (CPC) ó Células Progenitoras derivadas de la Médula Ósea (BMC), en pacientes con infarto agudo de miocardio. Un total de 59 pacientes fueron randomizados, asignados a recibir CPC o BMC en la arteria coronaria responsable del infarto, después de 4,9 ± 1,5 días de sufrido.

La aplicación intracoronaria de las Células Progenitoras o Stem Cells no incurrió en nuevo daño miocárdico, pero un paciente experimentó embolia distal luego de la terapia celular.

Durante la fase hospitalaria, un paciente de cada grupo desarrolló infarto de miocardio, y uno de ellos falleció por Shock cardiogénico. No aparecieron nuevos eventos cardiovasculares, incluyendo arritmia ventricular o síncope.

Por Ventriculografía a los 4 meses, se vio un incremento significativo en la Fracción de Eyección, y una significativa reducción en el Volumen de Fin de sístole, sin diferencias entre los dos grupos.

Por Resonancia Magnética Nuclear con contraste, luego de un año del implante, se evidenció un incremento en la Fracción de Eyección, reducción del tamaño del infarto y ausencia de hipertrofia reactiva (remodelado), sugiriendo la regeneración funcional del ventrículo infartado.

La infusión de células progenitoras (BMC o CPC) es segura y factible en pacientes luego de un infarto de miocardio, luego de realizárseles una Angioplastía transcutánea con implante de Stent.

Se esperan los resultados de grandes estudios randomizados doble ciego sobre la seguridad del implante de células y de los efectos sobre el remodelado ventricular.

Otro estudio recientemente finalizado, el BOOST (transferencia Intracoronaria de Células Progenitoras de la Médula Ósea luego del Infarto Agudo de Miocardio), estudio clínico controlado randomizado (14), en el que tomaron pacientes con síndrome coronario Agudo con elevación del ST a los que se le efectuaron Angioplastía Transcutánea (78 pacientes), se randomizaron 60 de ellos y fueron asignados unos a Grupo Control (n=30) quienes recibieron tratamiento óptimo postinfarto, y otros al Grupo de Implante Celular (n=30) quienes también recibieron óptimo tratamiento médico y transferencia de células autólogas Progenitoras de la Médula Ósea a los 4 – 8 días luego de la intervención percutánea coronaria. El volumen aspirado de las médula ósea fue promedio de 128 ml tomado de la Cresta Iliaca posterior. Durante la preparación de las células de la médula ósea, el proceso de sedimentación reduce el volumen de células de la médula a una media de 26 ml, recuperando un 75% de células nucleadas desde el aspirado inicial. La preparación final de células de la médula ósea contiene 24,6 x 108 células nucleadas (viabilidad del 99%), 9,5 x 106 células CD33+, y 3,6 x 106 células formadoras de colonias Hematopoyéticas. El conteo celular final de la preparación fue de 182 x 106 por ml.

El punto final primario fue comparar la Fracción de Eyección del VI (FEy Vi) inicial y el medido a los 6 meses, determinado por Resonancia Magnética Nuclear, cuyo análisis de imágenes fue realizado por dos

investigadores que desconocían el tratamiento asignado. La FEy Vi inicial o basal, determinada a los 3 – 5 días después de la Angioplastía, fue del 51,3% en el Grupo control, y de 50,0% en el otro grupo; después de 6 meses la media de FEy Vi hallada fue incrementada en 0,7% en el grupo control, contra un incremento del 6,7% en el grupo de Implante celular.

Concluyendo que la transferencia de Células progenitoras de la Médula Ósea incrementa la FEy VI , especialmente en los segmentos adyacentes al área infartada; no incrementa el rango de efectos clínicos adversos, ni tiene incidencia en la estenosis del stent, ni efectos proarrítmicos. Concluyendo que el implante de Células progenitoras de la médula ósea promueve un incremento de la función sistólica del ventrículo izquierdo en pacientes post Infarto de Miocardio.

En un pequeño estudio multicéntrico prospectivo de 14 pacientes realizado en nuestro país (17), en los que se administró aspirado de médula ósea autóloga no fraccionada por vía del seno coronario en pacientes con angina crónica estable, demostró mejoría en un 38% en calidad de vida, a los 180 días mejoro el grado de angina, en 13/14 pacientes mejoró, a los 90 días, la perfusión miocárdica. La angiografía coronaria mostró mayor circulación colateral en 9/14 pacientes.

5. ANGIOGENESIS TERAPÉUTICA MIOCÁRDICA

Se puede definir la angiogénesis como la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, así en esencia, difiere de la vasculogénesis el cual es un fenómeno embriogénico en donde, nuevos vasos sanguíneos se forman de novo a partir de islotes sanguíneos compuestos de stem cells.

La angiogénesis requiere de una serie procesada de eventos que incluye: la migración y proliferación de células endoteliales dentro y fuera de la microvasculatura original, el rompimiento de membranas basales, y finalmente la expresión controlada de enzimas proteolíticas que pueden degradar matriz extracelular, reensamblar nueva matriz extracelular, y formar tubos endoteliales.

El proceso normal de angiogénesis incluye moléculas proangiogénicas y antiangiogénicas. Dentro de las moléculas angiogénicas principales que se conocen en la actualidad están: Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), Factor alfa de necrosis tumoral, Factor beta de transformación del crecimiento, Factor de crecimiento derivado de plaquetas y la angigenina. También es importante señalar, que la hipoxia tisular es una de las mayores fuerzas que estimulan la angiogénesis.

Desde principios y mediados de los años noventa, se han hecho esfuerzos por aumentar la respuesta angiogénica natural, aplicándola al tratamiento de la enfermedad arterial periférica y la cardiopatía isquémica avanzada.

El objetivo principal, es alterar selectivamente el programa genético celular vascular. En primer lugar se identifica el gen de interés, posteriormente se introduce al huésped, el gen se transcribe y posteriormente se expresa sintetizando la molécula apropiada. En el proceso se utilizan vectores virales (retrovirus, adenovirus, y herpesvirus modificados) y no virales. Los efectos colaterales de este tip[o de vectores pueden representar riesgos para el huésped, por lo que esto ha originado otras técnicas como la inoculación directa de genes o la infusión de las propias substancias o Factores Angiogénicos.

Con base en la experimentación en animales, se ha demostrado la utilidad de los factores angiogénicos en el miocardio isquémico.(16)

Se ha experimentado hasta el momento varias rutas de administración de genes recombinantes o factores angiogénicos, a saber, intravenosa e intracoronaria, intrapericárdica, inyección intramiocárdica y endomiocárdica, utilizando técnicas de cateterismo percutáneo. En el momento actual se desconoce cuál es la vía más efectiva y segura. Con relación a estudios utilizando inyección intramiocárdica directa, la primera experiencia clínica fue reportada por Schumacher (23), quien utilizó factor de crecimiento fibroblástico recombinante inyectado directamente en el miocardio de pacientes sometidos a revascularización con puente de mamaria; la inyección se hizo de manera distal al sitio de la anastomosis. Al realizar una angiografía a estos pacientes 12 semanas después de la cirugía, se observó un aumento de la red arterial alrededor del sitio de la inyección.

Más recientemente se diseñó un sistema basado en técnicas de cateterismo percutáneo y guiado por un mapeo endocárdico electromecánico basado en campos magnéticos (sistema Biosense), el cual permite la administración de genes, factores angiogénicos y células directamente en el endocardio, siendo aplicado en un sitio específico y local de miocardio isquémico.

En cuanto a su aplicación clínica, es de destacar el estudio VIVA (21) aleatorizado, controlado y doble ciego en pacientes sin opción de revascularización. A los 120 días, existían diferencias significativas en cuanto al grado anginoso en el grupo de mayor dosis respecto del control y grupo de menor dosis.

Baumgartner y col.(19) aplicaron a nivel intramuscular un plásmido codificador de VEGF a pacientes con enfermedad vascular periférica e indicación de amputación. observaron un aumento en los niveles plasmáticos de VEGF y una mejoría clínica en las úlceras isquémicas y en la necesidad de amputación.

Losordo y col.(20) aplicaron a nivel miocárdico mediante inyección intramiocárdica un plásmido de DNA codificador de VEGF, en el territorio isquémico de cinco pacientes, en los que se observó una disminución del grado anginoso.

El estudio KAT (22) que incluye 103 pacientes a los que a continuación de implantarles un Stent coronario se los asignaba a terapia génica con adenovirus-VEGF, plásmido-VEGF o placebo, mediante infusión intracoronaria. A los 6 meses de seguimiento no se objetivaron efectos adversos ni reestenosis en los grupos de tratamiento, además, el grupo tratado con adenovirus-VEGF presentó una mejoría significativa en la perfusión miocárdica al compararlo con los otros dos grupos.

La administración de factores angiogénicos puede tener riesgos potenciales aún no bien determinados en el paciente como son, incremento de actividad tumoral en neoplasias ocultas, acelerar retinopatía preexistente, complicaciones de lesiones ateroscleróticas, así como efectos proaterogénicos.

Se puede concluir que el uso de genes recombinantes o de moléculas angiogénicas que aumentan el flujo colateral en las zonas isquémicas, puede representar una nueva forma de tratamiento en pacientes con enfermedad isquémica avanzada y que no son candidatos a cirugía de revascularización coronaria y/o angioplastía coronaria.

6. CONCLUSIONES

Tanto el transplante celular como al angiogénesis, han despertado enormes expectativas en el mundo científico, como terapéuticas destinadas a mejorar la viabilidad miocárdica, limitar el infarto, y restaurar la función muscular de una miocardiopatía dilatada idiopática.

Deben concluirse grandes estudios aleatorizados, con gran número de pacientes, determinando entre otras cosas:

Precondicionamiento para la diferenciación de las células madre antes del implante
Demostración y mejoramiento del acoplamiento electromecánico entre las células transplantadas y las nativas
Optimización en el promedio de las células que sobreviven al procedimiento de transplante, en el corto y largo plazo
Necesidad de repetidas y múltiples implantes para recolonizar progresivamente la escara miocárdica
Momento oportuno para realizar el implante celular en la cardiopatía isquémica
Asociación de terapéuticas angiogénicas con el implante celular
Transplante celular combinado con un marcapaseo auricular biventricular sincronizado, lo que mejoraría la distribución celular, desarrollo de miotubos y aumento de las cadenas de miosina
Determinar en estudios comparativos a largo plazo, con cual de las técnicas analizadas (implante de Mioblastos, de Stem cells, angiogénesis, y combinación de técnicas) se obtiene los resultados mas alentadores.

Es un gran desafío, muy complejo, interdisciplinario, que está en sus comienzos, que requiere de análisis muy rigurosos, y que constituyen una gran promesa para el tratamiento de las patologías que se acompañan de degeneración o necrosis tisular y disfunción celular.

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Dr. Alfredo Spatola