Hidrólisis enzimática de la carne de alpaca mediante la papaina (página 2)

Son los monómeros y los principales constituyentes de las proteínas por lo que su distribución y concentración determinan fundamentalmente las propiedades de cada proteína. Exceptuando la hidroxiprolina y la prolina, que son consideradas como a-iminoácidos, los demás aminoácidos son ácidos a-amino carboxílicos con carácter anfotérico debido a la presencia de los grupos amino y carboxilo. Son a-aminoácidos porque los grupos carboxilo y amino se encuentran en el carbono a de la molécula mientras que en los a-iminoácidos el nitrógeno del grupo amino interacciona de tal manera que se forma un anillo heterocíclico de cinco miembros. Con excepción de la glicina que tiene un átomo de hidrógeno como radical R, todos los a-aminoácidos presentan un carbono asimétrico y por lo tanto existen en dos formas ópticamente activas: D y L isómeros. De acuerdo con la estructura química del gliceraldehído, los aminoácidos que se encuentran en la naturaleza, y que tienen actividad biológica son los de configuración L. Las de la serie D se encuentran en las mezclas racémicas de aminoácidos producidos a través de distintos procesos químicos y no son aprovechados por el organismo humano en la síntesis de proteínas, sino que en la mayoría de los casos sirven únicamente como fuente de energía.

FIGURA 2.3. Isómeros de los a-aminoácidos

c. PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS

Solubilidad. Dependen en gran parte del pH, el efecto del medio ácido o alcalino determinan que el aminoácido esté presente en forma predominante positiva o negativa, la cual favorece la solubilidad, también se aumenta ésta subiendo la fuerza iónica de la solución, aunque, cuando es excesivo el aumento los aminoácidos tienden a precipitarse.

Absorción de Luz Ultravioleta. Los aminoácidos con radicales cíclicos como la tirosina, absorben luz ultravioleta, con máximo de absorción a 275 milimicras, hecho que permite hacer análisis de proteínas, basándose en que estos aminoácidos constituyen un índice de la proteína total en vista de estar presentes de modo constante en las proteínas.

Actividad óptica. Los aminoácidos son ópticamente activos y algunos de ellos desvían la luz polarizada hacia la derecha y otros hacia la izquierda.

Las propiedades químicas más importantes son: Reacción con ácido nitroso, Titulación con formol, N-arilación, Reacción de la ninhidrina.

2.2.4.1. LA CARNE FUENTE DE PROTEÍNAS

De acuerdo con su función las proteínas de origen animal se han dividido en proteínas contráctiles (miofibrilares), sarcoplásmicas y de tejido conectivo o estroma; el porcentaje de cada fracción depende de la especie animal que se trate. Por ejemplo, en el ganado vacuno se obtiene una distribución de aproximadamente 50%, 35% y 15% respectivamente, las proteínas solubles de los tejidos animales son las miofibrilares y las sarcoplásmicas, mientras que las del tejido conectivo son muy insolubles, las principales características de las proteínas solubles son su poder emulsionante y su capacidad de absorción de agua, por la que evitan pérdidas de humedad durante el proceso de cocción de los cárnicos y sus derivados, además tienen la capacidad de coagular formando geles de una textura que es desecada en varios alimentos.

La carne es uno de los alimentos más ricos en nutrientes y fuente excelente de proteínas de alto valor biológico, de vitaminas de complejo B y de sustancias minerales, particularmente hierro.

El valor biológico puede reducirse si la carne contiene cantidades importantes de tejido conectivo, ya que este, prácticamente no contiene metionina y triptófano.

2.2.4.2. LA CARNE DE ALPACA (Lama pacos).

La carne de alpaca se caracteriza por su bajo nivel de grasa intramuscular y un contenido de minerales, aminoácidos y ácidos grasos comparables a los encontrados en carne de vacuno y ovino. Sin embargo, la carne de alpaca muestra un cociente de ácidos grasos n-6/n-3 más favorable que el de la carne de vacuno u ovino y una baja concentración de vitamina E. La caracterización de la carne de alpaca en lo que respecta a los parámetros que determinan su calidad tecnológica también ha sido reforzada con el presente trabajo. La nueva información aportada por este estudio ha sido la determinación de los parámetros del color (CIELab) y el contenido en mioglobina. En relación a los valores de pH, dureza y CRA fueron coincidentes con los encontrados por otros autores en carne de alpaca, y en su defecto en carne de otros camélidos u ovinos, de similar tamaño y/o edad de sacrificio. (Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ 2009)

2.2.4.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y VALOR NUTRITIVO DE LA

CARNE DE ALPACA

La materia prima principal para la investigación presente es la carne de alpaca. La importancia de este animal radica en su carne, su fibra y su piel.

En la producción de carne se puede estimar que una alpaca pesa unos 50 kg obteniéndose un promedio de carne de unos 25 kg aproximadamente. Las cualidades de este producto son excelentes: muy magro, alto contenido proteico, gran suavidad y apta para ser consumida en fresco, seca o preparada en embutidos.

COMPONENTES QUÍMICOS DE LA CARNE

– Agua

Es el componente de mayor cantidad, variable entre límites muy ostensibles según la edad y principalmente el estado de nutrición.

La carne físicamente tiene estado sólido, pero presenta la propiedad de tixotropía, esto es que las propiedades sólidas de la estructura desaparecen con la destrucción de las uniones celulares por trituración fina, la carne entonces fluye como un líquido viscoso. Este hecho se aprovecha en la industria, en el relleno de tripas para la fabricación de embutidos.

La anexión de algunas sales, como cloruro de sodio, aumenta la capacidad fijadora de agua por parte de la carne, ya que se forman enlaces entre el agua y los iones disueltos. Este hecho es aprovechado para la fabricación de embutidos escaldados.

-Proteína

Es el componente más importante de la carne, que entra en constitución de todas las partes del cuerpo y en todas las sustancias que regulan las funciones del organismo.

La proteína de la carne esta constituida por varias cadenas de aminoácidos, los cuales se clasifican de acuerdo a su importancia en la nutrición humana en aminoácidos esenciales, por lo que el valor biológico de las proteínas es muy alto, solo superado por la leche y los huevos.

-Grasa

Se distinguen tres tipos de grasa: la extracelular, intermuscular e intramuscular. En el primer grupo se encuentra el tejido adiposo localizado debajo de la piel y los demás depósitos de grasa del organismo. La grasa muscular es de constitución constante y específica y su composición depende de la alimentación.

-Minerales

Los minerales en la carne se encuentran distribuidos irregularmente entre el jugo muscular, los compuestos celulares y el resto de líquidos extracelulares. La carne y órganos son buena fuente de potasio y fósforo, contienen cantidades moderadas de sodio y magnesio, y cantidades bajas de calcio. También contienen microelementos como: zinc, hierro, manganeso, yodo, flúor, cobalto, estroncio y selenio.

-Carbohidratos

Los carbohidratos contenidos en la carne tienen un rol específico en cuanto a la acidez y conservación de la carne pero desde el punto de vista nutritivo carece de importancia.

-Vitaminas

En comparación con los vegetales y las frutas la carne posee poco contenido en vitaminas.

Las carnes ricas contienen vitaminas liposolubles (A, D y algo de E). Las carnes no presentan vitamina C.

-Enzimas

Las enzimas son de gran importancia en los procesos de transformación de las sustancias nutritivas, fundamentales para los fenómenos post morte que sufre la carne.

COMPONENTES ORGANOLÉPTICAS DE LA CARNE

Los factores que influyen en las características organolépticas son la especie, edad, tipo de alimentación, actividad del animal y la forma de beneficio.

-Olor y sabor

El aroma es una sensación compleja que influye en el olor, sabor, textura, temperatura y pH; de estos los más importantes son el olor y sabor.

Algunas características determinantes del aroma son de naturaleza hereditaria. Otro factor es el estado bioquímico de los músculos, cuanto más elevado es el pH final menor es su aroma. La duración y temperatura de cocción influyen en la naturaleza e intensidad de olor y sabor de la carne; la cocción prolongada determina una intensa degradación de la proteína y una disminución del aroma.

La presencia de testosterona en machos adultos tiene mucha influencia en este sentido.

-Color

El aspecto que ofrece la superficie de la carne al consumidor no solo depende de la cantidad de mioglobina presente, sino también del estado químico y físico de otros componentes, entre ellos la hemoglobina.

El color normal de la carne es rojo cereza claro que estará dado por la presencia de pigmentos como hemoglobina (sangre) y mioglobina (músculo).

Este color puede variar por factores intrínsecos como la cantidad, estado químico, especie, raza, edad y alimentación; y por factores extrínsecos como grado de desangrado de la carne, grado de conservación, tipo de transformación, contaminación, descanso, ayuno, condiciones de beneficio y estado patológico.

-Textura

La textura es más basta al aumentar el animal de edad, y en los músculos de los animales machos el tejido es más duro que en las hembras.

COMPARACIÓN ENTRE COMPOSICIONES QUÍMICAS DE DISTINTAS CARNES

Cuadro N° 1: Comparación entre distintas carnes

(Fuente: Análisis en el Instituto de Certificación, Inspección y Ensayos de La Molina, Lima)

La carne de alpaca se caracteriza por ser un alimento apto para el consumo. Además posee características similares con respecto a otras carnes rojas. Es una carne de color rojo purpúreo, suave en animales jóvenes, consistentes y fibrosos al contacto. La carne de los camélidos tiene mayor nivel proteico en relación a otras especies. La carne de llama y alpaca no presenta un nivel suficiente de carbohidratos, pero ese déficit se ve compensado por la grasa animal. Con respecto a esta grasa diferentes científicos

(Garnica, 1985), han medido el colesterol sérico en alpacas, encontrando que en cada 100 ml de suero sanguíneo hay entre 20,43 mg a 52,22 mg de colesterol. Estas cantidades son muy inferiores si las comparamos con las de ovino y vacuno que van de 200 mg a 300 mg/100 ml.

Las carnes de los camélidos andinos nos proporcionan apreciables cantidades de vitaminas del complejo B, algo de vitamina A y las restantes solo en las vísceras. En el charqui de llama o alpaca, que es la forma como ha sido aceptada mayormente, si fue curada al sol pierde parte de vitamina A, pero si se enriquece en la vitamina D.

En cuanto a la chalona de alpaca comparada con la de ovino, obtenemos los siguientes resultados:

– Chalona de alpaca: 57.7 % proteína, 3.6 % grasa.

– Chalona de cordero: 50.3 % proteína, 11.7 % grasa.

Con estos análisis se deduce que la carne de alpaca debido al manejo del animal es ecológica, nutritiva y sana.

(ING: ARANTXA URSÚA ANDRÉS (e)k " PROYECTO DE PLANTA DE EMBUTIDOS Y CHALONA, CON CARNE DE ALPACA, EN PILPICHACA, PERÚ" 2004 Universidad Pública de Navarra)

El conocimiento de la composición química de la carne de alpaca es importante para el entendimiento de su valor nutritivo, así como también para interpretar su calidad sensorial y aptitud para el tratamiento industrial.

En la bibliografía internacional solo se ha encontrado un estudio sobre los componentes mayoritarios de la carne de alpaca (en músculo L. dorsi) realizado por Cristofanelli et al. (2004) con animales de 25 meses criados de forma tradicional en Perú. En dicho estudio se manifiesta que la carne de alpaca es baja en grasa y presenta un contenido de proteínas elevado con respecto a carne de rumiantes más convencionales y de cerdo. Además estos autores han observado una composición similar entre carne de alpaca y llama, a excepción de las cenizas que son mayores para el caso de la alpaca. Adicionalmente se puede observar la composición química de la carne proveniente de la pierna (sin considerar la grasa subcutánea) de alpaca, cerdo y cordero, donde resalta el bajo contenido graso de la carne de alpaca y mayor contenido de proteínas, con respecto a la carne de las otras especies. En el estudio de Cristofanelli et al. (2004), anteriormente mencionado, también se determinó el contenido en colesterol de la carne (L. dorsi) de las alpacas y las llamas, obteniendo valores de 51 mg/100 g para las alpacas y de 56 mg/100 g para las llamas. Coates y Ayerza (2004), también estudiaron en Llamas argentinas el contenido de colesterol en el músculo L. dorsi y grasa renal, encontrando valores en torno a 52 mg/100g en el músculo y 93 mg/100g en la grasa renal, estableciendo así la diferencia en el contenido de colesterol entre ambos tejidos (graso y muscular), lo que podría ser extrapolable a la alpaca. Los valores de colesterol de la carne de alpaca y llama (músculo L. dorsi) son al menos 10-30 mg/100g inferiores que los valores encontrados en la carne (músculo L. dorsi) de vacuno u ovino (Badiani et al., 1998; USDA, 2008;) y porcino (USDA, 2008); sin embargo, tiene valores similares a los encontrados en pechuga de pollo y pavo sin piel (Chizzolini et al., 1999; USDA, 2008).

En cuanto al perfil de ácidos grasos de la carne de alpaca, no se han encontrado en la bibliografía trabajos previos al respecto; sin embargo, se

tienen referencias de estudios en carne de llama – animal que presenta

similitudes con la alpaca en cuanto a que también es un camélido sudamericano y que se cría extensivamente compartiendo lugares de pastoreo con las alpacas – realizados por Coates y Ayerza (2004) y Polidori et al. (2007b). Estos autores determinaron el perfil de ácidos grasos en el músculo Longissi us thoracis y lumborum de llamas argentinas (5-8 años de edad) y peruanas (2 años) y encontraron un porcentaje de ácidos grasos saturados sobre ácidos grasos totales entre 46 y 50%, de ácidos grasos monoinsaturados Introducción: Carne de alpaca 17 entre 38 y 42% y de poliinsaturados entre 4,5-7,2%. De acuerdo a esos autores, en términos generales, la composición de ácidos grasos de la carne de llama puede ser comparada con datos obtenidos en experimentos previos sobre vacuno y cordero (Chan, 2004), aunque la carne de llama presentó mayores cantidades de ácidos grasos poliinsaturados que los hallados en la carne de dichos rumiantes (4,3 – 5,0 % del total de ácidos grasos). Se puede observar que los ácidos grasos mayoritarios de la carne de llama fueron el ácido oleico (C18:1 cis), seguido del palmítico (C16:0) y esteárico (C18:0). También es importante mencionar que, debido a que el sistema de explotación de las llamas se basa en el pastoreo, su carne tiene un contenido importante de ácido linolénico C18:3 n-3 (en torno al 1%), comparado con los valores promedios encontrados en carne de vacuno y ovino, aunque similar al hallado en vacunos jóvenes que pastan (Enser et al., 1998). El contenido en minerales de la carne de alpaca (en el músculo L. thoracis) ha sido determinado por Polidori et al. (2007a). Estos autores analizaron la carne de 20 llamas y 30 alpacas machos criadas en Perú y sacrificadas a los 25 meses de edad. A partir de los resultados se concluye que los contenidos minerales de la carne de alpaca y llama son comparables al de otras carnes. El contenido aminoacídico de la carne de alpaca no ha sido encontrado en las referencias bibliográficas revisadas. No obstante, Bustinza et al. (1993) estudiaron la calidad nutritiva de la proteína de la carne de alpaca en experimentos con animales de laboratorio, determinando el índice de digestibilidad (D), el valor biológico (VB), la utilización neta de proteína (UNP) y la conversión y eficiencia alimenticia. Las muestras de carne consistieron en una mezcla por partes iguales de carne de cuello, brazuelo, costillar, lomo y pierna de seis alpacas Huacaya procedentes del departamento de Puno (Perú). También se observan los resultados obtenidos en esos ensayos, realizados sobre carne de alpaca cruda y carne hervida en agua a 100 ºC durante 45 minutos. Comparando dichos resultados con los obtenidos en carne de vacuno (Organización para la Agricultura y la Alimentación ?FAO?, 1981), estos autores afirman que en términos generales, la carne de alpaca tiene aproximadamente un 10% más de valor biológico, menos de un 10% de digestibilidad y un UNP similar. Finalmente, en cuanto al contenido de vitaminas no se han reportado estudios en carne de alpaca.

(Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ 2009)

a. PROTEÍNAS DE LA CARNE

PROTEÍNAS MIOFIBRILARES

Estas proteínas representan, aproximadamente la mitad de todas las proteínas del músculo y sus componentes más importantes son: La miosina y la actina, que constituyen a su vez, el 50% y 25% respectivamente, de las proteínas miofibrilares.

Se caracterizan porque son insolubles en agua y en soluciones salinas muy diluidas, consiguiéndose su solubilización con soluciones salinas más concentradas y a pH superiores a 5,5. La miosina es una proteína fibrosa de estructura helicoidal cuyo peso molecular es del orden de 500,000 la miosina es rica en glutámico y lisina.

Una caracterización bioquímica especial de la miosina es que cataliza la hidrólisis de la unión fosfato terminal del ATP, transformando la energía liberada en trabajo mecánico.

La actina se puede encontrar como actina globular (G-act¡na) y como actina fibrosa (F-actina), la G-actina tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 contiene unos 450 aminoácidos. La F-actina es un polímero consistente en una doble hélice de monómeros de G-actina, en número de 500 a 600 y su peso molecular de muchos millones. La molécula de la actina es mucho más simple que la miosina y, como otras proteínas musculares fibrosas, es rica en aminoácidos dicarboxílicos.

Se han aislado cantidades relativamente pequeñas de otras proteínas que están asociadas a las miofibrillas, entre ellas, Tropomiosinas, Troponinas y Actininas. Estas proteínas están íntimamente asociadas a los filamentos de actina y miosina de la contracción-relajación muscular.

PROTEÍNAS SARCOPLÁSMICAS:

Las proteínas sarcoplásmicas, también denominadas miogeno, son muy numerosas y complejas. Principalmente están constituidas por los sistemas enzimáticos del metabolismo celular.

Representan aproximadamente el 35% de las proteínas musculares y están constituidos en su mayor parte por albúminas y globulinas. Estas proteínas se caracterizan porque son solubles en agua y en soluciones salinas diluidas, en especial el pigmento respiratorio mioglobina que es responsable del color de la carne.

PROTEÍNAS DEL ESTROMA:

Las proteínas del estroma representan la fracción proteica insoluble de las proteínas del tejido conectivo y se distribuyen ampliamente por todo el organismo animal, formando parte del esqueleto y de la estructura de órganos, tendones y nervios.

El principal componente es el colágeno y en menor proporción, elastina y reticulina. Estas proteínas son las responsables más directas de la dureza de la carne.

El colágeno es la proteína más abundante del organismo animal, su composición en aminoácidos, parece ser muy similar en la mayoría de las especies de los mamíferos.

El colágeno es muy resistente a la acción hidrolítica de los enzimas del tubo digestivo.

b. AMINOÁCIDOS DE LA CARNE

C. ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS

FUENTE: M. EN C. ISRAEL VELÁZQUEZ MARTÍNEZ

D. VITAMINAS DE LAS CARNES

CUADRO 2.5

e. CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE SEGÚN INDECOPI

La presente Norma Técnica establece los requisitos generales que deben cumplir las carnes para el consumo humano. (Ver Anexo 1)

También existe el Reglamento Tecnológico de Carnes (Decreto Supremo N° 22-95-AG), el mismo que consta de Ciento Tres Artículos, Once Títulos, Cuatro Disposiciones Complementarias, Tres Disposiciones Transitorias y Doce Anexos.

Este Reglamento norma el beneficio de ganado, el proceso de industrialización y comercialización de las carnes y menudencias de los animales de abasto, así como las apropiadas condiciones Técnico – sanitarias de los establecimientos y de otros medios empleados para tal fin, en provecho del consumidor.

El SENASA (Servicio Nacional de Sanidad Agraria), es el organismo encargado de hacer cumplir este reglamento.

TABLA 2.3.

COMPOSICIÓN EN AMINOÁCIDOS DE LAS CARNES FRESCAS, EN PORCENTAJE DE LA PROTEINA BRUTA

FUENTE : SCHWEIGERT y PAYNE, 1956.

TABLA 2.3.1.

CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS EN CARNE DE ALPACA COMPARADA CON LA CARNE DE CORDERO Y CAMELLO (Expresados en porcentaje respecto al total de aminoácidos)

FUENTE : Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ

"CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)"

TABLA 2.4. CONTENIDO DE VITAMINAS DE DIVERSAS CARNES CRUDAS

FUENTE : Mc.CANCE Y Widdowson

TABLA 2.4.1

CONTENIDOS DE LOS ELEMENTOS MINERALES EN CARNE DE ALPACA

(EXPRESADOS EN MG/100G).

FUENTE : Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ

"CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)"

2.3. HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS

La acción de los ácidos, álcalis o enzimas hidrolizan las proteínas. Sin embargo, el método más utilizado para el estudio de la composición en aminoácidos de las proteínas es la hidrólisis ácida. En este caso, se somete la proteína a la acción de una solución de ácido clorhídrico al 20.5% durante 17-20 horas a reflujo. Se puede reducir este tiempo a 8-10 horas aumentando la temperatura hasta 120°C. Con este tipo de hidrólisis no se provoca la racemización y, por tanto, se obtiene una solución de L-aminoácidos. No obstante, se corre el riesgo de que en tratamientos muy prolongados los ácidos minerales descompongan al triptófano.

Se induce también la formación de ácidos aspártico y glutamico a partir de asparagina y glutamina y, además, cabe que los aminoácidos sulfurados experimenten cierta oxidación.

Por otro lado, la hidrólisis alcalina origina, en primer lugar, la racemización de los aminoácidos y, debido a ello, los alimentos así elaborados tienen un valor nutritivo menor. Para practicar esta hidrólisis se suele utilizar una solución 6N de hidróxido de Sodio o de Bario. Este método ocasiona la destrucción de la argínina y parcialmente de la Usina, mientras que por el contrario, el triptófano permanece incólume.

Por último, también se logra la hidrólisis completa de las proteínas mediante la aplicación de métodos basados en la acción de enzimas proteolíticos. A diferencia de los métodos de hidrólisis acida ó alcalina, estos no modifican los grupos funcionales de la proteína.

2.3.1. HIDRÓLISIS ENZIMATICA DE PROTEÍNAS

2.3.1.1. INTRODUCCIÓN

Los enzimas, catalizadores biológicos de naturaleza proteica que regulan las muchas reacciones que tiene lugar en los seres vivos, han sido utilizados desde la antigüedad en algunos procedimientos alimentarios, si bien de forma empírica e indirecta utilizando microorganismos enteros o extractos de tejidos vegetales o animales.

La hidrólisis enzimática presenta indudables ventajas frente a la tradicional hidrólisis química, acida o alcalina, entre las que cabe mencionar las siguientes:

a. SELECTIVIDAD:

Las enzimas son específicas para un tipo determinado de enlace y, por tanto, no es frecuente la aparición de productos de degradación.

b. CONDICIONES MODERADAS DE TEMPERATURA Y PH:

La hidrólisis enzimática transcurre a temperaturas próximas a la ambiente, generalmente en el intervalo de 40° a 60°C, y pH comprendido entre 4-8.

c. NO SE AÑADEN SUSTANCIAS EXTRAÑAS:

Salvo la enzima.

d. SE MANTIENE EL VALOR NUTRITIVO:

Ya que no se produce degradación de los componentes separados.

2.3.1.2. FUNDAMENTO DE LA ACCIÓN ENZIMATICA

La acción catalítica de una enzima se produce por unión de la enzima con las proteínas que van a reaccionar y que, en el lenguaje bioquímico, se llaman sustratos, aunque generalmente, son moléculas mucho más pequeñas que la de la enzima.

FIGURA.2.4. Acople-enzima-sustrato en el sitio activo

La unión se produce en un sitio preciso de la molécula proteica enzimática, llamado sitio activo. La conformación de la enzima, en el sitio activo, encaja perfectamente con las moléculas de proteína (sustrato) de modo que las sitúa, orienta y activa

En el complejo enzima-sustrato (ES) ocurren varias cosas:

• La concentración (vecindad) de las substancias reaccionantes se hace muy grande en el sitio activo de la enzima.

• En los puntos de unión ES, las fuerzas de atracción activan las moléculas reaccionantes, de tal manera que la energía Térmica de activación se hace innecesaria o se reduce mucho.

• En el lugar de la reacción se produce una fuerte disminución de la entropía (mayor concentración, mayor ordenación, mayor orientación de las moléculas). Por estas tres razones, las reacciones enzimáticas transcurren con velocidades altas, a bajas concentraciones y temperaturas bajas, ya que las moléculas que reaccionan son activadas en un punto con proximidad y la orientación adecuada y, allí, son activadas.

La reacción enzimática transcurren en tres fases.

FIGURA. 2.5. Coordenadas de reacción para una reacción catalizada por un enzima en comparación con otra no catalizada.

Donde:

2.3.1.4. PARÁMETROS

a. VARIABLES INDEPENDIENTES

– CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA

La unidad usual de actividad enzimática es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mol de sustancia por minuto en condiciones preestablecidas. Sin embargo, por lo que respecta a los enzimas alimentarios comerciales, las unidades de actividad no se ajustan necesariamente a la definición citada, la mayoría de los enzimas utilizados en los sistemas alimentarios no son puros y no es posible medir la cantidad de proteína enzimáticamente activa responsable de la transformación del sustrato.

– pH

En general, los enzimas son activos en un rango limitado de pH. Usualmente cada enzima tiene un pH óptimo porque, al igual que otras proteínas, los enzimas poseen muchos grupos ionizables de forma que los cambios de pH pueden alterar su conformación, su capacidad de unión con el sustrato y la actividad catalítica de los grupos que forman el centro activo. Los efectos pueden deberse a un cambio en la velocidad de reacción máxima (Vmax.). Un cambio en la afinidad del enzima por el sustrato (Km) o una alteración en la estabilidad del enzima. La estabilidad depende del tiempo que el enzima haya sido mantenido a un pH desfavorable. De forma similar, los grupos ionizables del sustrato pueden verse afectados por el pH, lo que puede ser importante a la hora de formar el complejo enzima-sustrato. En general todos estos efectos tienen lugar simultáneamente, aunque también se pueden producir de forma aislada.

Cuando se observa una gran amplitud del rango de pH óptimo, por ejemplo, en la invertasa, se debe usualmente a que el sustrato no puede ionizarse. En muchas reacciones enzimáticas industriales el pH no es constante sino que cambia a lo largo de la reacción, dependiendo de la capacidad tamponante de los sustratos y los productos implicados. El pH también afecta a la estabilidad del enzima de forma que el pH óptimo de trabajo se calcula estableciendo un compromiso entre los efectos en la actividad y estabilidad del enzima. (Ver 2.2.3.4.)

– TIEMPO

(Ver 3.6.)

b. VARIABLE CONTROLABLE

– TEMPERATURA

Cabe señalar que en los puntos de unión enzima-sustrato (ES), las fuerzas de atracción activan las moléculas reaccionantes, de tal modo que la energía térmica de activación se reduce mucho, además se produce una fuerte disminución de la entropía.

Estas son unas de las razones, por las cuales las reacciones enzimáticas, transcurren con velocidades altas, a bajas concentraciones y temperaturas bajas. Esto trae como consecuencia la utilización de condiciones moderadas de temperatura: la hidrólisis enzimática transcurre a temperaturas próximas a la ambiente.

c. VARIABLE DEPENDIENTE (VARIABLE RESPUESTA)

– GRADO DE HIDRÓLISIS

El grado de hidrólisis tiene importancia científica y tecnológica y viene a ser la formación de productos, en presencia de la enzima, con concentraciones y condiciones adecuadas y definidas.

2.3.1.5. EQUIPOS

Un reactor enzimático es, básicamente, el recipiente en el cual se lleva a cabo una reacción catalizada por enzimas o células libres o inmovilizadas, junto con los mezcladores, equipos de toma de muestra y aparatos de control. El papel que cumple el reactor es el de obtener un producto específico a una velocidad dada a partir de unos reactantes concretos y con un costo mínimo. Los reactores enzimáticos se diferencian de los reactores químicos en que trabajan a temperaturas y presiones bajas y comparativamente consumen o generan poca energía durante la reacción. Se diferencian de los fermentadores en que no se comportan de una forma autocatalítica, ya que en estos últimos las células en crecimiento se están regenerando continuamente por sí mismas. Al igual que con los reactores químicos, los reactores enzimáticos se valoran en función de su productividad y especificidad.

Los reactores se clasifican en homogéneos y heterogéneos, en función de que su contenido sea homogéneo, con una sola fase, o heterogéneo, si coexisten varias fases. En los reactores heterogéneos frecuentemente hay un sustrato líquido continuo y un sólido discontinuo inmovilizado que es la fase catalítica. Los reactores también se pueden clasificar en función de que la reacción se produzca de forma continua o discontinua o como reactores abiertos o cerrados, según que el catalizador salga del reactor durante su uso o no. La clasificación más importante es la que tiene en cuenta la extensión de la mezcla alcanzada dentro del reactor, y así se habla idealmente de reactores de mezcla completa o de flujo pistón. El perfil de concentración de los reactantes dentro de los reactores de distintas formas varía apreciablemente. En los reactores de mezcla completa las moléculas de reactante se mantienen en un estado de agitación constante, mientras que en los reactores de flujo pistón los elementos de fluidos previos o subsecuentes añadidos al reactor. Por tanto, en los reactores discontinuos de mezcla completa la composición de los reactantes varía a lo largo de la reacción, aunque permanece constante a través del reactor. En un reactor agitado continuamente la composición del contenido del reactor del estado estacionario es uniforme y no varía con el tiempo en ausencia de inactivación enzimática. En los reactores de flujo pistón la composición de los reactantes es invariable con el tiempo aunque varía a lo largo de la longitud del reactor. Los perfiles de concentración pueden influir tanto en la actividad como en la estabilidad de los enzimas inmovilizados; por ejemplo los inhibidores producidos endógenamente son constantemente extraídos de los reactores continuos con objeto de no alcanzar altas concentraciones que pueden resultar críticas. Por tanto, en los reactores de flujo pistón el factor de eficacia es alto cerca del inicio de éste y más bajo en la salida del reactor, debido a que la concentración de sustrato disminuye a medida que los reactantes atraviesan el reactor. En los reactores discontinuos, el factor de eficacia es uniforme en todo el reactor. Sin embargo, en la práctica, a pesar del cuidado en el diseño y operación, los reactores reales sólo se aproximan, en muchos casos estrechamente, a los sistemas mezclados ideales. En particular, en las columnas empaquetadas el flujo no ideal es un hecho habitual, especialmente en las que se utilizan a gran escala.

2.4. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

2.4.1. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

2.4.2. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS

a. MÉTODOS GRAVIMETRICOS:

Ocasionalmente algunos reactivos precipitan a un aminoácido de manera específica y cuantitativa. Un caso bien conocido es el de la Determinación de la arginina por medio de su precipitación en forma de flavianato insoluble.

b. MÉTODOS COLORÍMETRICOS:

Hay reactivos que producen compuestos coloreados específicos con determinados aminoácidos que pueden utilizarse con fines cuantitativos.

En estas ocasiones es el radical R del aminoácido el responsable directo de la reacción, entre los casos más conocidos se encuentran los siguientes:

-Reacción de Millón

-Reacción de Xantoproteica

-Reacción de Hokins-Cole

-Reacción de Nitroprusiato

-Reacción de la Ninhidrina

– REACCIÓN DE LA NINHIDRINA

Es una de las reacciones del grupo a-amino más características y más ampliamente utilizada, que puede utilizarse para valorar los aminoácidos cuantitativamente en cantidades muy pequeñas.

La calefacción de un a-aminoácido con dos equivalentes de ninhidrina da un producto intensamente coloreado. En la reacción con la ninhidrina aparece un color azul con todos los aminoácidos y péptidos que poseen grupos a-amino libres, mientras que la prolina y la hidroxiprolina, en las que el grupo a-amino se haya sustituido, rinde derivados algo diferentes que poseen un color amarillo característico.

El grupo a-amino de los aminoácidos al reaccionar con la ninhidrina se oxida, para formar amoníaco, C02 y el aldehido (que se obtiene por pérdida de un carbono del aminoácido original). En dicha reacción, un equivalente de ninhidrina actúa como oxidante del aminoácido para formar los productos mencionados.

Un segundo equivalente de ninhidrina reacciona entonces con la ninhidrina reducida y el NH3 que se forma elaborándose un producto muy coloreado que tiene la siguiente estructura.

Este compuesto coloreado (azul) que se forma, cuya intensidad es proporcional a la concentración del aminoácido presente es muy utilizado en la cuantificación de éstos. Este complejo de color azul, tiene una absorción de luz de aproximadamente 570 nm – 690 nm.

c. MÉTODOS CROMATOGRAFICOS

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN:

Si una serie de compuestos absorbidos en un sólido se desplazan sobre la superficie de este sólido debido a la acción de un líquido apropiado, su velocidad de movimiento dependerá de la fuerza con que estén absorbidos al sólido y del grado en que se disuelven en la fase líquida.

Se tiene con este método, uno de los más sencillos procedimientos para la separación cuantitativa de compuestos químicos de estructura muy parecida, los sólidos para absorber la sustancia son de materiales de distinta naturaleza dentro de los más usados se encuentra el almidón, el papel, el oxido de aluminio, los geles de sílice, el carbón, etc.

CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL:

Sobre papel ó sobre lámina delgada, que permite identificar los aminoácidos existentes en la mezcla por comparación con los factores de retraso (Rf) de los aminoácidos en las mismas condiciones.

ANÁLISIS CROMATOGRAFICOS DE AMINOÁCIDOS EN COLUMNA:

Los aminoácidos son absorbidos primeramente en una columna que contiene una resina de intercambio catiónico, en forma sódica, que retiene con más fuerza los aminoácidos más básicos. Fijada la mezcla de aminoácidos en la cima de la columna, se elude con un

tampón de pH y fuerza iónica crecientes. A pH bajos son eluidos los aminoácidos de punto isoeléctrico más bajo y a pH altos los más básicos; de este modo, por la base de la columna salen los aminoácidos separados.

MÉTODOS DE DILUCIÓN CON ISÓTOPOS:

Para el cuanteo de aminoácidos en hidrolizados de proteínas, aunque requiere un equipo especializado.

SÍNTESIS MICROBIOLOGICA:

Numerosos gérmenes, para manifestar crecimiento óptimo, requieren medios de cultivo con distintos aminoácidos, vitaminas, etc. Si se quita del medio de cultivo uno de los aminoácidos necesarios para el crecimiento del microorganismo, éste deja de desarrollarse, pero al añadir nuevamente al medio cantidades progresivas del aminoácido en cuestión, se obtienen crecimientos progresivos y proporcionales a la cantidad añadida del aminoácido en estudio. De está manera es posible cuantear en forma rápida y precisa, diversos aminoácidos en hidrolizados u otros productos.

MÉTODOS ENZIMATICOS:

Algunas enzimas específicas permiten el cuanteo de los aminoácidos, midiendo indirectamente determinados productos de la reacción. Así, la enzima arginosa libera urea del aminoácido arginina y de está manera. determinando urea, se puede conocer la cantidad del aminoácido, a partir de diversos gérmenes se han purificado descarboxilosas específicas de ciertos aminoácidos que, al actuar sobre ellas ponen en libertad CO2 que se suele medir por métodos manométricos.

2.4.3. VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS

La actividad de un enzima se determina a partir de la concentración del enzima, la concentración del sustrato y su disponibilidad, la concentración de los cofactores y/o los efectores alostéricos, la presencia, concentración y tipo de inhibidores, y la fuerza iónica, el pH y la temperatura del medio. La cinética enzimática estudia la forma en que todos éstos parámetros influyen en la actividad enzimática, proporcionándonos un conocimiento de la reacción en estudio y permitiéndonos su control.

Para un único sustrato(S) y un único producto (P) se puede aplicar el siguiente esquema de reacción:

Cuando la concentración de sustrato es mucho mayor que la del enzima (E), la velocidad de reacción es de orden cero respecto a los reactantes, es decir, depende solamente de la concentración de enzima presente. Por tanto, la velocidad de reacción es esencialmente constante hasta que haya reaccionado casi todo el sustrato, momento en que pasa a depender de la concentración de sustrato existente y es de primer orden con respecto a la concentración de sustrato.

La mejor forma de describir la cinética enzimática es mediante la ecuación de Michaelis-Menten, que presupone la formación de un complejo enzima-sustrato:

Y representa la concentración máxima (Constante de Michaelis)

V= Velocidad inicial de la reacción

Por tanto, cuando la concentración de sustrato es diez veces el valor de Km la reacción se produce a un 91% de la velocidad máxima de reacción (Vmax ), y si es 100 veces el valor de Kmás la reacción se produce al 99% de la Vmax , con tal que no tenga lugar la inhibición por el exceso de sustrato y no se produzcan inhibidores durante la reacción enzimática.

En este caso,

Vmax =K2 [E]

Donde : V max = Velocidad máxima Ec. 2.2

La cinética de Michaelis-Menten supone que tanto el sustrato como el enzima son solubles y están mezclados de forma homogénea, lo que no siempre ocurre en los procesos industriales donde a menudo se emplean sustratos muy concentrados y viscosos e incluso a veces sólidos. En este último caso, el área de las partículas de sustrato es un término con frecuencia más útil que el de la concentración, particularmente cuando algunos enzimas, por ejemplo las lipasas parecen absorberse en su superficie.

2.4.4. EQUIPO PARA ANÁLISIS

2.4.4.1. EL ESPECTROFOTÓMETRO

Cabe recordar que el término espectrofotometría se refiere al uso de la luz para medir las concentraciones de sustancias químicas. Existen dos procesos fundamentales: la absorción y la emisión de luz por las moléculas, estas se utilizan en el análisis cuantitativo.

Cuando una muestra absorbe luz, la potencia radiante del haz de luz disminuye de manera que P(potencia radiante emergente) < P0 (potencia radiante incidente).

La transmitancia T, se define como la fracción de la luz incidente que sale de la muestra

Esta varía de 0-2.

La importancia de la absorbancia estriba en que es directamente proporcional a la concentración de especie absorbente en la muestra :

Ec. 2.5.

a a c

Donde : A = Absorbancia (adimencional)

C = Concentración

CC = coeficiente de proporcionalidad

La ecuación 2.5. es fundamental para aplicar la espectrofotometría en química analítica, se denomina ley de Beer – Lambert.

El espectrofotómetro es un equipo para medir la absorción de luz. La luz de una fuente continua pasa a través de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Esta luz monocromática atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la potencia radiante de la luz que sale.

Para medir la Absorbancia de luz visible en nuestra investigación se ha utilizado el espectrofotómetro PERKIN ELMER, que se muestra en la Fig. 2.6.

En este instrumento, la fuente de luz es una lámpara de wolframio cuya emisión cubre el espectro visible completo. La luz es dispersada en las diferentes longitudes de onda que la componen mediante una rejilla, y sólo una banda estrecha de longitudes de onda pasa a través de la muestra.

Es un espectrofotómetro de doble haz, la luz pasa alternadamente por las celdas de muestra y referencia. Este equipo para investigación está equipado para realizar el barrido automático de longitud de onda y el registro de la absorbancia.

Fig. 2.6 ESPECTRÓMETRO, ULTRAVIOLETA PERKIN ELMER WALLAC MODELO: LAMBDA BIO

CAPITULO III

Desarrollo experimental

3.1. GENERALIDADES

El trabajo experimental de la presente investigación puede ser muy amplio, ya que la biotecnología implicada es muy diversa y compleja, por lo que nos circunscribimos a tres puntos principales:

a. Investigación para obtener la papaína

b. Investigación acerca del sustrato

c. Cuantificación de la hidrólisis enzimática

Para la obtención de la papaína se ha utilizado Papaya común procedente de la selva puneña, y posteriormente se llevó a cabo la limpieza, la desinfección, extracción y purificación con Sulfato de Amonio y Cloruro de sodio, observándose un mejor rendimiento con la primera sal. Finalmente se procedió a centrifugación y desecación. De esta manera se aseguraba una mejor pureza del enzima.

En la preparación del sustrato se tuvo que tomar en cuenta: la calidad o valor nutritivo del mismo (lomo de carne), rigidez y pH debido a la formación del ácido láctico. Cabe destacar la eliminación del color de la carne. Ensayos preliminares de hidrólisis determinaron los problemas que ocasionarían durante las determinaciones colorimétricas, es por eso que la carne se tuvo que lavar con agua fría varias veces hasta la eliminación total del color rojizo.

La temperatura factor muy importante en un proceso de hidrólisis se fijó en 32° C para evitar desnaturalización notoria y que la velocidad transcurra en un tiempo adecuado.

La concentración de la enzima es de 2,5 a 5% con respecto al sustrato (10 gr.)

El pH fue de 5 – 6, teniendo presente el rango de actividad de la enzima.

Se utilizó el diseño factorial para determinar el número mínimo de experimentos a realizar con todas las combinaciones posibles, resultando 8 pruebas como mínimo.

Posteriormente se realizó la preparación de las soluciones estándar con los aminoácidos que libera el enzima, considerando las concentraciones máximas en las que se encuentra en la carne. Estas muestras patrón tuvieron un peso total de: 1,298 gr.; 1,105896 gr.; 1,0384 gr.; y 0,98648 gr.

La preparación de las 8 muestras han sido diseñadas con los parámetros anteriormente mencionados y aplicando el diseño factorial respectivo. Luego de transcurrido el tiempo de hidrólisis, se determinó cuantitativamente la actividad de la papaína, con el método de la ninhidrina para su posterior lectura en el espectrofotómetro (Longitud de Onda 680 nm) de la Absorbancia

El potencial de las bioconversiones enzimáticas en la industria de las carnes, es enorme y se quiere lograr que los nutrientes biodisponibles de la carne estén al alcance de una mayoría.

3.2. OBJETIVOS DE LA EXPERIMENTACIÓN

• Obtener la papaína de la papaya y lograr su estabilización.

• Preparar la carne de alpaca en las condiciones más óptimas para que sea hidrolizada por las enzimas.

• Determinar cuantitativamente la actividad enzimática de la papaína sobre la carne de alpaca.

3.3. METODOLOGÍA

Para llevar a cabo la experimentación principal, el cual es la hidrólisis enzimática de las proteínas de la carne de alpaca, se ha tenido que desarrollar experimentos previos, para disponer de la enzima y para adecuar el sustrato para su consiguiente hidrólisis.

3.4 ALGORITMO DE LA ESTRATEGIA EXPERIMENTAL