Hidrólisis enzimática de la carne de alpaca mediante la papaina

CAPITULO I

Introducción

1.1. GENERALIDADES:

Las proteínas son sustancias complejas, que constituyen la materia fundamental de los seres vivos. Estas se hidrolizan en menor o mayor grado por los ácidos, por los álcalis y por los fermentos, produciendo aminoácidos.

Es lógico pensar que cuando se pretende utilizar los hidrolizados de proteínas, por su valor nutritivo en la preparación de dietas elementales para la alimentación infantil o nutrición enteral, debe respetarse al máximo la estructura de los componentes separados, no sólo para mantener su valor biológico, sino también para evitar la contaminación de los hidrolizados obtenidos por los productos de degradación de estos componentes, de ahí la necesidad de recurrir a la hidrólisis enzimática.

El tema de investigación comprende el estudio de la papaína, sus fuentes naturales (origen vegetal), así como su estabilización posterior.

En este trabajo, dedicado a la hidrólisis enzimática de las proteínas de la carne de alpaca por actividad enzimática de la papaína, tiene como finalidad conseguir un mayor grado de hidrólisis y demostrar la importancia de enzimas proteolíticas como la papaína.

1.2. OBJETIVOS.-

1.2.1. OBJETIVO GENERAL

Mejorar la hidrólisis de proteínas mediante la aplicación tecnológica de biocatalizadores ó enzimas.

1.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar el grado de hidrólisis óptima de la carne de alpaca, mediante el uso de la enzima papaína.

• Determinar las mejores condiciones de las variables del proceso de hidrólisis a nivel laboratorio y mediante un diseño experimental que conlleve a un modelo matemático.

1.3. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN1.3.1. DE INVESTIGACIÓN

En la actualidad y en el futuro el mejorar el Porcentaje de digestibilidad de los alimentos que consumimos es una de las metas más importante, y más aún si se trata de las proteínas que es el grupo de alimentos que más carencias tiene la población.

Por eso con esta investigación se quiere contribuir a solucionar en parte este problema. La papaína es una enzima proteolítica muy activa. Es la enzima más termoestable conocida. La papaína se encuentra en el fruto, en las hojas y en el tallo, se extrae del látex coagulado de la papaya. En las enfermedades digestivas, se utiliza como medicamentos en las insuficiencias de la segregación estomacal, por sus propiedades similares a la pepsina pues actúa sobre las proteínas produciendo aminoácidos libres.

1.3.2. DE TECNOLOGÍA

La producción industrial de hidrolizados enzimáticos de alimentos no se ha desarrollado tecnológicamente hasta este siglo, en el que han sido favorable dos factores: por una parte, la disponibilidad comercial de las enzimas adecuadas y, por otra, la demanda en la industria alimentaria de estos productos.

En cuanto a la disponibilidad comercial de enzimas, cabe destacar que la producción y el uso industrial no se produjo hasta 1890.

La demanda de hidrolizados enzimáticos en la industria alimentaria ha sido función de la necesidad de sustituir determinados alimentos, bien por razones económicas, bien por razones de escasez, o de la necesidad de obtener alimentos más asimilables por el cuerpo humano.

La hidrólisis enzimática es uno de los procesos que se usa actualmente a nivel mundial para obtener aminoácidos en EE.UU, México, (Fermax), Japón (Kyowa Hakko, Suntory) países que usan esta tecnología.

Además estos hidrolizados desecados se utilizan en preparados sólidos, para alimentos pre cocidos de niños.

Laboratorios mundialmente conocidos como Bayer, Parke Davis y otros han perfeccionado los métodos hidrolítícos. La hidrólisis enzimática, industrialmente se lleva a cabo en tanques agitados con la enzima en disolución, aunque parece existir una tendencia creciente hacia la utilización de reactores de lecho fijo o fluidizado con enzimas inmovilizadas.

1.3.3. ECOLÓGICO

El presente tema de investigación, está enmarcado dentro de la industria por mantener el medio ambiente ya que utiliza materias primas naturales (papaya) dándole un mayor valor agregado y el proceso de hidrólisis (industria silenciosa, sin humos y sin reactivos tóxicos) revelan que el tema tiene para seguir investigando sin dañar la naturaleza.

Las precauciones que se deben tomar con respecto al uso de la papaína es que no debe consumirse sólida, sino diluida y el organismo deberá tener previamente un sustrato sólido principalmente proteínico.

1.4. HIPÓTESIS DE TRABAJO

1.4.1. CONSIDERACIONES DEL PROBLEMA

– Constantes: – Temperatura

-Concentración del Sustrato(Carne de alpaca)

– Variables: – Concentración del Enzima

– pH

-Tiempo

1.4.2. HIPÓTESIS

Se pretende demostrar experimentalmente que existe una relación entre el pH y el tiempo y que ambas variables se relacionan en una ecuación empírica que parametrisa el proceso. Además, la concentración óptima del enzima está en el intervalo de 2,5 – 5 % con respecto al sustrato.

1.5. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

La presente investigación se lleva a cabo mediante la siguiente estrategia:

a. Esté trabajo se abocará a la investigación de los parámetros de hidrólisis enzimática de la carne de alpaca por el enzima del látex de la papaya.

b. Los parámetros que se han mantenido constantes con elfin de hacer más fácil el sistema de estudio son:Concentración del sustrato, temperatura.

c. Las pruebas se realizan tomando como sustrato la carne de alpaca.

d. El tipo de hidrólisis a llevar a cabo es un método basado en la acción de enzimas proteóliticas, usando como enzima papaína.

e. El análisis del hidrolizado obtenido es determinado por espectrofotometría.

f. Los datos que deben tomarse al respecto son:

-Concentración del sustrato.

-Concentración del enzima papaína.

-pH.

-Temperatura.

-Tiempo de hidrólisis.

-Absorbancia.

g. Analizar y recomendar rangos de los parámetros tomados para este proceso.

1.6. ALGORITMO DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

CAPITULO II

Investigación bibliográfica

2.1. GENERALIDADES

Esta revisión bibliográfica incluye la papaína: forma de extracción, purificación, estabilización, activación, propiedades físicas y químicas, usos y aplicaciones.

Nos ocuparemos también, de las proteínas, aminoácidos, propiedades y composición de la carne de alpaca.

Por otra parte, se ha revisado la hidrólisis enzimática de proteínas, y los diferentes factores que puedan influir en el complicado proceso, para poder seleccionar las condiciones de operación.

Por último, los métodos de determinación de proteínas y aminoácidos.

Toda esta bibliografía revisada, nos dará una base bien clara, para poder comprender el proceso de hidrólisis enzimática de proteínas.

2.2. MATERIAS PRIMAS

2.2.1. FUENTES DE MATERIA PRIMA DE ENZIMAS

2.2.1.1. DEFINICIÓN DE ENZIMAS

Los enzimas son proteínas producidas en las células con la finalidad de catalizar las reacciones químicas que se dan en los organismos vivos.

Un catalizador es cualquier sustancia que acelera una reacción en ambos sentidos, sin consumirse en ella, sin formar parte de los productos y que experimenta solo un cambio físico ó químico transitorio.

Los catalizadores Biológicos son vitalmente necesarios para bajar la cantidad de energía de activación que requieren las moléculas para reaccionar en los seres vivos; estos son los Enzimas, y capacitan a la célula para realizar sus actividades con máxima rapidez y eficacia en las condiciones que son compatibles con la vida. La sustancia sobre la que actúa el enzima se llama sustrato.

Existen proteínas no enzimáticas, como los citocromos, que tienen propiedades catalíticas pero actúan como transportadores de electrones, y no activando otra sustancia. Los enzimas actúan activando a los sustratos.

2.2.1.2. PROPIEDADES DE LOS ENZIMAS

• ESPECIFICIDAD

La gran mayoría de enzimas tiene la capacidad de catalizar reacciones específicas; es decir, su intervalo de acción se limita a un determinado tipo de sustrato que debe reunir ciertas características para que pueda ser utilizado como tal. La especificidad de los enzimas es una propiedad que los hace muy diferentes a muchos catalizadores no biológicos, y que se ha dividido en cuatro grandes grupos:

• ESPECIFICIDAD ESTEREOQUÍMICA

Normalmente los enzimas utilizan D o L isómeros como sustrato: Casi todos los monosacáridos en la naturaleza son D mientras que los aminoácidos pertenecen a la serie L.

– BAJA ESPECIFICIDAD

Se presenta cuando los enzimas atacan un determinado tipo de enlace químico sin importar la naturaleza del sustrato.

– ESPECIFICIDAD DE GRUPO

Actúan sobre un sustrato que contiene un determinado enlace y un grupo químico específico al lado de dicho enlace.

– ESPECIFICIDAD ABSOLUTA

Es la más común, consiste en que el enzima utiliza una sola y muy específica sustancia como sustrato.

2.2.1.3. SITIO ACTIVO DE UN ENZIMA

Es aquella porción de aminoácidos de la proteína que participa en el proceso catalítico; es decir el sitio activo está formado por ciertos aminoácidos que forman un microambiente catalizador dentro de la propia molécula del polipéptido.

La participación de los aminoácidos del sitio activo en la reacción enzimática, implica en algunos casos, la formación de un compuesto intermediario enzima-sustrato unido covalentemente; no se ha demostrado que esto suceda con todos los enzimas, pero sí en algunas hidrolasas como la quimotripsina, la tripsina y la papaína, en las que se forman intermediarios covalentes que son posteriormente hidrolizados por la acción nucleófila del agua. En el sitio activo de muchos enzimas hidrolíticas participan aminoácidos nucleófilos, cuya característica principal es la tendencia a donar un par de electrones; los grupos más importantes son el hidróxilo de la serina, el sulfhidrilo de la cisteína, el imidazol de la histidina y el carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico.

Las estructuras conformacionales de los enzimas están estabilizadas por puentes de hidrógeno, uniones iónicas e hidrófobas, y en algunos casos enlaces disulfuro.

La acción de temperaturas extremas (altas o bajas), de disolventes, de condiciones drásticas de pH y fuerza iónica, y de varios agentes químicos, produce la desnaturalización del enzima, lo que origina la pérdida de su actividad; cuando el efecto del agente desnaturalizante no es muy fuerte, el enzima puede nuevamente regenerar su actividad al adquirir otra vez su estructura tridimensional de origen.

A temperaturas cercanas a los 30°C y de bajas concentraciones de los reactivos, catalizan limpiamente con gran eficacia y dan productos secundarios, reacciones muy específicas que con los métodos de la química orgánica no se pueden realizar.

Se auto regulan en respuesta a cambios de concentración de los reactivos o productos y su conformación no es rígida sino flexible.

Ciertas enzimas requieren de ciertos compuestos orgánicos, termoestables para poder cumplir con su función catalítica, estas moléculas se denominan coenzimas, generalmente tiene bajo peso molecular y suelen ser claves en el mecanismo catalítico. La apoenzima unida a la coenzima constituye la holoenzima. Estas moléculas termoestables generalmente son vitaminas o metales.

Según el tipo de reacción que catalizan las enzimas se dividen en 6 clases o grupos:

2.2.1.4. CLASIFICACIÓN DE LA COMISIÓN INTERNACIONAL DE ENZIMAS:

Cuando el número de enzimas conocidas se hizo mayor, fue necesario ordenar la nomenclatura y establecer una clasificación. La que se acepta universalmente es la Comisión Internacional de Enzimas (IEC) que las agrupa en seis clases según el tipo de reacción que catalizan, cada una de éstas seis clases se divide en subclases y subsubclases, en donde indicamos la clase subclase y subsubclase de las Hidrolasas.

CLASES DE ENZIMAS

• OXIDORREDUCTASAS

• TRANSFERASAS

ESTERASAS

CARBOHIDRASAS

NUCLEASAS

3. HIDROLASAS

3.4. ENZIMAS PROTEOLITICAS (PROTEASAS)

3.4.4. PROTEÍNASAS

ENDOPEPTIDASAS FICINA

3.4.4.10. PAPAÍNA *

BROMELINA

ENDOPEPTIDOSAS

PEPSINA

RENNINA

QUIMOTRIPSINA

CATEPSINA

TRIPSINA

PEPTIDASAS

• LIASAS

• ISOMERASAS

• LIGASAS

* Papaína: Código EC 3.4.4.10

2.2.1.5. ESPECIFICIDAD DE LOS ENZIMAS PROTEOLITICOS DEL GRUPO DE LAS PROTEÍNASAS:

a. PROTEÍNASAS ENDOPEPTIDOSAS:

Contienen serina e histidina en el centro activo y son inhibidas por el diisopropilfluorofosfato. La Catepsina, Tripsina, Pepsina, Rennina y Quimotripsina son enzimas de origen animal de tanta importancia en la fisiología humana y animal, ya que éstos producen la autólisis de los tejidos después de la muerte de los animales y tienen enorme importancia en bromatología.

b. PROTEÍNASAS ENDOPEPTIDASAS:

Tienen cisteína en el centro activo y son inhibidas por yodoacetato, p-cloromercuribenzoato y metales pesados, y activadas por el ácido cianhídrico.

La Papaína, Bromelina y Ficina; estos tres enzimas vegetales son semejantes en su especificidad y atacan a los enlaces peptídicos en los que participan aminoácidos básicos, leucina o glicina, así como sus esteres y amidas, poseyendo por lo tanto un margen de actuación más amplio que la Tripsina y la Quimotripsina.

2.2.2. PAPAYA

2.2.2.1. DEFINICIÓN

El papayo o "Carica Papaya" pertenece a la familia de las "caricáceas". Su raíz es de origen embrionario, posee un tallo esbelto y erecto coronado por un racimo de hojas planas de pedúnculo que van desde medio metro hasta metro y medio de largo.

El fruto es de forma esférica u ovoide, su cascara es delgada, lisa, su color es verde cuando está inmadura y amarilla-anaranjada cuando se encuentra en estado maduro.

La pulpa tiene un color anaranjado y es de un espesor de 2.5 a 5cm. y rodea a una cavidad, en cuyas paredes laterales existen membranas a las que están adheridas las semillas redondas y negras, éste grosor de la pulpa varía según la variedad.

2.2.2.2. VARIEDADES

Las más importantes son:

a. VARIEDAD SOLO:

Es de color amarillo claro y sabor muy dulce, contiene gran cantidad de materia carnosa comestible, esta variedad abunda en los trópicos.

b. VARIEDAD TALLO AZUL:

Tiene la forma oblonga, cascara verde oscura y carne espesa y sabor agradable, esta variedad se produce abundantemente en Florida.

c. CARICA PAPAYA NARA:

Es de fruto muy pequeño y de forma alargada, de color amarillo brillante en su madurez, esta variedad se produce abundantemente en Chile.

Teniendo en cuenta la inflorescencia y la forma de la fruta se puede clasificar e identificar dos tipos:

– El dioico o de fruta redonda, y

– El monoico o de fruta alargada

Dentro de estos tipos fundamentales, hay una serie de variedades que se caracteriza por diversas formas del fruto, debido tanto a la variabilidad de los hábitos de esta planta como a su edad, notándose que después del tercero o cuarto año de crecimiento, comienza a detenerse y las hojas y frutos disminuyen de tamaño, en nuestro departamento se cultiva las variedades de papaya común y las denominadas "Colombianas", para el presente Trabajo de Investigación se utilizará la variedad de "Papaya Común" que es procedente de la selva puneña.

2.2.2.3. ESPECIFICACIONES CUADRO 2.1.

FUENTE: Eficacia antioxiurotica de Cucúrbita máxima (Zapalla), Carica papaya, Portulaca olerácea (verdolaga) en escolares del nivel primario. Tesis-UNSA, 1997. Pág.25, Biblioteca Biomédicas

En México se le conoce con el nombre de zapote y melón, mamón en Argentina, mamao en Brasil, papaw en Inglés e higo de mastuerzo en España.

2.2.2.4. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS

CUADRO 2.2.

FUENTE: Molina Q. "Deshidratación Industrial", 1973.

2.2.1.1. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PAPAYA

CUADRO 2.3.

Contenido en 100 gr. de parte comestible de carica papaya l.

FUENTE: Folleto Titulado "Composición de los Alimentos Peruanos" del Ministerio de Salud. 1963.

2.2.3. PAPAÍNA

2.2.3.1. DEFINICIÓN

El enzima papaína se obtiene del látex del fruto del papayo (Carica papayo L), bien desarrollado pero aún no maduro, en forma de polvo de color crema; pudiendo también extraerse de los tallos de dicha planta.

Hidroliza la mayor parte de las proteínas, proteosas y peptosa hasta dar lugar a los péptidos y los aminoácidos, requiere un pH ligeramente ácido.

2.2.3.2. COMPOSICIÓN

La composición elemental de la papaína cristalina está dada por los resultados de tres laboratorios diferentes que se muestran a continuación:

CUADRO 2.4.

FUENTE:Advances in Enzymology. Volumen XIX, 1957. pág. 282; Biblioteca Biomédicas – UNSA. Cód. SO142800017

El contenido de aminoácidos de la papaína ha sido determinado independientemente por Cióse, Moore y Biwood y Pousmith, Stockell y Limmel.

Las mediciones cuantitativas en las fracciones de efluente fueron hechas colorimétricamente con ninhidrina, el triptófano y cisteína fueron estimados separadamente. Los datos de ambos laboratorios están dados en la siguiente tabla:

TABLA 2.1. COMPOSICIÓN Y PESO MOLECULAR DE LA PAPAÍNA

a Tomado solamente de. los datos de Smith, Stockell, y kimmel (155)

b Omitido total .

FUENTE :Avances in Enzymology. Volumen XIX, 1957, pág. 283. Biblioteca Biomédicas – UNSA. Cód: SO142800017

Donde ambos grupos usaron columnas de intercambio iónico debido a las discrepancias en los casos de estos aminoácidos utilizaron los factores de corrección para la destrucción durante la hidrólisis.

Las características más notables de la composición de papaína son el alto contenido de tirosina y glicina, la presencia de un solo residuo de histidina y la ausencia de metionina.

El contenido de cistina de la papaína es de considerable importancia debido a la naturaleza tiol del enzima.

No se ha encontrado fósforo o carbohidrato. La papaína contiene ocho átomos de sulfuro por mol de papaína.

El peso molecular de la papaína calculado de la composición de aminoácidos es 20,406.

El volumen específico parcial de papaína determinado es 0.724.

Este enzima está compuesto por una cadena polipeptídica sencilla de 212 aminoácidos. Estudios cinéticos han demostrado que el sitio activo puede acomodar siete aminoácidos, cuatro en el lado del acilo del enlace escindido (S4 – S1) y tres en el lado amino (S*1 – S'3).

La papaína es específica para aminoácidos hidrofóbicos en el sitio S2. Los esteres, y presumiblemente los péptidos, se hidrolizan a través de un camino con acilenzima, con la excepción de que se acila la Cys – 25.

Si denotamos la histidina "Im" y la cisteína "RSH", la forma iónica [RSH.HIm+] es inactiva a pH bajo, mientras que la forma iónica [RS-lm] es inactiva a pH elevado. La forma catalíticamente activa a pH neutro es uno de los tautómeros [RSH.Im] o [RS".HIm+] : no se puede distinguir entre dos estados iónicos que son portadores de la misma carga neta examinando la dependencia respecto al pH.

FIGURA 2.1 Mecanismo de reacción ( enzima + sustrato)

• ESTRUCTURA DEL SITIO ACTIVO

DE LA PAPAÍNA

En la estructura cristalina, la molécula está formada por dos dominios con una brecha profunda entre ellos. Ahí se observa lo siguiente:

a. El sitio de fijación para el sustrato se encuentra a horcajadas de esta brecha, aunque la Cys-25 y la H¡s-15S están en contacto próximo, se encuentran en lados opuestos de la brecha. La bolsa relativamente honda de. sitio S2 de los aminoácidos hidrofóbicos está formada con las cadenas laterales hidrofóbicas de la Tyr-67, Pro-68 y Trp-69 de un dominio y las de la Phe-207, Ala-160, Val-133 y Val-157 del otro.

El bajo pKa de la histidina se debe probablemente a que está parcialmente enterrada en una región hidrofóbica.

Los residuos D-aminoácidos no se pueden acomodar en los subsitios debido a interferencia esférica con la masa del enzima.

El enzima no es exopeptidasa porque el carboxilato libre del sustrato estaría a sólo 3-4 Á del carboxilato del Asp-158 con la consiguiente repulsión electrostática.

Análogos del sustrato que tienen un grupo estéricamente pequeño en la posición del grupo saliente se fijan de una forma considerablemente más fuerte que los que tienen residuos más voluminosos.

La especificidad para restos hidrofóbicos grandes en el subsitio S2 se manifiesta en valores de Kcat más elevados y no en fijación más fuerte.

Se encontró un movimiento hacia fuera de las paredes de la hendidura en la estructura cristalina del enzima inhibida por el derivado clorometilcetona de la N-benciloxicarbonil-L-fenilalanina-L-alanina.

Esta estructura demuestra que hay un sitio de fijación para el oxígeno carbonílico del enlace peptídico escindible.

La naturaleza exacta de la catálisis ácido-básica en el sitio activo no es conocida.

La etapa determinante de velocidad en la hidrólisis de amidas y de anilinas parece ser la ruptura del intermedio tetraédrico por catálisis acida general.

k. Se ha encontrado que en sistemas químicos sencillos la combinación de una base B y un tiol RSH reaccionan en forma de RS- y BH+.

FIGURA 2.2. Etapa de Acilación Estado de Transición

2.2.3.4. ESTABILIZACIÓN DE LA PAPAÍNA

Los componentes proteolíticos del Látex de papaya son inusualmente estables con relación a los extremos de temperatura y pH. La papaína resiste a 50°C por 30 minutos sin pérdida significativa de actividad, encima de 75°C ocurre la inactivación.

El enzima es muy estable a 30°C en el rango de pH 5 a 7, encima de pH 7 la actividad es lenta y encima de pH 11 la pérdida de actividad es más rápida, debajo de pH 3 la enzima es rápidamente inactivada.

La papaína cristalina es remarcablemente estable en soluciones de urea. La exposición a al:as concentraciones de urea produce pequeños cambios configuracionales en la papaína.

2.2.3.5. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS

• La papaína pura es un polvo amorfo, de color blanco grisáceo (crema) o pardusco.

• Ligeramente higroscópico.

• Poco soluble en agua y en la mayoría de los solventes orgánicos.

• Soluble en alcohol etílico y metílico.

• Su punto isoeléctrico aparente es 8.8.

• La papaína es termoestable.

• La temperatura de inactivación está entre 75° y 83°C.

• Pierde de 3 a 4 % de su actividad por mes a temperaturas ordinarias.

2.2.3.6. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS

• Es una enzima proteolítica considerada en la clasificación de los enzimas como Papainasa, del grupo de las Proteinasas y su propiedad enzimática está dada por la presencia de SH.

• Ataca a las sustancias proteicas y no a los polipéptidos.

• En la oscuridad puede conservarse por un año.

• La proteólisis es rápida a 40 – 50°C, actuando mejor a un pH próximo a la neutralidad.

La ventaja de la papaína sobre la pepsina es que puede actuar en medio alcalino o neutro y hasta ligeramente ácido.

Desdobla las proteínas hasta peptonas y aminoácidos.

Está sujeta a activación mediante agentes reductores y es inactivada por agentes oxidantes.

Pueden emplearse como activadores la cisteína, el glutatión, el cianuro de sodio, el tioglicolato de sodio y los sulfitos.

En la práctica parece que se añaden bisulfitos durante la preparación del enzima comercial. Casi todos los agentes oxidantes, incluso el oxígeno atmosférico inactivan la papaína en solución. Se ha demostrado la presencia de inhibidores "bioquímicos" en las harinas de soya y de trigo.

La papaína seca con 5-10 % de humedad, es bastante estable.

2.2.3.7. ACTIVACIÓN DE LA PAPAÍNA

El HCN ejerce un efecto activador en la acción proteolítica del látex de la papaya. El H2S es también efectivo y se sugirió que este agente activante funciona como coenzima.

Todos los activadores conocidos de la papaína son capaces de reducir los enlaces disulfuro, la papaína es reversiblemente oxidada con agentes oxidantes tales como l2, H202 y por exposición al aire la inactivación pudo ser parcialmente revestida por adición de agentes reductores, se puede decir que la activación de la papaína es el resultado de una reacción de reducción.

Varios investigadores postularon que la papaína inactiva existía como disulfuro (PaSSPa) y a la reducción como (PaSH) se hacía activo.

Las investigaciones hechas han demostrado sin embargo que la papaína no era activada completamente por alguno de los agentes reductores usuales. Análisis con a-Benzoil-L-Argininamida (BAA) como sustrato se observaron efectos iónicos específicos marcados en la actividad de la papaína, cuando la cisterna sola, era el agente activante, la combinación de Verseno-L-etilendiamino Tetra acetato, con algún reductor simple facilita la activación producida por este reactivo.

La combinación de la Cisteína y el Verseno dieron una actividad especifica máxima.

Las observaciones demuestran que un agente reductor es requerido, presumiblemente para la reducción de enlaces disulfuro a grupos Tiol libres que son esenciales para la actividad.

Es importante enfatizar que aunque la papaína requiere activación, la presencia continua del activador no es requerida, esto es la prueba más conclusiva de que la Cisteína, HCN, etc. no funcionan como coenzimas.

2.2.3.8. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

a. PRECIPITACIÓN FRACCIONADA:

Con alguna sal como S04(NH4)2 la diálisis y la precipitación de más proteínas mediante calentamiento moderado con algún ácido o con concentración moderada de alcohol o acetona.

POR ADSORCIÓN:

Con sustancias inorgánicas como los hidróxidos férrico y alumínico coloidales.

PRECIPITACIÓN DEL EXTRACTO:

Del látex de papaya (papaína cruda) con cloruro de sodio, por centrifugación en forma directa, seguido por la afinidad cromatográfica del precipitado redisuelto, para su posterior obtención en polvo.

2.2.3.9. USOS Y APLICACIONES

a. ALIMENTOS:

Se le emplea para ablandar las carnes duras y con este fin se le mezcla con la sal y demás sazonadores, con este mismo fin se le usa en inyecciones para colocárseles a los animales vivos antes del sacrificio: Por su propiedad digestiva puede usarse en recetas de dietas fácilmente digestibles. Se usa también para reducir la viscosidad de la clara del huevo y así helarla sin que gelatinice. Los hidrolizados ("lisados") de proteínas han sido muy utilizados en la práctica médica como reconstituyentes, a la que esporádicamente retornan de tanto en tanto. Actualmente se acrecienta su aplicación como aditivos alimentarios, pero si bien en algunos casos suelen utilizarse enzirnas proteolíticas en su preparación, es mucho más común que se apele a la hidrólisis clorhídrica. Naturalmente que así se destruyen algunos aminoácidos (tirosina y especialmente triptofano), por lo que en los hidrolizados destinados a uso terapéutico o a la elaboración de peptona (triptona) para ,ensayo microbiológicos se recurre a la hidrólisis enzimática.

b. INDUSTRIA CERVECERA:

Aplicada cuando la malta está hirviendo, impide que en la cerveza se forme una bruma cuando esté puesta en refrigeración. Las proteínas de alto peso molecular que se disuelven primero en la cerveza en presencia de oxígeno forman compuestos insolubles y la papaína hace que estas se descompongan en unidades más pequeñas, fácilmente solubles y que no precipiten.

c. INDUSTRIA DE CUEROS:

Otro proceso industrial importante en el que se emplean enzimas proteolíticas es la manufactura de cueros, ya sea en la etapa previa de depilación de la piel, como en la posterior del ,."batido", cuyo objetivo es preparar el cuero para el teñido y que consiste en la remoción de restos de pelos, glándulas, células epiteliales y tejidos superficiales no separados por los tratamientos previos. En este caso la más utilizada es la pancreatina, proteasa de origen animal, pero también se ha ensayado el uso de papaína,

d. LAVANDERÍA:

Es un detergente blanqueador, además ayuda a preservar la ropa de la grasa y suciedad.

e. EN MEDICINA:

Apoya la digestión enzimática. El amplio sector de pH en que la papaína desarrolla su actividad proteolítica ha de considerarse como ventaja, digiere proteínas provenientes de los alimentos.

f. EN LECHERIA:

Como agente de maduración de quesos.

f. EN FOTOGRAFÍA:

Para l a separación de la plata de las películas fotográficas.

g. EN LA INDUSTRIA TEXTIL :

En e l desgomado de la seda y el tratamiento de lanas. Para eliminar el apresto de la seda, el acetato, cuando aquél está hecho a base de gelatina o caseína.

h. EN FARMACOPEA :

En los polvos dentífricos, como sustituto de la pepsina diferenciándose de asta por ser activa en estado neutro o alcalino, por lo que está muy difundida en terapéutica. La papaína pura se usa como vermífugo destruyendo los parásitos intestinales al desintegrar su cutícula queratinosa, que los protege de la acción de los jugos digestivos. Es así como destruye los oxiuros, áscaris, tricocéfalos y anquilostomas de la familia de los nematodos.

i. OTROS:

Es usada también como antihelmíntico, , en la industria del tabaco, bacteriología, cosmetología, radiología, etc.

2.2.4. MATERIAS PRIMAS PARA LA HIDRÓLISIS

a. PROTEÍNAS

Cuando se solubilizan son de dimensiones coloidales tienen propiedades anfotéricas, su hidrólisis completa produce una mezcla de aminoácidos.

Por su función biológica, se las conoce con el nombre de biopolímeros.

Debido a que están constituidas por aminoácidos, las proteínas desarrollan una carga neta que depende de la influencia de los diferentes grupos R ionizables y del pH al que se encuentren:

Es decir, pueden tener una carga positiva y negativa o bien no tener carga cuando se llega a su punto isoeléctrico

b. AMINOÁCIDOS