Manual de Prácticas de Microbiología

Presentación

El Manual de Microbiología – Parasitología, se elaboró con la finalidad de proporcionar un material ordenado y de fácil acceso al trabajo académico, el cual se complementa con la actividad científica en el laboratorio.

Actualmente, toda carrera profesional que esté relacionada con el campo de la salud humana, debe contar con un Manual de Prácticas de Microbiología, tal como los estudiantes de Biología, Enfermería, Farmacia y Bioquímica, Odontología, etc. Es por esta razón que me di a la tarea de elaborar un manual que satisfaga las necesidades del estudiantado, quienes deben complementar el aspecto teórico, llevado en el aula, con la actividad científica desarrollada en el laboratorio de tal forma que se facilite el trabajo ordenado y uniforme en todos los niveles de pre grado.

El Manual consta de dieciocho prácticas y fue elaborado tomando en cuenta las referencias bibliográficas que se mencionan en los diferentes currículos académicos de la Universidad Nacional de "San Luís Gonzaga" de Ica, para la asignatura de Microbiología.

La elaboración del Manual se realizó en varias etapas mediante la recopilación de prácticas. Cada práctica inicia con el título en la parte central el cual se seleccionó de acuerdo a la dosificación del programa por semana. El objetivo hace referencia al aspecto significativo que se pretende que los alumnos logren al final del experimento. La introducción es la parte teórica de cada una de las prácticas, fue tomada de diversas referencias bibliográficas. En la parte experimental el procedimiento se tomó de diversos manuales de otras Universidades y de la misma Universidad de Ica. El cuestionario en el que el alumno demuestra su aprovechamiento logrado al final de la secuencia de aprendizaje se elaboró basado en el aspecto introductorio y resultados experimentales que se esperan de cada práctica. Así mismo, se complementa con observaciones que el alumno realizará mediante dibujos o esquemas y finalizará con conclusiones personales del mismo.Los autores

Recomendaciones generales

1. La hora de entrada al laboratorio tendrá 10 minutos de tolerancia, después de este tiempo, no se te permitirá el acceso a dicho ambiente.

2. Al entrar al laboratorio, deberás ponerte la bata y abotonarla completamente, sólo podrás quitártela al salir de éste.

3. Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, tu mochila debe ser colocada en el lugar indicado por el profesor.

4. Terminantemente prohibido comer ni fumar en el laboratorio, no debes introducirte ningún objeto a la boca.

5. Para las señoritas, recógete el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.

6. Limpia y desinfecta el área de trabajo antes y después de usarlo.

7. No pasees entre las mesas del laboratorio, el trabajo debes efectuarlo sentado y en tu equipo de trabajo.

8. Días antes de iniciar la práctica lee cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiendes pregunta al profesor.

9. Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica, es necesario que lo consigas, de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el equipo.

10. Informa al profesor de cualquier accidente que ocurra.

11. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbrelo con fenol y deja actuar diez minutos. Avisa al profesor.

12. Todo el material que vas a incubar o desechar, debes colocarlo en el sitio indicado por el profesor.

13. Etiqueta todo el material que vas a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha y nombre del material

14. Después de la incubación es necesario la esterilización del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud.

15. Lávate las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.

16. Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

PRACTICA N° 01

Reconocimiento de materiales y equipos de laboratorio

OBJETIVO

Cada estudiante del curso de Microbiología debe identificar y reconocer los materiales de laboratorio.

MATERIALES:

1. TUBOS DE ENSAYO: Son de vidrio, es empleado para conservar microorganismos en medios de cultivo líquido o sólido. Hay de diferentes formas y capacidades, con borde o sin borde pero, lo que más importa es su calidad termo resistente, es decir, su resistencia al calentamiento y a los cambios bruscos de temperatura.

2. PLACAS PETRI: Son materiales de vidrio que se utiliza para aislar microorganismos provenientes de diversas fuentes infecciosas.

3. PIPETAS: Son materiales de vidrio destinados a medir volúmenes pequeños de medios de cultivo líquidos u otras sustancias. Hay graduadas de 0.1 ml hasta 10 ml.

Pipetas graduadas con jeringa herméticamente esmerilada

4. MATRAZ DE ERLENMEYER: Son recipientes de vidrio en forma cónica que disponen una escala graduada y permiten estimar o aproximar volúmenes de líquidos. Se emplea para disolver medios de cultivos y conservarlos; los hay de varias capacidades de 25 ml hasta 5 litros.

5. BALONES: Son recipientes de vidrio de fondo plano (matraz Florencia), que sirve mayormente como contenedor, tiene similar función que el matraz de Erlenmeyer

6. MATRAZ DE KITASATO: Son recipientes de vidrio, de forma cónica, similar al Erlenmeyer, con la diferencia que en la parte del cuello posee un orificio lateral de salida. Se emplea para realizar filtraciones al vacío.

7. PROBETAS: Son recipientes cilíndricos graduados de vidrio grueso, con pico y con base para poderlos parar. Se emplean para medir volúmenes de líquidos. Hay de diferentes volúmenes, de 5 ml a 2 litros

8. BAGUETA: Llamadas también agitadores. Son varillas sólidas de vidrio. El largo del agitador está determinado por el tamaño y la forma del recipiente en que se emplea, así en vasos de precipitados. Sirven para homogenizar muestras y transportar pequeñas cantidades de ella; agitar y trasvasar líquidos; desprender partículas de precipitados adheridos al recipiente que no se pueden sacar.

9. BEAKER: Son vasos de vidrio que se utilizan para efectuar mezclas y titulaciones. Hay de diferentes volúmenes, de 25 ml a 500 ml

10. JERINGAS Y AGUJAS HIPODERMICAS: son materiales peligrosos que necesitan manejarse con precaución para evitar la inyección accidental o a generación de aerosoles durante las inoculaciones. Generalmente, la utilización de las mismas debe restringirse a los procedimientos para los que no existe una alternativa. Las agujas no deben doblarse, romperse, guardarse en la funda, o quitarlas de la jeringa después de su uso.

11. PORTA Y CUBRE OBJETOS: Son de vidrio. El porta objetos sirve para montar muestras de microorganismos, es más grande y más grueso que el cubre objetos, ya que éste sirve para cubrir las muestras montadas y permitir una mejor visualización.

12. PIPETAS PARA RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS: Es graduada a una dilución de 1/200. Es de vidrio con una cápsula en la parte sub terminal que permite almacenar el líquido diluyente en la sangre para una mezcla adecuada.

13. CAMPANA DE BREWER: Son de vidrio pirex, grueso y tienen mayor resistencia mecánica y térmica. Se usa para mantener una ambiente carente de oxígeno cuando se trabajan con bacterias exigentes. El borde esmerilado debe estar ligeramente cubierto con vaselina blanca o alguna grasa blanca especial, para conseguir un cierre hermético al aire.

14. ASA DE KOLLE: Consiste de dos piezas: el mango de Kolle y el asa, de bronce cromado y mango con bakelita. Son de un material inoxidable. Sirve para tomar muestras y poder realizar el cultivo en las placas petri.

15. MECHERO DE BUNSEN: Son aparatos para mantener un ambiente de esterilidad cuando se trabajan con siembra de microorganismos.

16. TRIPODE: Es de metal, construido de un anillo circular apoyado en tres patas equidistantes, que son varilla delgadas. Se utilizan para colocar sobre el la malla de asbesto en una operación de calentamiento de cualquier matraces con medios de cultivo.

17. GRADILLA: Es de metal o de madera. Es una especie de escalerilla portátil y sencilla. Sirve para portar a los tubos de ensayo durante un trabajo con éstos.

18. GOTERO: Son tubos de vidrio cortos y delgados, donde en uno de los extremos se adapta una perilla o bombilla de goma y en el otro extremo se encuentra estrangulado. Se emplea para la adición de pequeños volúmenes (gotas) de colorantes en tinciones.

• EQUIPOS

1. AUTOCLAVE: Es un equipo cuyo uso se destina a la esterilización de material para laboratorio. En la parte superior hay un termómetro y un barómetro que funciona: esterilización por aumento de la temperatura a altas presiones. 

2. INCUBADORA: Sirve para mantener en la temperatura adecuada al cultivo de bacterias. Mantiene a una temperatura de 37 a 34 °C

PRACTICA Nº 02

Manejo del microscopio y el mundo microbiano

OBJETIVO

El alumno reconocerá el microscopio compuesto, identificará cada una de sus partes y lo manejará correctamente observando la presencia de microorganismos en muestras biológicas

MATERIAL

• Microscopio compuesto

• Porta y cubre objetos

• Palillo

• Hisopo

• Agua estancada

INTRODUCCION

El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más útil en un laboratorio de Microbiología, proporciona la amplificación o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos de miles de veces.

Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios ópticos y los microscopios electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un sistema de lentes ópticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrónicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para producir una imagen ampliada.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

• Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

• Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

• Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

• Para realizar el enfoque:

• Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

• Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

• Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

PROCEDIMIENTO

Técnicas de montaje húmedo

La gota pendiente o las preparaciones húmedas permiten examinar organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones húmedas se hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lámina de vidrio y cubriéndola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporación y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con vaselina.

Cuando se examinan las preparaciones húmedas por microscopía de campo claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la intensidad de la luz mediante la utilización de filtros especiales.

Utilizada para estudiar la movilidad de los microorganismos

• En el centro de un portaobjetos coloca una gota de agua estancada

• Con una laminilla cubre cuidadosamente dicha gota, sin formar burbujas de aire

• Examina con objetivos de 10X y 40X.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es poder de resolución?

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2. ¿Con qué finalidad se utiliza el microscopio compuesto?

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3. ¿Cual es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?

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4. ¿Qué diferencias hay entre el microscopio óptico y electrónico?

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5. ¿Que importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras biológicas frescas?

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6. Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto

OBSERVACIONES

Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que preparaste durante el experimento.

CONCLUSIONES:

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Práctica Nº 02

Nombre del Alumno:______________________________ Grupo___________

Prof. de Laboratorio ______________________________ Calif:___________

PRÁCTICA Nº 03

Coloraciones bacterianas: coloración de Gram

OBJETIVO

El alumno aplicará una técnica de coloración diferencial para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

MATERIAL

• Asa de Kolle

• Microscopio

• Porta objetos

• Cultivo de Staphylococcus aureus

• Cultivos de Escherichia coli

• Cultivo de Candida albicans

• Aceite de inmersión

• Colorante cristal violeta

• Solución decolorante alcohol acetona

• Colorante safranina

• Lugol para Gram

INTRODUCCIÓN

TINCION DE GRAM

Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana. El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos, bacilos y formas espiraladas

Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos se tiñen de azul, mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espiralados se tiñen de rojo y se dice que son Gram negativos.

Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes:

• La presencia de cocos Gram positivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos

• La presencia de diplococos Gram negativos son características de especies de Neisseria

• Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o Clostridium, los bacilos Gram positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes (difteroides)

• Los bacilos Gram negativos son las bacterias más comunes halladas en los laboratorios clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus.

El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.

PROCEDIMIENTO

REALIZACIÓN DEL FROTIS

• Coloca una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.

• Flamea el asa de siembra y toma en condiciones asépticas una pequeña cantidad del cultivo bacteriano y transfiérelo a la gota de agua. Remueve la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario que realices los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.

FIJACIÓN

• Acerca la lámina a la llama del mechero para que la muestra se seque en forma paulatina. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado la lámina, pues las células pueden deformarse o romperse.

COLORACIÓN

• Tiñe con cristal violeta, 1minuto.

• Lava con abundante agua el exceso de colorante.

• Cubre con Lugol, 1 minuto.

• Lava con agua el exceso de Lugol.

• Decolora con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg)

• Lava con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

• Tiñe con safranina 1 minuto.

• Lava con agua para eliminar el colorante de contraste.

• Seca la preparación.

• Examina al microscopio con aceite de inmersión y fijándote sobre todo en el color de cada preparación.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es un colorante?

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2. ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?

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3. ¿Qué tipos de coloraciones conoces, describe brevemente

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4.- ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los microorganismos?

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5. De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿El cristal violeta a qué estructuras de la bacteria colorea?

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6. ¿Por qué se dice que la coloración Gram es de orientación?

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7. Menciona tres bacterias Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas

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8. Menciona tres bacterias Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas

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OBSERVACIONES:

Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las tinciones realizadas

CONCLUSIONES:

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Práctica Nº 03

Nombre del Alumno:_________________________________ Grupo______

Profesor de Laboratorio_______________________________ Calif:______

PRÁCTICA Nº 04

Coloración ácido-alcohol resistente

OBJETIVO:

El alumno aplicará las técnicas de coloración de microorganismos ácido-resistentes para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades morfológicas

MATERIAL:

• Esputo de tuberculoso procesado en autoclave.

• Fucsina fenicada de Ziehl- Neelsen

• Azul de metileno

• Alcohol acidulado

• Fenol al 5%

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes bacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos (ácidos micólicos), que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Ácido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Son bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) por lo que la tinción de Ziehl-Neelsen es útil para la coloración de estos microorganismos obtenidos de muestras clínicas o de cultivo. Con esta tinción, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos son difíciles de teñir con la tinción de Gram, y se observan como bacilos Gram positivos con tinción irregular. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes (BAAR)

El género Mycobacterium incluye más de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el punto de vista bacteriológico, pero con fines didácticos se dividen en tres apartados: Complejo tuberculosis. Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluye también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata. Complejo lepra, en el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana y Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en roedores. El Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios Otras Micobacterias, no comprendidas en los dos grupos anteriores, sólo algunas de ellas suelen ser patógenas, otras pueden ser patógenas oportunistas y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas

PROCEDIMIENTO

• Prepara un frotis del esputo, haciendo un delgado extendido del material para su estudio y deja que se seque al aire.

• Cubre la preparación con fucsina fenicada

• Calienta la preparación en un mechero Bunsen durante 5 minutos, no debe hervir. Si se evapora, añade más fucsina para que no se seque en ningún momento.

• Lava con agua el resto de colorante.

• Decolora con ácido-alcohol, hasta que adquiera un tenue color rosa.

• Lava con agua para que no prosiga la decoloración.

• Tiñe con azul de metileno por 1 minuto.

• Lava con agua el resto de colorante.

• Seca la preparación al medio ambiente.

• Examina al microscopio con objetivo de inmersión por 100 X (aceite)

• La tinción es positiva para bacilos rojos contra un fondo azul claro

CUESTIONARIO

1. Describe las características morfológicas del bacilo de la tuberculosis

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2. ¿Por qué el bacilo de Koch tiene mucha resistencia a la desecación?

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3. ¿Cuál es el protocolo de tratamiento para un paciente con TBC?

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4. ¿En qué casos el médico solicita el cultivo de esputo para el diagnóstico de una posible TBC?

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5. ¿Cómo se hace el reporte de la coloración Ziehl – Neelsen?

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OBSERVACIONES:

Haz un esquema de los pasos que realizaste durante la realización de la práctica, así como el dibujo de las bacterias bacilares observadas en el microscopio.

CONCLUSIONES:

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Práctica Nº 04

Nombre del Alumno:_________________________________ Grupo______

Profesor de Laboratorio_______________________________ Calif:______

PRACTICA Nº 05

Medios de cultivo

OBJETIVO

• Conocer los medios de cultivo y la finalidad que cumplen.

• Aplicar técnicas de siembre y observar la variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente.

MATERIAL

• Placas con Agar nutritivo

• Placas con Agar Mac Conkey

• Placas con Agar Manitol Salado

• 2 Mecheros

• caja de hisopos estériles sin abrir

• toallas de papel

• cinta adhesiva

• marcador permanente o lápiz de cera

• un desinfectante con 70% de solución de alcohol, 10% de una solución blanqueadora, jabón líquido Extran o alkox.

INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como carbohidratos, suero, sangre completa, bilis, etc. Los carbohidratos se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

A) POR SU ASPECTO FISICO

Medios líquidos. Se emplean fundamentalmente para:

• Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos. La multiplicación bacteriana en los medios de cultivos líquidos se manifiesta generalmente por el enturbiamiento de éste;

• Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.

• Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.

Medios semisólidos.- Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda. (0.5 gramos de agar por 100 ml)

Medios sólidos.- Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. En los medios de cultivos sólidos la multiplicación bacteriana se manifiesta por una formación macroscópica denominada colonia bacteriana, que es el resultado de la multiplicación de una sola célula bacteriana. (2 gramos por 100 ml)

B) POR SU FUNCION

I. Medios de cultivos comunes o básicos. Se caracterizan por que el material nutritivo, permite el crecimiento de diferentes especies de bacterias, constituyen la base para la preparación de otros medios. Como ejemplo pueden citarse el caldo nutritivo y el agar nutritivo.

II. Medios de cultivos especiales. Entre estos se encuentran:

a) Medios enriquecidos. En general son los mismos medios básicos a los que se les agrega una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso está orientado especialmente a obtener buen desarrollo de bacterias exigentes, se utilizan en primera instancia en el aislamiento bacteriano de productos patológicos. Los medios de este tipo de uso más frecuente son: Agar sangre, Agar chocolate.

b) Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden el crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram(+).

c) Medios de cultivos diferenciales. Se emplean para demostrar alguna propiedad bioquímica de la bacteria como degradación de carbohidratos, proteínas, etc., contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias. Entre los de uso más corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azúcar (TSI agar) Medio de SIM.

d) Medios de transporte. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especimenes, es decir, que no permiten la multiplicación de las bacterias manteniéndolos viables.

Técnicas de siembra

La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, así como a casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetación. Las superficies del baño, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos.

Un estudio adecuado de microorganismos que hay en este hábitat requiere técnicas que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto, separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una célula parental. El material que se inocula sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica. Durante la incubación a 37°C, las células microbianas individuales se reproducen tan rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen colonias. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo puro. La mayoría de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patógenos o causan enfermedad.

La siembra de microorganismos puede realizarse en medios líquidos o en medios sólidos. En el primer caso, para la inoculación se utilizará asa estéril si el medio de partida es sólido, o pipeta estéril (Pasteur o graduada) si es líquido. En el segundo caso, cuando se parte de otro medio sólido, se utiliza el asa de platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para siembra en picadura en tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir el microorganismo en el seno del medio de cultivo sólido; cuando el medio de partida es líquido, se puede pasar al medio sólido con un asa de platino calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o con pipeta, depositando la muestra que luego se extenderá sobre la placa con un asa de Digralsky o con una varilla doblada.

PROCEDIMIENTO

En esta actividad escogerás un fomite (cualquier objeto inanimado que pueda causar enfermedad en los organismos por contener microorganismos como: la manija, el marco, el control remoto de la televisión, una moneda). Este fomite ayudará a confirmar la presencia de microbios y los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en placas de Petri.

1. Si tienes el cabello largo, recógetelo para mantenerlo lejos de las placas de Petri cuando estés trabajando. Lava tus manos. Limpia tú área de trabajo frotando suavemente, con la solución desinfectante en una toalla de papel. Saca tus placas de Petri pero no las abras hasta que se te indique.

2. Escoge un objeto del salón de laboratorio (la manija, el marco, el control remoto de la televisión, una moneda, etc.). Toma una placa de Petri sin abrir y con tú lápiz de cera o marcador, divide la base de la caja en cuatro secciones iguales. Escribe el nombre del objeto al otro lado y designa las secciones de 1 hasta 4. Abre la caja de hisopos de algodón y escoge uno con cuidado para no tocar la punta. Limpia tu objeto escogido con todos los lados de la punta del hisopo volteándolo y retorciendo el hisopo a medida que lo mueves por la superficie del objeto.

3. Ahora abre la tapa de la placa y suavemente haz cuatro siembras sobre la superficie del medio de cultivo como se muestra en la ilustración, empezando en la sección designada "1" y continuando en el orden de las secciones, de manera que la última siembra esté en la sección 4. Presiona firme pero suavemente y no repitas las siembras anteriores. Tus siembras sólo deben dejar una impresión muy ligera en el Agar. Cierra la placa. No cubras la caja con cinta o no podrás verla bien.

4. Divide una segunda caja de Petri en 4 secciones numeradas de 1 hasta 4 y desígnala "Control." Limpia la mitad del objeto que escogiste anteriormente con una toalla de papel humedecida con agua, solo frótala un par de veces; no la restriegues. Con un nuevo hisopo estéril, toma muestra del área limpiada. Abre la tapa de la segunda placa y haz SUAVEMENTE 4 siembras en la superficie, siguiendo el orden de las secciones numeradas como lo hiciste previamente. Cierra la placa.

5. Divide la tercera placa de Petri en 4 secciones numeradas y desígnalas con el nombre del desinfectante que escogiste (por ejemplo "blanqueador"). Usa el desinfectante escogido para limpiar la otra mitad del objeto que trabajaste antes. Con un nuevo hisopo estéril, toma muestra del área. Repite el proceso de sembrar la placa y ciérrala.

6. Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y descártalos. Pon las placas en un lugar apartado e incúbalas a 37°C por 24 horas. Limpia tu área de trabajo con la solución desinfectante y lava tus manos.

7. Repite todo el experimento utilizando placas con cultivo de Agar sangre sólo que ahora selecciona otro Fomite que no hayas empleado

8. Después de que hayan pasado 24 horas, mira las placas de Petri iniciales. No la abras. Crea una tabla que compare las placas sembradas antes y después de limpiar el objeto (mira la tabla de ejemplo). Asegúrate de indicar si los microbios crecieron en cada siembra.

9. Nota: el profesor supervisor debe hacer este paso preferiblemente Cuidadosamente abre las placas de Petri en un lavadero e inúndalas con blanqueador o alcohol sin diluir. Déjalas por una hora y enjuágalas completamente; colócalas en una bolsa plástica, amárrala y descártala. Asegúrate de no tocar la superficie de las placas cuando las abras y lava tus manos cuidadosamente después de manipularlas. Limpia tú área de trabajo con la solución desinfectante.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es metabolismo bacteriano?

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2. ¿Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos?

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3. Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que se emplean en el laboratorio de microbiología

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4. ¿Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y peptona?

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5. ¿Qué medios de cultivo se emplean para aislar bacterias causantes de meningitis, tifoidea y neumonía?

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6. ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana?

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7. Completa en la siguiente tabla anotando X en los espacios correspondientes a las divisiones realizadas en donde hayan crecido los microorganismos:

A) MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR NUTRITIVO

B) MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR SANGRE