Técnicas de la Biotecnología (página 2)

Según esta definición, la fabricación, entre otros, de pan y cerveza que se basa en el empleo de células de levadura es un proceso biotecnológico.

La diferencia aportada por la biotecnología moderna es que actualmente el hombre no sólo sabe cómo usar las células u organismos que le ofrece la naturaleza, sino que ha aprendido a modificarlos y manipularlos en función de sus necesidades. La biotecnología tal como la conocemos actualmente empezó en los años 50 con el descubrimiento por James Watson y Francis Crick de la estructura de la molécula de ADN* (ácido desoxirribonucleico) que es donde se almacena la información genética (la herencia) en todos los seres vivos.

En contra de lo que pueda parecer, la Biotecnología no es un campo nuevo de actividad empresarial, su desarrollo puede remontarse a varios miles de años atrás cuando el hombre aprendió a producir pan y otros productos como el queso, la cerveza y el vino.

El hombre lleva varios miles de años modificando los vegetales que utiliza como alimento. Por ejemplo, las repollitos de Bruselas, la coliflor y el brócoli son variedades artificiales de la misma planta (aunque no lo parezcan). Lo mismo se puede decir de las decenas de variedades de manzanas, maíz, papas, trigo, entre otros. Los antecedentes salvajes de muchas de estas plantas, cuando existen, son tan poco parecidas que no serían reconocidos como tales por alguien que no fuera experto.

En cuanto a la "mezcla de especies", el triticale, un híbrido de trigo y centeno, lleva décadas prosperando en terrenos de mala calidad (útiles para centeno, pero no para trigo), pero con algunas buenas propiedades del trigo, lo que lo hace mucho más valioso para alimentación humana.

Sin embargo, la ingeniería genética permite ahora llevar a cabo, en pocos años y de forma controlada, lo que antes podía costar décadas o siglos, o conseguir efectos que sólo estaban en los sueños de los agricultores, pero que eran imposibles con las viejas técnicas de cruce y selección.

La ingeniería genética se utilizó inicialmente (por su alto coste) para producir sustancias de usos farmacéutico, como la insulina, modificando genéticamente microorganismos. Con los posteriores desarrollos, se obtuvieron también enzimas para uso industrial, como la quimosina recombinante, utilizada, al igual que la obtenida de estómagos de terneros jóvenes (su fuente original, el "cuajo"), para elaborar el queso. Posteriormente se han obtenido vegetales (y animales) modificados genéticamente para mejorar sus propiedades. Los productos de la biotecnología están alrededor nuestro. El yogurt, la cerveza, el vino y el queso de nuestra heladera son productos de la biotecnología. Los pickles, el pan, y el vinagre de nuestra cocina también lo son. Cientos de años atrás, la gente fue descubriendo, casi por accidente, cómo hacer uso de los procesos biológicos que ocurren dentro de las células vivientes. Sin entender los procesos, podían ver los resultados. Descubrieron, por ejemplo, que ciertos microorganismos, como las bacterias y los hongos podían producir vinagre, cerveza o vino cuando crecían en grandes tinas. Estos procesos fueron llamados fermentación. A través de prueba y error, aprendieron el control de estos procesos y a producir grandes cantidades de un amplio rango de productos.

Los científicos actualmente comprenden muchos de estos procesos biológicos y cómo estos ocurren. Esto les ha permitido desarrollar nuevas técnicas para alterar o copiar algunos de estos procesos naturales y por lo tanto lograr una amplia variedad de productos. Algunos, como el queso, son los mismos productos hechos utilizando la biotecnología tradicional, pero con los nuevos métodos son más rápidos, económicos y más confiables. Otros, como algunos de los nuevos productos farmacéuticos no pueden ser fabricados con los métodos antiguos.

Muchas definiciones de biotecnología han sido discutidas a lo largo de estos años. Algunas de las que se han mantenido a través de los años son:"Biotecnología significa la aplicación de principios científicos y de ingeniería para el proceso de materiales a través de agentes biológicos para obtener bienes y servicios. Estos principios cubren una amplia variedad de disciplinas pero se basa principalmente en microbiología, bioquímica, genética e ingeniería genética". OECD 1982, "Biotecnología, Perspectivas y Tendencias Internacionales"."Biotecnología significa la aplicación de la ciencia y de la ingeniería con el uso directo o indirecto de organismos vivos o partes o productos de organismos vivos en su forma natural o modificada". Canadian Environmental Protection Act, 1985.

En este trabajo tendremos la dura tarea de representar y dar ejemplos de ocho de las tantas técnicas utilizadas en la biotecnología en el campo tecnológico y biológico de los cuales entre otros podemos mencionar: el cultivo de células y tejidos, el uso de enzimas y la fermentación microbiana, la tecnología del hibridoma, la ingeniería de las proteínas y la genética que es la más conocida por las personas y la bioinformática; veamos…

Cultivo de células y tejidos

El cultivo de tejidos fue desarrollado a principios de siglo XX como un método de estudio del comportamiento de las células animales, libres de las variaciones sistémicas, y mantenidas en condiciones controladas. Primariamente se limitaba al estudio de las células capaces de migrar fuera del tejido cultivado. Con el desarrollo posterior de las técnicas de disgregado celular y de selección de distintos tipos celulares específicos fue posible obtener cultivos de células aisladas y cultivos enriquecidos en determinado tipo celular.

Se denominaron a partir de ese momento de forma diferente a los distintos tipos de cultivos. El cultivo órgano-típico implica que se cultiva un trozo de órgano manteniendo su conformación espacial característica y sus diversos tipos celulares. El cultivo histo-típico por otro lado, se caracteriza por la re asociación de células de alguna forma para asemejar a la estructura del tejido original.

El cultivo de células es el nombre que se utiliza para describir el cultivo de células disociadas y mantenidas directamente sobre la superficie del recipiente de cultivo.

Ésta es un una poderosa herramienta para el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicación y transcripción del ADN, síntesis proteica, metabolismo energético, nutrición, infecciones virales, transformación maligna, acción de drogas, toxicidad, secreción de productos especializados, desarrollo embrionario, etc. Además debe mencionarse la posibilidad del cultivo de tejidos con fines de reintroducción reparativa en diferentes patologías como por ejemplo el Parkinson.

Como ventajas de esta metodología podrían citarse:

• Control del medio ambiente celular: permite mantener a las células bajo condiciones similares a las fisiológicas de forma estable, y modificar a su vez únicamente las variables de interés.

• Caracterización y homogeneidad de la muestra: las muestras de tejidos son invariablemente heterogéneas, sin embargo generalmente luego de uno o dos pasajes, las líneas celulares asumen una constitución uniforme al ser mezcladas al azar y al actuar las fuerzas selectivas en favor de los tipos celulares que se dividen más rápidamente en esas condiciones. Se generan así réplicas casi idénticas disponibles para protocolos de análisis clínicos o de investigación.

• Economía y practicidad: los cultivos pueden ser expuestos a una concentración menor y conocida de cierta sustancia, existiendo un acceso directo a las células. Asimismo, en un solo experimento pueden realizarse una gran cantidad de duplicados y tratamientos distintos, sin tener que recurrir primariamente a grupos de animales.

Como desventajas podrían citarse:

• Experiencia requerida: las técnicas de cultivo deben ser llevadas a cabo en condiciones de asepsia estrictas, ya que las células animales crecen mucho menos rápido que los contaminantes biológicos. Además, las células de los metazoos no son capaces de vivir de forma aislada fuera del animal, con lo cual se requiere un ambiente de cultivo muy complejo, que simule el plasma sanguíneo o el fluido intersticial.

• In vitro no es in vivo: muchas de las diferencias entre el comportamiento de células en cultivo e in vivo se generan debido a la disociación de las células de su geometría tisular tridimensional, y a su propagación en un sustrato que no solo es bidimensional sino que carece de muchos de los elementos de la matriz extracelular organizada del animal. Las interacciones célula-célula, las características del tejido se pierden, cambian las proporciones relativas de tipos celulares, y el estadio y regulación del ciclo celular. Asimismo, el ambiente del cultivo carece también de muchos componentes sistémicos, involucrados en la homeostasis y en los diversos ciclos del animal.

Es posible encontrar muchas más diferencias in vivo-in vitro, lo cual ha llevado a ver al cultivo de células con ojos escépticos, sin embargo resulta innegable que muchas funciones especializadas son expresadas in vitro, de tal forma que si se comprenden las limitaciones del modelo puede transformarse en una herramienta poderosa.

Biología de la célula en cultivo

Luego del primer sub-cultivo o pasaje, el cultivo primario se denomina línea celular, y podrá· ser propagado y sub-cultivado varias veces. Con cada sub-cultivo sucesivo, las células con una lenta velocidad de división o con menor resistencia a las manipulaciones o tratamientos de disgregado se perderán, y el cultivo ser· cada vez más homogéneo y estable.

Las líneas celulares pueden ser propagadas de forma inalterada por un número limitado de generaciones, luego de lo cual mueren o dan origen a líneas celulares continuas. La alteración en cultivo dando origen a una línea celular continua se denomina comúnmente transformación in vitro, y puede ocurrir espontáneamente o en forma inducida con agentes químicos o virus. Sin embargo, la inmensa mayoría de las células normales no dan origen a líneas celulares continuas. Un ejemplo clásico de historia de vida de un cultivo lo constituyen los fibroblastos humanos, que se mantienen euploides durante su vida en cultivo, hasta la denominada crisis del cultivo (unas 50 generaciones después), deteniendo sus divisiones y comenzando un período de senescencia final.

Metodología del cultivo: técnica aséptica y cámaras de flujo laminar

• Técnica aséptica.

A pesar de la utilización de antibióticos en los medios de cultivo, la contaminación por microorganismos continúa siendo uno de los mayores problemas del cultivo de células. Las bacterias, los mico plasmas, las levaduras y las esporas de los hongos, pueden ser introducidas vía el operador, la atmósfera, la superficie de trabajo, las soluciones, etc. Una correcta y rigurosa técnica aséptica por parte del operador, conjuntamente con la utilización de soluciones y materiales probadamente estériles son imprescindibles para el mantenimiento de los cultivos libres de contaminantes biológicos.

• Cámaras de flujo laminar

La cámara de flujo laminar es un dispositivo que permite al operador trabajar en condiciones asépticas en un área bajo un flujo laminar de aire estéril. Existen tres tipos de cámaras de flujo laminar. Las cámaras tipo I son utilizadas para la preparación de soluciones y el trabajo con microorganismos o cultivos de células animales no humanas o de primates. Las cámaras de flujo horizontales y algún tipo de verticales son de esta clase. Claramente la cámara que ofrece menor seguridad al operador es la de flujo horizontal, si bien es también la que posee el flujo de aire más estable y la mejor protección frente a las infecciones de los cultivos. Las cámaras de flujo laminar tipo II y III son de flujo vertical, e incorporan diversas protecciones para el operador y el medio. Las de tipo III son de máxima seguridad, en estas el operador no posee contacto directo con los materiales de trabajo (solo a través de guantes sellados herméticamente contra la pared delantera de la cámara), todo el aire que sale de la zona de trabajo es re filtrado, y todo el material utilizado es auto clavado antes de entrar y de salir de la cámara. Este tipo de cámaras son utilizadas para el trabajo con agentes infecciosos humanos.

Ambiente de cultivo: sustratos, fase gaseosa, medios de cultivo y propiedades físicas

La influencia del ambiente de cultivo sobre las células es ejercida por cuatro vías principales: (i) naturaleza del sustrato o fase sobre o dentro de la que crecen las células, (ii) constitución fisicoquímica y fisiológica del medio de cultivo, (iii) constitución de la fase gaseosa, y (iv) propiedades físicas como la temperatura de incubación.

(i) Sustrato.

La mayoría de las células que han sido crecidas en cultivo, han sido cultivadas en mono capa sobre sustratos artificiales, y el crecimiento en suspensión sólo ha sido posible para ciertos tipos celulares como las células hematopoyéticas y otros pocos tipos. Es sabido ya que la mayoría de las células necesitan adherirse y extenderse sobre el sustrato para poder dividirse, con lo cual una correcta adherencia al sustrato resulta fundamental. Actualmente, las placas de cultivo de polietileno descartables proveen al investigador de una superficie de cultivo simple y reproducible para el cultivo, combinado con buenas propiedades ópticas.

Otro sustrato muy utilizado, aunque con fines específicos, son las bolitas de polietileno, sephadex, o poliacrilamida, para la propagación de células anclaje-dependientes en suspensión, amplificando así enormemente la superficie real de cultivo de un recipiente, como por ejemplo en el caso de los bio-reactores.

Las superficies son muy a menudo pre tratadas con por ejemplo medio de cultivo ya utilizado para el cultivo de otras células, o sembrando células que luego se remueven dejando sus secreciones adheridas, proveyendo de esta forma alguna de los constituyentes normales de la matriz extracelular del animal entero. También se agregan directamente a las placas, previo al contacto con las células, diversas macromoléculas de este tipo tales como laminina, fibronectina, colágeno, etc. En muchos casos in vitro, el contacto de la célula con estas macromoléculas es fundamental para un correcto crecimiento y expresión de sus características especializadas.

También se utiliza una mono-capa de células como acondicionadora del ambiente y como sustrato vivo para el cultivo de otro tipo celular. Este método no solo mejora o en algunos casos posibilita el crecimiento y diferenciación de ciertos tipos celulares en cultivo, sino que también contribuye a emular las condiciones originales de ciertos tejidos.

Se han diseñado otros muchos sistemas de cultivo para requerimientos especiales de determinado tipo celular, o condición experimental, tal es el caso de un tipo de recipiente que posee micro-capilares permeables, sobre los cuales se cultivan las células, y por dentro de los cuales se hace circular medio de cultivo.

(ii) Fase gaseosa.

Los constituyentes más importantes de esta fase para el cultivo de células son el O2 y el CO2. Los cultivos varían en sus requerimientos de oxígeno, tal es el caso de los cultivos celulares y los cultivos órgano-típicos. Mientras que tensiones de O2 atmosféricas o menores son preferibles para la mayoría de los cultivos de células, algunos cultivos órgano-típicos requieren hasta un 95% de O2 debido a su escasa difusión.

El CO2 tiene un papel complejo, y es difícil entender cómo ejerce su efecto debido a sus implicancias sobre la concentración de O2 disuelto, el pH y la concentración de HCO3- del medio de cultivo. La tensión atmosférica de CO2 y la temperatura del ambiente del cultivo regulan directamente la concentración de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Se regulará así de forma indirecta el pH del medio de cultivo, ya que al cultivo se le adiciona también cierta cantidad de HCO3-, con lo cual se establecerá un equilibrio que sirve como tampón:

H20 + CO2 ( H2CO3 ( H+ + HCO3- + Na+ ( NaCO3 + H+

Se ajustan las concentraciones de HCO3- y CO2 para fijar el equilibrio a pH 7,4.

(iii) Medios de cultivo y suplementos.

Con el fin de emular las condiciones in vivo se desarrollaron medios de cultivo basales tales como el de Eagle, y medios más complejos como el 199. Sin embargo estos medios requieren de la suplementación con suero según los tipos celulares. Para condiciones en las cuales es deseable eliminar el suero, se desarrollaron medios de cultivo definidos (de composición conocida) que permiten el correcto crecimiento de un determinado tipo celular in vitro. Cada tipo celular tendrá sus propios requerimientos lo cual hace necesario un cuidadoso análisis de las características del medio de cultivo que se elige para cada tipo celular.

La base de todo medio de cultivo es una solución salina balanceada, a la cual se le van adicionando diferentes componentes para generar un tampón, aminoácidos esenciales, vitaminas, trazas de minerales, y otros metabolitos como piruvato, nucleósidos, lípidos, etc. Como ya hemos comentado, en la mayoría de los casos se adiciona además distintas proporciones de suero, cuyo componente mayoritario son las proteínas tales como transportadores de minerales, hormonas o lípidos (albúmina, globulinas, transferrina, etc). Otros de sus componentes importantes son metabolitos diversos, nutrientes específicos, factores de crecimiento polipeptídicos (PDGF, FGF, NGF, etc.), y hormonas (insulina, hidrocortisona, etc.).

(iv) Propiedades físicas.

La mayoría de las líneas celulares crecen a pH 7,4. Con el fin de fijar el pH del medio de cultivo en este valor, se utiliza un tampón bicarbonato como ya se ha descrito. Este tampón si bien no tiene una alta capacidad, es muy aconsejable debido a su baja toxicidad y a que es el principal sistema de tampón in vivo. Otro factor importante es la osmolaridad, que si bien en el plasma humano es aproximadamente 290 mOsm/kg, en la práctica, en cultivo pueden utilizarse osmolaridades de entre 260 y 320 mOsm/kg para la mayoría de las líneas celulares. La temperatura de incubación de los cultivos se ajusta a la temperatura promedio del animal del cual proviene el cultivo, para mamíferos debe ser de 37ºC, mientras que para otros cultivos de origen diferente como en el caso de insectos o anfibios será distinta. Finalmente, la viscosidad es otra propiedad importante del medio de cultivo, que se encuentra principalmente determinada por los constituyentes del suero.

Uso de enzimas y fermentación microbiana

Uso de Enzimas:

La utilización empírica de preparaciones enzimáticas en la elaboración de alimentos es muy antigua. El cuajo, por ejemplo, se utiliza en la elaboración de quesos desde la prehistoria, mientras que las civilizaciones precolombinas ya utilizaban el zumo de la papaya. Sin embargo, hasta 1897 no quedó totalmente demostrado que los efectos asociados a ciertos materiales biológicos, como el cuajo o las levaduras pudieran individualizarse en una estructura química definida, llamada enzima, aislable en principio del organismo vivo global. Desde hace unas décadas se dispone de enzimas relativamente puros y con una gran variedad de actividades susceptibles de utilizarse en la elaboración de alimentos. Los progresos que están realizando actualmente la ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar un desarrollo cada vez mayor del uso de los enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales con la actividad deseada a precios razonables. Los enzimas son piezas esenciales en el funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como catalizadores de las reacciones de síntesis y degradación que tienen lugar en ellos. La utilización de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas, además de las de índole económica o tecnológica. La gran especificidad de acción que tienen los enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Así mismo se puede trabajar en condiciones moderadas, especialmente de temperatura, lo que evita alteraciones de los componentes más lábiles del alimento. Desde el punto de vista de la salud, puede considerarse que las acciones enzimáticas son, en último extremo, naturales. Además los enzimas pueden inactivarse fácilmente cuando se considere que ya han realizado su misión, quedando entonces asimilados al resto de las proteínas presentes en el alimento. Para garantizar la seguridad de su uso deben tenerse en cuenta no obstante algunas consideraciones: en aquellos enzimas que sean producidos por microorganismos, estos no deben ser patógenos ni sintetizar a la vez toxinas, antibióticos, etc. Los microorganismos ideales son aquellos que tienen ya una larga tradición de uso en los alimentos (levaduras de la industria cervecera, fermentos lácticos, etc.). Además, tanto los materiales de partida como el procesado y conservación del producto final deben ser acordes con las prácticas habituales de la industria alimentaria por lo que respecta a pureza, ausencia de contaminantes, higiene, etc.Los enzimas utilizados dependen de la industria y del tipo de acción que se desee obtener, siendo éste un campo en franca expansión. A continuación se mencionan solamente algunos ejemplos.

• Industrias lácteas:

Como se ha indicado, el cuajo del estómago de los rumiantes es un producto clásico en la elaboración de quesos, y su empleo está ya citado en la Ilíada y en la Odisea. Sin embargo, el cuajo se obtuvo como preparación enzimática relativamente pura solo en 1879. Está formado por la mezcla de dos enzimas digestivos (quimosina y pepsina) y se obtiene del cuajar de las terneras jóvenes. Estos enzimas rompen la caseína de la leche y producen su coagulación. Desde los años sesenta se utilizan también otros enzimas con una acción semejante obtenidos a partir de microorganismos o de vegetales Actualmente empieza a ser importante también la lactasa, un enzima que rompe la lactosa, que es el azúcar de la leche. Muchas personas no pueden digerir este azúcar, por lo que la leche les causa trastornos intestinales. Ya se comercializa leche a la que se le ha añadido el enzima para eliminar la lactosa.

• Panadería:

En panadería se utiliza la lipoxidasa, simultáneamente como blanqueante de la harina y para mejorar su comportamiento en el amasado. La forma en la que se añade es usualmente como harina de soja o de otras leguminosas, que la contienen en abundancia. Para facilitar la acción de la levadura, se añade amilasa, normalmente en forma de harina de malta, aunque en algunos países se utilizan enzimas procedentes de mohos ya que la adición de malta altera algo el color del pan. La utilización de agentes químicos para el blanqueado de la harina está prohibida en España.A veces se utilizan también proteasas para romper la estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa. Este tratamiento es importante en la fabricación de bizcochos.

• Cervecería:

A principios de este siglo (1911) se patentó la utilización de la papaína para fragmentar las proteínas presentes en la cerveza y evitar que ésta se enturbie durante el almacenamiento o la refrigeración, y este método todavía se sigue utilizando. Este enzima se obtiene de la papaya. Un enzima semejante, la bromelaína, se obtiene de la piña tropical.Un proceso fundamental de la fabricación de la cerveza, la rotura del almidón para formar azúcares sencillos que luego serán fermentados por las levaduras, lo realizan las amilasas presentes en la malta, que pueden añadirse procedentes de fuentes externas, aunque lo usual es lo contrario, que la actividad propia de la malta permita transformar aun más almidón del que contiene. Cuando esto es así, las industrias cerveceras añaden almidón de patata o de arroz para aprovechar al máximo la actividad enzimática.

• Fabricación de zumos:

A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean turbios y demasiado viscosos, produciéndose también ocasionalmente problemas en la extracción y en su eventual concentración. Esto es debido a la presencia de pectinas, que pueden destruirse por la acción de enzimas presentes en el propio zumo o bien por enzimas añadidas obtenidas de fuentes externas. Esta destrucción requiere la actuación de varios enzimas distintos, uno de los cuales produce metanol, que es tóxico, aunque la cantidad producida no llegue a ser preocupante para la salud.

• Fabricación de glucosa y fructosa a partir del maíz:

Una industria en franca expansión es la obtención de jarabes de glucosa o fructosa a partir de almidón de maíz. Estos jarabes se utilizan en la elaboración de bebidas refrescantes, conservas de frutas, repostería, etc. en lugar del azúcar de caña o de remolacha. La forma antigua de obtener estos jarabes, por hidrólisis del almidón con un ácido, ha sido prácticamente desplazada en los últimos 15 años por la hidrólisis enzimática, que permite obtener un jarabe de glucosa de mucha mayor calidad y a un costo muy competitivo. De hecho, la CE ha limitado severamente la producción de estos jarabes para evitar el hundimiento de la industria azucarera clásica. Los enzimas utilizados son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La glucosa formada puede transformarse luego en fructosa, otro azúcar más dulce, utilizando el enzima glucosa-isomerasa, usualmente inmovilizado en un soporte sólido.

• Otras aplicaciones:

Los enzimas se utilizan en la industria alimentaria de muchas otras formas, en aplicaciones menos importantes que las citadas anteriormente. Por ejemplo, en la fabricación de productos derivados de huevos, las trazas de glucosa presentes, que podrían oscurecerlos, se eliminan con la acción combinada de dos enzimas, la glucosa-oxidasa y la catalasa. Por otra parte, la papaína y bromelaína, enzimas que rompen las proteínas, se pueden utilizar, fundamentalmente durante el cocinado doméstico, para ablandar la carne.Algunas enzimas, como la lactoperoxidasa, podrían utilizarse en la conservación de productos lácteos.

Fermentación microbiana:

La fermentación microbiana es el uso de microorganismos para generar un producto de consumo humano o utilidad veterinaria, ya sea alterado genéticamente o no. Entre los productos generados se encuentran: bebidas alcohólicas, enzimas, comidas y aditivos de comida, vitaminas, vacunas, antibióticos, etc.Anteriormente las bacterias habían sido utilizadas para la producción de vino y antibióticos, cosa que no se ha dejado de hacer. La utilización de la biotecnología en la fermentación microbiana empezó en el 1973 con el gen del African clawed toad que fue insertado en el laboratorio en la bacteria de Escerichia coli; este fue el primer experimento de ingeniería genética y con esto comenzó la era de la tecnología de DNA recombinante. El primer medicamento generado mediante la utilización de estas dos técnicas (fermentación microbiana y DNA recombinante) fue una forma de insulina.La fermentación microbiana es el método más aplicado en la biotecnología. La ventaja de la fermentación microbiana es que al utilizar bacterias y levaduras estas crecen rápidamente en un medio a bajo costo, ofrecen una alta expresión de los niveles de la proteína que deseamos obtener, de las cuales ellos a veces secretan en el medio y esto hace más fácil la purificación. También estos microorganismos pueden resistir fuertes tratamientos comparados con las células animales. Sin embargo, existen ciertas limitaciones en la utilización de bacterias y hongos para procesos industriales ya que no llevan a cabo procesos post-translacionales como lo es la glicosilación (bacterias) y muchas veces estos organismos liberan proteasas junto con la proteína de interés, también puede haber presencia de endotoxinas en el caso de las bacterias y muchas veces las bacterias forman cuerpos de inclusión lo que dificulta la tarea de recolectar el producto.Entre los principales microorganismos utilizados se encuentran: E. coli y B. subtilis. E. coli es el organismo más común como fuente de producción de proteína recombinante ya que se conoce su mapa genético. B. subtilis ha sido utilizado principalmente por su gran tendencia de secretar proteínas en su ambiente. La fermentación de bacterias y hongos ofrecen la opción más económica y algunos criterios la convierten en la respuesta más obvia.

Aplicaciones:

La fermentación microbiana tiene un sin número de usos y aplicaciones en la industria hoy día. Mediante la fermentación microbiana se ha logrado la elaboración de diferentes productos como lo son: alimentos, vitaminas, bebidas alcohólicas, productos farmacéuticos, químicos, combustibles, enzimas, biomasa, proteínas, entre otros.

Los productos antes mencionados se generan por medio de diferentes tipos de fermentación. La fermentación láctica (queso, yogurt), fermentación alcohólica (vino, cerveza, alcohol, cigarrillos, chocolate, pan y otros) y la fermentación acética (vinagre).

Un ejemplo de esta tecnología es la producción industrial de eritromicina, antibiótico producido por el actinomiceto gran positivo Saccharopolyspora erythraea bajo fermentación aeróbica utilizando aceite de soya como fuente principal de carbono y acido propionico como precursor. La producción de eritromicina es actualmente llevada a cabo en la planta de Abbott en P.R.

La fermentación microbiana también es un medio de producción de vitaminas. Entre el grupo de vitaminas generadas por este medio podemos encontrar las siguientes: acido ascórbico, riboflavinas, beta-caroteno, vitamina B12, acido fólico y la pro vitamina A. Las de mayor importancia a nivel industrial son: riboflavina, beta-caroteno y vitamina B12.

En sus comienzos la vitamina B12 fue obtenida como un subproducto de los estreptomicetos en la producción de estreptomicina. En la actualidad la producción de esta vitamina es llevada a cabo por varias bacterias entre estas: Propionibacterium fredenreichii, Propionibacterium shermani y Pseudomonas denitrificans

La fermentación de riboflavina puede llevarse a cabo mediante bacterias, hongos o levaduras. Entre los organismos utilizados: Emerothecium ashbyii y Ashbya gossypii.

Los rendimientos más altos en la producción del Beta-caroteno se han obtenido mediante la fermentación del hongo Blakeslea trispora donde se emplean ambas formas sexuales (+ y -). Estas dos formas sexuales no tienen que estar en igual concentración ya que la encargada verdaderamente de la formación de beta-caroteno es la cepa negativa.

Con respecto a las bebidas alcohólicas en la elaboración de vinos también hace uso de esta técnica. El proceso mediante el cual es producido vino es el siguiente:

• La elaboración del vino puede tener como materia prima cualquier fruta o vegetal con alto contenido de azúcares pero se asocia a los vinos de calidad con uvas.•La fermentación de estas uvas es llevada a cabo por levaduras silvestres (presentes de forma natural en las uvas) o por lo general Saccharomyces cerevisiae.•Luego de fermentado estas levaduras son separadas del vino por sedimentación.•El vino se añeja.

Como han podido apreciar la técnica de fermentación microbiana es una de gran utilidad en la elaboración de muchos de los productos de nuestro diario vivir.

Tecnología del hibridoma

Los hibridomas son células híbridas resultantes de la fusión de células extraídas del bazo de un animal (linfocitos) con células cancerosas inmortales y de reproducción rápida (mielomas). Esta técnica es utilizada para la producción de anticuerpos mono nucleados.

La respuesta normal en lo que concierne a anticuerpos a cualquier molécula que se ha introducido natural o artificialmente es compleja (policlonal) y da como resultado la formación de una mezcla de diferentes anticuerpos contra cualquiera de los sitios antígenos (pueden formarse anticuerpos contra azúcares, proteínas o lípidos o combinaciones de ellos). La principal ventaja de la producción de anticuerpos monoclonales es que la respuesta policlonal compleja descrita puede separarse en sus componentes individuales. Sin embargo dado que las células que los albergan sólo viven unos pocos días requiere que las células manipuladas se tornen en inmortales.

La primera fase en la producción de anticuerpos monoclonales (o mononucleados) consiste en preparar el antígeno (seleccionando especificidades individuales mediante fusión celular), éstos son purificados parcialmente, vgr por disgregación sub-celular, lavado con un disolvente apropiado (elución) de bandas proteínicas a partir de geles de acrilamida o enriquecimiento cromotográfico.

Posteriormente, se inocula al animal en cuestión con los antígenos seleccionados, de suerte que cada linfocito produzca un anticuerpo específico; cada uno de ellos (normalmente mortal) es posteriormente, inmortalizado por la fusión con un mieloma (célula cancerosa, de reproducción indefinida y rápida). La célula resultante con una nueva carga genómica, guarda su especificidad en la producción de anticuerpos homogéneos (y únicos, de allí su denominación de anticuerpos monoclonales) al originar un clon de nuevas células, con la rapidez del mieloma.

El hibridoma productor del anticuerpo monoclonal para poder ser analizado para su utilización dependiendo  de la unión directa del anticuerpo con su antígeno, la cual no es fácil de detectar, por lo que se le adiciona un segundo anticuerpo marcado ya sea con una molécula fluorescente, un isótopo radiactivo, o con una enzima que posee un producto de reacción coloreada; de esta manera puede detectarse la unión de un anticuerpo monoclonal con su antígeno, una vez que la cavidad que contiene el anticuerpo deseado es identificada, las células tienen que clonarse para tener la certeza de que todas proceden de un sólo producto de fusión (lo que se logra reduciendo, por dilución, a una las células de cada cavidad para que cuando vuelvan a crecer los sobrenadantes de esos clones correspondan a un único origen), asegurado lo cual el producto se congela en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Aunque existen numerosas variantes para la obtención de hibridomas y Ac Mc específicos, el protocolo general tiene las siguientes etapas:

• Clon de células específicas (Inmortalidad) 1. Como célula de mieloma parenteral se selecciona una mutante enzimo-dependiente de una línea celular de plasmocitoma. Habitualmente se usan células deficientes en hipoxantin-guanin-fosforribosil-transferasa (HGFRT-). Se cultivan en un medio que contiene dicha enzima.

• Anticuerpos específicos (cel. bazo) 2. Las células parentales productoras de anticuerpos se obtienen del bazo (o de la población linfocitaria de sangre periférica) de un animal inmunizado con el antígeno frente a cuyos epitopes se desea obtener anticuerpos monoclonales.3. Ambos tipos de células parentales se mezclan en polietilenglicol durante 1 minuto. Se produce la fusión celular y se originan los hibridomas.4. Tras un lavado y unas horas de incubación, se procede a la dilución y clonado de la suspensión celular, sub cultivando durante varias semanas en un medio desprovisto de HGFRT. Las células no fusionadas mueren en este medio y cada uno de los hibridomas da lugar a un clon.5. Los sobrenadantes de cada clon celular son examinados periódicamente para determinar la presencia de anticuerpos frente al antígeno utilizado. Los clones identificados como productores de anticuerpos son clonados de nuevo, se comprueba su capacidad de producción, se establece la línea celular correspondiente y se determinan las características del Ac Mc obtenido.

La producción del Ac Mc se realiza por cultivo en masa de la línea celular o por inducción de un mieloma en un animal singénico, en cuyo líquido ascítico la concentración del Ac Mc puede ser muy elevada.Cuando se ha establecido un clon de células fusionadas, todo el Ac que secretan deriva por definición de una célula, pero no se trata necesariamente de un Ac Mc en el sentido inmunológico, porque cada célula del clon tiene cromosomas de la célula mielomatosa y de la del bazo, y expresa ambas dotaciones cromosómicas. Dado que los híbridos tienden a perder cromosomas, pueden seleccionarse las variantes que sólo secretan el Ac específico. Cuando la línea mielomatosa parental, además de ser HGFRT-, es una mutante que sólo secreta cadenas ligeras o que no secreta Ac en absoluto, se facilita la obtención del clon que sólo secreta Ac Mc según la información proporcionada por la célula de bazo parental. En la actualidad se dispone de una amplia gama de líneas mielomatosas murinas para fusión de estas características (líneas NS1, SP2, 653, etc.).Se ha consagrado un gran esfuerzo a la consecución de adecuadas líneas de mieloma humano y, en general, a la producción de hibridomas con células humanas que sinteticen anticuerpos que puedan ser utilizados experimentalmente en el hombre. Aunque se consigue la fusión entre células mielomatosas de ratón y células humanas que expresen los caracteres de estas últimas, en general son poco estables. En 1980 se obtuvieron los primeros hibridomas con ambas células de origen humano.Bajo los mismos principios se han desarrollado hibridomas de células T mediante la fusión de células de un linfoma de células T con células linfoides de un animal inmunizado. En este caso se consigue la inmortalización de los caracteres de la célula T parental. Estos hibridomas encuentran, entre otras, importantes aplicaciones en la investigación de las funciones, marcadores de superficie y productos de las subpoblaciones linfocitarias T. También resultan inestimables en la producción de mediadores de las células linfoides.

MONOCLONALES VERSUS POLICLONALES Los Ac Mc producidos por hibridomas presentan considerables ventajas frente a los antisueros convencionales preparados en animales inmunizados. Son inmunoglobulinas de una sola especie molecular con una afinidad medible por el Ag, lo que los convierte en productos de grado analítico, utilizables para una cuantificación precisa de las reacciones serológicas, y en reactivos estándar de calidad constante. Por otra parte, pueden seleccionarse los anticuerpos específicos frente a los diferentes determinantes de un antígeno complejo, sin la difícil y a veces imposible purificación del inmunógeno (antígenos de las membranas celulares, tumorales, microbianas, etc.): de hecho, la tecnología de los hibridomas permite una completa disección de la respuesta inmunitaria.Por último, la inmortalidad de las líneas celulares productoras garantiza el suministro continuo de anticuerpos de calidad constante con costos reducidos.Por todo ello, no es exagerado afirmar que los hibridomas y sus productos han introducido una verdadera revolución tecnológica con enorme impacto en la inmunología, microbiología, hematología, genética y muchas otras áreas, y múltiples aplicaciones en investigación, diagnóstico y terapéutica (algunas ya consolidadas y otras aún en el terreno experimental).

REACTIVOS: Las aplicaciones de los Ac Mc, se incrementa día a día. Se utilizan para identificación de antígenos celulares y, en consecuencia, individualización de subpoblaciones celulares normales (células linfoides, células del sistema nervioso) o patológicas (leucemias, células tumorales); como reactivos de laboratorio para su uso en inmuno-química, microbiología, hematología, endocrinología, etc., por técnicas como radio-inmuno-ensayo, inmuno-fluorescencia o ELISA, y para caracterización de enzimas, neurotransmisores, receptores celulares, etc. En otro orden, puesto que los Ac Mc son capaces de reconocer un componente determinado de una mezcla de antígenos, constituyen inmuno-absorbentes excelentes que encuentran gran aplicación en la purificación de antígenos.

TRATAMIENTOS: Los Ac Mc han abierto perspectivas extraordinarias en la terapéutica. Por una parte, los hibridomas podrán ser, muy probablemente, la fuente de anticuerpos utilizables en inmunidad pasiva con grandes ventajas sobre los actuales sueros preventivos y terapéuticos. Por otra parte, los Ac Mc dirigidos contra epitopes de células tumorales, de sub-poblaciones linfoides, etc. se están ensayando en el tratamiento antitumoral, en la prevención del rechazo de trasplantes alogénicos, etc. en experiencias altamente prometedoras.Inmunotoxinas Finalmente, la posibilidad de copular Ac Mc con toxinas de acción muy específica (de origen bacteriano o vegetal), con antimitóticos o incluso con isótopos radiactivos ha introducido el concepto de anticuerpos armados o inmunotoxinas, que podrían actuar con refinada selectividad destruyendo determinadas células nocivas.

Ingeniería de proteínas

La Ingeniería de Proteínas es una rama emergente de la ingeniería. Aplica conocimientos de matemática, economía y biología molecular al diseño de proteínas. Existen dos métodos para el diseño de proteínas: el diseño racional (rational design) y la evolución dirigida.

En el diseño racional se presupone un conocimiento detallado de la estructura y función de la proteína, en la que se introducen los cambios deseados. Es un método sencillo y barato, aunque el conocimiento necesario para aplicarlo no siempre está disponible.

En la evolución dirigida se introducen mutaciones aleatorias en la proteína bajo estudio y se seleccionan sólo aquellas variantes que presentan las propiedades deseadas. Varias rondas de mutación y selección dan lugar a una colección de proteínas modificadas que presentan las características deseadas. En este momento se aplica la técnica de barajar ADN (DNA shuffling) consistente en mezclar partes de las proteínas más exitosas en busca de una proteína aún mejor. Estas técnicas están inspiradas en la evolución natural y la reproducción sexual respectivamente.

Es frecuente que los investigadores apliquen ambas técnicas en el diseño de una proteína dada. Primero se aplica el diseño racional y se somete al producto a evolución dirigida.

Hay varios factores que influyen en la síntesis de las proteínas transgénicas. Uno de los más importantes es la frecuencia de uso de codones. La concentración intracelular de cada ARN de transferencia varía significativamente de un organismo a otro. La presencia en un gen eucariota de un triplete poco usado en bacterias, o viceversa, disminuye drásticamente la síntesis de la proteína, factor que debe ser tenido en cuenta para elegir el huésped más conveniente. Además, muchas proteínas sintetizadas en sistemas transgénicos no son capaces de plegarse correctamente y adquirir una conformación funcional, sino que precipitan en conglomerados insolubles. No se conocen los factores que determinan el plegamiento de un péptido cuando es sintetizado en una célula extraña, aunque se presume que son los mismos que en el resto de los seres vivos.

El punto crucial, sin embargo, no está relacionado con las técnicas y consideraciones de orden práctico, descriptas en los párrafos precedentes y necesarios para encarar experiencias de muta génesis sitio-dirigida, sino con las modificaciones a introducir en una proteína para obtener la funcionalidad biológica buscada. En los últimos años se ha acuñado el término ingeniería de proteínas para definir el conjunto de procedimientos moleculares aplicables al diseño y construcción de proteínas con funciones o propiedades predefinidas.

La ingeniería molecular de proteínas se apoya en las leyes por las cuales una secuencia lineal de aminoácidos adquiere su estructura tridimensional, la que, a su turno, determina la función biológica de la proteína. Junto con la cristalografía de rayos X, la muta génesis sitio-dirigida es una de las herramientas más poderosas para diseñar proteínas más estables, más activas, más específicas, etc., y sirve tanto para la investigación básica como para la aplicada.

La muta génesis opera de manera óptima si se trabaja con proteínas cuya estructura tridimensional sea conocida de modo preciso, pues se tendrá información detallada acerca de la posición relativa de un aminoácido con respecto a otro, y podrán hacerse inferencias sobre la fijación de ligados, el plegamiento de la proteína, su actividad biológica, etc. Pero aun sin contar con evidencias mayores sobre esas posiciones relativas de los aminoácidos, es posible substituirlos para:

(i) Confirmar experimentalmente la funcionalidad inferida a partir de los datos estructurales y(ii) mejorar o alterar esa funcionalidad. La mayor parte de los actuales estudios de muta génesis encuadran en el segundo propósito

Sí no se tienen datos estructurales, todavía es posible construir un modelo, basado en conformaciones conocidas de proteínas homólogas; la exactitud del modelo, no obstante, depende de la similitud de las secuencias en cuestión. En los últimos años se ha trabajado exitosamente en la muta génesis de aminoácidos -que no variaron mucho a lo largo de la evolución- relacionados con el sitio activo de diferentes enzimas y con los sitios de fijación de ligando.

Cuando se desconocen tanto la estructura tridimensional de una proteína como la de sus eventuales homólogas, aún se puede obtener cierta información sobre la funcionalidad de determinados aminoácidos mediante experimentos de modificación química. Consisten en alterar las cadenas laterales de los aminoácidos utilizando reactivos específicos, y luego establecer la ubicación del residuo afectado en la secuencia primaria de la proteína. La funcionalidad del aminoácido puede evaluarse estudiando los efectos de la modificación sobre parámetros como la afinidad por sustratos e inhibidores, las velocidades absolutas y mecanismos de reacción (para enzimas), la estabilidad de la proteína, su protección por ligandos, etc. Para que los datos sean de utilidad, es indispensable que la modificación sea específica. Por lo general, los modificadores químicos son moléculas voluminosas que se unen covalentemente a la cadena lateral del aminoácido con el cual reaccionan; alteran la función biológica de la proteína por efectos estéricos, electrostáticos, etc. Así, se han documentado numerosos casos de aminoácidos, supuestamente esenciales según los datos de las modificaciones químicas, cuya muta génesis no tiene efecto alguno sobre la funcionalidad de la proteína. De todos modos, los modificadores químicos constituyen una ayuda inapreciable en aquellas ocasiones en que no es posible contar con información estructural, y seguirán empleándose para estudiar proteínas cuya conformación tridimensional sea desconocida.