Relación entre los niveles de carga viral y los niveles de linfocitos CD4 en el diagnóstico de Cryptosporidium spp. en heces de niños (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Se trata de un estudio observacional en una cohorte dinámica de menores de 16 años, referidos a la Clínica Pediátrica de VIH/SIDA del Hospital Universitario del Valle (HUV) «Evaristo García» de Cali, Colombia, entre julio de 1998 y enero de 2005, con diagnóstico de infección por VIH/SIDA, según la carga viral, sin otra inmunodeficiencia comprobada y sin entidades que pongan en riesgo su vida como sepsis, encefalopatía, estatus epiléptico, falla renal, falla cardíaca, falla hepática o falla orgánica multisistémica.

Se registraron datos como edad en el momento de la toma de la muestra de heces (0 a 2, 2.1 a 5, 5.1 a 10, 10.1 a 15 años cumplidos), género (masculino, femenino), procedencia (rural, urbana), institución de donde provenían («Fundamor»), consanguinidad de los sujetos incluidos en el estudio (hermanos que convivan con el paciente), tratamiento farmacológico para infección VIH/SIDA, estadio de la enfermedad según la clasificación de los CDC (Center for Disease Control) de los Estados Unidos (niños con SIDA leve, moderada o severamente sintomáticos), supervivencia de la madre y peso. Se consideró desnutrición global de acuerdo con las tablas del National Center for Health Statistics (NCHS) de los Estados Unidos, cuando el déficit era superior a 10% según el peso para la edad.

Se tomaron tres muestras de materia fecal, que se analizaron en fresco o para concentrar los ooquistes de Cryptosporidium spp., por medio de la técnica de Ziehl-Neelsen modificada. Si la deposición era líquida, se centrifugaba para analizar el sedimento, que se tomó con un asa, y se extendía sobre una lámina donde se mezcló con una gota de solución salina; cuando esta porción estuvo seca, se cubrió con metanol absoluto durante un minuto; luego el porta-objetos se inundó con carbolfucsina de Kinyoun por cinco minutos, se lavó después con alcohol ácido al 1% y se enjuagó inmediatamente con agua; luego se agregó el colorante de Loeffler con azul de metileno por un minuto para lavar otra vez con agua y una vez seco se llevó al microscopio para estudiar la lámina con objetivo de inmersión. Esta es la técnica modificada de Ziehl-Neelsen, sin calentar la placa que, cuando es positiva permite visualizar los ooquistes teñidos de rojo brillante y el resto del material con azul o rojo opaco. Se midieron los niveles de carga viral en copias/ml, y se tomó para el análisis como punto de corte <400 copias/ml y los niveles de CD4 en células/ml, con punto de corte <15%.

El tamaño de muestra fue de 70 niños de la Clínica Pediátrica de VIH/SIDA del HUV, con un error alfa de 0.05, un error beta de 20% y una razón de riesgos por lo menos de 2.5. Se compararon los promedios de las variables independientes por la presencia o no de los parásitos intestinales medidos en el estudio con la prueba t de Student y cuando las varianzas no eran normales u homogéneas, se aplicaron transformaciones o pruebas no paramétricas. Se realizaron tablas de contingencia de 2 x 2 y de n x n, mediante la prueba de chi2 y por la prueba de probabilidad exacta de Fisher donde tiene significancia una p <0.05. Se efectuó un análisis estratificado para ajustar los cálculos por las variables covariadas, y se construyeron modelos de regresión logística para determinar la independencia de las asociaciones.

Este trabajo lo aprobó el Comité de Ética de la Universidad del Valle y del HUV, y se clasificó como riesgo inferior al mínimo según la Resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud; además, se contó con el consentimiento informado de cada uno de los padres o tutores de los niños incluidos en el estudio.

RESULTADOS

Ingresaron al estudio, 72 niños de la Clínica Pediátrica de VIH/SIDA del HUV de Cali, Colombia, entre 0 y 15 años de edad (edad promedio 5.4 años), con una razón 1.1 hombre–mujer (52.7% masculinos), la mitad de ellos con consanguinidad y con madre viva; la mayoría proveniente del área urbana (54.2%) e institucionalizados («Fundamor») (68.1%), 36.1% de ellos con grado C de severidad de la enfermedad, 73.6% recibían análogo nucleósido con inhibidor de proteasa, algo más de la mitad con carga viral y de CD4 >100.000 copias (Cuadro 1).

La prevalencia de Cryptosporidium spp. en materia fecal fue 51.4% (37/72), para el grupo de edad más afectado entre los 5.1 y los 10 años (48.6%), seguido de los grupos de edad entre los 2.1 y los 5 años (35.2%), entre los 10.1 y los 15 años (10.8%) y entre los 0 y 2 años (5.4%); con una mayor proporción de niños positivos para Cryptosporidium spp. con un grado severo de la infección por VIH/SIDA (p = 0.03) (Cuadro 2) y madre muerta (p>0.05).

No hubo diferencias significativas en cuanto al género, consanguinidad, estar institucionalizado, tratamiento, procedencia, ni estado nutricional, al ser comparados; como tampoco en los niveles de carga viral ni de CD4 (p>0.05) (Cuadro 3).

Al realizar el modelo de regresión logística, y con un intervalo de confianza de 95%, los niños mayores de dos años tuvieron un riesgo 8 veces mayor de ser positivos en materia fecal para Cryptosporidium spp. (1.6-40.1); para las variables edad, género y procedencia rural, el riesgo fue 7.7 (1.5-38.9); para las variables madre viva y estar institucionalizado, el riesgo fue 6.1 (1.1-32.7), y para las variables severidad de la enfermedad y peso, el riesgo disminuyó a 5.7 y no fue significante (1-32.3).

DISCUSIÓN

El Cryptosporidium spp., es uno de los gérmenes oportunistas emergentes que puede afectar a personas con cierto grado de compromiso inmunitario como desnutrición, cáncer y VIH/SIDA (1,10). Se ha visto que los viajes a áreas endémicas son un riesgo para adquirir criptosporidiosis (11). Se sabe de epidemias producidas por Cryptosporidium en diversos centros de atención y cuidados para niños en Estados Unidos (12-19), Australia (20,21), Francia (22), Portugal (23), Chile (24), y África del Sur (25). Casi 32% de los pacientes con SIDA se sobreinfectan con Cryptosporidium (27). En una mayor frecuencia los individuos VIH positivos para Cryptosporidium se asocian con afecciones biliares, vómito y mayor riesgo de mortalidad, luego del primer año de infección (4,26-29).

La prevalencia del Cryptosporidium spp., de 51.4% en la población del presente estudio es elevada si se la compara con lo descrito en el artículo de Milwaukee (2) cuya tasa de infección en pacientes con SIDA para el Cryptosporidium spp., fue 32%; con lo que informan los CDC (30) de los Estados Unidos, 22% en inmunodeficientes; con la comunicación de Pettoello et al. (10) de 6.4% en niños italianos inmunodeficientes y con los datos de Hernández et al. (31) en pacientes VIH positivos, 4.8%; muy similar a lo visto en niños con cáncer del Hospital Universitario «Ramón González Valencia» de Bucaramanga, Colombia (4), 42%; igualmente alta frente a niños sanos: 7% en niños inmunocompetentes según los CDC (30), 4% en menores de 5 años en África (32), hasta 9.8% en niños de India (33), 5.9% en Liberia (34), hasta 11.6% en Guatemala (26,35), 5% en Asia (36) y 32.3% en niños de Piedecuesta, Colombia (3) y 4% en niños del Centro de Salud Lourdes de Cali, Colombia (5); y finalmente, lo mismo que en la población general, según lo descrito en Milwaukee (37), Brasil (38) y Colombia (39). La alta seroprevalencia de anticuerpos anti-Cryptosporidium spp., 83.3% en Colombia, indica que la criptosporidiosis es endémica y constituye un problema de salud pública en el país (39).

La prevalencia del Cryptosporidium spp., en las heces dependerá del método diagnóstico que se siga. En este estudio, al igual que en dos de los tres trabajos previos hechos por el Grupo de Investigación GASTROHNUP en niños sanos de Piedecuesta, Santander (3) y en niños con cáncer del Hospital Universitario «Ramón González Valencia» de Bucaramanga (4), fue la búsqueda de los ooquistes del parásito por visualización al microscopio (31), que es el patrón de oro en individuos VIH positivos.

Los gérmenes oportunistas se multiplican y sobreviven en niños desnutridos y con funciones comprometidas en su inmunidad. Tampoco se encontró asociación entre los niveles de carga viral o de CD4 con la prevalencia de Cryptosporidium spp., en materia fecal. Si bien es cierto, Hernández et al. (31), describen que los pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), causado por los retrovirus de la inmunodeficiencia humana VIH1 y VIH2, agotan de manera selectiva y progresiva los linfocitos T CD4 ayudadores y que incluso cuando su nivel alcanza un punto crítico de 200 células/ml son más susceptibles a todo tipo de infecciones por agentes oportunistas, en los niños de Cali no se pudo demostrar esto estadísticamente, al igual que lo descrito en la epidemia de Milwaukee, donde no hubo correlación entre los niveles de CD4 y la prevalencia de Cryptosporidium spp., aunque sí se prolongó más el episodio diarreico y fue necesario más tiempo de hospitalización y de atención médica (2,26,37).

Aunque la criptosporidiosis no tiene una asociación clara y definida con el VIH, cuando existe, produce un empeoramiento de las condiciones clínica e inmunológica, y, en consecuencia, es posible afirmar que la criptosporidiosis entérica se convierte en un signo de la progresión del VIH (7). En el presente trabajo, la única asociación significativamente estadística que se encontró fue una mayor proporción de niños positivos para Cryptosporidium spp., con un grado severo de la infección por VIH/SIDA.

Aunque en la actualidad no hay tratamiento efectivo contra el Cryptosporidium, para su manejo terapéutico se usan paramomicina y azitromicina con resultados no concluyentes, pues no es posible definir si la infección se ha resuelto por sí sola o por la acción de estos medicamentos (2,6,10,40). El estudio de las rutas de transmisión, a saber, animales, contaminación del agua, alimentos y hasta por la vía sexual, son importantes debido a la poca efectividad en los aspectos preventivos y en el tratamiento de la criptosporidiosis en pacientes con SIDA (1,9,41). En los últimos años con el uso de la terapia antirretroviral. HAART (highly active antirretroviral therapy) se ha visto una restauración de las funciones inmunes y se ha podido reducir la incidencia de los efectos de la criptosporidiosis y otras enfermedades oportunistas.

Como recomendación, y debido a que la búsqueda del parásito por microscopio se ha usado con liberalidad consume mucho tiempo, y requiere de una labor intensa y difícil que depende del entrenamiento del examinador y del conocimiento morfológico de las distintas coccidias y en ocasiones no es concluyente, en enfermos inmunodeprimidos se han propuesto otros métodos diagnósticos menos subjetivos con alta sensibilidad y especificidad que permiten analizar y tamizar un gran número de muestras en un tiempo corto, como ELISA (42-45), reacciones de la polimerasa en cadena (PCR) (46-51) y pruebas serológicas (39).

En conclusión, en este grupo de 72 niños de la Clínica Pediátrica de VIH/SIDA del Hospital Universitario del Valle de Cali, Colombia, la prevalencia para Cryptosporidium spp., en materia fecal por la técnica de Ziehl-Neelsen modificada fue 51.4%, con factores de riesgo la edad mayor a los 2 años y el grado de severidad C según la clasificación de los CDC de los Estados Unidos para la infección por VIH/SIDA, sin diferencias estadísticamente significantes en otros factores descritos en la literatura mundial como peso, niveles de carga viral y niveles de linfocitos ayudadores T CD4.

AGRADECIMIENTOS

A los doctores Oscar Ramírez pediatra oncohematólogo y epidemiólogo de la Fundación Clínica Valle del Lili, Cali, Colombia y Carlos Echandía, pediatra epidemiólogo, profesor de la Universidad del Valle, Cali, Colombia, por su desinteresado apoyo en la orientación metodológica y análisis estadístico del presente trabajo.

REFERENCIAS

1. Schultz MG. Emerging zoonoses (editorial). N Engl J Med 1983; 308: 1285-1286.

2. Cordell RL, Thor PM, Addiss DG, et al. Impact of a massive waterborne cryptosporidiosis outbreak on child care facilities in metropolitan Milwaukee, Wisconsin. Pediatr Infect Dis J 1997; 16: 639-644.

3. Velasco CA, Sarmiento IC, Calderón J, Fonseca RA, Castro P, Carreño M. Prevalence of criptosporidiosis in children younger than 13 years. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2002; 35: 437.

4. Carreño M, Velasco CA, Rueda E. Prevalencia de Cryptosporidium spp. en niños menores de 13 años con afecciones oncológicas. Colomb Med 2005; 36 (Supl 2): 6-9.

5. Velasco CA, Vélez D, Dueñas VH, López P, Caro T, Rojas C, Neuta P. Prevalence of Cryptosporidium spp. by ELISA test in healthy children from Cali, Colombia. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005; 41: 516.

6. Chappell CL, Okhuysen PC. Cryptosporidiosis. Curr Opin Infect Dis 2002; 15: 523-527.

7. Velasco CA, García JR. Cryptosporidiosis en pediatría: etiología, epidemiología, cinética de la infección y clínica. Rev Med UIS 2002; 16: 20-29.

8. Saavedra CH. Epidemiología de la infección por el VIH. In: Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (VIH/SIDA). Solus Holos (edición especial). Bogotá; 2001. p. 8-58.

9. Glaser CA, Safrin S, Reingold A, Newman TB. Association between Cryptosporidium infection and animal exposure in HIV-infected individuals (Epidemiology). J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 1998; 17: 79-82.

10. Pettoello M, Di Martino L, Dettori G, et al. Asymptomatic carriage of intestinal Cryptosporidium in immunocompetent and immunodeficient children: a prospective study. Pediatr Infect Dis J 1995; 14: 1042-1047.

11. Ungar BLP, Mulligan M, Nutran TB. Serologic evidence of Cryptosporidium infection in US volunteers before and during Peace Corps service in Africa. Arch Intern Med 1989; 149: 894-897.

12. Diers J, McCallister GL. Occurrence of Cryptosporidium in home day care centers in West Central Colorado. J Parasitol 1989; 75: 637-638.

13. Combee CL, Collinge ML, Britt EM. Cryptosporidiosis in a hospital-associated day care center. Pediatr Infect Dis 1986; 5: 528-532.

14. MMWR. Cryptosporidiosis among children attending day-care centers in Georgia, Pennsylvania, Michigan, California, New Mexico. Morb Mortal Wkly Rep 1984; 33: 599-601.

15. Nwanyanwu OC, Baird JN, Reeve GR. Cryptosporidiosis in a day care center. Tex Med 1989; 85: 40-43.

16. Skeel MR, Sokolow R, Hubbard CV, et al. Cryptosporidium infection in Oregon public health clinic patients 1985-1988. The value of a State-wide laboratory surveillance. Am J Public Health 1990; 80: 305-308.

17. Stehr-Green JK, McCraig L, Ramsen HM. Shedding of oocysts in immunocompetent individuals infected with Cryptosporidium. Am J Trop Med Hyg 1987; 36: 338-342.

18. Tangermann RH, Gordon S, Wiesner P, et al. An outbreak of cryptosporidiosis in a day-care center in Georgia. Am J Epidemiol 1991; 133: 471-476.

19. Taylor JP, Perdue JN, Dingley D, et al. Cryptosporidiosis outbreak in a day care center. Am J Dis Child 1986; 139: 1023-1025.

20. Cruickshank R, Ashdown L, Croese J. Human cryptosporidiosis in North Queensland. Aust NZ J Med 1988; 18: 582-586.

21. Ferson MJ, Young LC. Cryptosporidium and Coxsackie virus B5 causing endemic diarrhoea in a child care center. Med J Aust 1992; 156: 813.

22. Bretagne S, Jacovella J, Breuil J, et al. Cryptosporidiosis in children: outbreaks and sporadic cases. Ann Pediatr 1990 37: 381-386.

23. Mello Cristino JAG, Carvalho MIP, Salgado MJ. An outbreak of cryptosporidiosis in a hospital day-care center. Epidemiol Infect 1988; 101: 355-359.

24. Neira P, Tardio MT, Carabelli M, et al. Cryptosporidiosis in the V region of Chile. III. Study of malnourished patients. 1985-1987. Bol Chil Parasitol 1989; 44: 34-36.

25. Walters IN, Miller NM, van den Ende J, et al. Outbreak of cryptosporidiosis among children attending a day-care center in Durban. S Afr Med J 1988; 74: 496-499.

26. Cruz JR, Cano F, Cáceres P, et al. Infection and diarrhoea caused by Cryptosporidium spp. among Guatemalan infants. J Clin Microbiol 1988; 26: 88-91.

27. Soave R, Amstrong D. Cryptosporidium and cryptosporidiosis. Rev Infect Dis 1986; 8: 1012-1023.

28. Garone MA, Winston BJ, Lewis JH. Cryptosporidiosis of the stomach. Am J Gastroenterol 1986; 81: 465-470.

29. Moon AS. Cryptosporidium-induced gastric obstruction in a child with congenital HIV infection. Case report and review of the literature. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1999; 28: 108-111.

30. Center for Disease Control. Cryptosporidium. Assessment of chemotherapy of males with acquired immunodeficiency syndrome. MMWR 1982; 31: 589.

31. Hernández L, Mora N, Porras A. Hallazgos de protozoarios en pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Acta Med Costarr 1999; 43: 1-8.

32. Cegielski JP, Ortega YR, McKee S, et al. Cryptosporidium, Enterocytozoon, and Cyclospora infections in pediatric and adult patients with diarrhea in Tanzania. Clin Infect Dis 1999; 28: 314-321.

33. Mathan M, Venkatesan S, George R, et al. Cryptosporidium and diarrhoea in southern Indian children. Lancet 1985; 2: 1172-1175.

34. Hojlyng N, Molbak K, Jepsen S. Cryptosporidium spp., a frequent cause of diarrhea in Liberian children. J Clin Microbiol 1986; 23: 1109-1113.

35. Blanco RA, Samayoa JC. Diarrhoea and Cryptosporidium in Guatemala. Bol Med Hosp Infant Mex 1988; 45: 139-143.

36. Current WL, García LS. Cryptosporidiosis. Clin Microbiol Rev 1991; 4: 325-358.

37. Frisby HR, Addiss DG, Reiser WJ, et al. Clinical and epidemiologic features of a massive waterborne outbreak of cryptosporidiosis in persons with HIV infection (epidemiology). J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 1997; 16: 367-373.

38. Agnew DG, Lima AAM, Newman RD, et al. Cryptosporidiosis in Northeastern Brazilian children: association with increased diarrhea morbidity. J Infect Dis 1988; 177: 54-60.

39. Vergara C, Santos S, Freire F, Ares E. La criptosporidiosis en la región andina de Colombia: seroprevalencia y reconocimiento de antígenos. Pan J Public Health 2000; 8: 373-379.

40. Blackman E, Binder S. Cryptosporidiosis in HIV-infected patients: diagnostic sensitivity of stool examination based on number of specimens submitted. J Gastroenterology 1997; 92: 451-453.

41. Nime FA, Burek JD, Page DL, Holscher MA, Yardley JH. Acute enterocolitis in a human being infected with the protozoan Cryptosporidium. Gastroenterology 1976; 70: 592-598.

42. Newman RD, Jaeger KL, Wunib T, et al. Evaluation of an antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Cryptosporidium oocytes. J Clin Microbiol 1993; 31: 2080-2084.

43. Koontz F, Weinstock JV. The approach to stool examination for parasites. Gastroenterol Clin North Am 1996; 25: 435-449.

44. Michell MY, Khalifa AM, Ibrahim IR. Detection of Cryptosporidium parvum antigen by co-agglutination test and ELISA. East Mediterr Jealth J 2000; 6: 898-907.

45. Siddons CA, Chapman PA, Rush BA. Evaluation of an enzyme immunoassay kit for detecting Cryptosporidium in feces and environmental samples. J Clin Pathol 1992; 45: 479-482.

46. Keegan AR, Fanok, S, Monis PT, Saint CP. Cell culture-TaqMan PCR assay for evaluation of Cryptosporidium parvum disinfection. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 2505-2511.

47. Rochelle PA, Ferguson DM, Handojo TJ, De León R, Stewart MH, Wolfe RL. An assay combining cell culture with reverse transcriptase PCR to detect and determine the infectivity of waterborne Cryptosporidium parvum. Appl Environ Microbiol 1997; 63: 2029-2037.

48. Aboytes R, DiGiovanni GD, Abrams FA, et al. Detection of infectious Cryptosporidium in filtered drinking water. J Am Water Works Assoc 2004; 96: 88-98.

49. Deng MQ, Cliver DO, Mariam TW. Immunomagnetic capture PCR to detect viable Cryptosporidium parvum oocysts from environmental samples. Appl Environ Microbiol 1997; 63: 3134-3138.

50. Abu Al-Soud W, Radstrom P. Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. Appl Environ Microbiol 1998; 64: 3748-3753.

51. Braid MD, Daniels LM, Kitts CL. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. J Microbiol Methods 2003; 52: 389-393.

Mirey Siuffi, M.D.1, Mario Angulo, M.D.1, Carlos Alberto Velasco, M.D.2,5, Pío López, M.D.2, Víctor Hugo Dueñas, Bacteriol.3,5, Consuelo Rojas, Bacteriol.4,5

* Trabajo de Tesis de grado para optar al título de Especialista en Pediatría de los doctores Mirey Siuffi y Mario Angulo. 1. Residente, Departamento de Pediatría, Escuela de Medicina, Facultad de Salud,. Universidad del Valle, Cali, Colombia. 2. Profesor Titular, Departamento de Pediatría, Escuela de Medicina, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 3. Profesor Asociado, Escuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 4.Profesora Auxiliar, Escuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 5. Grupo de Investigación en Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica GASTROHNUP. Cali, Colombia.