Materiales e instrumentos de laboratorio

Materiales de laboratorio

Equipos y/o aparatos de laboratorio

El espectrofotómetro

Uno de los instrumentos principales del laboratorio de biología celular es el espectrofotómetro. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda particular)  a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al fisiólogo realizar dos funciones:

1.      Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga características únicas. Al ser expuestos a la luz del especrofotómetro, algunos electrones de los átomos que forman las moléculas absorben energía entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energía absorbida es emitida en forma de fotones. Esa emisión de fotones es distinta para cada sustancia, generando un patron particular, que varía con el largo de onda usado. Dependiendo del largo de onda, será la cantidad de energía absorbida por una sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs l

2.      Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert: a mayor cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones. 

Abs = K C L

Abs: absorbancia

K: coeficiente de extinción molar

C: concentración

L: distancia que viaja la luz a traves de la muestra. (normalmente es de 1 cm)

La cuveta promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centímetro (L).  La ecuación describe una línea recta, donde el origen es cero. Si L es constante (1.0 cm) y se conoce el valor de K,  podemos calcular C en base a Abs:

Abs / K L = C

El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de tramitancia. Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la siguiente ecuación.

%T = - Log Abs.

El espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la misma vez, ahorrando la necesidad de hacer los cálculos. (Tramitancia= cantidad de luz que atravieza la mezcla).

Una característica del instrumento es la necesidad de "blanquear" el aparato antes de cada lectura. Esto se hace colocando una cuveta con una solución control que tenga todos los componentes de la reacción menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia. El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que puedan presentar los demás componentes de la reacción a ese largo de onda particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a un largo de onda de luz específico para cada tipo de sustancia.

Cubetas

Las cuvetas son unos viales de plástico transparente o cuarzo que dejan pasar la luz. Los mejores para trabajos de investigación son las de cuarzo porque su interferencia al paso de la luz es mínimo. Son más costosas inicialmente pero bien tratadas pueden ser reusables. Las de plástico vienen con distintas características. Por lo general son desechables, aunque pueden reusarse. El tipo de cuveta plástica a usar depende del rango de luz en el que se van a analizar las muestras. Vienen unas para luz visible, que son las más económicas,  y otras para el rango de visible a ultravioleta. Estas son más versátiles.

Ambos tipos de cuvetas deben manejarse con cuidado para evitar rallazos sobre la superficie por donde pasa la luz. Si la cuveta está rallada, los rayos de luz que incidan en la zona se difractan y no pasan por la muestra, por lo que  puede dar lecturas de absorbancia erróneas. Esto es especialmente crítico cuando queremos determinar concentración en una muestra. Antes de tomar una lectura, debemos observar que la cuveta no tenga rallazos ni esté sucia. Si se ven marcas de polvo u otro tipo de sucio la cuveta debe limpiarse con papel tisú (Kimwipes). Si la cuveta se manipula mucho, debemos sostenerla usando papel tisú para evitar pegarle los aceites que normalmente tenemos en las manos. No debemos usar ningún otro tipo de papel para limpiar las cuvetas, puesto que pueden soltar fibras que pudieran caer en la muestra o rallar la superficie.

Las cuvetas viene en distintos volúmenes, desde 1 ml hasta 4 ml. El volumen a escoger depende de la cantidad de muestra disponible. Si la muestra disponible es poca o difícil de conseguir, lo mejor es usar una cuveta de menor volumen para perder la menor cantidad posible de la muestra. Por lo general, la muestra utilizada para hacer la lectura se pierde, sobre todo si es una sustancia bien sensitiva, como el ADN.

Pipetas y pipeteadores

Usamos las pipetas para medir volúmenes de líquidos de forma más precisa que con una probeta. Y son más versátiles, sobre todo al manejar volúmenes pequeños.

Las pipetas de bulbo son útiles para medir volúmenes que no requieren de mucha presición. Antes se usaban pipetas "Pasteur" de cristal a las que se les aditaba un bulbo de goma que se usaba para succionar el líquido. Ahora vienen en plástico desechable de una sola pieza y se consiguen con o sin calibración.

Las pipetas volumétricas vienen en distintos tamaños, desde 1 ml hasta 200 ml, y con distintas formas, de acuerdo al uso que se les dé. También vienen en distintos materiales como borosilicato y plástico, desechables o reusables, estériles o sin esterilizar. Algunas pueden ser esterilizadas en horno o autoclave. Para llenarlas se pueden usar bulbos de caucho, bombas manuales o eléctricas, o equipos de llenado. Las bombas eléctricas y los equipos de llenado son muy útiles si se está trabajando con múltiples muestras, pues minimizan la fatiga del técnico.

Las micropipetas son extremadamente útiles en los laboratorios de biotecnología. Estas permiten medir con presición volúmenes tan pequeños como 0.1 µl hasta 1 ml. Estas requieren de unos pipeteadores especiales que deben der tratados con mucho cuidado para evitar que se descalibren. Los pipeteadores vienen de distintos tipos. La mayoría pueden servir muestras individuales. Pero vienen los que pueden servir muestras múltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12 muestras a la vez. Estas son muy útiles al hacer pruebas de ELISA, donde se practican diluciones seriadas multiples, o para preparar reacciones de varias muestras distintas a la vez. Se usan en conjunto con platos de fosas múltiples.

 Las puntas de micropipetas vienen con distintas características de acuerdo al uso que se les dé. Vienen con punta ancha, estrecha o aplanada, con o sin filtros contra aerosoles, estériles o sin esterilizar  y pueden ser esterilizadas en autoclave.

Aparatos de electroforesis

Estos son unas cámaras que contienen un circuito eléctrico expuesto a un líquido electrolítico, llamado amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de moléculas grandes de acuerdo a su carga y/o su tamaño. La técnica consiste en inocular la muestra en un medio semisólido, la fase estacionaria, que se somete a un campo eléctrico, en una cámara donde en un extremo se encuentra un filamento que actúa como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro filamento formando el polo negativo. Las moléculas con cargas netas positivas se moverán hacia el polo negativo y las de carga negativa se irán hacia el polo positivo. Luego de la muestra ser tratada apropiadamente dependiendo del tipo de electroforesis, las moléculas que viajen hacia uno de los polos se separarán por tamaño, viajando más en la fase estacionaria las moléculas más pequeñas. El tipo y concentración de la fase estacionaria dependerá del tipo de moléculas que nos interesa correr.

Centrífugas

Son muy útiles para precipitar células y moléculas. Vienen en distintos tamaños y con distintas capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración que obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase utilizado, separándolas del medio en que se encuentran. Incluso, bajo ciertos métodos se puede generar un gradiente de concentraciones dentro del mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o fases dentro del tubo. Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer del mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de interés.

Entre las centrífugas que usaremos durante el semestre están la centrífuga refrigerada, que nos va a permitir separar células de los medios de cultivo. El rotor de esta centrifuga puede sostener tubos de 50 ml, pero puede ser intercambiado por rotores que sostienen botellas de cultivo.

La microcentrífuga es una versión más pequeña de la descrita anteriormente. Es compacta, se coloca sobre la mesa y procesa muestras de hasta 2 ml. Es muy útil para precipitar ADN y otras sustancias que se trabajan en volúmenes pequeños.

Equipo de cromatografía

Haremos varias cromatografias al final del semestre. En una cromatografía buscamos separar uno o varios tipos de moléculas, relativamentre pequeñas, de una mezcla de sustancias o para purificar muestras. Existen varios tipos de cromatografías. La que se utilice dependerá del tipo de moléculas que buscamos aislar.

La cromatografía de capa fina es ideal para separar muestras pequeñas. Presenta dos componentes: una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria consiste de una placa de vidrio o celulosa impregnada con polvo de silicato (vidrio molido extremadamente fino). Las muestras se colocan a un centímetro del borde inferior y se coloca en un tanque de revelado que contiene algun tipo de solvente en el fondo. La placa se coloca de forma que el solvente no toque directamente las muestras. La fase móvil consiste del solvente. El solvente a usarse dependerá de las propiedades químicas de los componentes de la mezcla.

El solvente sube por capilaridad por la superficie impregnada con las muestras. Los componentes de la mezcla comenzarán a migrar, según el grado de afinidad que tengan por el solvente y/o la fase estacionaria. Mientras más afín sea algún componente a la fase móvil, más rápido se moverá y más lejos llegará en su migración sobre la fase estacionaria.

En la cromatografía de columna se pueden separar volúmenes más grandes de muestras. Tambien tiene una fase estacionaria que consiste de un tubo conteniendo un material que separa la mezcla analizada. Los amortiguadores que se usan para lavar la columna constituyen la fase móvil.

El empaque de las columnas puede separar moléculas por su tamaño, por sus interacciones iónicas o por interacciones hidrofóbicas. El tipo de empaque a usar dependerá de las propiedades de la muestra.

Existen otros tipos de cromatografía más sofisticados, que se usan en laboratorios de investigación y en procesos de manufactura en varios tipos de industrias. Nosotros nos limitaremos a los descritos anteriormente.

Microscopio

El microscopio

es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.

Etiquetas para colocar a los reactivos

La pureza de los reactivos es fundamental para la exactitud que se obtiene en cualquier análisis. En el laboratorio se dispone de distintos tipos de reactivos (sólidos, líquidos o disoluciones preparadas) tal y como se comercializan.

En general, las casas comerciales ofrecen un mismo producto con varias calidades. Es importante que cuando seleccionemos un reactivo su calidad esté en concordancia con el uso que se le va a dar.

2.1. Clasificación

En el laboratorio de análisis se utilizan reactivos de calidad analítica que se producen comercialmente con un alto grado de pureza. En las etiquetas de los frascos se relacionan los límites máximos de impurezas permitidas por las especificaciones para la calidad del reactivo o los resultados del análisis para las distintas impurezas. Dentro de los reactivos analíticos pueden distinguirse tres calidades distintas:

• Reactivos para análisis (PA): Son aquellos cuyo contenido en impurezas no rebasa el número mínimo de sustancias determinables por el método que se utilice.

• Reactivos purísimos: Son reactivos con un mayor grado de pureza que los reactivos "para análisis" .

• Reactivos especiales: Son reactivos con calidades específicas para algunas técnicas analíticas, como cromatografía líquida (HPLC), espectrofotometría (UV)…

Hay reactivos que tienen características y usos específicos como los reactivos calidad patrón primario, que se emplean en las técnicas volumétricas, o los patrones de referencia.

2.2. Etiquetado de los reactivos

Todo envase de reactivos debe llevar obligatoriamente, de manera legible e indeleble, una etiqueta bien visible que contenga las distintas indicaciones que se muestran en las siguientes figuras:

Los pictogramas, las frases R de RIESGO y las frases S de SEGURIDAD aparecen en las etiquetas del producto informando sobre la peligrosidad del mismo

PICTOGRAMAS DE PELIGROSIDAD

Reglas y normas de laboratorio

I. PARA INGRESAR AL LABORATORIO.

• Revise los antecedentes conceptuales y el protocolo de trabajo experimental correspondiente a la sesión previa al inicio de la misma.

• Llegue puntualmente a la sesión. Es sumamente importante aprovechar el tiempo disponible para el trabajo en el laboratorio. Si llega tarde, repórtese inmediatamente con el Profesor responsable.

• Use zapatos cerrados, de piso y con suela antiderrapante. Use pantalón largo o falda mediana de fibra natural. Retírese todos los accesorios personales que puedan comprender riesgos de accidentes mecánicos, químicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares y sombreros. Si usa corbata, sujétela con un pisacorbatas o introduciéndola a la camisa. Evite peinados con copetes; si usa copete o cabello largo, recójalo y colóquese el protector facial, gorro o escafandra. Evite usar mangas largas y anchas; en caso de usar manga larga y ancha, cúbrala y sujétela completamente con las mangas de la bata. Evite el uso de lentes de contacto; use anteojos. Mantenga las uñas recortadas y limpias.

• Use la bata cerrada durante toda la sesión y el protector facial, los monogogles, guantes y respirador en su caso. Colóquese la credencial a modo de gafete. Indique en la credencial su tipo sanguíneo e informe de alergias, padecimientos crónicos o uso de prótesis.

• Porte la bitácora de laboratorio. Esta debe contener la información sobre los reactivos y los cálculos para preparar las soluciones que serán empleadas en la sesión. También debe contar con los teléfonos de emergencia y con una tabla de los primeros auxilios, así como de las medidas de contingencia química más comunes. Asimismo, incorpore el protocolo del trabajo experimental y la Lista de Seguridad. Revise las medidas y el equipo de seguridad en el laboratorio.

• Recoja con prontitud el material y los equipos para el trabajo correspondiente. Se debe revisar el estado de la mesa de trabajo, del material y de los equipos recibidos. Reporte cualquier falla o irregularidad al Técnico responsable del laboratorio. El material se debe lavar y secar antes de ser usado. Consulte con el Profesor y con el Técnico responsable y revise la existencia de los reactivos a utilizar.

• Cuente con el material de uso personal que se enlista abajo para cada sesión experimental.

II. PARA PERMANECER EN EL LABORATORIO.

• Siga las medidas de seguridad necesarias con los equipos, materiales y reactivos de la sesión para prevenir accidentes. Esto incluye a los bancos de trabajo; éstos deben permanecer colocados bajo las mesas o junto a éstas o a las paredes.

• Tome sólo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo experimental y colóquelas en material de vidrio limpio y seco. Etiquete y rotule todos los recipientes donde coloque reactivos, productos y residuos. Siga las medidas de contingencia y mitigación en caso de accidente.

• Mantenga sólo el material requerido para la sesión sobre la mesa de trabajo. Los frascos de reactivos deben permanecer en las campanas. Los demás objetos personales o innecesarios deben guardarse o colocarse lejos del área de trabajo.

• No ingiera alimentos ni bebidas en el interior del laboratorio, a menos que lo indique el protocolo.

• No fume en el interior del laboratorio. Todas las fuentes de fuego o calor deben estar controladas.

• No reciba visitas en el interior del laboratorio. Evite las distracciones. Así puede evitar accidentes.

• Informe al Profesor responsable cuando le sea necesario salir del laboratorio durante la sesión. Repórtese al reincorporarse.

III. AL CONCLUIR LA SESION.

• Disponga de los residuos y de los reactivos no utilizados de la manera indicada por las normas. Consulte la Lista de Seguridad del Laboratorio. Los reactivos no usados no se devuelven a los frascos. Los frascos de reactivos puros deben regresarse al almacén.

• Lave el material y devuélvalo limpio y seco. Retire las etiquetas de los materiales que contenían reactivos, productos o residuos. Realice la entrega en orden y esperando su turno.

• Deje limpio y seco el lugar de trabajo. Coloque los bancos junto a las mesas o invertidos sobre éstas.

• Antes de salir del laboratorio retírese la bata y demás equipo de seguridad y guárdelo en una bolsa de plástico exclusiva para este uso. Los filtros del respirador se guardan en un recipiente hermético. La bata y los guantes deberá lavarse al final de cada sesión.

MATERIAL PERSONAL COTIDIANO OBLIGATORIO.

• Bata larga (a la rodilla o pantorrilla) de algodón 100% y manga larga, con botones. Se recomienda que sea blanca.

• Monogogles incoloros sin ventilación o con trampas.

• Anteojos neutros de seguridad de policarbonato o vidrio endurecido con protección lateral.

• Protector facial transparente de 20 cm de largo.

• Guantes de látex para manejar ácidos débiles y cetonas.

• Guantes de PVC para manejar ácidos y bases débiles.

• Guantes de neopreno para manejar ácidos y solventes alifáticos.

• Guantes de nitrilo para manejar solventes y derivados orgánicos.

• Guantes térmicos de algodón o asbesto (para materiales calientes y fríos).

• Respirador con filtros para: a) Vapores orgánicos y gases ácidos (código amarillo). b) Vapores orgánicos (código negro). c) Amoniaco y alcalinos (código verde obscuro). d) Humos (código violeta).

• Escobillones de varios tamaños.

• Fibra verde.

• Detergente bajo en fosfatos.

• Encendedor para mechero y/o cerillos.

• Franela de algodón limpia.

• Cinta para encubrir (masking tape) de 1.27 cm de ancho.

• Toallas absorbentes de papel.

• Rollo de papel higiénico blanco o caja de pañuelos desechables blancos.

• Rollo de papel aluminio.

• Marcador indeleble, preferentemente negro.

• Tijeras rectas.

• Percolador de 8 cm de diámetro.

• Embudo de plástico de 8 cm de diámetro.

Importancia del laboratorio

La importancia de los laboratorios tanto en la enseñanza de las ciencias como en la investigación y en la industria es, sin duda alguna, indiscutible. No se puede negar que el trabajo práctico en laboratorio proporciona la experimentación y el descubrimiento y evita el concepto de "resultado correcto" que se tiene cuando se aprenden de manera teórica, es decir, sólo con los datos procedentes de los libros. Sin embargo, el uso de laboratorios requiere de tiempo adicional al de una clase convencional, por ejemplo, para descubrir y aprender de los propios errores. En términos generales, un laboratorio es un lugar equipado con diversos instrumentos de medición, entre otros, donde se realizan experimentos o investigaciones diversas, según la rama de la ciencia a la que se enfoque. Dichos espacios se utilizan tanto en el ámbito académico como en la industria y responden a múltiples propósitos, de acuerdo con su uso y resultados finales, sea para la enseñanza, para la investigación o para la certificación de la industria.

Prácticamente todas las ramas de las ciencias naturales se desarrollan y progresan gracias a los resultados que se obtienen en sus laboratorios. Por su parte, en el mundo de la industria, estos, entre otras cosas, permiten asegurar la calidad de productos. Así, en la academia los ejercicios del laboratorio se utilizan como herramientas de enseñanza para afirmar los conocimientos adquiridos en el proceso enseñanza-aprendizaje; en tanto que en la industria se emplean para probar, verificar y certificar productos. Cabe destacar que, en especial, permiten mostrar el fenómeno y comportamiento de ciertos procesos, así como complementar las clases impartidas en las universidades; mientras que, en el terreno de la investigación, permiten avanzar el estado del conocimiento y realizar investigación de punta. Por lo general este tipo de laboratorios se encuentran en instituciones de educación superior que proporcionan grados de maestría y doctorado. Por otra parte, los laboratorios del sector industrial son más especializados y cubren un amplio abanico de aplicaciones con el propósito de asegurar un control y aseguramiento de calidad, aunque están más orientados hacia la industria. En los laboratorios de ambos sectores, las prácticas aportan parte del método científico, validan la teoría y calibran las simulaciones por computadora. Varias universidades y escuelas de graduados en todo el mundo están equipadas con diversos aparatos de investigación —desde los más moderados o tradicionales hasta los más avanzados— para servir a las necesidades de cada nación en términos de investigación y futuros investigadores y profesores universitarios. En el sector educativo, la experiencia en laboratorio también brinda la valiosa oportunidad para que los estudiantes desarrollen, además, habilidades de comunicación —tanto oral como escrita—, liderazgo y cooperación. Las tareas rutinarias y las pruebas que sólo se limitan a resolver problemas aportan pocas posibilidades para desarrollar las habilidades de escritura. Por otra parte, los experimentos y la divulgación de esta información a los otros profesionales con habilidades similares a aquellas que necesitan los ingenieros en sus prácticas.

En experimentos donde el propósito principal consiste en demostrar mediciones físicas fundamentales y comprensión básica, no es necesario un equipo sofisticado, de hecho éste puede suponer trabas en el aprendizaje de los estudiantes si los experimentos son para demostrar el proceso de pruebas y evaluación con ayuda de la computadora, tal como se utiliza en las grandes industrias. Con frecuencia se requiere de equipo moderno que, por lo general, es costoso. En este sentido, cabe señalar que a lo largo de los años se han hecho recomendaciones, tanto de empresarios como de varias organizaciones técnicas y profesionales, para revisar exhaustivamente los planes de estudio de la ingeniería con el fin de asegurar que los estudiantes estén preparados para la práctica profesional.

Autor:

Gustavo Condezo