Manual de control microbiológico del agua y del líquido de diálisis (página 2)

Las Unidades de Hemodiálisis están sujetas a unas normas de funcionamiento en cuanto la calidad del agua y del líquido de diálisis (LD). Estas normas varían de unos países a otros y están evolucionando en el sentido de exigir más calidad. Las mejoras técnicas del tratamiento del agua y LD han logrado que su calidad en cuanto a contaminación por partículas y solutos sea buena. Sin embargo, no ha sucedido así con la contaminación bacteriana y las endotoxinas, que han persistido como un problema importante.

El líquido de diálisis constituye una parte fundamental de la biocompatibilidad y de ahí, la necesidad e importancia de tratar adecuadamente el agua utilizada en su fabricación y de alcanzar un adecuado nivel de calidad. Por otro lado, no debemos olvidar que el personal de las salas de diálisis es responsable de la calidad del líquido de diálisis, a diferencia de los dializadores y monitores que están garantizados por casas comerciales que se responsabilizan de su calidad y de cumplir las normas vigentes al respecto. El líquido de diálisis, por el contrario, se fabrica en el momento y en la propia unidad de diálisis, sin posibilidad de controles de calidad previos a su utilización e indudablemente, bajo la responsabilidad del personal técnico y sanitario tratante.

El agua suministrada a las ciudades debe cumplir una serie de requisitos imprescindibles que la hacen apta para el consumo humano, pero aún así, no sirve para la fabricación del líquido de diálisis, es necesario purificarla y mantener unos grados de pureza muy superiores a los del agua potable. Esto es así porque, cada semana, la sangre del paciente sometido a hemodiálisis se pone en contacto con 270-600 litros de agua y lo hace a través de una membrana nada selectiva y por otro lado, la insuficiencia renal le impide eliminar los contaminantes acumulados, pudiéndole ocasionar una verdadera intoxicación.

Recogida de la muestra del líquido de Diálisis

La siguiente metodología corresponde a las recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Nefrológicas. (Ref. Rev Soc Esp Enferm Nefrol 2004; 7 (1): 6/8)

Los controles microbiológicos del agua purificada o altamente purificada se realizaran al menos una vez al mes.

Las muestras se deberán recoger aproximadamente en la mitad del lapso de tiempo que media entre dos desinfecciones programadas con el fin de adelantar la desinfección en el caso de que los resultados estén por encima de un nivel tolerable. En todo caso, se deberán realizar después de 4 días de la última desinfección.

Puntos de toma de muestras: En el periodo de validación se tomarán muestras del agua de aporte; del agua descalcificada; del agua tratada a la salida de la osmosis y al menos en el 20 % de los monitores de la toma de agua; también del LD a la entrada al dializador y del drenaje. En el periodo de mantenimiento no es necesario tomar muestras en el pretratamiento, a menos que se detecte contaminación significativa del agua tratada. Las tomas de los puertos de toma de agua de los monitores se deberán realizar al comienzo de la sesión de diálisis. Si se emplean fiadores para abrir la válvula de seguridad y permitir la salida de agua por los puertos de conexión de las máquinas de diálisis, estos elementos deberán haber sido esterilizados previamente (autoclave o gas).

La carga bacteriana de cada punto de muestreo de agua de diálisis debe recogerse después de dejar correr el chorro durante un periodo de tiempo estrictamente controlado, 1 minuto o, preferiblemente, hasta que drene una cantidad fija de agua de un litro, ya que los primeros decilitros de agua suelen tener una carga bacteriana sensiblemente superior.

El líquido de diálisis deberá recogerse de la salida correspondiente del monitor empleando una jeringuilla o un contenedor estéril.

Las muestras se pueden recoger en cualquier recipiente de vidrio o plástico estéril. Un envase estéril de urocultivo de 50 ml de capacidad es adecuado para el agua purificada o el líquido de diálisis estándar, si se va a evaluar carga microbiana. En caso de determinación de endotoxinas, se recomienda una jeringuilla estéril o un frasco de vidrio previamente despirogenizado. Es aconsejable etiquetar los recipientes previamente, indicando el lugar de recogida. Para determinar la carga bacteriana del agua o líquido de diálisis ultra pura, es necesario que se recoja un volumen de agua superior a un litro.

Los frascos conteniendo la muestra deben conservarse en hielo o refrigerarse a 4º C, entre 3 y 6 º C, hasta el momento de su procesamiento para cultivo. Dicho cultivo deberá realizarse en el menor tiempo posible, máximo 24 horas.

Dada la pureza del agua recibida habitualmente, se recomienda sembrar un volumen de 5 ml de muestra con 10 ml de medio de cultivo líquido, monitoreando los cultivos a diario. Si eventualmente hubiera una contaminación considerable, usualmente las colonias aparecen al segundo día, por lo que se recomienda sembrar nuevamente 1 ml de muestra que se ha guardado convenientemente refrigerada, con el fin de obtener un contaje apropiado e informar al centro de tratamiento.

El volumen inoculado deberá ajustarse a los límites y a la cantidad de gérmenes que se presume encontrar. Por lo general se utilizan 1 a 5 ml. En el caso que el agua estuviera contaminada, se deberá diluir la muestra con agua estéril para lograr un recuento válido.

3.1 Material necesario:

• Recipientes estériles de 100 ml. con tapa.

• Parafilm.

• Cubeta con hipoclorito sódico al 2%.

• Cubeta con agua tratada.

• Cubeta vacía para drenaje del dializado.

• Guantes de látex.

• Condiciones para la recogida del agua :

• 1. Recogida escrupulosa de la muestra: escoger un punto de acceso directo al circuito; desinfectar el punto en donde se tomará la muestra y dejar correr el líquido, desechando los primeros mililitros. El volumen de al menos 1 ml se recogerá en un recipiente estéril y libre de endotoxinas.

• 2. La muestra debe obtenerse mientras el aparato está todavía enjuagado en agua, inmediatamente después de enjuagar todo el desinfectante residual.

• 3. Sin tocar la abertura del conector del dializador o la zona circundante, sujetar el conector sobre una cubeta vacía de modo que el líquido fluya directamente de la parte inferior del conector. Deje drenar por 2 minutos.

• 4. Colocar el recipiente de recogida de muestra estéril bajo el chorro y recoger asépticamente una muestra de 100 ml del líquido. Cerrar el recipiente con parafilm y rotular.

• 5. La muestra se mantendrá a 4 º C y transportadas en frío al laboratorio, el cual la deberá sembrar antes de las 24 h.

El punto de muestreo no debe limpiarse con desinfectantes del tipo hipoclorito o ácido acético etc. Es admisible el empleo de alcohol al 70 % permitiendo después su completa evaporación. Es recomendable el uso de guantes estériles y que la recogida se realice entre dos personas, tratando de minimizar la contaminación cruzada.

Observaciones:

• a) El monitor no debe estar conectado al paciente.

• b) El personal que vaya a recoger las muestras utilizará guantes de látex.

• c) Desconectar del monitor la línea de dializado (tapón azul) y sumergirla en la

cubeta con Hipoclorito sódico al 2% durante 30 minutos.

• d) Enjuagar la línea 3 veces sucesivas en la cubeta con agua tratada cambiando el agua cada vez.

• e) Volver a conectar la línea al monitor.

Control microbiológico del agua

Se deben realizar controles bacteriológicos del agua al menos una vez al mes. Un tema fundamental es cómo y cuándo tomar las muestras bacteriológicas y como procesarlas, y la realización de la prueba de endotoxinas. Se debe buscar la máxima sensibilidad y para ello, es preciso utilizar volúmenes grandes, con una recogida escrupulosa y un buen transporte, sembrándolos precozmente, en medios de cultivo pobres, a temperatura ambiente y por periodos largos.

Los controles bacteriológicos del agua se realizarán fundamentalmente en las tomas de agua de algunos de los monitores, escogidas de forma rotatoria. En caso de contaminación, se deberán tomar en distintos puntos del sistema de tratamiento: en primer lugar del agua de la red, una vez pasado el descalcificador, el filtro de carbón activado y la ósmosis inversa.

Los puntos en los que es más frecuente encontrar contaminación son en el filtro de carbón activado y después del filtro, y en el sistema de distribución, si existen puntos de estancamiento. También se deberán tomar muestras del LD, predializador, en cada una de las máquinas de hemodiálisis.

Un problema de gran importancia es la formación de biofilm bacteriano en los circuitos. Estos se relacionan generalmente con contajes de más de 1000 UFC/ml en el líquido de diálisis. En su destrucción es fundamental usar tanto desincrustantes (ácido cítrico, ácido peracético), como detergentes (hipoclorito (lejía) y desinfectantes con capacidad oxidante (lejia y peróxido de hidrógeno), en concentración y tiempo suficientes.

• Medios de cultivo recomendados :

La Farmacopea Europea aconseja el medio de cultivo a base de hidrolizado de caseina de soja. La AAMI consigna el medio de cultivo "TSA" (Tripticasa de Soya y Agar). Pueden utilizarse también otros medios conocidos por su capacidad de permitir el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos. Debido a que los Microorganismos que habitan en el circuito de agua no poseen nutrientes, el medio empleado para el crecimiento debe ser similar, bajo en nutrientes. Otro medio de cultivo pobre en nutrientes recomendado es el Reasoner´s 2-agar (R2A) y el Tryptone glucose extract agar (TGE-agar)

Luego de haber comparado la sensibilidad de diversos medios y la temperatura de incubación a 37 ó a 20 °C, Ledebo y Nystrand ( Defining the microbiological quality of diálisis fluid. Artif Organs 1999; 23: 37-43 ) han recomendado el medio "TGE-Agar" (Tryptone Glucose Extract Agar) el que se incuba por 2 días a 20 °C. Al respecto, en otra publicación los autores expresan lo más significativo de la presente recopilación: "Este estudio demuestra un incremento de 10 a 100 veces en el recuento bacteriano del fluido de diálisis incubado en Tryptone Glucose Extract Agar (TGEA) a 20 °C durante 5 días comparados con la incubación en Agar de Trypticasa y Soya a 37 °C durante 2 días.-"

4.2 Procedimiento:

• a) 1.0 ml de la muestra debe sembrarse en un medio líquido de enriquecimiento como el Tioglicolato con indicador, e igual cantidad en platos Petri conteniendo un medio pobre en nutrientes, como el Reasoner´s 2-agar ( R2A) o el Tryptone glucosa extract agar ( TGE-agar ) o también puede usarse el Tripticase Soy Agar ( TSA ).

• b) Incubar a temperatura ambiente entre 21 – 24 °C.

• c) Leer a las 48 horas y una última lectura tardía a los 5 – 7 días.

• d) Cuantificar el número de colonias por mililitro de muestra y determinar el germen.

Nota: La AAMI ( American Association for Medical Instrumentation ) recomienda el medio de TSA a 37°C y lectura a las 48 horas.

Interpretación: Máximo número de colonias admitido por la AAMI: 200 UFC/ml para el agua y 2.000 UFC/ml para la solución de diálisis.

4.3 Método del Hospital Mount Sinaí:

Para el cultivo del agua (Líquido Pre-Diálisis):

a) Cultivo:

•   b) Interpretación del Cultivo :

Examine el agar sangre, el McConkey y el caldo anaeróbico diariamente durante 4 días de incubación. Si no hay crecimiento en los platos, pero evidencia de crecimiento en el Tioglicolato, realice tinción de Gram y subcultivo en medios para crecimiento de aerobios, anaeróbicos y con requerimiento de CO2. Todos los aislamientos deben ser identificados.

c) Reporte:

a) Tinción de Gram: Reporte la presencia o ausencia de organismos.

b) Cultivo:

Reporte negativo: "No hubo crecimiento"

Reporte Positivo: Reporte todos los aislamientos con su correspondiente sensibilidad. No cuantifique. Adicione el siguiente comentario si el aislamiento es solo del medio de Tioglicolato: "Crecimiento del caldo de cultivo solamente, indicativo de pequeño número de microorganismos y/o contaminación."

Es importante señalar otras dos metodologías reconocidas y aprobadas para el cultivo del agua y del dializado. Estas son las recomendaciones del CDC y las del AAMI (American Association for Medical Instrumentation).

4.4 Método del CDC:

a) Cultivar 0,5 ml de muestra en Tripticase Soya agar (TSA) BBL.

b) Incubado a 37ºC durante 48 horas.

4.5 Método del AAMI (American Association for Medical Instrumentation ) :

a) Cultivar de 1.0 ml de la muestra en Low Nutrient Agar R2A (Difco).

b) Incubar durante 1 semana a temperatura ambiente.

Formulario de solicitud de examen

CAJA DE SEGURO SOCIAL

LABORATORIO CLÍNICO CHMDrAAM

FORMULARIO DE SOLICITUD DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

EN MUESTRAS DE AGUA DE DIÁLISIS

Fecha de recolección: .……………………Hora de Recolección….…………

Cantidad de Cantidad de Muestra: ………………

Nombre de quién entrega la muestra…………………………………………………

Lugar donde se obtuvo el Lugar donde se obtuvo la muestra: ……………………………………………………..……………………………………

Tipo de muestra:

Agua potable (Red): Agua tratada:

Fuente de obtención de la muestra: Agua Red

Agua Post-Tratamiento:

Post-Filtro Arena Post-Ablandadores Post- Osmosis Reversa

Post-Desionización Agua diálisis Pre-Filtro

Agua diálisis Post-Filtro

Temperatura de transporte de la muestra: ……?C.

ANÁLISIS SOLICITADOS:

Enumeración de bacterias totales (Heterótrofas)

Recuento de coliformes

Recuento de Mohos y levaduras

Detección de un microorganismo específico. Indique: ……………………………

Determinación de Endotoxinas

Especificar razones para qué se requiere este análisis:

Vigilancia: Investigación: Otro:

Nombre de la persona que recibe la Muestra : ………………………………….…..

Fecha de recepción:……………….. Hora: ……………..

Nº interno de la muestra: ………………………………..

Firma responsable: ___________________________

Determinación de niveles de endotoxinas

6.1 Principio:

Las endotoxinas, lipopolisacaridos de la pared celular de bacterias gram- negativas, desencadenan una reacción de coagulación sobre el LAL.

Este test de coagulación, basado en la incubación, a 37º C por 1 hora, de series de dilución de muestras y del estándar, en presencia del reactivo LAL, permite, mediante la determinación del punto final de coagulación (gel firme al giro de 180 º) la obtención de resultados reproducibles. Es importante anotar que no existe una relación de equivalencia entre la presencia de colonias de Gramnegativos y los niveles de endotoxinas. Es posible que se detecten niveles de endotoxinas elevados, sin la presencia de las colonias de microorganismos.

Fuente: Limulus Amebocyte Lysate (Pyrotell), Método para la Detección y Cuantificación de Endotoxinas. Associates of Cape Cod, Inc.

6.2 Empresas productoras del reactivo :

a) Associates of Cape Cod, Inc Falmouth Technology Park 124 Bernard E. Saint Jean Drive East Falmouth, MA 02536-4445

Tel. 508-540-3444

Fax. 508-540-8680

www.acciusa.com/

b) Bio-Whittaker Bioproducts, Inc

8830 Biggs Ford Rd. Walkersville, MD 21793 Tel: 800/638-8174 Fax: 301/845-8338

www.biowhittaker.com

c) Cambrex Corporation

1205 11th Street Charles City, Iowa50616 (641) 257-1000

www.cambrex.com

6.3 Método rápido de detección:

Recomendaría la utilización de un test rápido de screening, conocido como Single Test Kit, como el nuevo test de Associates of Cape Cod, especialmente para agua y líquido de dializado llamado Pyrosate® ( Código PSD25, kit de 25 pruebas ) que ya viene con sensibilidad de 0.25 EU/ml , tubos despirogenizados y resultados en 30 minutos.

Hemos recomendado una sensibilidad del Pyrosate®, de 0.25 EU/ml , ya que es el punto de corte aceptable para el líquido de diálisis en base a la Farmacopea Europea.

Otro kit equivalente es el de Cambrex Co ( Código N189-25, Kit de 25 test ), el cual es un tubo libre de pirógenos que trae incluido el reactivo LAL liofilizado ( Pyrogen® ) con una sensibilidad de 0.25 EU/ml.

En ambos casos la metodología incluye:

• a) Adicionar el volumen de muestra indicado en el inserto

• b) Incubar por el tiempo señalado en el inserto

• c) Observar por formación de coágulo firme en el tubo

Una prueba negativa (No coágulo) indica que los niveles de endotoxinas de la muestra están por debajo de la sensibilidad del reactivo (0.25 EU/ml), por lo que la muestra es de buena calidad.

Una prueba positiva (Presencia de coágulo firme con el tubo invertido) indica que la muestra contiene niveles de endotoxinas superiores a 0.25 EU/ml, lo cual indica contaminación del agua, en base a los niveles máximos aceptados por la farmacopeia internacional.

Kit de Test Rápido para Endotoxinas

Pyrosate ®

En caso de requerirse la detección de otros puntos de corte en el reporte de la prueba, a continuación se describe el método completo que habría que realizar.

6.4 Test completo de Endotoxinas:

NOTA: TODOS LOS MATERIALES Y REACTIVOS USADOS EN ESTE ANALISIS DEBERAN ESTAR LIBRES DE PIROGENOS.

Los materiales de vidrio y metálicos deben ser despirogenizados mediante tratamiento térmico en horno a 220º C por 2-3 horas.

6.4.1 Procedimiento:

6.4.1.1 Reactivos, Materiales y Equipos:

a) LAL Pyrotell® ( Associates of Cape Cod Inc) (Limulus Amebocyte

Lysate (Pyrotell), Método para la Detección y Cuantificación de

Endotoxinas. Associates of Cape Cod, Inc.), viales de 1, 10 y 50 tests.

También se puede usar viales de 5 ml para múltiples pruebas.

Sensibilidad de 0.125 EU/Ml.

b) Control Estándar de Endotoxina (0.5 &µg/vial)

c) Agua Destilada, libre de pirógenos.

d) Tubos de ensayo de vidrio de 20×150 mm.

e) Tubos de ensayo de vidrio de 10×75 mm (Fisher Cat# 14-958B)

f) Gradillas para tubos

g) Pipetas serologicas de 0.5, 1, 2, 5 y 10 ml.

h) Micropipetas Eppendorf de 10 – 100 ul.

i) Micropipetas Eppendorf de 100 – 1000 ul.

j) Puntas (tips) Eppendorf, libres de pirógenos 10-100 ul y 100-1000 ul

k) Parafilm

l) Bloque congelado (Ice pack/ gel pack)

m) Eppendorf repeater, 10 ul – 5 ml, Fisher Cat. #21-380-8.

n) Combitips de 5 ml, libre de pirógenos, Fisher Cat. # 21-381-107.

o) Fuente de calor

p) Olla ( vidrio o metálica)

q) Mezclador Vórtex

r) Horno 180-250º C.

s) Baño de María 37 +1º C.

t) Cabina de flujo laminar

6.4.1.2 Metodología:

a) Preparación de la Solución Estándar de Endotoxinas (100 ng/ml)

1.- Dentro de la cabina de flujo laminar, levantar y remover la parte central del sello de aluminio que recubre la tapa del vial que contiene el estándar de endotoxinas. Efectuar la misma operación con el vial de agua libre de pirógenos. No eliminar el resto del sello de aluminio, para evitar que el tapón de goma sea accidentalmente abierto

2.- Usando una jeringa de 5 ml, libre de pirógenos, retirar, a través del tapón del vial sellado, 5 ml de agua libre de pirógenos; insertar la aguja a través del tapón de goma y dispensar el agua dentro del vial cerrado. para garantizar que el estándar ha conservado el vacío original, la entrada de agua debe ser automática por succión.

3.- Mezclar en Vórtex intermitentemente por 30 a 60 minutos para garantizar su completa homogeneidad. Conservar el vial frío, colocándolo frecuentemente sobre el gel pack.

4.- Cubrir la tapa con parafilm y refrigerar.

El Estándar de Endotoxinas puede mantenerse hasta cuatro semanas bajo condiciones de refrigeración (2 – 8º C ). No congelar.

b) Preparación del Reactivo Pyrotell ®.

1.- Antes de rehidratar, golpear suavemente el vial contra la superficie de la mesa, para que todo el polvo caiga al fondo del vial..

2.- Remueva el sello y el tapón de goma del vial .

3.- Rehidratar con 1 ml de agua destilada libre de pirógenos, utilizando una pipeta despirogenizada..

4.- Agitar suavemente el vial en forma circular, hasta lograr una dilución homogénea del reactivo. La formación de espuma debe ser evitada, para no afectar negativamente la sensibilidad del Pyrotell.

El reactivo Pyrotell deberá mantenerse refrigerado todo el tiempo. Durante su utilización, debe ser conservado sobre hielo o gel pack. El reactivo deberá ser transparente o ligeramente opaco. Una coloración amarilla y/o presencia de partículas, son indicativos de contaminación o deterioro.

c) Preparación de la Muestra.

1.- Si la muestra es clara, no hacer dilución de la misma. Si es turbia, hacer dilución transfiriendo 0.1 ml de la muestra al tubo correspondiente y agregar 0.9 ml de agua destilada libre de pirógenos

(Factor de Dilución 1:10). El Factor de Dilución se utilizará en el cálculo del resultado final.

d) Preparación de las diluciones del Estándar de Endotoxinas.

1.- Marque tubos de vidrio, libres de pirógenos, cap. 20 ml, con las siguientes diluciones: 10, 1, 0.1 , 0.05, 0.025, 0.0125, 0.006, 0.003 ng/ml.

2.- A partir de la solución estándar (100 ng/ml) , preparar una serie de diluciones, hasta alcanzar una concentración correspondiente a la mitad de la sensibilidad del LAL que se utilice, según se describe a continuación:

Para cada ensayo se deberá preparar una nueva serie de diluciones a partir del estándar refrigerado.

e) Preparación de las diluciones de la Muestra.

A partir de la dilución 1:10, preparar una serie de diluciones hasta alcanzar los niveles de Endotoxinas esperados, valor que dependerá de la sensibilidad del Lal que se utilice.

A continuación se presentan un cuadro de diluciones de la muestra, según tres niveles de sensibilidad del Lal:

Cuadro de Diluciones de la Muestra según la Sensibilidad del Lal (Opcional).

Marque tubos de vidrio, libres de pirógenos, cap. 20 ml, con los factores de dilución: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, etc., según sea necesario, y proceda a efectuar las diluciones descritas a continuación:

Generalmente nos interesa saber si la muestra se encuentra por debajo de 1 ng/ml, por lo tanto el análisis llegará hasta la dilución correspondiente, según la sensibilidad del Lal.

En casos en que se esperen niveles mayores a 1 ng/ml, la serie se prolongará hasta dónde sea necesario.

6.4.1.3 Procedimiento:

1.- Preparar una serie de 10 tubos de 10×75 mm, despirogenizados, en una gradilla, preferentemente dentro de una campana de flujo laminar.

2.- Agregar 0.1 ml de las series de diluciones de muestra, estándar y agua libre de pirógenos (control negativo) a los correspondientes tubos.

3.- Seguidamente, agregar a cada uno de los tubos 0.1 ml del reactivo Lal reconstituido.

4.- Mezclar suavemente con movimientos circulares, evitando la formación de espuma.

5.- Incubar los tubos a 37 + 0.5º C, por 60 min. Evitar mover y/o golpear los tubos durante su incubación

6.4.1.4 Lectura e Interpretación de los Resultados:

1.- Al finalizar el período de incubación (60 + min) efectuar la lectura de los tubos, en forma secuencial, sin retirar la gradilla del Baño María, invirtiendo suavemente los mismos para detectar formación de coágulo.

La prueba se considera positiva si se forma un coágulo firme que no colapse al invertir 180º el respectivo tubo.

2.-Empezar la lectura por el control negativo. Si la lectura resultare positiva (formación de coágulo), se invalidará toda la prueba por contaminación de los materiales o reactivos.

Lectura del Estándar de Endotoxinas: Leer las diluciones del estándar de endotoxinas para comprobar la sensibilidad del Lal (Pyrotell).

Sensibilidad de Pyrotell 0.003 ng/ml: Si la sensibilidad del Pyrotell es de 0.003 ng/ml, se debe esperar coágulo en los dos primeros tubos (0.006

y 0.003 ng/ml). Se puede obtener coágulo también en el tercer tubo (0.0015 ng/ml), pero nunca en el cuarto tubo (0.0007).

Sensibilidad de Pyrotell 0.006 ng/ml: Se debe esperar coágulo en los dos primeros tubos (0.012 y 0.006 ng/ml). Se puede obtener coágulo también en el tercer tubo (0.003 ng/ml), pero nunca en el cuarto tubo (0.0015).

Sensibilidad de Pyrotell 0.0125 ng/ml: Se debe esperar coágulo en los dos primeros tubos (0.025 y 0.0125 ng/ml). Se puede obtener coágulo también en el tercer tubo (0.006 ng/ml), pero nunca en el cuarto tubo (0.003).

Sensibilidad de Pyrotell 0.0250 ng/ml: Se debe esperar coágulo en los dos primeros tubos (0.050 y 0.025 ng/ml). Se puede obtener coágulo también en el tercer tubo (0.0125 ng/ml), pero nunca en el cuarto tubo (0.006).

4.- Lectura de la Muestra: Leer las diluciones de la muestra buscando la mayor dilución en que se observa coágulo firme con el tubo invertido.

6.4.1.5 Cálculos:

Se toma en consideración la máxima dilución en la que se observó coágulo firme y se multiplica por la sensibilidad del Pyrotell y por el factor de dilución de la muestra, si se hubiera hecho dilución previa..

El resultado será la concentración de endotoxinas de la muestra.

Endotoxinas = (D) x (S) x (I)

D = Ultima dilución seriada de la muestra con coágulo firme

S = Sensibilidad del Pyrotell

I = Dilución inicial de la muestra. (opcional)

Ejemplo: Última dilución: 1:8

Endotoxinas = (8) x (0.0125) x (10) (si hubiera)

Endotoxinas = 1 ng/ml.

Nota: Para convertir ng/ml a EU/ml hay que multiplicar por 10. Así,

1.0 ng/ml = 10 EU/ml.

Requisitos mínimos de calidad en la hemodiálisis actual

En España, el agua utilizada en la fabricación del líquido de diálisis debe cumplir la norma UNE 111-301-90 de Enero de 1990 y publicada en 1991 en el Journal de Nefrología. Estas normas se basan en la Norteamericana aprobada en 1981 por el American National Standards Institute, Inc (ANSI ;AASI), que fija la resistencia mínima del agua, las concentraciones máximas admisibles de diversos electrolitos y sustancias y los límites aceptables en cuanto a contaminación bacteriana. Estos límites son < 200 UFC/ml para el agua y < 2000 UFC/ml para el LD.

La European Pharmacopoeia corrientemente establece los límites máximos de bacterias y endotoxinas en 100 microorganismos y 0.250 EU/ml de endotoxinas.

Se ha mostrado reacciones pirogenéticas inducidas a niveles de endotoxinas de 5 EU/kg. Esto representa un nivel de 300 EU para un paciente de 60 kg de peso. Una carga de 300 EU se logra si se filtran 1.2 litros de dializado con una concentración de endotoxina de 0.250 EU/ml. Hay que tener en cuenta que se requieren más de 1.2 litros de dializado durante una sesión de diálisis con un dializador del alto flujo. Esto sugiere que los estándares de la Farmacopea Europea no sean suficientemente terminantes para la hemodialisis de alto flujo.

Normas de calidad del agua y líquido de hemodiálisis

Nota : 1 ng/ml = 10 EU/ml de Endotoxinas

Glosario de términos

Agua altamente purificada o ultra pura: Se define como agua altamente purificada o ultra pura la que se ajusta a un contenido de contaminantes químicos.

Tiene menos contaminación bacteriana, aproximadamente de 10 UFC/100 ml y menos de 0,25 UE/ml. Referencia: Real Farmacopea Española 2.1. 07/2002:1927; pág. 2950. European Pharmacopoeia 4.3 07/2002:1927; pág. 3157.

Agua de aporte o bruta: Se entiende como agua de aporte al agua que se va a tratar, bien si procede de la red municipal, se capta de un pozo o se recibe en camiones cisterna.

Agua de rechazo o "concentrado": Es el agua que no ha pasado a través de las membranas de ósmosis y que lleva la práctica totalidad de las sales y de los contaminantes.

Agua estéril apirógena: Es el agua libre de organismos vivos y esporas. La esterilidad viene definida como la ausencia de bacterias viables y < 0,03 UE/ml de endotoxinas.

Agua pretratada: Es el agua sometida a todos los procesos previos a su llegada al equipo de ósmosis o tratamiento.

Agua purificada: Es el agua destinada a la preparación de medicamentos o de líquidos de diálisis que no deben ser necesariamente estériles y exentos de pirógenos.

AAMI – Asociación para el Avance de la Instrumentación Médica:

Recomienda estándares para procedimientos médicos en los Estados Unidos de América. www.aami.org.

Bacterias heterótrofas: Bacterias que desde el punto de vista metabólico dependen para su desarrollo de la utilización de compuestos orgánicos. Este es un grupo muy amplio y diverso que incluye especies simbiontes, saprofitas y patógenas. El término heterótrofo se utiliza comúnmente como nombre genérico para las bacterias del agua con escasos requerimientos nutricionales.

Biofilm: Colonias de bacterias asentadas sobre las superficies de los circuitos hidráulicos, protegidas por un ecosistema de precipitados minerales y una matriz polisacárida mucosa extracelular, que se reproducen y generan en lugares de estancamiento. Su presencia se asocia a fuerte contaminación bacteriana >1000

UFC/ml.

Caudal nominal: Es el caudal que produce un equipo de ósmosis inversa en condiciones ideales.

Cloraminas: Productos formados por la combinación del cloro libre con amonio. El amonio puede proceder de la descomposición vegetal, otros contaminantes orgánicos o aportado por los responsables de la potabilidad del agua para desinfectarla

Descalcificador o "ablandador": Dispositivo para reducir la dureza del agua, mediante la eliminación del calcio y magnesio por intercambio iónico con cationes ligados a resinas.

Desinfección: Proceso de destrucción de microorganismos, que reduce su número, pero no los elimina. La esterilización reduce el número hasta un nivel seguro, dado que la eliminación total es virtualmente imposible. Puede ser química o térmica.

Desionizador (DI): Dispositivo para reducir los iones libres en el agua, mediante lechos dobles o mixtos de resinas catiónicas y aniónicas.

Endotoxina: Sustancia pirógena y biológicamente activa, lipopolisacárida, liberada de la pared celular externa bacteriana Gram-negativa. Se miden en Unidades de Endotoxina UE/ml

Filtro de carbón activado: Filtro empleado para eliminar del agua cloro, cloraminas y sustancias orgánicas, por medio de la adsorción de la estructura micro porosa del carbón activado.

Filtro de cartucho: Esta formado por un cilindro de material poroso que al pasar el agua a través de él retiene las partículas de menor tamaño que el del poro.

Filtro de cartucho bobinado: Es un filtro de cartucho formado por un alma rígida perforada en el que el material poroso esta formado por un cordón que puede ser de algodón, polipropileno u otro similar y que dependiendo del tipo de hilo, del numero de hilos por vuelta y de la presión del bobinado se obtiene mayor o menor capacidad de filtrado. Pueden retener partículas entre 1 y 100 µm.

Filtro de cartucho plisado: Es un Filtro de cartucho formado por un alma rígida perforada en el que el material poroso es de poco espesor y mucha superficie,

"una especie de papel" y doblado en zigzag, sellado por ambos extremos y unidos al alma. La capacidad de filtrado lo determina la porosidad del material filtrante. Pueden retener partículas y bacterias de hasta 0,2 µm.

Filtro de lecho: Filtro compuesto por un recipiente lleno de un material rígido granulado de tamaño homogéneo, que retiene las partículas en los espacios libres.

LAL Limulus Amebocito Lisado (Analisis de Lisado de Amebocito de Limulus): Ensayo especifico de detección de endotoxinas, basado en el lisado de amebocitos del cangrejo Limulus polyphemus.

Lavado a contracorriente: Proceso a que se somete un filtro de lecho consistente en introducir el agua por la parte inferior a un caudal ascendente para esponjar el lecho y permitir la eliminación de las partículas retenidas. Para el correcto lavado la velocidad del agua debe ser ligeramente superior a la velocidad de fluidificación para conseguir un esponjamiento del lecho en un 10% al menos.

Lavado a corriente: Proceso a que se somete un filtro de lecho consistente en introducir el agua por la parte superior y eliminar el agua utilizada en el lavado a contracorriente, que no ha sido filtrada.

Líquido de diálisis ultrapuro: Líquido de diálisis producido preferentemente con agua altamente purificada, con menos de 1 UFC/ml y menos de 0,03 UE/ml de endotoxinas y que ha pasado por un ultrafiltro inmediatamente antes del dializador.

Lipopolisacáridos (LPS): Endotoxinas compuestas por lípidos y azúcares (polisacáridos).

Microfiltro: Filtro que es capaz de eliminar partículas menores a 1 µm de diámetro. (0,1-0,3 µm según la AAMI).

Nanofiltración: retiene compuestos orgánicos con pesos moleculares entre 300 y 1000 D. retiene algunas sales y trabaja a menos presión que la OI.

Ósmosis Inversa (OI): Proceso de purificación del agua mediante el tamizado a través de una membrana y rechazo del concentrado iónico. Elimina iones y contaminantes orgánicos de peso molecular > 100 D.

Permeado o "filtrado": Fluido que ha pasado a través de una membrana de ósmosis inversa.

Pirógeno: Sustancia que induce fiebre. Los pirógenos externos (endotoxinas / exotoxinas) inducen pirógenos internos, citoquinas, como IL-1 o TNF a, que son mediadores en la inducción de fiebre e inflamación. Sustancias capaces de activar a las células mononucleares de la sangre.

Prefiltro o "filtro de sedimentación o de arena": Filtro de lecho que elimina grandes partículas, entre 500 – 20 µm y se coloca en el agua de entrada al tratamiento.

Permite contralavados.

Resina: Cationes, aniones o mezcla fijada a gránulos, en los lechos de intercambio iónico como los de los descalcificadores y desionizadores.

Resistividad: Resistencia de un medio al paso eléctrico. Es la inversa de la conductividad. A menor número de electrolitos mayor resistividad. Una resistividad de

1M O/cm es lo mismo que una conductividad de 1 microS/cm.

Unidades de endotoxinas por ml (UE/ml): Unidades de endotoxinas (ET) tituladas mediante una prueba basada en la activación de un lisado de amebocitos Limulus (LAL). Anteriormente la unidad de medida era el ng/ml. 1 ng/ml=10 EU/ml.

Unidades formadoras de colonias (UFC): Unidad de medida de bacterias viables. Refiere el número de colonias bacterianas que se han desarrollado en un medio de cultivo sólido. Se expresan en UFC por mililitro de líquido.

Ultrafiltración, como método de diálisis: Transporte convectivo de solutos a través de una membrana, mediante un gradiente hidrostático de presiones (presión transmembrana).

Ultrafiltración, como tratamiento del LD: es un proceso similar a la OI.

Rechaza contaminantes entre 1000 D y 0,1 µm La ultrafiltración requiere presiones bajas para operar. Retiene fundamentalmente sustancias orgánicas, bacterias y pirógenos. La efectividad de las membranas en ultrafiltración se determina como el menor peso molecular que rechaza mas del 90 % .

Ultrafiltro: Filtro de membrana (polisulfona, poliamida) empleado para eliminar los componentes microbianos del agua de diálisis, en el post-tratamiento del agua de diálisis o más comúnmente en los líquidos de diálisis. Algunos ultrafiltros retienen ET por adsorción. También se usa como sinónimo de dializador.

Ultravioleta: Radiación ultravioleta utilizada para eliminar microorganismos.

USP: United States Pharmacopoeia.

Velocidad de fluidificación: Es la velocidad de contralavado de un filtro de lecho a la que este se ve sometido a una fuerza ascendente igual a su peso. Su volumen aparente no varía, su esponjamiento es cero.

Volumen aparente de un lecho: Es el volumen que ocupa un lecho cuando se esponja con un lavado contracorriente.

Volumen real de un lecho: Es el volumen que ocupa un lecho en un recipiente.

Se entiende que el espacio existente entre las partículas es un volumen ocupado por el propio lecho.

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Autor:

Lic. Eric Caballero J.