Teocintle (Zea mays sp mexicana) una maleza fuente de bacterias benéficas de raíces para maíz (Zea mays)

1. Resumen
2. Introducción y antecedentes
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión

RESUMEN

El teocintle es una gramínea silvestre, para algunos una maleza, reconocida como el ancestro del maíz. En general abundante información existe al respecto, pero no así sobre el tipo bacterias benéficas de raíces (BBR). El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar las BBR dominantes de la rizósfera de teocintle ( Zea mays sp mexicana L), potencialmente benéficas para el maíz.

Para ello se colectaron, raíces y semillas de teocintle y suelo de la región en donde crece silvestre, en el norte del municipio de Morelia, Mich. Las raíces se usaron como fuente de aislamiento de las BBR, por siembra en agar Watanabe (medio mineral sin nitrógeno combinado), PCAT (agar selectivo para Burkholderia spp). La capacidad para fijar N2 de las BBR teocintle, se demostró por la técnica de reducción de acetileno y se realizó su identificación bioquímica parcial.

Los resultados indican que las BBR asociada a las raíces de teocintle, son predominantemente del tipo Gram negativo entérico, en orden descendente Burkholderia spp, y Azotobacter spp, parcialmente concluye que en sus raíces existe un grupo de BBR similares a la reportada en maíz, con potencial para emplearse como inoculante y disminuir el uso de fertilizante nitrogenado en su producción.

Palabras clave: Teocintle, raíces, enterobacterias, Burkholderia.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

El teocintle (Zea mays sp mexicana L) es una gramínea distribuida en América conocida por su relación con el maíz (Zea mays sp L). Teocintle, significa grano de Dios (13,16), con este nombre se le registró cuando se le introdujo en Europa, en México se le denomina con otros nombres que lo asocian a las aves que se alimentan de sus semillas o por su semejanza con el maíz (31 ,32).

En general, una gama de argumentos concluyen que el maíz se originó del teocintle (5,), cambios en su composición genética (4,20) señalan sus características anatómicas y fisiológicas distintas al del maíz común: la forma de las mazorcas, la dureza del grano, topografía y morfología de las semillas, así como la flexibilidad del teocintle para adaptarse a las condiciones adversas del ambiente: desecación, pobreza de nitrógeno combinado a otros nutrientes esenciales: P, Fe, etc, a la alcalinidad del suelo (20), al ataque de patógenos de raíces y aéreos (31) y porque a diferencia del maíz, el teocintle no es protegido por el hombre por el contrario se le combate con herbicidas (27,33).

El teocintIe utiliza como defensa natural (4,5), una producción elevada de semillas liberada a la madurez (32), en el maíz, las hojas de las mazorcas lo evitan, por ello depende para su reproducción del hombre (23,27).

Parte de la adaptabilidad del teocintle a diferentes ambientes se atribuye a la asociación de sus raíces y tejidos con microorganismos, los cuales al usar productos del metabolismo de la planta, los transforman en promotores del crecimiento vegetal (SPCV). Además una característica de esas bacterias, es su capacidad de competencia para sobrevivir a las condiciones adversas del ambiente y establecer interacciones positivas con las raíces de vegetales y estimular su desarrollo (14,25). Como las BBR (7), que producen SPCV

(10,12), o por solubilización de minerales de fósforo y el hierro (25). Se sabe que teocintle y maíz están genéticamente relacionados, por ello se cree que comparten el mismo tipo de BBR (33), como lo reportan Calderón et al. (9) y Sánchez-Yáñez et al. (33) lo que ya se conoce en otras gramíneas domésticas.

Las BBR dominantes en la rizósfera del maíz (Zea mays sp L) son: Azospirillum spp una bacteria Gram negativas (-) en forma de coma, de uso comercial como inoculante para el crecimiento del maíz, con excelentes resultados en ciertos suelos y climas y negativos en otros, de venta en el mundo incluso en México (29). Aunque esta BBR en condiciones de anegación del suelo, provoca pérdida de N por desnitrificación.

Otra BBR es Herbaspirillum, recién descubierta en maíz y en evaluación para proponer su uso como inoculante en otras gramíneas bajo un esquema de producción sin hiperfertilización nitrogenada (3).

Otro ejemplo de BBR en maíz es Azotobacter chroccoccum un bacilo Gram (-), formador de quistes, que inoculado en: trigo y avena desde principios de siglo XX en Rusia y Estados Unidos, ha dado resultados parcialmente consistentes al reducir la dosis de fertilización y mantenimiento de rendimiento (22), así como Rahnella aqualilis una bacteria entérica, pero que por su asociación con bacterias enteropatógenas para humanos, tiene problemas para su aplicación en la agricultura (7).

Finalmente Klebsiella lerrigena otra entérica encontrada en raíces del maíz y que promueven el crecimiento del maíz pero por su patogenicidad potencial para humanos su futuro como inoculante es incierto (6).

En general los reportes sobre la BBR asociadas al teocintle son escasos al respecto Calderón et al. (1999), Sánchez-Yánez et al. (1998), reportaron un grupo de BBR similares a las conocidas en el maíz, lo que se corroboró por García et al. (1995, 2001), que encontraron BBR en la rizósfera del teocintle y también endófitas.

Por lo anterior los objetivos de este trabajo fueron: 1) Aislar e identificar BBR de teocintle, potencialmente benéficas para maíz.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. ORIGEN DE LAS PLANTAS.

El teocintle en madurez y senectud, al igual que las semillas y suelo se colectaron del Rancho "Los Ramírez" al norte del Municipio de Morelia, Mich., México (31,32), además se sembraron semillas en macetas en el suelo original de colecta, esas macetas se mantuvieron en invernadero en el Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich. para su posterior análisis, las raíces de plantas en madurez y senectud se transportaron en bolsa de plástico, para su estudio en el laboratorio (22).

2. AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS DE TEOCINTLE

Las raíces de teocintle se lavaron con agua corriente, se desinfectaran con etanol al 90% por 15 minutos y se lavaron tres veces con agua destilada estéril, se trituraron en un mortero en condiciones asépticas y se diluyeron desde 10-1 hasta 10-6 en tubos de 18 x 150 mm con 9.0 mL de solución salina estéril (NaCl 0.85% p/v), de cada dilución se tomaron 0.2 mL para sembrar en el medio mineral sin carbono ni nitrógeno, llamado Watanabe (W), el cual consiste en cuatro soluciones: Solución A g/L: ZnS04 . 7H2O, 0.43, MnS04 . H20. 1.30; NaMo04. 2H2O 0.75; H3B03, 2.8; CuS04 . 5H2O, 0.026; CoS04.7H2O, 0.07.

Solución B g/L: MgS04 . 7H2O,2.00; CaCI2 . 2H2O,2.00; FeS04 . 7H20, 0.44; EDTA, 0.40; solución A, 20mL. Solución C g/L: K2HPO4 60; KH2PO 4,40. medio final: Solución B, 50mL; Solución C, 15mL; en 1000 mL de agua destilada, pH de 6.8 a 7.0. Solución D (g/L): manitol l0, almidón 10, sacarosa 5, ácido málico 5, los azúcares y el ácido se agregan, esterilizados por filtración con membrana Millipore de 0.2 micras (Gelman, Co. ) al medio base después de esterilizar. Para mantener la mezcla semisólida se agregó 0.5% de agar-agar y para solidez total 18g/L (35).

3. REDUCCIÓN DE ACETILENO DE LAS BACTERIAS DE TEOCINTLE

Las bacterias sospechosas de fijar N2 (característica frecuente en las BBR) se conservaron en agar W y para su pureza se resembraron en AN y se mantuvieron en glicerol al 10% y -5 °C (22). Esas BBR se sembraron en tubos de 18 x 15O mm con 3.0mL de caldo W y se ajustaron a l x l0-3 bacterias/mL con el tubo No. 1 de Mac Farland, los tubos se sellaron con tapones de hule y se incubaron á 35°C por 48 h., después se usó una jeringa Hamilton de 5.0 mL para extraer de cada tubo el 10% de la fase gaseosa y sustituir por una inyección del mismo volumen de acetileno etileno producido en cada tubo, se determinó por cromatografía de gases (Beckman modelo GC-72-5) empacado con una columna Porapack Q.

4. IDENTIFICACIÓN DE LAS BBR DE TEOCINTLE

Se realizó una identificación parcial de las BBR dominantes de teocintle. Así las bacterias que fijaron N2 en PCAT y en agar W, inclusive sus características morfológicas microscópicas como: la forma, arreglo celular, movilidad, reacción al Gram.

La producción de oxidasa, catalasa y otras pruebas bioquímicas para identificar Burkholderia spp (6,35,36).

El segundo grupo clasificado que fija N2, solo creció en agar W pero no en PCAT se sometió a las pruebas bioquímicas como: (23,24) crecimiento en anaerobiosis, ácido de: glucosa, lactosa, sacarosa, manitol y almidón, utilización de citratos como única fuente de carbono y energía, producción de H2S a partir de cistina y lisina, formación de indol de triptofano y la síntesis de pigmento intra o extracelular (8,9,33) y las indicadas previamente para Burkholderia (36). –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la tabla 1 se muestra la actividad de reducción de acetileno (ARA) medida por la producción de etileno, la ARA para Burkholderia vietnamiensis TVV7S cepa de referencia usada como control positivo (aislada de arroz), fue de 196 nnmol de etileno/día/tubo, mientras que cero para Bacillus cereus G4 (cepa de referencia de Paspallum sp) no fijadora de N2. "'.:'

Mientras que los aislados de teocintle mostraron una tendencia de ARA relati vamente alta, lo que no significa que sean mejores fijadores de N2 que B. vietnamiensis TVV7S, ya que condiciones específicas nutricionales para cada género bacteriano son específicas, las que frecuentemente no favorecen la ARA de cualquier bacteria (6,23), por tanto la ARA es principalmente variable cualitativa, (10,21,24), ¿cuánto y bajo qué condiciones? Burkholderia de teocintle fijan N2, es tema de investigación de otro tipo (8,9).

En oposición a lo esperado en las raíces de maíces franceses y australianos el tipo de Burkholderia no fijan N2 (36), ello sugiere una especificidad bacteria-raíces de teocintle (1,6).

En la tabla 2, se muestran las características bioquímicas de las BBR dominantes del teocintle que crecieron en PCAT y se identificaron presuntivamente como Burkholderia spp, independientemente del estado fisiológico del teocintle; a nivel de plántula, floración, madurez y senectud lo que indica que estos bacterias colonizan y dominan sus raíces hasta su muerte (17) como se reporta en otras gramíneas (27).

Así observó que Burkholderia spp, es parte de la rizósfera del teocintle desde la germinación de la semilla (17,25) hasta el final de su ciclo. Esto apoya la investigación exploratoria en progreso (8,9), la que se muestra que la permanencia de Burkholderia en sus tejidos y en la parte externa de la raíz, en donde la selección de bacterias es regulada por los exudados radicales (15,36).

Por ello el aislado clave STL, es un representante del grupo dominante, que se sabe que es de los más competitivos (19,30). Pruebas de inoculación de invernaderos y campo demuestran que efectivamente influyen positivamente en el crecimiento y rendimiento de maíz a dosis reducida de urea (30).

Tabla 3 y 4. Se presentan las características bioquímicas de bacterias dominantes de las raíces y suelo alejado de las raíces del teocintle. En ambos casos se detectó Azotobacter sp conocido por su capacidad de asociación y fijación biológica N2 en la rizósfera de gramíneas (22). En donde las características bioquímicas basadas para su identificación fueron: la producción de quiste en n-butanol como fuente de carbono, su movilidad, la producción de oxidasa, de un pigmento fluorescente verde y la utilización de azúcares (ramnosa, almidón, glucosa, etc.), así como otras pruebas bioquímicas adicionales que apoyan que el comportamiento bioquímica corresponde a este tipo de BBR , en progreso se realiza la identificación de estas BBR definitiva con bases genéticas se trata de un Azotobacter (33).

CONCLUSIÓN

En las raíces de teocintle, existen diversos tipos de BBR en el orden que sigue: bacterias entéricas Gram negativas, Burkholderia spp y Azotobacter spp, así como otras bacterias no identificadas, potencialmente benéficas para el maíz. Investigación en progreso lo anterior y posteriormente, los resultados se presentaron.

Tabla 1. Actividad relativa de la reducción de acetileno por Burkholderia spp de raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L), en Morelia, Mich .

aNúmero de repeticiones. +cepa de referencia no fijadora de N2. bPromedio de la actividad máxima de producción en nmol de C2H4/día/tubo.*(cepa de referencia donada por el Dr. Tran Van Van). STL Burkholderia sp aislada de teocintle rancho "Los Ramírez", Morelia, Mich., México.

Tabla 2. Características bioquímicas de Burkholderia spp dominante de raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L), en Morelia, Mich.

*Cepa de referencia donada por el Dr. TranVan Van. Reacción (+) positiva, (-) negativa, TSI = Agar triple azúcar hierro, LIA = Agar Hierro Lisina, SIM = H2S lndol Movilidad, STL= aislado de teocintle.

Tabla 3. Comportamiento bioquímico de Azotobacter spp de las raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L) en Morelia, Mich.

Reacción (+) positiva, (-) negativa; * Cepa de referencia donada por el Dr. G .R. Vela, UNT, USA Denton, Tx; STL= aislado de teocintle.

Tabla 4. Comportamiento bioquímico de las bacterias benéficas entéricas fijadoras de nitrógeno del suelo alejado de las raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L) en el municipio de Morelia, Mich.

Reacción (+) positiva, (-) negativa, TSI= Agar triple azúcar hierro, LIA = Agar Hierro Lisina, SIM= H2S Indol Movilidad, T= aislado de teocintle, b o c = aislados de suelo sin raíces de diferentes plantas; °Cepa de referencia.

AGRADECIMIENTOS.

A la Agencia Internacional de Energía Atómica que por medio del contrato num. 311-D 1-Mex-7944, financió parcialmente este trabajo

A la Coordinación de Investigación Científica de la UMSNH por el proyecto 2.7 (2005-2006) estudio de la Microbiota Fijadora de Nitrógeno asociada a teocintle y maíz, por su apoyo para la realización de ciertas fases experimentales y su publicación

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Juan Manuel Sánchez-Yáñez

Microbiología Ambiental, Instituto de Investigación Químico-Biológicas, Univ. Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Edif. B-3 *

Cd. Universitaria, Morelia, 58030,Michoacán, México.