Equipos e instalaciones para análisis microbiológico (página 2)

CUADRO

A pesar de las varias clasificaciones de sistemas de conservación, las más grandes son por frío y por calor. A su vez los diferentes tipos de conservación se agrupan en dos grandes bloques: • Sistemas de conservación que destruye los gérmenes (bactericidas) • Sistemas de conservación que impiden el desarrollo de gérmenes (bacteriostático) CUADRO

Los resultados obtenidos en una atmósfera ozonizada se pueden resumir en los siguientes: • Carencia de mohos en alimentos y envases. • Conservación más prolongada de los alimentos. • Conservación del peso inicial con alto grado de humedad. • Mejor calidad interna. • Excelente apariencia externa. • Pocas mermas por deterioro. • Retrasa la maduración por la fruta al actuar rompiendo la molécula de etileno por oxidación. Es sabido que el etileno activa el metabolismo de ciertas frutas acelerado su maduración.

El pescado es tanto o más alterable que la carne. En el almacenamiento de pescados refrigerados se combate, como en el caso de la carne, la descomposición y la aparición de olores no deseables. El ozono consigue sobradamente la solución a ambos problemas. No obstante si los pescados no han sido eviscerados, la descomposición se inicia en su interior y el ozono solo puede prolongar unos días el inevitable y total deterioro. También es recomendable la administración de ozono en las bodegas de los barcos de pesca, en el transporte del pescado a los centros de venta y en las vitrinas frigoríficas de marisquerías, restaurantes y pescaderías.

Contaminación

Se admite que la masa interna de la carne no contienen microorganismos o estos son escasos, habiéndose, no obstante, encontrado gérmenes en los ganglios linfáticos, médula ósea e incluso en el mismo músculo. En los ganglios linfáticos de los animales de carnes rojas se han aislado estafilococos, estreptococos, Clostridium y Salmonella. Las prácticas comunes en los mataderos eliminan los ganglios linfáticos de las partes comestibles. Sin embargo, la contaminación más importante es de origen externo y se produce durante la sangría, desuello y cuarteado, los microorganismos proceden principalmente de las partes externas del animal (2jj, pezuña y pelo) y del tracto intestinal. Los métodos "humanitarios’ de sacrificio recientemente aprobados, ya sean mecánico, químicos o eléctricos, dan lugar, por si mismo, a escasa contaminación, pero la incisión y la sangría que se efectúan a continuación puede determinar una contaminación importante. Cuando los cerdos y se sacrifican por el método clásico con el cuchillo, las bacterias que contaminan este pronto se pueden encontrar en las carnes de las diversas partes de la canal, vehiculadas por la sangre y linfa.

En la superficie externa del animal, además de su flora natural existe un gran número de especies de microorganismos del suelo, agua, piensos y estiércol, mientras que el intestino contiene los microorganismos propios de esta parte del aparato digestivo. Los cuchillos, paños, aire, manos y ropa del personal pueden actuar como intermediarios de contaminación. Durante la manipulación posterior de la carne puede haber nuevas contaminaciones, a partir de las carretillas de transporte, cajas u otros recipientes, así de otras carnes contaminadas, de aire y del personal. Es especialmente peligrosa la contaminación por bacteria psicrófila de cualquier procedencia, por ejemplo de otras carnes refrigeradas.

Ciertas máquinas como picadoras, embutidoras y otras, pueden aportar microorganismos perjudiciales en cantidades importantes y lo mismo pueden hacer algunos ingredientes de productos especiales, como son los rellenos y especias. El crecimiento de microorganismos en las superficies que entran en contacto con la carne y en las mismas carnes pueden hacer que aumenten mucho su número. Debido a la gran variedad de fuentes de contaminación, los tipos de microorganismos que suelen encontrarse en la carne son muchos. Mohos de diferentes géneros, llegan a la superficie de la carne y se desarrollan sobre ella. Son especialmente interesantes las especies de los géneros Cladosporium, Sporotrichum, Geotrichum, Thamnidium, Mucor, Penicillium, Alternaria y Monilia. A menudo se encuentran levaduras, especialmente no esporuladas. Entre las muchas bacterias que pueden hallarse, las más importantes son las de género Pseudomonas, Alcalígenes, Micrococcus, Streptococcus, Sarcina, Leuconostoc, Lactobacillus, Proteus, Flavobacterium, Bacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonellas y Streptomyces. Muchas de estas bacterias crecen a temperatura de refrigeración., también es posible la contaminación de la carne y de sus productos por gérmenes patógenos del hombre, especialmente de origen entérico.

Vías de contaminación

Matadero:

– Mala salud de los manipuladores.

– Falta de higiene de los manipuladores.

– Insectos y roedores.

Animal:

– Piel (Micrococcus, Pseudomonas y otros gramnegativos, Staphylococcus, Lactobacillus).

– Contenido intestinal (coliformes, E. coli, clostridium, Streptococcus y, a veces, salmonella).

Otras fuentes:

– En almacenamiento y manipulación posterior hay gérmenes, como las Pseudomonas, B. cereus, Cl. perfringes y a veces E. coli, Salmonella, Mucor, levaduras, entre otras, que proviene del suelo, aire, manipuladores y agua.

La carne puede contener parásitos helmintos (cestodos y nematodos), protozoarios y bacterias patógenas.

• Cestodos:

– Tenia solium. Proviene del cerdo, el hombre se infesta por ingestión de carne con cisticercos (Cysticercus cellulosae). La forma adulta se fija en el intestino del hombre.

– Tenia saginata. Proviene de los bóvidos, el hombre se infesta por ingestión de carne con cisticercos (Cysticercus Boris). La forma adulta se implanta en el intestino del hombre.

– Echinococcus granulosus. Responsable de la equinococosis, que se manifiesta por un quiste hidatídico. La infestación directa en el hombre por la carne es rara.

• Nematodos: Estos son los gusanos redondos. Se incluye una sola especie: Trichinella spiralis. Sus larvas se desarrollan en los músculos estirados del huésped hasta su estado infestante. Estas se sitúan entre las miofribillas del músculo longitudinalmente, luego se enrollan y encapsulan en quistes calcificados. Las ingestiones humanas se producen por la ingestión de cerdo, jabalí, etc, poco cocinado o crudo.

• Protozoarios: Los que se pueden infestar en la carne son:

– Toxoplasma gondii, que es transmitido por la carne de cerdo.

-Sarcocystis (agente de la sarcosporidiosis), que se trasmite por carnes de cerdo y ovino.

• Bacterias: Las enfermedades que se pueden transmitir por la carne son: salmonelosis, brucelosis, mal de rojo, carbunco, tularemia. La carne es un producto fácilmente alterable, por so todas las manipulaciones que se realicen después del sacrificio se deben realizar en un ambiente refrigerado. La cadena de frío no debe interrumpirse. Los dos sistemas que se utilizan para la conservación de la carne son:

– Refrigeración: Cuanto más pronto se realice y más rápido el enfriamiento de este alimento, menos posibilidades tienen los gérmenes mesófilos de reproducirse. Las temperaturas de almacenamiento varían de —1.4 a 2.2° C, siendo la primera la más frecuente usada. El tiempo máximo de conservación de la carne de vacuno mayor refrigerada es de unos 30 días, dependiendo del número de gérmenes presentes, de la temperatura y de la humedad relativa, para cerdo, cordero y oveja de 1 a 2 semanas y para la ternera todavía menos. Los embutidos que no se cuecen, las salchichas y los chorizos no curados o el picadillo para prepararlos, deben conservarse refrigerados. Al aumentar la temperatura generalmente se disminuye la humedad del local de almacenamiento. Al aumentar el dióxido de carbono de la atmósfera, la inhibición del crecimiento microbiano es mayor, pero también se acelera la formación de metamioglobina por lo que se pierde gran parte de la "frescura" o color natural de la carne.

Con este proceso se inhibe el desarrollo de la flora microbiana en general, excepto la psicrófila y algunos mohos y levaduras. Las que causan mayores problemas en el almacenamiento de la carne refrigerada son las psicotróficas principalmente del género Pseudomonas, si bien las de los géneros Alcalígenes, Micrococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Flavobacterium y Proteus y ciertas levaduras y mohos pueden crecer a temperaturas bajas. – Congelación: Este proceso puede destruir aproximadamente la mitad de las bacterias presentes o inhibir el crecimiento de otras. Si la descongelación del producto se efectúa en forma lenta, puede proliferar abundantemente la flora psicrófila (Pseudomonas, Alcalígenes, Mocrococcus, Lactobacillus, Flavobacterium y Proteus) que se había mantenido inhibida mientras el alimento se encontraba congelada.

La carne picada es la que se encuentra con más posibilidades de sufrir alteraciones, debido a su amplia superficie de contaminación, al estar triturada, y a su mayor manipulación.

La carne, durante el proceso de maduración, puede sufrir alteraciones debido a su degradación, que son originadas por microorganismos:

• Degradación por microorganismos aerobios:

– Viscosidad: se origina cuando la tasa de los gérmenes que causan la alteración sobrepasa la cifra límite de gérmenes por centímetro cuadrado. Esta alteración es causada por microorganismos pertenecientes a la Pseudomonas, Achromobacter, Leuconostoc, Bacillus, micrococcus, Lactobacillus, levaduras y mohos (a pesar de que son aerobios, psicrotróficos e hidrófilos, el ambiente frió y húmedo favorece su crecimiento).

– Decoloración: Se produce debido a los fenómenos de oxidación originados por levaduras y bacterias de los géneros Lactobacillus y Leuconostoc.

– Pigmentación: Originada por Pseudomonas, Flavohacteriam, Micrococcus, Serratia, levaduras y mohos.

– Enranciamiento: alteración de la grasa producida por Pseudomonas, levaduras y mohos.

– Enmohecimiento: Se debe a la presencia de la flora micótica variada.

– Decoloración verde: Generalmente e carnes almacenadas a 1 y 2º C y baja tensión de oxigeno. En estas condiciones la decoración tiene lugar al transformarse la mioglobina en sulfomioglobina, en presencia del SH2 preformada por P. mephitica cuando se multiplica sobre la carne.

– Lipolosis: Se genera por el desarrollo de gérmenes lipolíticos pertenecientes a las Pseudomonas y Achromobacter, levaduras (Tricosporum y Candida) y mohos. Cuando se hidrolizan las grasas se forman compuestos químicos que producen olores particulares.

– Fosforescencia: Se debe al crecimiento de los microorganismos fosforescentes. Se suele observar en carnes conservadas a baja temperatura. En esta alteración la luciferina se oxida.

– Olores y sabores a normales:

a) Olor y sabor agrio, al crecer bacterias y levaduras acidificantes.

b) Sabor a rancio, por crecimiento de actinomicetos.

c) Sabor a tierra, por crecimiento de actinomicetos.

d) Sabor a humedad, por crecimiento de mohos.

• Degradación por microorganismos anaerobios:

– Agriado: Se debe a la presencia de ácidos volátiles y no volátiles, como consecuencia de la acción enzimática de la carne durante su maceración, los procesos de fermentación microbiana con formación de ácidos grasos y acido táctico, y por la proteolisis microbiana.

– Putrefacción: Ésta indica descomposición anaeróbica de las proteínas con formación de amoniaco, indol, acido sulfúrico, etc, que presentan olor nauseabundo. Esta alteración se presenta en carnes no refrigeradas o mal refrigeradas, siendo las mas afectadas las de un pH mayor a 6.2. Las carnes que tienen esta alteración están repletas de gas, tienen color gris-verdoso y despiden un olor desagradable.

– Hueso hediondo: Se caracteriza por un olor pútrido que se produce en las partes profundas de la carne (sobre todo cerca del hueso). Esta alteración se produce por la mala refrigeración de las carnes con pH elevado.

En la carne se pueden encontrar gérmenes perjudiciales para la salud del hombre, procedentes de animales enfermos o de malas manipulaciones durante su preparación: Salmonella, Staphylococcus aureus, Yersina enterocolítica, Campylobacter jejuni/coli, Listeria monocytógenes, Clostridium perfringes, Clostridium botulinum.

Preparación de la muestra a analizar

Las muestras de carne, sea fresca, troceada o picada, permanecerán refrigeradas a temperaturas entre 0 y 5º C hasta el comienzo del análisis. Este deberá iniciarse lo mas pronto posible una vez recibido en el laboratorio y nunca mas de 24 horas después del muestreo.

Las muestras congeladas permanecerán en este estado (a temperatura inferior a -15º C) hasta el momento de analizarla. La descongelación se realiza en ambiente de refrigeración (2 y 5º C), durante 18 horas, según el tamaño de la muestra, para proceder con el análisis rápidamente.

Análisis

a) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 +- 1º C): En este se estima la flora total, sin especificar tipo de gérmenes. Esta determinación refleja la calidad sanitaria de los productos analizados indicando las condiciones higiénicas de la materia prima y como fueron manipulados durante su elaboración.

La presencia de patógenos o sus toxinas tienen un valor limitado. Un recuento total de aerobios mesófilos bajo no asegura que un alimento este libre de patógenos, tampoco un recuento alto significa presencia de flora patógena.

Los recuentos altos son pocos aconsejables para la mayor parte de los alimentos porque, de tener un resultado así, la materia prima se encuentra altamente contaminada, con posibilidades de presencia de patógenos. Además, un alto recuento, indica una inmediata alteración del producto, en caso de tener altas tasas de números de gérmenes (superando el límite) se inicia la descomposición.

El recuento de la flora aerobio mesófila es una prueba para conocer las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

• Métodos de recuento en placas: Son utilizados para determinar el número de gérmenes por gramo o mililitro del alimento, partiendo de la serie de diluciones decimales, empleando las técnicas en placas de agar.

– Recuento por siembra en masa

1) Material

Placas de petri estériles de 90mm.

Pipetas de 10 y 1 ml.

Asa de siembra.

Asa de vidrio estériles.

Estufa de cultivo.

Contador de colonias.

2) Medio de cultivo

Plata Count Agar. PCA

Composición: Triptona (5g), extracto de levadura (2.50g), dextrosa (1g), agar (12g), agua destilada (1000ml).

Se disuelven todos los ingredientes por calentamiento. Ajustar el pH a 7. Se distribuye en tubos o matraces y se esteriliza en autoclave a 121º C durante 15 minutos.

3) Técnica

Colocar, con pipeta estéril, 1 ml de cada dilución en las placas de Petri estériles.

Agregar a cada placa 15 ml de PCA previamente licuado y atemperado a 47º C. (Este paso se debe realizar en menos de 10 minutos).

Mezclar perfectamente el medio inoculo en todos los sentidos evitando que se impregne la tapa. Dejar solidificar el agar sobre una superficie horizontal.

Una vez que se tiene el agar perfectamente sólido, se invierten las placas y se introducen en la estufa (no apilar en exceso y evitar el contacto con las paredes de ésta). Dejar incubar a 31 +- 1º C durante 72 horas.

Pasado el tiempo de incubación, se realiza el conteo de las colonias en las placas que muestren entre 30 y 300 colonias aisladas (ir marcando las contadas para no contarlas de nuevo).

El resultado del recuento total de la muestra analizada se obtiene multiplicando el número total de colonias contadas por el factor de dilución de la placa elegido.

– Recuento por siembra en superficie

1) Material

Placas de petri estériles de 90mm.

Pipetas de 10 y 1 ml.

Asa de siembra.

Asa de vidrio estériles.

Estufa de cultivo.

Contador de colonias.

2) Medio de cultivo

Plata Count Agar. PCA

Composición: Triptona (5g), extracto de levadura (2.50g), dextrosa (1g), agar (12g), agua destilada (1000ml).

Se disuelven todos los ingredientes por calentamiento. Ajustar el pH a 7. Se distribuye en tubos o matraces y se esteriliza en autoclave a 121º C durante 15 minutos.

3) Técnica

Colocar en varias placas de Petri estériles 15 ml de agar nutritivo de recuento (licuado y enfriado a 47º C) y dejar solidificar. Para secar la superficie del agar, se colocan las placas en la estufa con la parte que lleva el agar en posición invertida y apoyada en la tapa. Se podrán usar cuando se haya secado el agua de condensación de la superficie (no secar a temperatura mayor a 45º C). Partiendo de las diluciones decimales, y por duplicado, se transfiere 0.1 ml de cada una de éstas a placas con agar nutritivo PCA (desechar la pipeta utilizada). El inóculo se esparce por todo el agar, sin romperlo, con ayuda de un asa de vidrio estéril (luego desecharla). Una vez que el inóculo se absorbió, se colocan las placas en estufa regulada a 31º C +- 1º C (no apilar en exceso y evitar el contacto con las paredes de ésta). El periodo de incubación será de 72 horas. Una vez transcurrida la incubación, se realiza el recuento de colonias en las placas donde estén perfectamente aisladas.

El resultado (recuento total de gérmenes en 0.1 g del producto analizado) se obtiene multiplicando el número total de colonias contadas por el factor de dilución de la placa elegido. Esta cifra, multiplicada por 10, expresará el recuento total de gérmenes por gramo o mililitro.

b) Investigación y recuento de Escherichia coli:Este se encuentra, de manera constante, en el intestino del hombre y de los animales de sangre caliente. Está considerado como un buen índice de contaminación fecal. Vive poco tiempo en el ambiente extraentérico, por lo que indica una contaminación reciente una vez presente en los alimentos. Se destruye a temperaturas de pasteurización y congelación, su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de flora patógena (menos resistente que la Salmonella). Presenta forma bacilar, casi siempre móvil, gramnegativo, con estructura antigénica.

La detección en los alimentos de la bacterias pertenecientes a la especie E. coli sirve como índice e contaminación fecal de los mismos. La mayoría de las cepas son inocuas, pero algunas son patógenas para el hombre.

Se comprobó que algunas de estas cepas eran la cusa de diarreas en niños. Se creía que E. coli enterovirulento afectaba solamente a bebés y niños. Pero realizando una serie de estudios se comprobó que, tambien, provoca con cierta frecuencia diarreas en adultos:

• Cepas E. coli enterotoxigénicas (ECET): Muchas de estas cepas elaboran una toxina lábil (LT), que se inactiva a 60º C durante 30 minutos, y/o una toxina estable (ST), resistente a más de 100º C durante 30 minutos.

El germen actúa colonizando el epitelio del intestino delgado, donde elabora toxinas. La toxina LB rompe la función celular del epitelio intestinal, produciendo la secreción de agua y electrólitos que vierten en la luz intestinal produciendo diarrea acuosa profusa. La toxina ST probablemente actúa de forma análoga.

Estas toxinas son causa de la diarrea infantil. La toxina LT provoca síntomas asemejados a los del cólera, los de la ST son menos frecuentes. Los síntomas de las cepas ECET se inician entre las 8 y 44 horas posteriores a la ingesta, manifestandose con diarrea acuosa, no sanguinolenta, a veces con mucosidad. Hay retortijones, dolor abdominal, malestar general, náuseas, vómitos y leve fiebre (estos síntomas duran entre 3 y 9 dias).

Las cepas que producen diarrea, exceptuando las enterohemorragicas, son de origen humano.

• Cepas E. coli enteroinvasivas (ECEI) : Las cepas de este tipo ademas de las propiedades comunes, presentan inmovilidad, similitud bioquímica relacionada con la shigella, algunas no producen gas de la glucosa ni de otros azucares, su fermentación lenta de la lactosa.

Las cepas citopatogenicas penetran en el intestino e invaden las celulas epiteliales del colon donde se multiplican y produce su muerte. Esto beneficia la producción de ulceraciones provocando asi diarrea sanguinolenta. Los síntomas que ocasionan las cepas ECEI aparecen entre las 8 y 24 horas posteriores a la ingestión (escalofrios, malestar, dolor de cabeza,mialgia, fiebre, retortijones abdominales y diarrea profusas sanguinolentas. La enfermedad puede durar dias o semanas.

• Cepas E. coli enteropatogenas (ECEP) : Los niños son los mas afectados, la enfermedad es mas frecuente en paises subdesarrollados. Los síntomas se inician entre 7 y 32 horas que siguen a la ingestión del germen(dolor abdominal, vomitos, fiebre, diarrea acuosa con abundante moco, pero sin sangre, esta dura entre 7 y 72 horas)
• Cepas E. coli enterohemorragicas (ECEH) (0157:H7): Son las mas importantes el tipo predominante en estas cepas es el serovar 0157:H7 y la toxina es la verotoxina. Su efecto es: colitis hemorragica que se genera una vez ingerida la carne picada poco cocinada.

Las manifestaciones generadas una vez ingerido el germen son: colitis hemorragica(dolor abdominal, vomitos, diarrea acuosa sanguinolenta y poca o ninguna fiebre; aparecen a los 3 o 9 dias de la ingestión del alimento contaminado y dura 2-9 dias), síndrome hemolitico uremico(diarrea sanguinolenta y , generalmente en niños fallo renal agudo que puede terminar en muerte, no hay fiebre), purpura trombotica , trombocitopenica ( no hay fiebre, existe hemorragia gastrointestinal y puede ser afectado el sistema nervioso central, se pueden formar coagulos en el cerebro con peligro de muerte) La carne poco cocinada y sobre todo la picada son las mas involucradas.

1. Material

2. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm.

   Gradilla.

   Asa de cultivo.

   Baño maria.

   Placas de Petri de 90 mm.

   Pipetas de 1 ml.

   Estufa de cultivo.

3. Medio de cultivo y reactivos

Caldo lactosado biliado verde brillante

Agar Levine

Composición: Peptona (10 g), lactosa (10 g), fosfato dipotasico (2 g), eosina (0.40 g), azul de metileno (0.065 g), agar (15 g) y agua destilada (1000 ml).

Disolver por calentamiento, ajustar el pH a 7.1, distribuir y esterilizar en autoclave a 121º C durante 15 minutos. Atemperar para preparar placas de petri.

Agua de tristona

Reactivo de Kovacs

Composición: Paradimetil-amino-benzaldehido (5 g), alcohol amilico (75 ml), HCL (25 ml).

Se disuelve el aldehido en alcohol a baño maria a 60º C. Se deja enfriar y añadir el acido gota a gota. El liquido amarillo obtenido debe conservarse en un frasco topacio, lejos de la luz y en frigorífico.

Plate Count Agar. PCA

Medio de Clark y Lubs (MR-VP)

Composicon: Peptona (7 g), glucosa (5 g), fosfato dipotásico (5 g), agua destilada (1000 ml).

Disolver por calentamiento, llevar pH a 6.9, distribuir en los tubos a razon de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 º C durante 15 minutos.

Reactivo para la prueba de rojo de metilo

Composición: Alcohol 90º (65 ml), agua destilada (35 ml), rojo de metilo (0.20 g).

Se disuelve el colorante en el alcohol y se completa con agua destilada

Reactivos para la investigación de acetil-metil-carbinol

Composición: Reactivo A: Alfa-naftol (40 g), alcohol absoluto (100 ml). La solucion se conserva en oscuridad. Reactivo B: Hidroxido potasico (40 g), agua destilada (100 ml), creatinina.

Agar citrato de simmons

Composición: Sulfato magnesico(0.20g), Dihidrogeno fosfato amonico (0.20g), Fosfato sodico amonico (0.80g), citrato sodico (2g), cloruro sodico (5g), azul de bromotimol (0.08g), agar (15g), agua destilada (1.000 ml)

Disolver por calentamiento, hasta ebullición, llevar a ph 7, distribuir en tubos a raiz de 7 ml , esterilizar en autoclave a 121º C durante 15 minutos, luego dejar solidificar con una inclinación que de 4-5 cm de superficie y un fondo de 2-3 cm.

Caldo laurel sulfato (MUG):

Composición: Triptosa (20g), Lactosa (5g), Cloruro sodico (5g), lauril-sulfato sodico (0.10g), hidrogeno-fosfato dipotasico (2.75g), hidrogeno-fosfato potasico (2.75g), L triptofano (1g), 4-metil-umbiferil –D-glucuronico (0.10g), agua destilada (1.000 ml).

Disolver por calentamiento, llevar ph a 7,1 ditribuir en tubos con campana de Durham a razon de 10 ml, esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

Técnica

Para la investigación y recuento de E.coli se parte de los resultados obtenidas en la investigación de enterobacteriaceae lactosa-positivas (coniformes), de acuerdo con los siguientes pasos:

Con asa de siembra se subcultivan todos los tubos positivos que se han detectado en la investigación de enterobacteriaceae lactosa-positivas,a otros que contengan 10 ml de caldo lactosado verde brillante con campana de Dirham. Incubar los tubos en baño maria regulando a 44,5 +/- 0,5ºC con lectura a las 24 y 48 horas.

Para su confirmacion a partir de los tubos positivos, se hacen siembras sobre agar levine, para obtener asi colonias ailadas fácilmente identificables, incubar a 44,5 +/- 1ºC con lecturas a las 24 y 48 horas.

Estas colonias en agar levine se manifiestan como planas o ligeramente cocavas, con centros oscuros, casi negros y con luz reflejada se puede observar un brillo metalico verdoso, que puede o no manifestarse.

Para la producción indol se siembran 1-2 colonias de cada placa en tubos TW, se incuban a baño maria a 44,5ºC durante 24 horas, luego se agregan 0,5 ml del reactivo de Kovacs.

Si el resultado es positivo, se presenta un anillo rojo bermellón en la superficie del medio. Un resultado negativo da como resultado el mismo anillo pero de olor amarillo.

La E.coli al desaminar e hidrolizar el triptofano del medio, produce indol que se comprueba con el añadido del reactivo de Kovacs.

Otras pruebas de confirmación:

Con las pruebas anteriores en el mayor de los casos es suficiente, pero existen otras como las IMVC, previa purificación de las colonias en agar nutritivo PCA.

I = indol

M = rojo de metilo

V = Voges Proskauer

C = citrato

Para llevar a cabo las pruebas M y V se siembran 2 tubos de medio Clark y Lubs por cada colonia que haya que identificar, incubar a 37ºC durante 4 dias .

• Reaccion del rojo de metilo

A uno de los tubos que contienen el cultivo sobre el medio de Clark y Lubs, se añaden 1-2 gotas del reactivo rojo de metilo. Si es positivo se produce una coloracion rojay si es negativo el color es amarillo.

• Prueba de Voges Proskauer

Al cultivo obtenido en el otro tubo del medio Clark y Lubs, se añaden 0,6 ml de reactivo A y 0,2 ml del reactivo B, agitar e intensificar la muestra con cristales de creatinina, hacer lectura luego entre los 15 minutos y 4 horas posteriores. Si es positivo se manifiesta por un color rojo.

• Asimilación del citrato

A partir de un cultivo reciente de PCA de la colonia de estudio, se siembra una estria unica sobre la superficie inclinada de agar citrato de simmons, se incuba a 37ºC durante 24 horas. La reaccion es positiva cuando hay crecimiento en el medio.

La E.coli responde a las pruebas IMVC de la siguiente manera:

I = positivo, a veces negativo.

M = positivo.

V = negativo.

C = negativo.

Conservación: La conservación de la carne, así como de casi todos los alimentos perecederos, se lleva a cabo por una combinación de métodos. El hecho de que la mayoría de la carnes constituyan excelentes medios de cultivos con humedad abundante, pH casi neutro y abundancia de nutrientes, unido a la circunstancia de que pueden encontrarse algunos organismos en los ganglios linfáticos, huesos y músculos ya que la contaminación por organismos alterantes es casi inevitable. Hace que su conservación sea más difícil que la de la mayoría de los alimentos. Empleo del calor: de acuerdo con el tratamiento térmico empleado, las carnes enlatadas industrialmente se dividen en dos grupos (1) carnes que son tratadas térmicamente con miras de convertir el contenido de la lata en estéril, al menos comercialmente estéril’. Y son latas que no requieren almacenamiento especial, y (2) carnes que reciben un tratamiento térmico suficiente para destruir los gérmenes causantes de alteración, pero que deben conservarse refrigeradas para evitar su alteración.

Los jamones enlatados y los fiambres de carnes reciben el último tratamiento. Las carnes del grupo 1 están enlatadas y son auto conservables, mientras que las del grupo dos no lo son y se conservan en refrigeración. Las carnes curadas y enlatadas deben su estabilidad microbiana al tratamiento térmico y a la adición de diversas sales de curado. El tratamiento térmico de éstas es de 98ºC —normalmente el tamaño del envase es inferior a 1 libra (453,59 g) — las carnes curadas y no auto conservables se envasan en recipientes de más de 22 libras (9,97 kg) y se tratan a temperaturas de 65°C. Normas y criterios:

Para que el muestreo sea lo mas representativo posible del alimento y para obtener resultados fiables, es necesario que el producto, en el momento del análisis, tenga las mismas características microbiológicas que tenia inicialmente. Por esta razón son necesarias las siguientes pautas.

Material utilizado en el muestreo

• Envases para la toma de muestras: estos deberán estar perfectamente limpios, secos y estériles. El tamaño de los mismos se elige de acuerdo a la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación que puedan adquirir una vez ya esterilizados. Se pueden utilizar: envases de vidrio de boca ancha, envases de plástico esterilizable, bolsas de plástico esterilizable, envases metálicos.
• Instrumentos para la apertura de envases: Tijeras, pinzas, cuchillos, sondas, taladros, cucharas, espátulas, sierras y otros (todos estériles).
• Etiquetas y material para marcar: Etiquetas de cartulina, etiquetas adhesivas de papel, lápiz graso, rotuladores, bolígrafos.
• Equipo de esterilización: Autoclave pequeño, horno, mechero, quemador de gas o estufa eléctrica.
• Refrigeración: Neveras portátiles, cajas de plástico aislantes para muestras refrigeradas y congeladas, congelador portátil.
• Liquido desinfectante: Alcohol etílico al 70%, algodón hidrófilo.
• Control de temperatura: Termómetro que marque entre –20 ºC y +100 ºC.
• Esterilización: Para la toma de muestras, en análisis microbiológicos, todo el material a utilizar debe ser estéril, es necesario que hallan sido sometidos previamente a los métodos habituales de esterilización por calor seco (horno) o calor húmedo (autoclave).

Condiciones para el muestreo:

Para obtener una muestra representativa de lo que posteriormente se va a analizar en el laboratorio, se deben cumplir ciertas condiciones:

• El analista debe conocer perfectamente la finalidad e importancia del muestreo, y deberá estar debidamente autorizado para realizar su labor. Cuanto mejor sea la toma de muestras, mejores serán los resultados obtenidos.
• Las unidades de muestra se tomaran, posiblemente, en sus envases originales en los que se enviaran al laboratorio.
• Las muestras que se deben recoger son únicas, circunstancia frecuente cuando se trata de alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria.
• El muestreo sobre lotes, partidas, remesas, etc se puede hacer aleatoriamente aplicando la tabla de números al azar sobre un número de muestras preestablecido.
• Si se trata de cajas con paquetes, éstas se escogen al azar y se separan los paquetes.
• Cuando los envases son muy grandes, se toma asépticamente una muestra representativa y se pasan a envases estériles mas chicos.
• Los alimentos a granel se maestrean tomando porciones de distintas zonas con material estéril y pasándolas a envases esterilizados.
• Si el producto por maestrear tiene salida por un conducto se desechan las primeras porciones antes de tomar la muestra.
• Si son productos líquidos se agitaran en su envase y se pasaran asépticamente a recipientes estériles.
• Si la toma es de agua de una canilla, esta se desinfecta con alcohol, luego se abre y se desecha el agua que sale en primeras porciones. Se cierra de nuevo y se flamea la gota que queda pendiente hasta que emita vapores. A continuación se vuelve a abrir el grifo dejando fluir agua durante uno o dos minutos antes de recoger la muestra en un recipiente estéril asépticamente cerrado.
• Para productos sólidos se tomaran las muestras en varias zonas con sacabocados taladros, sierras, etc. y se guardaran recipientes estériles.
• Es conveniente anotar la temperatura de almacenamiento del producto e incluso su propia temperatura para llevar al laboratorio dichos datos.

Agüero Florencia,

Amigo Lucia,

Corbalán Roque