Estudio de los efectos neurotóxicos del veneno de la serpiente micrurus mipartitus (Familia: ELAPIDAE) (página 2)

Todas las especies de la familia elapidae son proteroglifas, es decir con un maxilar superior alargado y en su extremo anterior un colmillo pequeño, curvo y dirigido hacia atrás perforado interiormente y comunicado con la glándula productora de veneno, esta familia posee los venenos más tóxicos de las serpientes terrestres.

A. COLMILLOS PROTEOGLIFOS.

B. GLÁNDULA VENENOSA

C. CONDUCTO DE VENENO EN COLMILLO

Fuente: A, C Seminario Ofidismo. Estudiantes Veterinaria. Universidad del Tolima.

B, Biblioteca de Consulta Microsoft ® Encarta ® 2005.

Los elapidos están representados en América por 3 géneros: micrurus, leptomicrurus y micruroides. Las especies que componen el genero micrurus (cola corta) en un numero mayor de 50 son las corales, venenosas o verdaderas llamadas también coralillas o gargantillas, en Colombia se han descrito 28 especies diferentes.

La Micrurus mipartitus es una serpiente de una longitud promedio de 80 cm., pero puede alcanzar un poco mas de un metro. El ojo es pequeño, puntiforme y la pupila vertical semieliptica. Tiene anillos negros separados por blancos o amarillos mas delgados, pero el segundo de la cabeza y los tres o cinco últimos, son rojos brillantes. Posee 15 hileras de escamas dorsales y carece de escama loreal en general son de vida nocturna y subterránea se alimentan de caecilidos, lagartos y otras serpientes. Son ovíparas, se hallan distribuidas en centro América y norte de Suramérica, en Colombia es probablemente las mas abundante en la cordillera de los andes encontrándose ampliamente distribuida a un altura aproximada de 1800 metros sobre el nivel del mar, es común en zonas productoras de café. [2]

Por su alto poder toxico y por la distribución geográfica en la zona que habita el mayor porcentaje de la población colombiana, es quizás, la más importante de nuestras corales venenosas, el veneno tiene una acción neurotóxica con manifestaciones paralíticas del tipo flácido, la cantidad promedio del veneno producido es de 2,4-6,7 mg. El 2,09% de la población Colombiana se ha visto afectada en accidentes con Micrurus.

4. VENENO NEUROTÓXICO DE LA M. mipartitus

La neurotoxicidad es un término que hace referencia a aquellas alteraciones funcionales, estructurales y bioquímicas producidas en el Sistema Nervioso (SN) y que conllevan a la manifestación de diferentes clases de efectos adversos como consecuencia de una exposición a un producto químico. Un efecto adverso implica un cambio que produce una desregulación o alteración del SN. La naturaleza de dicho cambio puede ser neuroquímica, morfológica, o relacionada con la conducta y puede manifestarse transitoria o permanentemente. [9]

No todas las neurotoxinas tienen el mismo sitio ni modo de acción o producen similares efectos clínicos. Las neurotoxinas presentes en los venenos de serpientes actúan sobre distintas estructuras, y de allí que originan distintos cuadros clínicos y patológicos.

Se conoce que los componentes principales del veneno de la M. mipartitus contiene abundantes alpha y beta-neurotoxinas pre-sinápticas de bajo peso molecular, y con enzimas prácticamente ausentes, llamadas dendrotoxinas, polipéptidos básicos de cadena simple con 57-60 residuos de aminoácidos, unidos por 3 puentes bisulfuro,que impiden la conducción de los impulsos nerviosos por bloqueo de canales de potasio en la membrana del axón terminal, causando una sobreliberación de acetilcolina, produciendo estimulación inicial y luego bloqueo, generando una parálisis fláccida.[10] . La dosis letal media (DL50) del veneno de la serpiente M. mipartitus aplicadas a un ratón es de 9 µg.

5. MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS NEUROTOXINAS

De acuerdo al sitio de acción las neurotoxinas pueden ser pre o post sinápticas.

Las Neurotoxinas presinápticas de la unión neuromuscular, afectan el axón Terminal, produciendo ruptura de vesículas sinápticas, con una sobreliberación inicial de acetilcolina provocando así un cese súbito en la descarga de la misma, y bloqueando completamente la transmisión neuromuscular. Esto causa parálisis fláccida de los músculos afectados. Sin embargo, el proceso no es instantáneo. La neurotoxina presináptica debe localizar la unión neuromotora, unirse a la membrana del axon terminal, y dañar esta membrana.

Es improbable la aparición de la parálisis presináptica en menos de 1-2 horas posteriores a la mordedura de la serpiente. Normalmente se ve primero los rasgos clínicos de parálisis temprana en los nervios craneales, con ptosis (caída de los párpados superiores) como primera señal. Debido a que las neurotoxinas presinápticas causan daño al axon terminal, ellas son pobremente sensibles a la terapia con el antiveneno. Así, una vez que la parálisis fláccida severa se establece con envolvimiento respiratorio, el antiveneno se muestra ineficaz para invertir la parálisis. [10]

Las neurotoxinas presinápticas se diferencian de las neurotoxinas postsinápticas ya que estas últimas actúan sobre la placa neuromotora y son más comunes que las toxinas presinápticas, además son menos potentes, pero más rápidas en actividad, y potencialmente más letales.

Estas neurotoxinas se unen al receptor proteico de acetilcolina o a sus adyacencias en el extremo terminal de la placa del lado del músculo, bloqueando así la señal que llega al músculo, produciendo una parálisis fláccida. Debido a que ellas pueden actuar tan pronto como alcanzan la placa neuromotora, pueden causar parálisis más rápido que las presinápticas. Como estas toxinas se hallan expuestas en la superficie celular, en el compartimiento extracelular, extravascular, ellas son accesibles a los antivenenos. Así, las parálisis postsinápticas pueden revertirse con el antiveneno.

6. CUADRO CLÍNICO DE ENVENENAMIENTO POR M. MIPARTITUS

Los accidentes elapidicos corresponde al 3% de los accidentes registrados en Colombia. La causa de muerte por este tipo de envenenamiento es la insuficiencia respiratoria. [4]

Fuente: Seminario Ofidismo. Estudiantes Veterinaria. Universidad del Tolima.

Los síntomas pueden surgir precozmente, en menos de una hora de la mordida. Se debe vigilar al paciente mínimo por 24 horas, por si hay retardo en la aparición de los signos y síntomas.

MANIFESTACIONES LOCALES: hay dolor discreto, generalmente acompañado de parestesias con tendencia a progresión próxima.

MANIFESTACIONES SISTEMICAS: inicialmente pueden presentar vomito; Posteriormente puede surgir un cuadro de flacidez muscular progresiva (fig. C), llegando a ptosis palpebral (fig. A), oftalmoplejia (fig. B) y una presencia de facies mialgicas por las "neurotoxinas". Asociado a lo anterior puede haber dificultades para mantener la posición erecta, mialgia localizada o generalizada y dificultad para deglutir por la parálisis del velo del palatino. La parálisis muscular puede progresar y afectar los músculos respiratorios que llevan a disnea y en el peor de los casos paro respiratorio. [12]

CLASIFICACIÓN: la parálisis fláccida de los músculos respiratorios comprometen la ventilación, pudiendo evolucionar a parálisis respiratoria.

Estos casos deben ser considerados como potencialmente graves por el riesgo de insuficiencia respiratoria.

A. Ptosis palpebral

B. Oftalmoplejia

C. Flacidez muscular

Fuente: fig. A. B. C. Seminario Ofidismo. Estudiantes Veterinaria. Universidad del Tolima.

7. IMPORTANCIA DE LA RATA COMO MODELO EXPERIMENTAL EN ESTUDIOS NEUROTÓXICOS.

La experimentación animal se define como una actividad que tiene como misión evidenciar y aclarar fenómenos biológicos sobre especies animales determinadas, el animal de experimentación es una de las piezas fundamentales en la biomedicina, tanto en los proyectos de investigación como en la pruebas diagnosticas y en los controles de los productos farmacológicos.

En la significación de la experimentación animal existen dos ideas básicas.

La primera es que la interpretación de los resultados y la extrapolación de estos de una especie a otra dependen del modelo experimental utilizado; esta es la noción de competencia o actuación, es decir, de qué fenómeno se trato y como lo podemos explicar. La segunda idea es que no existe un modelo perfectamente extrapolable al hombre, pero puede haber una afinidad de modelos experimentales, cuyas respuestas, fragmentarias, al converger, incrementen la significación biológica del fenómeno observado. En este sentido, el modelo animal experimental debe reproducir un efecto proveniente del sujeto original, poseer una estructura, una lógica propia y realizara actos determinados.

La rata tiene aproximadamente cien años de haber sido domesticada, lo cual es relativamente poco tiempo si la comparamos con otras especies animales. La domesticación es una forma de evolución. En el caso de la rata de laboratorio, los cambios ocurren en el tamaño y el color así como en su comportamiento, por ejemplo en la disminución de la agresividad.

A diferencia de lo que sucede en la vida silvestre, donde los individuos más agresivos y territoriales son los que copulan con las hembras, en la rata de laboratorio se busca seleccionar a los individuos menos agresivos para su reproducción, aun así, conserva cierta agresividad que puede variar de una cepa a otra. Otros instintos se mantienen prácticamente inalterados.

7.1. RATA Rattus norvegicus. CEPA WISTAR

Para efecto de estudios en el sistema nervioso, el modelo animal que se ajusta mejor a la experimentación es la rata de la cepa WISTAR, Rattus norvegicus criada en el laboratorio, gracias a sus características biológicas tales como el tamaño de los individuos y su reproducción constante a lo largo de todo el año; esto último redunda en el abasto, así como en la reducción del número de individuos usados en investigación y de las variables en los resultados obtenidos, además la rata reacciona fácilmente ante cosas o situaciones nuevas y su docilidad permite una fácil manipulación. Por otra parte, el bienestar que le proporciona las condiciones sanitarias de un laboratorio tiene como consecuencia la reducción del desasosiego (estrés) diminuyendo así los errores en los resultados de la investigación.

La cepa WISTAR es original del Instituto Wistar en el Reino Unido en 1947. Luego adquirida por laboratorio Charles River (CRL). Esta colonia particular se seleccionó debido a una incidencia baja de hidronefrosis, que es el resultado de la obstrucción del flujo de orina en la vía excretora, causada casi siempre por anomalías congénitas de los uréteres o de una hipertrofia prostática.

Orden: Rodentia

Familia: Muridae

Nombre científico: Rattus norvegicus (Berkenhout)

Nombre Común: Rata de Alcantarillas

La nomenclatura Crl: (WI).

Morfología Adultos:

• Longitud: entre 35 y 45 cm.
• Longitud de la cabeza y cuerpo: 186-240 mm.
• Longitud de la cola: 122-215 mm.
• Longitud del pie: 30-45 mm.
• Longitud de la oreja 15-20 mm.
• Peso: 195-485 g.
• Apariencia general: larga y robusta.
• Tamaño adulto (peso g): 200–500 g.
• Nariz: chata.
• Orejas: Las orejas son cortas y ligeramente peludas.
• Ojos: pequeños.
• Cola: obscura arriba, pálida por debajo.
• Piel: café mezclado con negro, vientre gris a amarillo, blanco peludo.
• Excremento: en forma de cápsula, de 2 cm x 1 cm.

De color blanco el albino. El pelaje es largo y áspero. El hocico es embotado, con vibrisas cortas y gruesas. La cola es más corta que la longitud del cuerpo y la cabeza, es robusta, moderadamente bicolor y es tenuemente cubierta con pelos ásperos. Las patas son largas y gruesas; la parte superior de ellas es blancuzca.

La hembra tiene 5-6 pares de mamas ubicadas a lo largo de la parte ventral del cuerpo. La posición de las crías al momento de nacer es de cabeza.

No presentan vesícula biliar, el pulmón derecho presenta cuatro lóbulos, mientras

que el izquierdo sólo uno. Esta especie puede alcanzar gran tamaño algunos ejemplares llegan a 1/2 kg. de peso.

Órganos de los Sentidos: Los roedores hacen uso especial de sus sentidos para moverse en busca de alimento y escapar del peligro, lo cual es importante para la reacción a estímulos aplicados en la investigación.

• Visión: Este sentido es el menos desarrollado e importante en la vida de la rata, tiene una pobre agudeza visual entre 1 a 1.5 m. Y no distinguen los colores.
• Oído: El sentido del oído es agudo: pueden oír dentro del aspecto de ultrasonido a 50 Khz. o más (los humanos oyen en el rango de 20 Khz.). Entre ellos emiten unos sonidos para avisarse de los posibles peligros.
• Olfato: El olor es un sentido importante en los roedores comensales. Las ratas marcan objetivos con la orina para reconocer su colonia. Los roedores comensales no presentan aversión al olor del hombre.
• Gusto: Excelente.
• Tacto: Excelente.

Características Reproductivas:

• Período de gestación: 3 semanas.
• Número de Camadas al Año: 3 – 6.
• Período desde el nacimiento hasta la madurez sexual: 12 semanas.
• Potencial de reproducción a partir de una pareja por año: 200 individuos.

La edad para empezar a aparearse está entre los 2 y 3 meses. Las camadas nacen alrededor de 22 días después del apareamiento (periodo de gestación), una rata hembra puede producir 10-12 camadas por año. Adquiere la madurez sexual de los 3 a los 5 meses, el período de gestación es de 22 días prolongándose cuando se presentan la lactancia y la gestación al mismo tiempo, en promedio tiene de 6 a 12 crías por parto y aunada a su alta fecundidad es capaz de criar de 6 a 10 camadas por año. La proporción de hembras y machos por camada es de 4:4 y la ganancia de peso corporal desde el nacimiento hasta el deteste es de 1.31 gramos/ día y desde el deteste hasta la sexta semana es de 4.3 gramos/día. La lactancia y la gestación pueden ocurrir simultáneamente ya que la hembra puede ovillar poco tiempo después del parto (48 hrs.) Su promedio de vida es de un año.

Alimentación:

? Preferencias alimenticias: Son omnívoros y tienen preferencia por lo fresco (22- 30 g / día). Su alimentación la constituye carne reseca, vegetales, cereales y frutas.

? Requerimientos de líquidos: 15-30 ml/día.

Etología: Son desconfiados. Reaccionan fácilmente ante cosas o situaciones nuevas. Tienen mucha agilidad para escalar y nadar.

La actividad es generalmente nocturna, ya que las ratas se orientan bien en la oscuridad. La rata común suele seguir rutas previamente exploradas y aprendidas. Si las condiciones les son favorables, es decir, si disponen de refugios, alimentos y humedad suficiente, estos roedores se reproducen rápidamente

8. TECNOLOGÍAS PARA EL ESTUDIO NEUROLÓGICO EN MODELOS EXPERIMENTALES.

Órganos cuya función esta estrechamente vinculada con el sistema nervioso, como la vista o el oído, pueden también padecer alteraciones que ponen de manifiesto afecciones neurológicas. Desde ese punto de vista, los estudios neurofisiológicos están destinados a estudiar la función de estos órganos o las vías de conducción, que pueden poner de manifiesto la existencia de procesos, afecciones neurológicas o alteraciones de la función sensorial o motora.

Los procedimientos que más se utilizan en la práctica son:

*Micro electroencefalografía: El procedimiento se lleva a cabo colocando sobre el cráneo 20 microelectrodos, que se adhieren Los microelectrodos están conectados con un amplificador, que envía señales cerebrales captadas por esos microelectrodos y que se registran en la pantalla de una computadora. El estudio dura aproximadamente 20 minutos y es muy importante que el individuo se halle con las más bajas condiciones de estrés posibles durante el procedimiento.

* Microelectromiografía: La microelectromiografía es una técnica que utiliza electrodos para investigar en forma directa la actividad eléctrica del músculo. Se realiza por medio de un microelectrodo de aguja concéntrica que se inserta en el músculo. A través de un amplificador, se pueden registrar los llamados potenciales de unidad motora durante la activación voluntaria. Se conoce con el nombre de potencial de unidad motora a la señal eléctrica generada por las fibras musculares inervadas por un mismo axón. El análisis de la duración y amplitud de un número de potenciales de unidad motora del músculo. Permite determinar si la debilidad muscular de un paciente depende de un trastorno primario del músculo o de una alteración neurogénica. En este último caso la lesión puede originarse en la motoneurona espinal, en los plexos o en los nervios periféricos. Para localizar el trastorno y determinarlo con precisión, resulta fundamental complementar el electromiograma con un estudio de velocidad de conducción de los nervios periféricos.

Además, la inserción del microelectrodo en el músculo se lleva a cabo para estudiar la actividad eléctrica durante el reposo muscular. En el músculo que ha perdido su inervación pueden observarse los llamados potenciales de denervación, cuyos elementos mas notables son las fibrilaciones y ondas agudas positivas.

* Velocidad de conducción de los nervios periféricos: La velocidad de conducción es un complemento capital de la microelectromiografía, pudiendo localizar la lesión en alguna de las estructuras que van desde la motoneurona espinal, hasta la unión neuromuscular. Es un estudio fundamental para diagnosticar atrapamientos de nervios periféricos o para diagnosticar, además polineuropatías periféricas. Por medio del mismo se puede determinar si la polineuropatía es motora, sensitiva o mixta, y si está afectada la vaina de mielina, el axón o ambas estructuras.

Permiten el análisis computarizado de las señales, el cálculo automático de la velocidad de conducción, y la comparación inmediata del valor obtenido con valores normales. *Estimulación Magnética Transcortical (PEM):

Este método permite estudiar las vías motoras descendentes del cerebro hacia los músculos periféricos

La Estimulación Magnética Transcortical permite excitar en forma transcraneana y relativamente indolora la corteza motora y, a través de la misma, generar impulsos descendentes hacia los músculos de los miembros. Esto permite hacer un estudio de la velocidad de conducción de las fibras motoras (haz piramidal) y por lo tanto tener acceso a la evaluación funcional de esas fibras.

* Ensayo de Citotoxicidad mediante la técnica del WST-1.

La técnica de citotoxicidad mediante el reactivo WST-1 (sales de tetrazolium/ formazan) permite medir de una forma directa la viabilidad celular frente a diferentes estímulos químicos (citotoxicidad), y de una manera indirecta, medir la proliferación celular.

Se trata de un ensayo colorimétrico, no radiactivo, de cuantificación espectrofotométrica que se basa en la degradación de las sales de tetrazolium (WST-1) a sales de formazan, mediante la acción de las deshidrogenadas mitocondriales, que se producen de forma natural cuando las células son viables. Esta técnica es sensible, rápida y sencilla.

En una cabina de flujo laminar y en condiciones de esterilidad (puntas amarillas

estériles), se aplica la molécula problema en los pocillos correspondientes de la placa del experimento de citotoxicidad. Se homogeniza el medio celular de la placa con movimientos rotatorios suaves a fin de que se pueda obtener una mezcla regular de la molécula en el medio de cultivo. Se incuba en la estufa de cultivos celulares (5% CO2, 95% aire, 90% humedad, 37°C) durante 30 minutos.

Luego de ello, se aplica el reactivo WST-1 en cada uno de los pocillos de la placa del experimento de citotoxicidad celular. Se homogeniza el medio celular a fin de mezclar el reactivo WST-1 en el medio de cultivo. Se vuelve a incubar durante 3:30 horas. La lectura de la placa se realiza mediante un lector epectrofotométrico con filtro de 450 nm y así se registra los resultados de lectura obtenidos.

9. BIBLIOGRAFÍA

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9. Regidor Braojos, Leandro. Solans Lampurlanés, Xavier. Neurotoxicidad: agentes neurotoxicos. Centro Nacional de Condiciones de Trabajo. Nota Técnica de Prevención. NTP 487.
10. Rodríguez-Acosta, Alexis. Los venenos y el síndrome de envenenamiento ofídico. Instituto de Medicina Tropical. Sección de Inmunoquímica. Universidad Central de Venezuela.
11. , Vargas-Rosso O, Gutierrez JM, Rochat H, Bougis PE. Characterization of alpha-neurotoxin and phospholipase A2 activities from Micrurus venoms. Determination of the amino acid sequence and receptor-binding ability of the major alpha-neurotoxin from Micrurus nigrocinctus nigrocinctus. Eur J Biochem. 1996 May 15;238(1):231-9
12. Seminario Ofidismo. Estudiantes Veterinaria. Universidad del Tolima. Ibagué 2005.

Elaborado por:

Luisa Fernanda González ¹

Tatiana Ortegón 2

Carlos Riaños 3.

Jonathan Sanchez 4

Estudiantes VI semestre de Biología. Facultad de Ciencias Básicas.

Universidad del Tolima.

Asesor:

Francis Liliana Turner.

Docente e investigadora en ciencia zoohumanas.

Universidad del Tolima.

Ibagué, Tolima. Colombia. 05/2006