Puesta en evidencia del virus diarrea viral bovina en bovinos clínicamente afectados (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestras: se trabajó con un total de 33 muestras, procedentes de animales que cursaban con cuadros clínicos sospechosos de ser causada por el VDVB. Cada muestra, constituida por uno o más trozos de tejidos (bazo, ganglios, hígado, pulmón, riñón, etc.), fue procesada, en forma separada para cada órgano, triturando y suspendiendo el tejido, al 2%, en medio de cultivo celular esencial mínimo Eagle (MEM) adicionado de 400 UI de penicilina, 400 mcg de estreptomicina y 4 mcg de micostatina por ml. Luego de centrifugar, a 3.000 x g por 10 minutos a 4°C, el sobrenadante se conservó a -70° C hasta el momento de ser inoculado en cultivos celulares. Del animal vivo se empleó como inóculo el suero sanguíneo.

Aislamiento viral: para realizar el aislamiento del VDVB se emplearon cultivos celulares primarios de pulmón fetal bovino (PFB), con no más de cuatro pasajes, y comprobados de estar libres de contaminación por el VDVB -prueba de inmunoperoxidasa indirecta (IPI) (Kit IPEX-BVD, Central Veterinary Laboratory. Weybridge. Catálogo Nº 0258108). Las células se dispusieron en microplacas de fondo plano de 96 pocillos (NUNC), y una vez establecida la monocapa se sembraron 6 pocillos, por cada inóculo, con volúmenes de 50 ul. Después de un período de absorción de 90 minutos a 25° C, se adicionaron 50 ul de medio de cultivo MEM con antibióticos y un 2% de suero fetal bovino (SFB), certificado como libre de contaminación microbiana y viral y desprovisto de anticuerpos para el VDVB. Los cultivos se incubaron a 37º C por un período de 5 días con observaciones microscópicas diarias. Al 5º día se cosechó el medio de cultivo y las células se fijaron con acetona, al 10% en PBS (0.01 M pH 7.6) para detectar la presencia de antígenos del VDVB mediante la prueba de IPI. Paralelamente, en cada microplaca, se controló la ausencia de antígeno viral en las células empleadas libres de inóculo y la presencia de antígeno viral en células inoculadas con un aislado de laboratorio NCP. La detección de antígeno viral en al menos uno de los órganos procesados de un mismo animal fue suficiente para considerar al animal como positivo al VDVB.

Identificación del biotipo de los aislados: para conocer el biotipo de los aislados, todos los medios de cultivos cosechados desde los cultivos celulares en que se detectó la presencia de antígenos del VDVB fueron reinoculados por segunda y tercera vez en las células de PFB, procediéndose de forma semejante a la señalada anteriormente. Después del tercer pasaje se repitió la prueba de IPI e independientemente de este resultado se aplicó la prueba de inmunofluorescencia directa, para lo cual se sembraron los inóculos cosechados del tercer pasaje, por cuarta vez en células de PFB dispuestas en tubos Leighton. Después de un período de incubación de 48 horas, las laminillas se tiñeron con un conjugado fluorescente policlonal anti-VDVB, cepa Singer, elaborado en conejos, y se observaron en un microscopio de fluorescencia Leitz SM-LUX, iluminado por una lámpara de mercurio de 50 W.

Para detectar la presencia de otros virus en las muestras, como parainfluenza 3 (PI3) y virus herpes bovino 1 (VHB 1), agentes causales de para-influenza 3 y de la rinotraqueítis infecciosa bovina (RIB), las muestras se inocularon, de forma semejante a la descrita para el VDVB, en la línea celular MDBK. Después de un período de incubación de 5 días a 37° C, con observación diaria, las células se lisaron y la suspensión fue reinoculada en células MDBK. Este proceso se repitió por tres veces. Frente a la aparición de efecto citopático, para identificar el aislado, se recurrió a la prueba de seroneutralización (índice neutralizante) empleando antisueros de referencia para PI3 y RIB.

RESULTADOS

De los 33 animales en estudio, en 23 de ellos se detectó la presencia del VDVB en el primer pasaje del inóculo en cultivos celulares de PFB, lo que corresponde a un 69.7%. De éstos, 14 correspondían a fetos abortados; uno a un nonato; uno a un mortinato; tres a vacas: una madre de un mortinato, una con síndrome de aborto y una muerta; dos a novillos muertos; dos a terneros: uno con síntomas neurológicos, sacrificado, y uno muerto con síndrome respiratorio (cuadro 1).

Todos los aislados de VDVB fueron de biotipo NCP al menos hasta el tercer pasaje en células de PFB.

Se constató que de los 23 animales positivos al VDVB, en el primer pasaje, sólo 17 mantuvieron su positividad a prueba de IPI, en el tercer pasaje, resultando negativas las muestras 10, 11, 12, 13, 14 y 19; y 19 fueron positivos a prueba de IFD en el cuarto pasaje, resultando como negativas las muestras 13, 14, 17 y 22 (cuadro 1).

En 13 muestras en que se contó con más de un órgano para preparar el inóculo viral los resultados demuestran que en 10 se aisló y detectó la presencia de antígenos virales en el primer pasaje, desde todos los órganos procesados. En la muestra 8 se detectó el virus en pulmón y no en hígado, resultado que se mantuvo para el tercer y cuarto pasaje; en la muestra 9 se detectó el virus en hígado y no en pulmón, pero en el cuarto pasaje el inóculo de pulmón dio fluorescencia positiva; y la muestra 19 fue, en su primer pasaje, positiva en bazo y negativa en riñón por IPI, pero en el cuarto pasaje los inóculos de ambos órganos mostraron positividad a IFD (cuadro 1).

En el tercer pasaje, 10 órganos que fueron positivos en el primer pasaje a IPI se tornaron negativos a la misma prueba: pulmones de las muestras 5 y 12, hígados de las muestras 7, 10, 12, 13 y 14; "pool" de órganos de la muestra 11; y bazos de las muestras 19 y 23 (cuadro 1).

Cuando se aplicó la prueba de IFD, en el cuarto pasaje, de los 43 positivos por IPI al primer pasaje, 32 mantuvieron la condición de positividad a IFD. La diferencia estuvo dada por los órganos: hígados de las muestras 6, 7, 9, 13, 14, 15; cornete nasal de la muestra 16; suero de la muestra 17; cerebro y pool de órganos de la muestra 22 y bazo de la muestra 23, que resultaron negativos a la prueba de IFD (cuadro 1).

El aislamiento viral en la línea celular MDBK, procedente de seis fetos abortados, demostró la presencia de células globosas y refringentes en el primer pasaje, efecto que se incrementó hasta el tercer pasaje afectando el 100% de la monocapa celular en todas las muestras inoculadas (hígado, pulmón y riñón). El efecto citopático fue neutralizado por un suero de referencia anti-VHB-1, considerándose a los aislados como virus causantes de la RIB. En ninguno de estos fetos se detectó la presencia del VDVB.

Los 4 animales que resultaron negativos al aislamiento viral correspondieron a un mortinato y a tres fetos abortados.

DISCUSIÓN

La presencia del VDVB en 23 de 33 animales sospechosos de estar siendo afectados por algunas de las manifestaciones patológicas provocadas por el VDVB, en ausencia de otros agentes virales citopatogénicos, hace suponer que el VDVB podría estar participando en la presentación de estas patologías, como agente causal o predisponente, pero dados los múltiples factores que pueden estar incidiendo, este supuesto es discutible ya que estudios señalan que es muy difícil asociar la presencia del virus, especialmente con aborto (Duffell y Harkness, 1985; Jerrett y col., 1984; Thorsen y Kahrs, 1984) y en otros casos ha sido imposible demostrar virus o anticuerpos para el VDVB, estando éste fuertemente implicado por evidencias circunstanciales (Harkness y col., 1988).

Todos los aislados fueron de biotipo NCP, al menos hasta el tercer pasaje del inóculo en cultivos celulares de PFB, situación que era esperada ya que las cepas CP se aíslan mayoritariamente desde animales que cursan el cuadro de EM (Brownlie y col., 1984; Radostits y Littlejohns, 1988; Reinhardt y col., 1986; Baker, 1987; Clarke y col., 1987; Shimizu y col., 1989), no obstante señalarse que aislados CP y NCP pueden encontrarse en el diagnóstico de rutina de DVB (Barber y col., 1985) y haberse aislado cepas CP desde fetos abortados, muerte perinatal y DVB aguda (Bezek, 1995; Rweyemamu y col., 1990; Woodard, 1994).

Cuadro 1. Aislados de campo del virus diarrea viral bovina identificados por pruebas de inmunoperoxidasa indirecta (IPI) e inmunofluorescencia directa (IFD) según patología y órgano procesado. Identification of bovine viral diarrhoea virus from isolates by indirect immunoperoxidase and direct immunofluorescence staining.

*N° de pasaje de los aislados en células de pulmón bovino. **Intensidad de la reacción en porcentaje de células reaccionantes: + < 25%; ++ = 25 a 50%; +++ = 50 a 75%; ++++ 75%.

La diferencia de resultados en el diagnóstico, entre el primer y tercer pasaje, se presentó en seis muestras y éstas correspondían, mayoritariamente, a muestras en que se disponía de un solo órgano para hacer el aislamiento viral. Este antecedente sugiere la necesidad de procesar más de un tejido en procedimientos de aislamiento viral para obtener resultados consistentes. La falta de positividad, en el tercer pasaje, podría atribuirse a una pérdida de la infecciosidad de los aislados durante el período de conservación de las muestras, o a una menor capacidad de adaptación de los aislados a los cultivos celulares. Sin embargo, 2 órganos que aparecieron negativos a la IPI en el primer y tercer pasajes (pulmón de muestra 9 y riñón de muestra 19), se detectaron como positivas en un cuarto pasaje con la prueba de IFD y en este caso se pensaría que los niveles de antígenos en los primeros pasajes de los tejidos no eran suficientes para demostrar positividad, o bien en este caso la sensibilidad de la IPI fue menor a la IFD, no obstante, Meyling (1983) señala que la sensibilidad de ambas pruebas es equivalente cuando se trata de diagnosticar VDVB. De todas formas este hecho denota la necesidad de hacer a lo menos tres pasajes de los inóculos antes de considerar una muestra como negativa.

En base a estos resultados y considerando que de los 10 muestras que se consideraron como negativas en este estudio, en cinco se procesó un órgano; en cuatro, dos órganos y sólo en una cuatro órganos y, por otro lado, el hecho de que no se intentaron pasajes de los aislados negativos, pone en duda la franca negatividad de dichas muestras, situación que, de ser estos aislados positivos, redundaría en una mayor significancia de la posible participación del VDVB en problemas de la salud del bovino con particular atención en las pérdidas reproductivas.

Si bien con estos resultados no se pueden valorar las pruebas de IPI e IFD usadas en estos diagnósticos, es preciso señalar que ambas se complementan. Al respecto es necesario destacar que el "kit" de IPI contiene una mezcla de 4 anticuerpos monoclonales y el conjugado fluorescente está preparado a partir de un suero policlonal elaborado contra la cepa Singer del VDVB, situación que estaría dando la posibilidad de pesquisar algunos antígenos diferentes entre los aislados con las dos pruebas y algunas de las diferencias encontradas podrían atribuirse a este hecho. Al respecto, Deregt y col. (1994) recomiendan, para detectar antígenos virales, el empleo de un pool de anticuerpos monoclonales en lugar de suero antipoliclonal.

En las muestras 8, 9 y 19, en que se pesquisó la presencia de antígenos virales, sólo en uno de los dos órganos procesados podría deberse a que no existiría una distribución homogénea del virus en el organismo animal, lo que se apoyaría también por el hecho de que la intensidad de la IPI no fue pareja en los aislamientos de diferentes órganos procedentes de un mismo animal. Al respecto se señala que el virus se encuentra mayoritariamente en tejidos asociados con el sistema reticuloendotelial (Miller y Wilkie, 1979).

Se concluye que hubo una alta frecuencia de aislamiento del VDVB de biotipo NCP desde animales sospechos de estar afectados por el VDVB, a la vez que se sugiere procesar más de un órgano y realizar al menos tres pasajes en cultivos celulares para obtener resultados concluyentes, y se recomienda estudiar la real asociación entre la presencia del VDVB en los animales y su rol patógeno.

__________________________________ Financiamiento: Departamento Técnico de Investigación. Universidad de Chile, Proyecto A-3141.

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