- Antecedentes generales
- Efecto de extracto de plantas en el bloqueo de la adhesión fimbrial
- Bibliografía publicada
Las infecciones gastrointestinales constituyen un problema mundial. Anualmente se producen 1647 millones de casos de diarrea. En niños menores de un año el saldo asciende a 32 millones de muertes.
La enfermedad diarreica aguda (EDA) provoca el 80% de los casos. E. coli enterotoxigénico (ECET) es el microorganismo que con mayor frecuencia se asocia a esta etiología, cómo único agente, o acompañado de rotavirus, se ha aislado del 80 % de los pacientes de EDA.
Pese a que las diarreas agudas debidas a ECET se relacionan siempre a las condiciones higiénico-sanitarias deficientes de los países del tercer mundo, en los últimos años se han presentado en países como Japón y Estados Unidos. ECET constituye un problema semejante en la salud animal. Las pérdidas debidas a esta entidad en cerdos neonatos y jóvenes sobrepasan el millón de pesos anualmente en el país.
Las Infecciones del Tracto Urinario (ITU) también constituyen un problema de salud a escala mundial. Anualmente en Estados Unidos alrededor de siete millones de personas son atendidos con esta enfermedad y más de 100 000 pacientes son hospitalizados por pielonefritis aguda.
Las ITU constituyen la forma más común de las etiologías extraintestinales ocasionadas por E. coli y a su vez, este microorganismo es la principal causa de esta enfermedad.
El proceso de infección en las ITU tiene lugar a partir de un prerrequisito esencial que es la adhesión bacteriana a receptores específicos del uroepitelio. Sin adhesión no se produce la colonización, con las consecuencias que caracterizan a cada etiología en particular.
En las ITU producidas por E. coli, las bacterias se adhieren a células periuretrales y uroepiteliales mediante fimbrias, entre las que predomina el tipo P (E. coli P+), reportado en el 70% de las pielonefritis agudas. En el caso de las cepas asociadas a cuadros de EDA ocurre algo similar que posibilita, pese al peristaltismo intestinal, la colonización del intestino delgado. Los factores fibrilares expresados por ECET patógenas al humano se designan con la sigla CFA (Colonization Factor Antigen) y ya son varios los descritos (I-IV).
En bovinos diarreicos prevalecen ECET con fimbrias F5 (denominadas K99) y F41, que también se han reportado en ovejas con esta etiología.
Otras fimbrias son ATT25 (actualmente F17), CS31A y F165. En cerdos los cuadros de EDA más comunes tienen lugar durante la primera semana de vida y luego, en los días que suceden al destete. La fimbria más común en ambos casos es F4 (designada como K88) que tiene varios subtipos. Fimbrias de los tipos F5 y F6 (987P) y F41 se han reportado en diarreas de neonatos, en tanto que el tipo F42 se ha aislado de cerdos con diarreas post destete. Otros factores fibrilares presentes en ECET de cerdos diarreicos son PCF141 y CS1541.
Durante años la principal opción terapéutica frente a estas etiologías ha sido la antibioterapia. Su uso excesivo ha demostrado que no sólo afecta al patógeno, también puede influir negativamente en la microflora normal del organismo y, además, desencadena un problema muy serio, la resistencia microbiana.
Por todo lo expuesto, interferir el proceso de adhesión fimbrial pudiera considerarse como una posibilidad tentadora en la terapéutica de las ITU y las EDA, ya que se podrían tratar desde otra perspectiva en la que no necesariamente se precisa eliminar el microorganismo mediante los mecanismos clásicos (bactericidas o bacteriostáticos), tan sólo basta anular esta ventaja adaptativa. Al respecto se han ensayado diversas variantes: uso de concentraciones subletales de antibióticos; métodos inmunológicos; empleo de extractos de plantas medicinales, entre otras.
La utilización de antibióticos en concentraciones subletales, además de inhibir la expresión fimbrial (Barreto et al., 1994) reduce los efectos adversos presentes en las dosificaciones convencionales. Sin embargo, esta variante presenta una gran limitante, la de generar cepas antibiorresistentes en una frecuencia aún mayor que la inducida cuando los antimicrobianos se utilizan en su dosis normal.
Las variantes inmunológicas comprenden la confección de vacunas recombinantes y la utilización de inmunosueros polivalentes y anticuerpos monoclonales.
Esta línea enfoca el fenómeno de la adhesión fimbrial a nivel molecular, lo cual es una opción exclusiva de centros de investigación de alto desarrollo tecnológico. En este sentido, se ha trabajado en la elaboración de vacunas contra E. coli P+ para tratar las ITU. Este camino, muy investigado en los ´90, ha encontrado como inconvenientes la diversidad antigénica de esta familia de fimbrias y el hecho de que en las vías altas y bajas participen muy diversos atributos de adhesión, algunos incluso no fibrilares. En las pielonefritis, la fimbria P constituye el principal factor de colonización pero en las cistitis y bacteriurias su presentación es baja.
La prevención de brotes de EDA mediante el desarrollo de preparados vacunales contra ECET, ha sido un tema ampliamente investigado en la esfera veterinaria. Las vacunas elaboradas han sido muy diversas y comprenden biopreparados que contienen cepas atenuadas, extractos semipurificados de antígenos pertenecientes a cepas circulantes en una región dada, hasta las obtenidas mediante tecnología de ADN recombinante, como VACOLI, que inmuniza contra ECET (K88+ y K99+). Sin embargo, la amplia diversidad de fimbrias a expresar por ECET, de una parte, y la presión selectiva ejercida por estas vacunaciones, han conllevado al predominio de ECET con un fenotipo fimbrial no contemplado en el biopreparado vacunal. Otro elemento de interés es que la amplia diversidad de fimbrias contempladas en la serie de vacunas desarrolladas no se encuentran expresadas con igual frecuencia en las ECET de diferentes áreas endémicas. Así, las ECET 987P+ se presentan con mayor frecuencia en Estados Unidos que en Europa; en Cuba este comportamiento no ha sido estable.
En las ECET que afectan a humanos la diversidad fimbrial tal vez sea superior a la presente en las aisladas de animales. Su expresión está influenciada por las diferentes áreas geográficas. Estas situaciones han limitado el desarrollo de vacunas que, indiscutiblemente, contribuirían a reducir la alta mortalidad en países en vías de desarrollo.
Con respecto al campo veterinario, pese al gran número de vacunas recombinantes obtenidas para la prevención contra ECET fimbriadas, en algunos países desarrollados, a partir de los 90’, ha habido una tendencia a no utilizarlas y, en su lugar, aplicar la denominada exposición intencional. Los inmunosueros, polivalentes y monovalentes, también han sido utilizados para el control de diarreas provocadas por ECET en animales, fundamentalmente en terneros. Su uso, no obstante, no ha tenido la aceptación y difusión de las vacunas ya analizadas.
Efecto de extracto de plantas en el bloqueo de la adhesión fimbrial
En Cuba los primeros reportes sobre el uso de extractos de plantas con relación al fenómeno de la adhesión fimbrial están relacionados a estudios efectuados al Eucabev, producto antidiarreico elaborado a partir de corteza de Eucalyptus. El mismo se enfrentó a las cepas de referencia G7 (08 K87, K88ab) y B44 (09 K30, K99) (Barreto et al., 1993a,b;1995a) luego de que decocciones del producto se utilizaran con éxito en el tratamiento de las diarreas agudas en diferentes especies animales y el humano (Bertha Velázquez et al., 1991) y que, en estudios microbiológicos, se comprobara que a las concentraciones utilizadas, el Eucabev carecía de acción bactericida o bacteriostática sobre ECET (Barreto et al., 1993c). El modelo experimental utilizado consistió en someter a las cepas fimbriadas a tres pases sucesivos, dos por medio de cultivo líquido y uno final en el mismo medio, pero agarizado.
El tipo de medio empleado, la temperatura de incubación y los tiempos entre cada pase estaban en dependencia de las condiciones óptimas para la expresión fenotípica de cada fimbria en particular. La presencia, o ausencia, de las mismas se confirmó a partir del crecimiento en el medio agarizado mediante la utilización de inmunosueros antifimbriales, o suspensiones de hematíes con receptores específicos para las mismas.
En los grupos experimentales, a los medios de cultivo se les sustituyó un volumen de agua destilada por otro equivalente del extracto estéril a evaluar.
La inhibición de los factores K88ab y K99 (83,3% y 100%) luego del enfrentamiento a los extractos de Eucalyptus fue significativa (P<0,05). En este ensayo, al igual que en otro posterior (Barreto et al., 1995a) existía un punto débil, la aparición de variantes autoaglutinantes luego de los pases por los medios con algunos extractos.
Los fenómenos de autoaglutinaciones se produjeron fundamentalmente en las réplicas efectuadas a la cepa G7. Este elemento enmascarador, dada la carencia de un microscopio electrónico, sembró la duda al respecto de si la fimbria K88ab se perdía o no. En ambos trabajos se utilizaron inmunosueros polivalentes anti-K88.
Ante la imposibilidad de aplicar técnicas de microscopía electrónica se diseñó un nuevo modelo en el que la presencia de K88ab se evaluó en paralelo con dos indicadores: un inmunosuero monoclonal 11/70 anti-K88ab y una suspensión de hematíes A en solución salina buferada. El primero detectaba la subunidad predominante de la fimbria K88; mediante hemoaglutinación manosa-resistente (HAMR) se establecía la porción adhesiva de dicha fimbria. Con este esquema se comprobó que en todas las variantes autoaglutinantes investigadas se había perdido la fimbria (Barreto y Campal, 2001). Todos los extractos que afectaban la expresión de K88ab tenían un efecto similar sobre CFA/I, la fimbria más frecuente en ECET asociadas a EDA en humanos.
Este trabajo estableció, además, que la acción sobre la viabilidad bacteriana dependía de la especie de Eucalyptus, la concentración de los extractos y la especie o variedad bacteriana analizada.
A Achirantes aspera se le atribuyen las más diversas propiedades terapéuticas. Se ha reportado que las tinturas (menstruo al 70%) de hojas, tallos, semillas y de toda la planta, poseen efecto bactericida frente a cepas de E. coli enterotoxigénicas (K88ab+) y uropatógenas (P+).
Sin embargo, en ese mismo estudio ninguna decocción presentó acción antibacteriana ante dichas cepas. La población, de forma tradicional, utiliza esta planta para el tratamiento de las EDA e ITU en forma de infusiones, decocciones y extractos acuosos.
En el trabajo mencionado, muy sencillo, y sin el rigor de los desarrollados con Eucalyptus, se pudo constatar un efecto inhibidor de la expresión fimbrial con las decocciones de hojas. Estos resultados fueron confirmados posteriormente (Barreto et al., 1997).
Entre las plantas más utilizadas por la población para el tratamiento de las afecciones renales figuran: Lepidium virginicum L, Xanthium occidentale Bertol y A. aspera. Estudios preliminares con cepas de E. coli P+ demostraron que las decocciones de estas plantas carecían por completo de efectos bactericidas o bacteriostáticos aunque, de forma variable, afectaban la expresión fimbrial (Barreto et al., 1997).
Estos ensayos, aunque interesantes, por sus resultados, tampoco contaron con la presencia de cepas de referencia y la expresión o ausencia de fimbrias P se estableció mediante HAMR. Teniendo en cuenta estas premisas, se procedió a una nueva experiencia (Barreto et al., 2000) en la que se incorporó un inmunosuero anti-PapA, que detectaba la subunidad predominante en P. El mismo se utilizó en paralelo al ensayo de HAMR, específico para la porción adhesiva.. Con el auxilio de la cepa de referencia E. coli ATCC25922 (P+) se efectuó un tamizaje para evaluar el bloqueo de la adhesión fimbrial a decocciones y tinturas elaboradas a partir de A. aspera, Lepidium. Virginicum L., Ageratum conyzoides L., Zingiber officinale Rosc., Curcuma longa L y Costus speciosus Smith. Sólo en el caso de C. longa no se inhibió la expresión fimbrial en ninguna de las variantes ensayadas.
En una experiencia anterior se había demostrado otra forma de bloquear la adhesión y fue cuando en lugar de enfrentar la cepa bacteriana a extractos de plantas, los mismos se aplicaron a las células portadoras de los receptores para fimbrias (Barreto et al., 1993c).
Aunque en esa ocasión se trataba de receptores para K99, algo similar podía ocurrir con los receptores para P. La realización de esta variante puso de manifiesto que varios de los extractos investigados, incluyendo la decocción de C. longa, bloqueaban dichos receptores y por ende, impedían la adhesión de E. coli P+.
Un equipo de investigadores norteamericanos ha reportado la inhibición irreversible de la fimbria P luego de efectuar dos pases sucesivos a la cepa JR1 en agar CFA con jugo del fruto de V. macrocarpon al 25% (Ahuja et al., 1998). Microfotografías realizadas demuestran la pérdida total de la fimbria P en las preparaciones elaboradas. Los autores concluyen que estos resultados podían deberse a un desprendimiento de las fimbrias o a una inhibición en su expresión.
Los resultados obtenidos con la cepa E. colí ATCC25922 (Barreto et al., 2000) apoyan la segunda interpretación, máxime si se tiene en cuenta, además, los resultados obtenidos al enfrentar a E. coli G7 con extractos diversos de Eucalyptus sp .(Barreto y Campal, 2001). En experiencias anteriores se demostró que este bloqueo, en algunos casos, obedecía a la persistencia del inhibidor en el medio, en otras, sin embargo, se perdía la capacidad de expresar las fimbrias aún cuando se realizaran subcultivos en medios libres del inhibidor. Estos resultados estaban determinados por la especie de planta utilizada y la clase de fimbria en cuestión (Barreto et al., 1993a, 1995ª,b, 1997; Barreto y Campal, 2001).
Muchos pueden ser los metabolitos primarios o secundarios que afectan la interacción necesaria para que tenga lugar la adhesión de E coli uropatógena o enterotoxigénica. En las plantas estudiadas hasta el momento se han detectado flavonoides, quinonas y taninos, su papel en la inhibición fimbrial aún está por demostrar, así como está por demostrar también el posible papel de análogos estructurales que, por simple competencia, interfieran en esta unión. Para pasar a esta etapa se requiere de un equipamiento y posibilidades que no están a nuestro alcance.
Lo expuesto constituye el resultado de una fase de investigación que, aunque comprende resultados in vitro, constituyen las primeras respuestas al por qué toda una gama de plantas empleadas tradicionalmente, y que carecen de una acción bactericida o bacteriostática pronunciada, tiene efecto terapéutico en el tratamiento de las ITU y las EDA.
Esta fase de la investigación es la que sometemos al tribunal competente para optar por el Premio Anual de la Academia de Ciencias. La etapa a nivel molecular e in vivo constituyen temas de dos Aspirantes a Doctor en Ciencias, coautores de esta etapa.
BARRETO, G. et al: Efecto de un medicamento a base de eucalipto (EUCABEV) sobre la producción de los factores de colonización F4 y F5 de E. coli enterotoxigénica (ETEC). Rev. Prod. Anim. 7 (1 y 2): 73-76, 1993ª.
BARRETO, G et al: Efecto de un medicamento a base de eucalipto (Eucabev) sobre los receptores para F5 de E. coli enterotoxigénica (ETEC). Rev. Prod. Anim. 7(3): 135-136, 1993b
BARRETO, G et al: Efecto bactericida o bacteriostático de un medicamento a base de eucalipto (Eucabev). Rev. Prod. Anim. 7 (1 y 2): 69-71, 1993c.
BARRETO G. et al: Efecto de concentraciones subletales de antibióticos en la expresión del factor de colonización F4. Revista de Producción Animal. 8 (1): 61-3, 1994.
BARRETO, G. et al: Acción de extractos de E. saligna y E. citriodora sobre el factor de colonización F4. Revista de Producción Animal. 9 (1): 68-79, 1995a.
BARRETO, G. et al: Expresión fimbrial (F4 y P) de E. coli en medios convencionales. Rev. Prod. Anim. 9: 83-87, 1995b.
BARRETO, G. et al: Efectos de los extractos de Achyranthes aspera sobre E. coli. Revista Referativa Electrónica Archivo Médico de Camagüey. 2 (3), 1997. [Publicación Electrónica].
BARRETO, G. Et al.: Microbiología Farmacéutica. Universidad de Camagüey. p. 154-157, 221-222. Camagüey, 2000.
BARRETO, G. et al: Tamizaje microbiológico a plantas medicinales bloqueadoras de la adhesión de E. coli uropatógena P+ presentes en Cuba.. XIV Forum de Ciencia y Técnica. 25 de Octubre. Camagüey, 2000.
BARRETO, G. y A. CAMPAL: Efecto de extractos de Eucalyptus saligna y Eucalyptus citriodora sobre la variabilidad y expresión fimbrial (K88y CFA/I) de E coli enterotoxigénica. Rev. Prod. Anim. 13 (2): 67-75, 2001.
BARRETO, G. et al: El bloqueo de la adhesión fimbrial como opción terapéutica. Rev. Prod. Aim. 13 (1): 67-75, 2001 ( trabajo que se presenta para su análisis).
BARRETO, G. y A. CAMPAL: ¿Es Escherichia coli un enteropatógeno? Taller Internacional sobre Nutrición y Medicina Veterinaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de Camaguey. Junio del 2002.
BARRETO, G. et al: Elementos para el tamizaje a plantas que evalúe su acción sobre la actividad fimbrial bacteriana. Rev. Prod. Aim. 14: 2002 (aceptado publicar).
CAMPAL, A. Et al: Use of monoclonal antibody against the K88 fimbriae antigen in ELISA and dye-bassed dipstick for the diagnosis of porcine colibacillosis. Avances en Biotecnología Moderna. Libro de Reportes cortos de Congreso. 1: 1-19, 1992.
VELAZQUEZ, B. et al: Diagnóstico y tratamiento de la colibacilosis porcina. Rev. Prod. Animal. 6 (2): 139-141, 1991.
Autor:
Dr.C. Guillermo Barreto Argilagos
Profesor e investigador del CEDEPA. Universidad de Gamagüey