Enfermedades genéticas

Introducción

La patología genética constituye un amplio grupo de enfermedades con importantes repercusiones clínicas.

Se consideran enfermedades genéticas todas aquéllas causadas por cualquier alteración en el código genético que da lugar a una malformación y/o disfunción orgánica. Los efectos clínicos que produce una determinada alteración genética pueden afectar al funcionamiento de uno o más tejidos u órganos, originando un cuadro polimalformativo.

Este tipo de patología se caracteriza por comprometer la calidad de vida de los afectos, tener una elevada y precoz mortalidad (más de la mitad de ellas producen un acortamiento de la vida), y por su carácter progresivo. Por otra parte, desde el punto de vista sanitario, su impacto social es muy importante, fundamentalmente por su carácter recurrente en la familia y por su elevado coste médico.

De modo general, las enfermedades genéticas pueden clasificarse en tres categorías:

— Alteraciones cromosómicas. Son aquéllas en las que puede demostrarse mediante técnicas de citogenética una anomalía en el número o estructura de los cromosomas.

— Alteraciones monogénicas o mendelianas. Son las producidas por una única mutación o lesión genética. Siguen un patrón de herencia mendeliano.

— Alteraciones poligénicas o multifactoriales, causadas por factores ambientales o varias anomalías genéticas que actúan conjuntamente.

Estructura y función de los cromosomas y genes

• Organización del genoma humano

El genoma humano en su forma diploide se compone aproximadamente de 6.000 a 7.000 millones de pares de bases de ADN organizado de manera lineal en 23 pares de cromosomas. El genoma contiene, según cálculos actuales, de 50.000 a 100.000 genes (codificando, por tanto, un número igual de proteínas) que controlan todos los aspectos de la embriogénesis, el desarrollo, la reproducción y el metabolismo.

El análisis de la organización del genoma humano constituye un área de enorme interés en la Genética médica y humana actual. La mayor parte de la información genética, si no toda, se identificará en un futuro muy próximo, y se examinará a escala molecular como parte de lo que se ha llamado el Proyecto Genoma Humano, un esfuerzo internacional para «mapear» y secuenciar todo el genoma.

• Estructura del ADN

El ADN es una macromolécula polimérica de ácido nucleico que se compone de tres tipos de unidades: un azúcar de cinco carbonos (la desoxirribosa), una base que contiene nitrógeno y un grupo fosfato. Las bases son de dos tipos: purinas (adenina y guanina) y pirimidinas (timina y citosina). Los nucleótidos, cada uno de ellos compuesto de una base, de un grupo fosfato y un azúcar, se polimerizan en largas cadenas de polinucleótidos mediante uniones 5"-3"fosfodiéster que se forman entre las unidades adyacentes de desoxirribosa. En el caso de cromosomas humanos intactos, estas cadenas de polinucleótidos (en forma de doble hélice) pueden extenderse cientos de millones de nucleótidos.

La estructura anatómica del ADN transporta la información química que permite la transmisión exacta de la información genética de una célula a sus células hijas y de una generación a la siguiente. Al mismo tiempo, la estructura primaria del ADN especifica la secuencia de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de las proteínas. El ADN posee características especiales que le brindan estas propiedades. El estado natural del ADN, como lo descubrieron Watson y Crick, en 1953, es una doble hélice. La estructura helicoidal asemeja una escalera de caracol dextrógira en la que las dos cadenas de polipéptidos avanzan en direcciones opuestas, mantenidas unidas por puentes de hidrógeno entre pares de bases: A-T y G-C. Por lo tanto, el conocimiento de la secuencia de las bases de una cadena permite de manera automática el conocimiento de la secuencia de la otra. Este carácter complementario de las bases permite, por una parte, la replicación del ADN y, por otra, la reparación eficaz y correcta de las moléculas dañadas.

• El código genético

Los cuatro tipos de bases en el ADN están colocados en grupos de tres; cada grupo forma una «palabra» en código o codón, que significa un aminoácido particular. Un gen representa la secuencia total de bases en el ADN que especifica la sucesión de los aminoácidos en la cadena polipeptídica de una molécula de proteína. La información genética codificada en el ADN de los cromosomas inicialmente se transcribe en una copia de ácido ribonucleico (ARN). Durante la transcripción, los nucleótidos de ribosa se alinean junto con el ADN de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. Por tanto, la adenina del ADN se une al uracilo del ARN, la citosina con guanina, la timina con adenina, y la guanina con citosina. Las bases de la ribosa se unen mediante la acción del enzima ARN polimerasa. La transcripción resultante de ARN forma la base para la traducción en la secuencia de aminoácidos de una proteína.

• Concepto de gen

Hasta finales de los años 70 el gen se consideraba simplemente un segmento de una molécula de ADN que contenía el código para la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica y de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión. Hoy se sabe que ésta constituye una descripción incompleta. La mayoría de los genes no existen como secuencias codificadoras continuas sino que se ven interrumpidos por una o más regiones no codificadoras (intrones). Estos intrones se transcriben inicialmente a ARN en el núcleo, pero no se encuentran presentes en el ARN mensajero maduro en el citoplasma de tal modo que no se hallan representados en el producto proteico final. Los intrones se alternan con secuencias codificadoras o exones, que codifican la secuencia de aminoácidos del producto final. En el proceso de «edición» del transcrito de ARN, que tiene lugar en el núcleo, las secuencias intrónicas son eliminadas y las regiones codificantes se unen para formar un gen continuo (ARN mensajero). Este ARN mensajero se aleja del núcleo y penetra en el citoplasma donde se une con los ribosomas y sirve como plantilla para la síntesis ribosómica de proteínas.

• Los cromosomas

Los genes están dispuestos en una secuencia lineal de ADN que junto con ciertas proteínas, denominadas histonas, constituyen unos cuerpos en forma de bastón llamados cromosomas. El estudio de los cromosomas, su estructura y su herencia se denomina Citogenética. La ciencia de la Citogenética humana moderna data de 1956, cuando Tijo y Levan desarrollaron técnicas efectivas para el análisis cromosómico y establecieron que el número normal de cromosomas humanos es cuarenta y seis. Cada especie tiene un complemento cromosómico característico (cariotipo) en cuanto al número y la morfología de sus cromosomas.

Cada célula somática humana contiene cuarenta y seis cromosomas dispuestos en veintitrés pares (veintidós pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales). Los miembros de un par (denominados cromosomas homólogos) contienen información genética emparejada. Un cromosoma de cada par proviene de cada progenitor del individuo, es decir, uno se hereda del padre y el otro de la madre. Por tanto, cada persona hereda dos copias de cada cromosoma, y en consecuencia, dos copias de cada gen. El sitio del cromosoma en el que se localizan las dos copias de cada gen se denomina locus genético. Cuando un gen que ocupa un locus genético está en dos o más formas diferentes, éstas reciben el nombre de alelos. Cuando dos genes en el mismo locus genético son idénticos, el individuo es homozigoto para ese locus. Cuando los dos genes difieren (es decir, dos alelos están presentes en el locus) el individuo es heterozigoto. Cada ser humano normal es heterozigoto en el 20% de sus locus genéticos, y homozigoto en el 80%, como promedio.

La información genética contenida en los cromosomas se transmite a las células hijas en dos tipos de circunstancias. Una se presenta siempre que una célula somática se divide y se denomina mitosis (se generan dos células hijas, cada una con cromosomas y genes idénticos a los de la célula madre). La otra prevalece cuando la información genética es transmitida de un individuo a su descendencia y se denomina meiosis. La meiosis es el proceso por el cual se originan las células germinales y por el que se determina cuál es la copia que la célula germinal recibe de cada cromosoma (los gametos poseen un complemento cromosómico haploide). Durante la meiosis, la distribución de cromosomas homólogos en las células germinales se realiza al azar, de tal forma que cada gameto contiene cromosomas paternos y maternos. Esta es la principal fuente de variación entre los individuos. Existe, sin embargo, una fuente adicional de variación. Cuando los pares de cromosomas homólogos se alinean, sufren un fenómeno de entrecruzamiento cuyo resultado se conoce como recombinación.

Modos de transmisión de las enfermedades hereditarias

Aunque pocos fenotipos están completamente determinados por un locus único, el concepto de trastornos monogénicos todavía es aplicable. Habitualmente estos trastornos muestran alguno de los tres siguientes patrones de herencia: autosómico dominante, autosómico recesivo o ligado al cromosoma X. La frecuencia de trastornos monogénicos en la población normal es de 10 por cada 1.000 nacidos vivos (aproximadamente 7 por 1.000 casos dominantes, 2,5 por 1.000 casos recesivos y 0,4 por 1.000 ligados al cromosoma X, excluyendo la ceguera para los colores).

Patrones de herencia mendeliana

Si una determinada enfermedad muestra alguno de los tres patrones de herencia mendeliana, su patogenia se debe a una alteración en un punto único del genoma, que generalmente afecta a una única proteína. Para establecer dicho patrón, un primer paso habitual consiste en obtener información acerca de los antecedentes familiares del paciente y representarlos gráficamente por medio de una genealogía que utiliza símbolos estándar. Los patrones que muestran los trastornos monogénicos en las genealogías dependen principalmente de dos factores: 1) la localización cromosómica del locus génico, que puede ser autosómico (ubicado en un autosoma) o ligado al X (cromosoma X) y 2) la clase de fenotipo que puede resultar dominante o recesivo. Salvo que se especifique de otra forma, los términos dominante y recesivo se refieren al fenotipo clínico asociado a un alelo particular. El problema es relativamente simple cuando el individuo heterocigoto es indistinguible del homocigoto. En este caso, el rasgo dominante (enfermedad) o el alelo (mutación) es el que prevalece en el heterocigoto. En los trastornos verdaderamente recesivos, el fenotipo de los heterocigotos es indistinguible del normal, mientras que en los trastornos verdaderamente dominante el fenotipo de los heterocigotos es indistinguible del que muestran los homocigotos. Sin embargo, los heterocigotos de muchos de estos trastornos recesivos presentan diferencias sutiles en el fenotipo que se pueden potenciar por la acción de los factores ambientales.

• Patrones de herencia autosómica dominante

En la herencia autosómica dominante clásica, cada individuo afectado en una genealogía posee un progenitor igualmente enfermo, quien a su vez tiene un progenitor igualmente enfermo y así sucesivamente, hasta donde pueda identificarse el trastorno o hasta donde pueda identificarse la mutación original. Esto también es cierto, para los patrones de herencia dominante ligados a X. Sin embargo, se distinguen con facilidad puesto que en estos últimos no es posible la transmisión varón-varón, ya que los varones transmiten el cromosoma Y y no el X a sus hijos varones.

La mayor parte de las mutaciones que provocan enfermedad son raras en la población en comparación con los alelos normales: así, en parejas cuyos hijos poseen una enfermedad autosómica dominante, uno de los padres a menudo es heterocigótico para la mutación y el otro es homocigótico para el alelo normal. Los genotipos de los padres pueden representarse como:

• A es un gen dominante para un fenotipo anormal: a es un alelo normal

Progenitor normal

Progenitor afectado

Cada hijo de esta pareja tiene una probabilidad del 50% de recibir el alelo A anormal de su progenitor afectado, y así afectarse a su vez (A/a), y una probabilidad del 50% de recibir el alelo normal y por tanto, de no estar afectado (a/a). Desde el punto de vista estadístico, cada embarazo constituye un «evento» independiente, no determinado por el desarrollo de embarazos previos.

En el patrón de herencia autosómica dominante, los miembros fenotípicamente normales de una familia no trasmiten el fenotipo a sus hijos. El fallo en la penetrancia o una expresión excepcionalmente leve de un trastorno pueden producir excepciones aparentes a esta regla.

Los varones y las mujeres se afectan por igual y poseen la misma probabilidad de trasmitir el fenotipo a sus hijos de cualquier sexo. En particular, la transmisión varón-varón puede ocurrir y es posible que los varones tengan hijas no afectadas.

• Patrones de herencia autosómica recesiva

Los fenotipos autosómicos recesivos son menos frecuentes que los dominantes, constituyendo una tercera parte de los fenotipos mendelianos reconocidos. Los trastornos autosómicos recesivos se expresan sólo en homocigotos que, por lo tanto, deben haber heredado un alelo mutante de cada uno de los progenitores. Si bien cualquier unión en la cual cada padre posea al menos un alelo recesivo puede producir descendencia homocigótica afectada, la más común es la unión de dos portadores. En estos casos, ambos padres de un individuo afectado son heterocigotos (portadores) y el riesgo de que sus hijos reciban el alelo recesivo de cada padre es de uno entre cuatro. El propósitus es el único miembro afectado de la familia, pero si otros están enfermos, de manera casi invariable todos pertenecen a la misma fratría (hermanos) y no tienen otras relaciones de parentesco. En ocasiones, otros familiares pueden estar afectados, especialmente en familias con antecedentes de consanguinidad.

Los tres posibles tipos de unión con riesgo para la descendencia son los siguientes:

El alelo recesivo mutante se simboliza con la letra r, y su alelo dominante normal con la letra R.

La frecuencia de portadores de genes autosómicos recesivos es importante desde el punto de vista clínico para el consejo genético. Debido a que un trastorno autosómico recesivo debe heredarse de ambos padres, el riesgo de que cualquier portador pueda tener un hijo afectado depende parcialmente de la frecuencia de portadores en la población general. Cuando se conoce la frecuencia poblacional del fenotipo y se cumplen otras características ideales de la población, la frecuencia del gen y las de portadores correspondiente pueden determinarse a partir de la frecuencia observada de individuos enfermos.

La mayor parte de los genes para trastornos autosómicos recesivos pueden distribuirse en las familias durante varias generaciones sin que aparezcan en forma homocigótica. La presencia de dichos genes recesivos ocultos no se revela hasta que el portador procrea con alguien que porta una mutación en el mismo locus, y los dos alelos deletéreos son heredados por un hijo. La probabilidad de que esto suceda se incrementa al menos un orden de magnitud si los progenitores son padres por ascendencia. La consanguinidad entre los padres de un individuo con un trastorno genético constituye una firme evidencia (aunque no una prueba) de que se trata de una alteración con herencia autosómica recesiva.

• Herencia ligada al cromosoma X

Los fenotipos determinados por genes en el cromosoma X tienen una distribución sexual característica y un patrón de herencia que generalmente resulta fácil de determinar. Si consideramos un gen mutante ligado al X, Xh en comparación con un alelo normal, XH. Dado que los varones poseen un único cromosoma X, pero las mujeres tienen dos, existen dos posibles genotipos en los varones y tres en las mujeres: los varones son hemicigotos con respecto a los genes ligados a X (XHno afecto y Xh- afecto), en tanto que las mujeres pueden ser homocigóticas para cualquiera de los alelos: XH /XH No afecto,Xh /Xh- afectoo heterocigóticas XH /Xh.

Los criterios para la herencia ligada a X son: únicamente los varones están afectos, al menos en dos generaciones, con transmisión de la enfermedad a través de hembras no afectas y sin que exista evidencia de transmisión varón-varón

Para entender completamente la herencia ligada a X, es necesario conocer el principio de inactivación del cromosoma X que ocurre en las mujeres y que a menudo se conoce como la hipótesis de Lyon (1962). De manera resumida, el principio tiene tres puntos:

• 1) En las células somáticas de las hembras demamífero sólo un cromosoma X es activo. El segundo permanece condensado e inactivo, y aparece en las células en interfase como el corpúsculo de Barr.

• 2) La inactivación ocurre al principio de la vidaembrionaria.

• 3) En cada célula somática femenina el X inactivo puede ser el X paterno o el materno, hecho que ocurre completamente al azar. Sin embargo, después de que un cromosoma X se ha inactivado en una célula, todas las células clónicas descendientes poseen el mismo X inactivo.

• 4) La inactivación del cromosoma X tiene tres consecuencias importantes desde el punto de vista clínico y genético: compensación de dosis, variabilidad de expresión en mujeres heterocigóticas y mosaicismo.

• Patrones de herencia recesiva ligada a X

Una mutación ligada a X se expresa fenotípicamente en todos los varones que la reciben, pero sólo en aquellas mujeres que son homocigóticas para la mutación.

Supongamos que Xh representa el alelo mutante y XH el alelo normal. Si un individuo afecto se une con una mujer normal, todos los hijos varones reciben el cromosoma Y del padre y el X de la madre y no están afectados, pero todas las hijas reciben el cromosoma X paterno y serán portadoras obligadas.

Las hijas serán todas heterocigotas (portadoras obligadas), mientras que los hijos serán todos sanos.

Si una hija de un varón afecto se une con un varón sano, pueden darse 4 genotipos en la progenie con iguales posibilidades:

El 50% de las hijas serán portadoras obligadas y el 50% de sus hijos serán afectos.

Un gen para un trastorno ligado al X está presente ocasionalmente tanto en el padre como en la madre portadora, y la descendencia femenina puede ser homocigótica afecta. Sin embargo, la mayor parte de las enfermedades ligadas a X son tan infrecuentes que resulta muy raro que una mujer sea homocigótica, a no ser que sus padres sean consanguíneos.

• Patrones de herencia dominante ligados a X

Un fenotipo ligado al X se describe como dominante si se expresa de manera regular en heterocigotos. La característica distintiva de una genealogía de este tipo es que todas las hijas y ninguno de los hijos de varones afectados están enfermos. Si alguna hija no está enferma o algún hijo lo está, la herencia debe ser autosómica y no ligada al X.

El patrón de herencia a través de las mujeres no resulta diferente al patrón de herencia autosómico dominante. Debido a que las mujeres poseen un par de cromosomas X, cada hijo de una mujer afectada posee una probabilidad del 50% de heredar el rasgo, independientemente de su sexo.

• Patrones de herencia no mendeliana

• Herencia mitocondrial o citoplasmática

El ADN mitocondrial (mtADN) está empaquetado en un cromosoma circular. Existen varias copias de este cromosoma en cada mitocondria y miles en cada célula. El mtADN ha sido completamente secuenciado y se sabe que codifica para dos tipos de ARN ribosómico (para 22 ARN de transferencia y para 13 polipéptidos que son subunidades de enzimas de fosforilación oxidativa). El mtADN se replica dentro de la mitocondria, y esta última se divide mediante división simple. Durante la citocinesis, las mitocondrias se distribuyen de manera aleatoria en las dos células hijas. Cuando una célula que contiene una mezcla de mtADN normal y mutante se divide, sus células hijas pueden contener sólo mtADN normal, mutante o una mezcla de ambos en diferentes proporciones. Dado que la expresión fenotípica de una mutación en el mtADN depende de las proporciones de ambos tipos de mtADN, la variabilidad de expresión constituye una característica de las genealogías de los trastornos mitocondriales.

Una característica única del mtADN es su herencia materna. El óvulo contiene muchas mitocondrias, pero los espermatozoides contienen pocas y éstas no persisten en la descendencia. La madre transmite su mtADN a toda su descendencia. Sus hijas lo transmiten a su vez, pero sus hijos no.

Ejemplos de enfermedades ligadas a mutaciones en el mtADN lo constituyen la neuropatía óptica de Leber y otras enfermedades neuromusculares.

• Mosaicismo

El mosaicismo se define como la presencia en un individuo o en un tejido de al menos dos líneas celulares, que difieren desde el punto de vista genético, pero derivan de un solo cigoto. Las mutaciones viables que ocurren en las células aisladas tanto en la vida prenatal como en la postnatal pueden de hecho generar clones de células genéticamente diferentes del cigoto original. El mosaicismo constituye un fenómeno clínicamente importante en los trastornos cromosómicos, y la mutación somática se reconoce como una causa importante, si no única, de muchos tipos de cáncer.

• Mosaicismo somático

Una mutación que afecta a la morfogénesis y ocurre durante el desarrollo embrionario, puede manifestarse como una anomalía segmentaria o desigual, según la etapa en que la mutación sucede y el tipo de células somáticas en la que se origina. Si esto ocurre en una etapa temprana antes de la separación de las células de la línea germinal de las células somáticas, está presente en las líneas celulares somática y germinal y, por lo tanto, es transmisible a la descendencia en su forma global y, al mismo tiempo, se expresa somáticamente en forma de mosaico. El mosaicismo somático se ha documentado en varios trastornos ligados al X tanto en varones como en mujeres.

• Mosaicismo germinal

Existen varias posibles explicaciones, entre las que se incluyen la expresividad variable o un fallo de penetrancia, para aquellas genealogías en las que los padres, que son fenotípicamente sanos, tienen más de un hijo afectado por una mutación nueva autosómica dominante. Sin embargo, la principal causa potencial de tales genealogías raras es que durante el desarrollo prenatal temprano de uno de los padres ocurrió una mutación somática en una célula de la línea germinal o en una célula precursora, que persistió en todos los descendientes clonales de dicha célula, y así finalmente afectó a una proporción de los gametos. Se producen alrededor de 30 divisiones mitóticas en las células de la línea germinal antes de la meiosis en la mujer, y varios centenares en el varón, lo cual ofrece muchas oportunidades para que ocurran mutaciones durante las etapas mitóticas del desarrollo de la célula germinal. Tales mutaciones, en teoría, pueden ser relativamente frecuentes en poblaciones de células germinales, aunque las genealogías en las que más de una persona recibe la misma mutación nueva son raras. Los padres fenotípicamente normales de un niño con un trastorno autosómico dominante (como por ejemplo, la osteogénesis imperfecta) o ligado a X, que se piensa que se debe a una mutación nueva, deben ser informados de que el riesgo de recurrencia es bajo, aunque no insignificante y han de ofrecérsele cuantas pruebas diagnósticas prenatales resulten apropiadas.

• Impresión genómica (Genomic imprinting)

En la actualidad se sabe que en un considerable número de trastornos genéticos la expresión fenotípica de la enfermedad depende de si el gen mutante se ha heredado del padre o de la madre. Un ejemplo de esto, lo constituye la forma grave de distrofia miotónica con inicio temprano que ocurre cuando el gen mutante se ha heredado por vía materna. Está claro que los cromosomas paternos y maternos pueden funcionar de manera distinta, y que las diferencias en su función dependientes de su origen, lo que se conoce como impresión (imprinting), pueden influir en la expresión de los trastornos genéticos humanos (Reik, 1989).

Quizá las situaciones más raras conocidas son las de los síndromes de Prader-Willi y de Angelman. El primero es un síndrome dismórfico relativamente común que se caracteriza por obesidad, polifagia, manos y pies de tamaño pequeño, estatura corta, hipogonadismo y retraso mental. En muchos casos de este síndrome existe una deleción citogenética que involucra el brazo largo proximal del cromosoma 15 heredado del padre (15q11q13). Lo contrario sucede en muchos pacientes con el raro síndrome de Angelman (también conocido como síndrome de la «marioneta feliz», en el que hay deficiencia de la misma región cromosómica, pero en el cromosoma 15 heredado de la madre (Knoll y cols. 1989).

Las diferencias en la expresión que dependen del sexo del padre transmisor se han estudiado de manera extensa en ratones transgénicos. Las diferencias en la expresión se relacionan con diferencias en los patrones de metilación del ADN que a su vez se relaciona con la regulación transcripcional de la actividad génica.

• Disomía uniparenteral

La disomía uniparenteral se define como la presencia de una línea celular disómica que contiene dos cromosomas determinados, heredados de un sólo progenitor (Spence et al. 1988). Si el mismo cromosoma está presente de manera duplicada, la situación se describe como isodisomía; si los dos cromosomas homólogos de un progenitor se encuentran presentes, la situación se denomina heterodisomía.

• Herencia multifactorial

La existencia de la herencia multifactorial no ha sido demostrada. En realidad cuando hablamos de herencia multifactorial, nos referimos a un modelo teórico para explicar la segregación de algunas enfermedades que no cumplen los criterios para ninguna de las herencias de tipo mendeliano. Por ejemplo, el labio leporino es una enfermedad cuya frecuencia en los hermanos (varones y mujeres) y los padres de un sujeto afecto es del orden del 2-4%. Esto es claramente inferior al 50% de un gen dominante, al 25% de un gen recesivo y claramente superior al 1 por mil de la población general. Para explicar estos hechos, en genética se ha supuesto la existencia de una variable no mensurable, denominada susceptibilidad individual. Esta variable dependería, por una parte de varios genes (herencia poligénica) y por otra parte de factores medio-ambientales. La enfermedad no aparecería más que a partir de un determinado umbral en el cual se reúne un número suficiente de factores.

Técnicas de estudio de las enfermedades genéticas

• Técnicas de identificación de anomalías cromosómicas. Cariotipo normal y anormal

Los cromosomas de una célula humana en división se analizan mejor en el estado de metafase o prometafase de la mitosis. En estas etapas los cromosomas se observan bajo el microscopio óptico como un conjunto de manchas, y cada cromosoma se observa compuesto por dos cromátides que se unen en el centrómero. Cada cromátide es una doble hélice de ADN. El centrómero posee un papel fundamental en la división celular y constituye una señal citológica estándar que divide los cromosomas en dos brazos, denominados p para el brazo corto y q para el brazo largo. Los brazos de los diferentes cromosomas se indican por el número del cromosoma seguido de las letras p o q. Los cromosomas humanos se clasifican por la posición del centrómero en tres tipos: metacéntricos (con un centrómero más o menos central y brazos de aproximadamente igual longitud), submetacéntricos (con un centrómero descentrado) y acrocéntricos (con el centrómero cerca de uno de los extremos). Los cromosomas humanos acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) poseen pequeñas masas de cromatina que se conocen como satélites, adosados a sus brazos cortos mediante delgados filamentos. Estos filamentos contienen los genes para el ARN ribosómico (18 S y 28 S).

Las células para el análisis cromosómico deben ser capaces de crecer y dividirse con rapidez en cultivo. Las células más accesibles para este fin son los leucocitos, y específicamente los linfocitos T. Para preparar un cultivo a corto plazo de estas células, se obtiene una muestra de sangre periférica mediante venopunción que se mezcla con heparina para impedir su coagulación. Mediante centrifugación se obtiene un sedimento leucocitario que se recoge y se coloca en un medio de cultivo tisular al que se añade un mitógeno, la fitohemaglutinina. Este cultivo se incuba alrededor de 72 horas, momento en el que se agrega una solución muy diluida de colquicina para impedir que la división celular se complete inhibiendo la formación del huso y retrasando la separación de los centrómeros. Como resultado se acumulan en el cultivo las células detenidas en metafase. Mediante la adición de una solución hipotónica se consigue la lisis celular y con ella la liberación de los cromosomas con los centrómeros intactos. Los cromosomas se fijan, se extienden en un portaobjetos y se tiñen con una de las varias técnicas disponibles para su análisis.

Aunque el cultivo celular preparado a partir de sangre periférica tiene una vida media corta (3 a 4 días), resulta ideal para el análisis clínico rápido. Los cultivos a largo plazo pueden obtenerse de otros tejidos: la biopsia de piel proporciona muestras de tejido que en cultivo producen fibrobrastos; los leucocitos también pueden transformarse en cultivo mediante la adición de virus de Epstein-Barr, con lo cual se forman líneas celulares linfoblastoides que son potencialmente inmortales- la biopsia de médula ósea tiene la ventaja de ofrecer una elevada proporción de células en división, de manera que se requiere un cultivo muy corto o ningún cultivo (se utiliza principalmente para el diagnóstico de trastornos hematológicos malignos); las células fetales obtenidas del líquido amniótico mediante punción o biopsia de vellosidades coriónicas también pueden cultivarse para análisis citogenéticos, bioquímicos o moleculares.

Mediante los tradicionales métodos de tinción empleados para el análisis citogenético, no era posible la identificación individualizada de los 24 tipos de cromosomas (22 autosomas, X e Y). Los cromosomas sólo podían clasificarse en siete grupos denominados con las letras A a G según su longitud total y la posición del centrómero. En la actualidad pueden hacerse distinciones más precisas e individualizadas mediante la observación del modelo único de bandas que aparecen cuando se tiñen los cromosomas con Giemsa o con varios colorantes de quinacrina que son fluorescentes bajo la luz ultravioleta. Algunos de estos métodos de bandeo se utilizan rutinariamente en laboratorios de citogenética para la identificación de cromosomas y el análisis de la estructura cromosómica. El Bandeo G es la técnica más ampliamente utilizada. Los cromosomas se tratan con tripsina para desnaturalizar las proteínas cromosómicas y después con tinción de Giemsa. Cada par de cromosomas se tiñe con patrones característicos de bandas oscuras y claras (Bandas G). El bandeo Q requiere tinción con mostaza de quinacrina o compuestos relacionados, así como examen con microscopia de fluorescencia. Los cromosomas se tiñen con un patrón característico de bandas brillantes y pálidas (bandas Q).

• Cariotipo anormal

El cariotipo permite estudiar las anomalías de número y estructura de los cromosomas.

• Anomalías de número

Estas son las más frecuentes y las mejor conocidas. Aunque en condiciones normales existen 46 cromosomas, en ciertas situaciones patológicas se pueden observar:

— Una trisomía, que consiste en la presencia de tres ejemplares de un cromosoma en lugar de dos. Este exceso puede afectar tanto a los autosomas como a los cromosomas sexuales.

— Una monosomía, es la presencia de un solo ejemplar de un cromosoma en lugar de dos. Las monosomías no son compatibles con la vida, excepto la monosomía X (síndrome de Turner).

— Triploidía, presencia de 3n, es decir, 69 cromosomas. Esta es una situación no viable.

• Anomalías de estructura

La más corriente es la translocación: consiste en la rotura de uno o varios cromosomas con desplazamiento del o de los fragmentos rotos, recogidos sobre otro cromosoma. Existen dos tipos de translocaciones:

Translocaciones robertsonianas: se producen entre dos cromosomas acrocéntricos con pérdida de un centrómero, la más corriente es la translocación 14, 21 que se nota t(14q-21q), ya que la pérdida de un centrómero da lugar a la translocación de un brazo largo de un cromosoma 21 sobre el brazo largo de un cromosoma 14. En estos casos durante la meiosis pueden darse dos situaciones: que la segregación se lleve a cabo de forma normal y a un gameto pase el cromosoma translocado 14-21 y al otro gameto los cromosomas 14 y 21 normales. En estos dos casos el gameto dará un sujeto normal. También puede ocurrir una alteración en la segregación: en los casos en los que el cromosoma translocado 14-21 arrastra al cromosoma 21 libre al mismo gameto, mientras que al otro gameto irá el otro cromosoma 14. Así, el gameto que porta el cromosoma translocado más el 21 libre si es fecundado por un gameto normal dará lugar a un huevo trisómico.

Translocaciones recíprocas: en este tipo de translocaciones las roturas de las cromátides han tenido lugar fuera del centrómero, es el fragmento de un brazo de un cromosoma el que se rompe y se une a otro cromosoma. En estos casos, tanto si la segregación es normal como anormal (monosomía parcial o trisomía parcial), dará lugar a individuos normales.

• Técnicas para el estudio de alteraciones en la secuencia génica. Técnicas de biología molecular

El análisis genotípico ya se puede aplicar al diagnóstico, consejo genético y tratamiento de muchas de las denominadas enfermedades por alteración de un solo gen. Los genes más relevantes han sido clonados y se han identificado mutaciones en los trastornos genéticos más frecuentes, en los que el análisis genotípico puede confirmar el diagnóstico, determinar el estado de los familiares en riesgo, predecir en ocasiones la gravedad, proporcionar la oportunidad de un diagnóstico presintomático y aportar también las bases para el consejo genético.

En la década de los 80, la tecnología del ADN recombinante, que permite el aislamiento de pequeños fragmentos de ADN y la producción de cantidades limitadas del material clonado, junto con los rápidos métodos de estudio basados en la reacción en cadena de la polimerasa (análisis de ligamiento y screening de mutaciones), permitieron la utilización de nuevas estrategias para la localización e identificación de genes implicados en enfermedades hereditarias y en cánceres somáticos.

Existen cuatro estrategias convencionales para la identificación de genes causantes de enfermedades. Las dos primeras (clonación funcional y clonación posicional) se engloban en lo que se denomina «aproximación desde el fenotipo» y en ellas el paso intermedio lo constituye la determinación de la localización cromosómica aproximada del gen en cuestión. Aunque en todas ellas el fin último es el de generar genes candidatos, en las dos últimas (Estrategia de genes candidatos independientemente de la posición y Estrategia de genes candidatos dependiendo de su localización) el estudio se inicia con la presunción de un gen candidato.

Los métodos de estudio molecular de relevancia clínica para el análisis de ácidos nucleicos están basados en la utilización de múltiples estrategias.

Los fragmentos lineales de ADN nativo (de doble cadena) pueden tratarse con calor o álcali para separar ambas cadenas y obtener así ADN de cadena sencilla o desnaturalizado. El ADN desnaturalizado se puede incubar en determinadas condiciones que permitan la hibridación del ácido nucleico, es decir, el reconocimiento y emparejamiento de bases. La hibridación es tan sensible que una molécula de ADN de una sola cadena se puede hibridar específicamente con una cadena complementaria de ADN o ARN y ser detectada cuando está presente en una cantidad aproximada de una parte por 10.000. La especificidad de la hibridación permite la detección de un gen específico entre decenas de miles de genes.

Las sondas son moléculas de ácido nucleico (habitualmente ADN) clonado o sintético que se utilizan en las reacciones de hibridación ADN:ADN o ADN:ARN. La mayoría de las sondas de hibridación se han preparado en forma radiactiva, aunque en la actualidad está aumentado su uso mediante métodos de detección no radiactivos.

Una variación muy útil en la hibridación con ácidos nucleicos es la utilización de oligonucleótidos con especificidad de alelo (ASO). La sonda ASO es un oligonucleótido sintético de una longitud entre 15 y 20 bases. Se sintetizan dos sondas que generalmente difieren en el punto de mutación de una sola base, una de ellas reproduce perfectamente la secuencia normal y la otra la secuencia mutante. El análisis con ASO permite la genotipificación precisa de una muestra de ADN y puede distinguir a personas que son homocigotas para la secuencia normal, heterocigotas u homocigotas para la secuencia mutante. Sin embargo, no todos los genes mutantes en un determinado locus comparten exactamente la misma mutación, por lo que la incapacidad de ASO para hibridar con el gen mutante, no necesariamente significa que el ADN del paciente sea normal en dicho gen, puede existir una mutación en otra parte del gen que no sea en la localización precisa examinada con dicho ASO en particular.

• Endonucleasas de restricción

Uno de los avances clave en el desarrollo de la clonación molecular fue el descubrimiento de las endonucleasas de restricción bacterianas, enzimas que reconocen secuencias de doble cadena específicas (generalmente cortas, de 4 a 8 bp) en el ADN y fragmentan el ADN en ese punto. La especificidad de secuencia de las enzimas representa un poderoso instrumento para la disección de los genomas de gran tamaño. Con la utilización de múltiples enzimas de restricción es posible definir un mapa detallado de puntos de fragmentación para un segmento particular de ADN. Las variaciones en la secuencia de los puntos de corte pueden revelar polimorfismos o mutaciones en el genoma humano.

• Transferencia Southern

Esta técnica constituye el método estándar de análisis de la estructura del ADN dividido por enzimas de restricción, e implica la hibridación del ADN en solución con ADN fijado en un soporte de membrana. En el análisis clínico, la transferencia se inicia con el aislamiento del ADN genómico a partir de leucocitos de sangre periférica o de células fetales. El millón de fragmentos de ADN generados por división mediante enzimas de restricción de una muestra genómica de ADN, se separa sobre la base de su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Una vez digerido y separado el ADN de esta manera, se tiñe con una solución de ADN fluorescente como bromuro de etidio, y los fragmentos del ADN genómico se aprecian como una mancha de material fluorescente porque existen demasiados fragmentos juntos de ADN. La técnica de Southern permite encontrar y examinar el fragmento de ADN de interés dentro de esta colección no informativa a primera vista. Para ello los fragmentos de ADN de doble cadena se desnaturalizan y posteriormente se transfieren a un fragmento de papel de filtro de nitrocelulosa por manchado y capilaridad. Para identificar el fragmento de interés se utiliza una sonda específicamente marcada. La sonda y el filtro se incuban juntos y posteriormente se exponen a una placa de rayos X para visualizar la hibridación. Este método es útil para detectar reordenamientos a gran escala en el ADN y algunas mutaciones puntuales.

Un procedimiento análogo que se inicia con ARN se ha denominado transferencia Northern, y en el se puede determinar la presencia o ausencia de un ARNm determinado. El término de transferencia de tipo Western, describe un procedimiento para el análisis de antígenos proteicos.