Técnicas inmunohistoquímicas para la identificación de antígenos fimbriales de E. coli enteropatógeno (página 2)

Cuadro 1. Grupos de Cerdos Inoculados Experimentalmente y Cepas de E. coli. Experimental groups of pigs and E. Coli strains used.

Análisis Microbiológico: posterior a la eutanasia,de cada cerditos se obtuvo contenido de duodeno, yeyuno e íleon que se dispuso en bolsas plásticas estériles, rotuladas, conservadas a 4ºC y enviadas al Instituto de Microbiología/3 para la realización de cultivo bacteriológico e identificación de fimbrias mediante el Test de Aglutinación (Fimbrex®)/4 (figura 1).

Inmunohistoquímica (IHQ): la identificación y distribución de antígenos fimbriales se realizó mediante dos técnicas de IHQ, empleándose para ello la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y la Técnica de Streptavidina – Biotina Peroxidasa (LSAB).

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI): en la totalidad de los cerdos inoculados experimentalmente, se realizó IFI de acuerdo a la técnica de Sternberger (1986) en improntas y cortes en crióstato de duodeno, yeyuno e íleon.

Improntas: de cada cerdo se obtuvo una porción de duodeno, yeyuno y 5 de íleon para realizar improntas, las cuales se secaron y fijaron en Acetona durante 5 minutos, manteniéndose en refrigeradas hasta su procesamiento mediante IFI.

Cortes en criostato de duodeno, yeyuno e íleon: de cada cerdito inoculado se obtuvo una sección de duodeno, yeyuno e ileon, las que se incluyeron en líquido congelante (M-1 Embedding Matrix For Frozen Sectioning, Lipshaw Co) a -20ºC. Se realizaron 5 cortes de cada sección (5-8 µm ) en crióstato Lipshaw (modelo 1500), se colocaron sobre portaobjetos impregnados con poly-L lysina (Sigma), fijados en acetona durante 5 minutos y conservados a -20ºC hasta su procesamiento mediante IFI.

De las muestras obtenidas, se incubaron 4 secciones de íleon, cada una con un anticuerpo primario diferente a fin de descartar reacciones cruzadas entre ellos; el quinto corte se utilizó como control negativo. Los cortes de duodeno y yeyuno se incubaron con el anticuerpo correspondiente a la inoculación, siguiendo el procedimiento descrito por Thorns y col. (1987) para la determinación de fimbrias en cortes de intestino.

Anticuerpos: como anticuerpos primarios se utilizaron antisueros policlonales de conejo adsorbidos (F4, F5, F6 y F41), preparados en el National Animal Disease Center5. La dilución óptima para improntas y sección de tejido fue de 1:500, la cual se realizó en buffer TRIS 0.05 /M, pH 7.6 más 0.7% de Carrageenan (Sigma). Como anticuerpo secundario se utilizó Inmunoglobulina G de cabra anti-conejo conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG ,whole molecule, Sigma), en dilución de 1:40 en buffer fosfato salino 0.01M, pH 7.6 (PBS).

Técnica : las improntas y cortes de duodeno, yeyuno e íleon realizados en crióstato fueron lavados con PBS, pH 7.6; siendo posteriormente incubados con el antisuero correspondiente en cámara húmeda, a 20ºC durante 1 hora. Posterior a dos lavados de 10 minutos cada uno en PBS pH 7.6, los preparados se incubaron con el anticuerpo secundario en cámara húmera, a 20ºC durante 1 hora, para finalmente realizar dos lavados en PBS pH 7.6 de 10 minutos cada uno y montarse en glicerol y PBS (9:1). Los tejidos fueron observados en microscopio de fluorescencia marca Zeiss.

Control Negativo: los anticuerpos primarios fueron reemplazados por suero no inmune de conejo o por buffer en improntas y secciones de íleon de cada cerdo. Por otra parte, se incubaron cortes de duodeno, yeyuno e íleon de cerdos del Grupo 1 (Control Negativo) con anticuerpos primarios F4, F5, F6 y F41, siendo procesados en forma idéntica a los inoculados con las diferentes cepas de E. coli.

Interpretación de la Reacción: se consideró inmunorreactividad cuando, en las improntas se observaron más de 10 bacterias con bordes fluorescentes por campo de 40X y cuando en cortes de intestino con crióstato se apreciaron bacterias adheridas al ápex y bordes laterales de las vellosidades (Francis, 1983).

Streptavidina – Biotina Peroxidasa ("Labelled Streptavidin-Biotin") (LSAB): esta técnica se realizó siguiendo el procedimiento de Sternberger (1986) en muestras de duodeno, yeyuno e íleon en la totalidad de los cerditos inoculados experimentalmente.

Fijación de los tejidos: con el fin de evaluar el grado de preservación antigénica de las fimbrias y determinar posteriormente el fijador más adecuado en las etapas posteriores, los tejidos obtenidos fueron fijados en formol tamponado al 10% y en metanol a 4ºC de acuerdo a la técnica de Saint Marie modificada (Rogers, 1985), durante 20-22 horas. Posteriormente las muestras se deshidrataron en cuatro pasajes de alcoholes ascendentes y se aclararon en dos pases en xilol. Luego de dos pasajes en parafina a 60ºC, los tejidos fueron incluidos y cortados en micrótomo de rotación (Jung AG) a 5 µm, montándose en portaobjetos previamente pasados por poly-L-lysina.

Antisueros Primarios: los anticuerpos primarios utilizados corresponden a los descritos en la técnica de IFI. Se realizaron diluciones de 1:1000 para F4, F5 y F6 y de 1:1500 para F41 en Buffer TRIS 0.05M, pH 7.6 más Carrageenan 0.7% (Sigma). Se incluyeron los mismos controles que los utilizados en IFI.

Técnica Utilizada: Streptavidina – Biotina Peroxidasa (LSAB)6, de acuerdo a lo especificado por Naish (1989). Los cortes de tejido incluidos en parafina son desparafinados y lavados en buffer TRIS 0.05M, pH 7.6 (Trizma-HCL, Sigma Chemical Co.). Posteriormente, la actividad de la peroxidasa endógena se anuló incubando los tejidos peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos, lavados en agua destilada y colocados en solución buffer TRIS 0.05M, pH 7.6. Se extrajo el exceso de buffer, se incubó con el agente bloqueador de proteínas inespecíficas6 por 5 minutos y luego con el anticuerpo primario correspondiente o con el antisuero usado como control negativo, en cámara húmeda y temperatura ambiente durante 2 horas. Posterior a dos lavados en buffer TRIS por 10 minutos, se cubrieron las muestras con el anticuerpo secundario biotinilado, manteniéndose en incubación en cámara húmeda, a temperatura ambiente durante 30 minutos.Luego de dos lavados en buffer TRIS de 10 minutos cada uno, los cortes se cubrieron con streptavidina-peroxidasa y se incubaron durante 30 minutos; posterior a dos lavados en buffer TRIS, se cubrieron con la solución sustrato-cromógeno (3-amino-9-ethilcarbazol AEC) y se incubaron durante 10 minutos. Se realizó tínción de contraste con Hematoxilina de Mayer durante 30 segundos y se montaron en glicerina Jelly (Luna,1968).

Interpretación de la Reacción: se consideró inmunorreactividad cuando se observaba precipitado de color rojo en los sitios de reacción antígeno-anticuerpo, ápex y bordes de las vellosidades intestinales.

RESULTADOS

Análisis Microbiológico: se realizó aislamiento bacteriológico de E. coli en la totalidad de cerdos inoculados. La identificación de fimbrias mediante Test de Aglutinación se evidenció parcialmente sólo en 3 grupos (cuadro 2).

Cuadro 2. Número de cerdos con aislamiento de E. coli e identificación de fimbrias mediante Test de Aglutinación en grupos experimentalmente inoculados. Isolation of E. coli and fimbriae identification in experimentally inoculated pigs.

Inmunohistoquímica: las técnicas IHQ utilizadas, IFI y LSAB, no preentaron diferencias en relación a su sensibilidad en la detección de los antígenos fimbriales analizados (F4, F5, F6 y F41), como se muestra en el cuadro 3.

Cuadro 3Frecuencia de cerdos con antígenos fimbriales (F4, F5, F6 y F41), en los grupos experimentales mediante Técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (LSAB). Identification of fimbriae in experimental group of pigs with IFI and LSAB.

En el cuadro 4 muestra que el antígeno F4 presentó mayor frecuencia de inmunorreactividad (3/5) en los 3 segmentos intestinales, siendo el íleon el segmento intestinal con mayor frecuencia de presentación de inmunorreacción a los diferentes antígenos fimbriales.

Cuadro 4Frecuencia de inmunorreacción a antígenos fimbriales en duodeno, yeyuno e íleon en cerdos inoculados con cepas de E. coli. Inmunoreactivity frequency of fimbriae in duodenum, jejunum and ileum of inoculated pigs with E. coli

De acuerdo con con el cuadro 5, el Test de Aglutinación no identificó antígenos fimbriales en 5 de los 12 cerdos que se visualizaron mediante IHQ; de dichos animales, 3 correspondieron a cerdos inoculados con cepa de E. coli F6 y 2 con E. coli F41.

Cuadro 5.Comparación entre técnicas inmunohistoquímicas y Test de Aglutinación en la identificación de antígenos fimbriales de E.coli. Relationship between Inmunohistochemical and Aglutination Identification of E. coli fimbriae.

DISCUSIÓN

En todos los cerdos inoculados con cepas de E. coli se realizó aislamiento bacteriológico del mismo, sin embargo, en algunos de los animales no se identificaron antígenos fimbriales. Al respecto, Evans y col. (1986) y Gyles (1993) hacen mención al hecho que una de las razones por la cual los cerdos inoculados con E. coli no enferman, se debe a la falta de receptores específicos en los enterocitos para las fimbrias o adhesinas colibacilares, las cuales son necesarias para permitir la adhesión, colonización y proliferación de la bacteria. Por otra parte, Isaacson y col. (1977), Duchet-Suchaux y col. (1991) y Seignole y col. (1991) han demostrado que existe resistencia a la colibacilosis en algunas líneas genéticas de cerdos. Los cerditos utilizados en la inoculación experimental provenían de razas híbridas, de tal modo que no es posible obtener conclusiones al respecto.

La IHQ constituye en la actualidad una técnica de gran importancia en biología y es utilizada para realizar diagnósticos rápidos de neoplasias, enfermedades autoinmunes e infecciosas en animales y en el hombre, dado que permite la identificación de antígenos específicos en cortes de tejidos, cultivos celulares e improntas (Roitt y col., 1993).

En el presente estudio, mediante IFI y LSAB se demostraron antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 en duodeno, yeyuno e íleon. La identificación por técnicas IHQ de los antígenos fimbriales mediante IFI ha sido reportada por Morris y col. (1982), Francis (1983) y Fairbrother (1994) y la técnica Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) por Morris y col. (1985) y Rogers (1985). Este último autor ha identificado antígeno F5 en cortes de íleon fijados en metanol e incluidos en parafina (método de Saint Marie modificado), sin embargo, utilizando formol al 10% no identificó dicho antígeno. Este último resultado contrasta con lo obtenido en la presente investigación, en la cual se observó reactividad a antígeno F5 en tejidos fijados en formol al 10% o en metanol por 20-22 horas y embebidos en parafina. Thorns y Roedor (1988), mencionan que el antígeno F41 es difícil de identificar en cortes de intestino fijados en formol e incluídos en parafina, no así en cortes obtenidos en crióstato, donde sí se ha evidenciado mediante IFI, resultado que también contrasta con lo encontrado en la presente investigación. Al respecto, Sternberger (1986) sugiere que a pesar que el formol tiene un marcado efecto enmascarador de antígenos, el mismo puede ser compensado por el uso de un método IHQ altamente sensible, por lo que se debe considerar la localización del antígeno a fin de evitar posibles problemas.

El método LSAB posee una alta sensibilidad en comparación con el método de Peroxidasa-Antiperoxidasa, siendo de particular aplicación en la localización de antígenos presentes en escasa cantidad y en especial en aquellos tejidos donde la fijación puede reducir la antigenicidad (Elías, 1990). El uso de esta técnica no ha sido comunicada anteriormente en la identificación de antígenos fimbriales de E. coli en el intestino, los resultados obtenidos señalan que el método LSAB es altamente sensible y de gran utilidad.

La IHQ permitió demostrar la presencia de antígeno F4 en los tres segmentos intestinales, en cambio antígenos F5, F6 y F41 se identificaron principalmente en yeyuno e íleon y con menor frecuencia en el duodeno. Idénticas observaciones han sido realizadas por Evans y col. (1986) y Fairbrother (1994) quienes demostraron que E. coli F4 coloniza la totalidad del intestino delgado, mientras que cepas con expresión F5, F6 y F41 colonizan principalmente el segmento posterior del yeyuno e íleon.

El Test de Aglutinación permitió en las cepas de E. coli aisladas, identificar fimbrias F4 y F5 con idéntica sensibilidad que la IHQ, sin embargo, en escasa cantidad al antígeno F41 y no fue posible la observación de F6. Al respecto, Moon y col. (1980) detectaron antígeno fimbrial F6 mediante IFI en íleon de cerdos infectados, no así por aglutinación. Francis (1983) y Evans y col. (1986) compararon el Test de Aglutinación con IFI, observando una menor sensibilidad en el primero, atribuyendo dicha diferencia a que ciertas cepas de E. coli son son incapaces de producir o sintetizar fimbrias bajo determinadas condiciones de cultivo, por otra parte, cuando estas se expresan, pueden ser bloqueadas por excesivo material capsular. Estos mismos autores indican que una ventaja del Test de Aglutinación es que puede emplearse en cultivos de tejidos o material fecal. De igual forma Fairbrother (1994), en un estudio de identificación de factores de virulencia en cepas de E. coli, utilizó IFI para pesquisar el antígeno F6 dado que es de difícil crecimiento en medios de cultivo, necesitando para su desarrollo de condiciones especiales, a diferencia de los antígenos F4 y F5 que se detectan fácilmente mediante aglutinación.

De acuerdo a lo obtenido en el presente estudio, se concluye que el método LSAB en tejidos embebidos en parafina así como la IFI en secciones obtenidas en crióstato, son efectivas para identificar antígenos fimbriales de E. coli, siendo posible su utilización como un método rápido de diagnóstico en cerdos lactantes con cuadro de colibacilosis y en estudios epidemiológicos de diarreas neonatales.

AGRADECIMIENTO

A la Dra. Evelyn Nistrom, del National Animal Disease Center, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Ames, Iowa, por colaboración con los anticuerpos primarios utilizados en el presente estudio. __________________________________________ * Proyecto FONDECYT 1951150

1 Laboratorio Sanderson S.A, Chile.

2 Laboratorio Chile, Chile.

3 Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile.

4 Anticuerpos Aglutinantes Fimbrex F4, F5, F6 y F41, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Inglaterra.

5 National Animal Disease Center, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Ames, Iowa.

6 Universal DAKOLSAB, Kit, Peroxidase (DAKOLSAB, Kit HRP).

BIBLIOGRAFIA

ARP, L. 1988. Bacterial Infection of Mucosal Surfaces: an Overview of Cellular and Molecular Mechanisms, Citado en: ROTH, J. 1988 Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. Am. Soc. Microb. Washington, D.C.

DUCHET-SUCHAUX, M., A.M. BERTIN, P.S. MENANTEAU. 1991. Susceptibility of chinese meishan and european large white pigs to enterotoxigenic Escherichia coli strains bearing colonization factor K88, 987P, K99 or F41. Am. J. Vet. Res. 52: 40-44.

ELIAS, J.M. 1990. Immunohistopathology. A Practical Approach to Diagnosis, ASCP Press. American Society of Clinical Pathologist, Chicago.

EVANS Jr., D.J., D.G. EVANS, H.L.DUPONT. 1979. Hemagglutation patterns of enterotoxigenic and enteropathogenic Escherichia coli determined with human, bovine, chicken and guinea pig erythrocytes in the presence and absence of mannose. Infect. Immun. 23: 336-346.

EVANS, M., G. WAXLER, J. NEWMAN. 1986. Prevalence of K88, K99, and 987p pili of Escherichia coli in neonatal pigs with enteric colibacillosis. Am. J. Vet. Res. 47: 2431-2434.

FAIRBROTHER, J. M. 1993. Les colibacilloses du porc. Ann. Méd. Vét. 137: 369-375.

FAIRBROTHER, J. M. 1994. Preweaning Escherichia coli diarrhea. Proccedings Am. Ass. Swine Pract. 254-256.

FRANCIS, D. 1983. Use of immunofluorescence, Gram's staining, histologic examination, and seroaglutination in the diagnosis of porcine colibacillosis. Am. J. Vet. Res. 44: 1884-1888.

GYLES, C. L. 1993. Escherichia coli. Citado por: GYLES, C. L., C. THOEN. Pathogenesis of bacterial infections in animals. 2nd. Ed.Iowa State University Press / AMES.

ISAACSON, R. E., B. NAGY, H. W. MOON. 1977. Colonization on porcine small intestine by Escherichia coli: Colonization and adhesion factors of pig. Enteropathogens that lack K88. J. Infec. Dis. 135: 531-539.

LUNA, L.G. 1968 Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3th. Ed. McGraw-Hill Book Company.

MACFADDIN, J.F. 1980. Biochemical Test for Identification of Medical Bacteria. 2nd. Ed. Waverly Press, Inc. Baltimore, U.S.A.

MAINIL, J., G. DAUBE, E. JACQUEMIN, A. KAECKENBEECK. 1995. Typage des Escherichia coli isolées de intestins de porcelets en Belgique au moyen de sondes génétiques: souches entérotoxinogènes, vérotoxinogènes ou entéropathogènes. Ann.Méd. Vét. 139: 5-13.

MOON, H., E. KOLER, R. SCHNEIDER. 1980. Prevalence of pilus antigens, enterotoxin types and enteropathogenicity among K88-negative enterotoxigenic E.coli fron neonatal pigs.. Infect Immun. 27: 222-230.

MORRIS, J. A., W. J. SOJKA, G. WELLS. 1982. K99 and 987P adhesins on Escherichia coli enteropathogenic for piglets. Vet. Rec. 111: 165-166.

MORRIS, J. A., C. J. THORNS, C. BOARER. 1985. Evaluation of a monoclonal antibody to the K99 fimbrial adhesin produced by Escherichia coli enterotoxigenic for calves, lambs and piglets. Res. Vet. Sc. 39: 75-79.

NAISH, S.J. 1989. Immunochemical Staining Methods. DAKO Corporation, Carpinteria, California.

NYSTROM, E. A. 1994. Colibacillosis in weaned pigs. Proceedings Am. Ass. Swine Pact. 257-258.

ROGERS, D. 1985. Application of the Peroxidase-Antiperoxidase technique for the detection of enterotoxigenic Escherichia coli K99 pilus antigen in paraffin-embedded tissues. J. Histochem. Cytochem, 33: 762-766.

ROITT, I., J. BROSTOFF, D. MALE. 1993. Inmunología, 3th Ed., Ed. Científicas y Técnicas, S. A. Masson-Salvat Med, España.

SEIGNOLE. D., M. MOURICOUT, Y. DUVAL-IFLAH, B. QUINTARD, R. JULIEN. 1991. Adhesion of K99 fimbriated Escherichia coli to pig intestinal epithelium: correlation of adhesive and non-adhesive phenotypes with the sialoglycolipid content. J. Gen. Microbiol. 137: 1591-160         [ ]

STERNBERGER, L. A. 1986. Inmunocytochemistry. 3rd Ed. John Wiley & Sons, New York.

SCHUDEL, A. 1985. Diarreas neonatales bovinas. Manual de técnicas para la caracterización de agentes infecciosos, pp. 75. FAO, Ofic. Reg. Am. Lat. Buenos Aires.

THORNS, C. J., C. D. BOARER, J. A. MORRIS. 1987. Production and evaluation of monoclonal antibodies directed against the K88 fimbrial adhesin produced by Escherichia coli enterotoxigenic for piglets, Res. Vet. Sc. 43 : 233-238.

THORNS, C. J., P. L. ROEDER. 1988. Use of a monoclonal antibody to detec the F41 fimbrial adhesin of enterotoxigenic Escherichia coli. Res. Vet. Sc. 44: 394-395.

WILSON, R., D.H. FRANCIS. 1986. Fimbriae and enterotoxins associated with Escherichia coli serogroups isolated from pigs with colibacillosis. Am. J. Vet. Res. 47: 213-217.

CANAL, A.M./1, M.V., M.Sc.; V. CUBILLOS G./2, M.V., PhD; J. ZAMORA/3, M.V.; G. REINHARDT/3, M.V., Dr.Med.Vet., E. PAREDES/2, M.V., Dr.med.vet.; R. IDEFONSO/2, M.V.; A ALBERDI/2, T.M.; P MACÍAS/3, T.M. 1.Patología Básica. Facultad de Agron. y Veterinaria de Esperanza, Universidad Nacional del Litoral, Argentina. 2.Instituto de Patología Animal, Fac. de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile. 3Instituto de Microbiología, Fac. de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.