Técnicas inmunohistoquímicas para la identificación de antígenos fimbriales de E. coli enteropatógeno

• Material y métodos
• Discusión
• Agradecimiento
• Bibliografía

RESUMEN: Con el propósito de evaluar dos técnicas inmunohistoquímicas (IHQ), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (LSAB) para la identificación de antígenos fimbriales de E. coli y su correlación con el Test de Aglutinación, se realizó una inoculación experimental con cepas enteropatógenas de E. coli que expresaban antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 en cerdos neonatos, los cuales no ingierieron calostro y se mantuvieron aislados de sus madres.

El antígeno F4 se distribuyó en duodeno, yeyuno e íleon, en cambio los antígenos F5, F6 y F41 se visualizaron en íleon y con menor frecuencia en yeyuno y duodeno. El Test de Aglutinación fue eficaz en la identificación de antígenos F4 y F5, no así para F6 y F41.

Los resultados del presente estudio demuestran que tanto LSAB en tejidos embebidos en parafina como IFI en secciones obtenidas en crióstato, son igualmente efectivas para identificar antígenos fimbriales de E. coli y pueden ser utilizadas como un método rápido de diagnóstico en cerdos lactantes con cuadro de colibacilosis y en estudios epidemiológicos de diarreas neonatales.

SUMMARY: A study to evaluate two Inmunohistochemistry (IHC) techniques (Indirect Immunoflourescense IFI and Streptavidina-Biotine-Peroxidase LSAB) to identify the antigen fimbrial of different enteropathogenic strains of E. coli was done, correlating the results with the Aglutination test.

Newborn piglets without calostrum were innoculated with enteropathogenic strains of E. coli which contained F4, F5, F6 and F41. Piglets were analysed to microbiologically isolate and identify the antigen fimbrial in the small intestine with IHC and Aglutination test.

The IHC techniques , identified F4 fimbriae was in the three intestinal segments ; However, the Ag F5, F6 and F41 were found in the ileon and jejunum with lesser frequency than in the duodenum. The aglutination test identified antigen F4 and F5 but was not able to identify F6 and F41.

These results suggest that IFI in cryostat-microtome sections and LSAB in paraffin embedded tissues, are effective and may be useful for a rapid analysis and for epidemiological studies of suckling pigs with diahrroea for E. coli .

Palabras claves: E. coli enteropatógeno, fimbrias, inmunohistoquímica, inoculación experimental, lechones.

Key words: Enteropathogenic E. coli, fimbriae, inmunohistochemical, experimental inoculation, suckling pigs.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad se considera a E. coli como el agente etiológico de mayor importancia en la presentación de cuadros diarreicos en cerdos lactantes. Entre los factores de virulencia que son los responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad, se encuentran las fimbrias o pili, necesarios para permitir la adhesión y colonización de cepas enteropatógenas (EPEC) y enterotoxigénicas (ETEC) de E. coli a las células epiteliales del intestino delgado del huésped, con posterior elaboración de toxinas en caso de ETEC, las que estimulan la secreción de fluídos con producción de diarrea (Fairbrother, 1994).

Las fimbrias corresponden a apéndices proteinaceos no flagelares, fibrilares, de 0,2 µm de largo por 2 – 7 nm de ancho, distribuidos en la superficie de la bacteria, pudiendo variar su número desde unos pocos a varios cientos. E. coli produce una o varias adhesinas fimbriales: I, CFAI, CFAII, K88, K99, 987P, Att 25 o FY, F41, F107, esta variedad de nomenclatura ha creado confusión, por lo que en la actualidad se denomina F1, F2, F3, F4, F5, F6, F17, F41, F107, respectivamente (Arp, 1988; Fairbrother, 1993; Nystrom, 1994), encontrándose en cuadros de diarrea neonatal en porcinos asociados con (ETEC), los antígenos fimbriales F4, F5, F6 y F41 (Mainil y col. 1995).

Entre los método más utilizados para realizar el diagnóstico de colibacilosis en cerdos lactantes, se encuentra el aislamiento bacteriológico de E. coli con posterior identificación de fimbrias y toxinas presentes, metodología que requiere de cierto período de tiempo para su realización y está sujeto además a las condiciones de cultivo. Sin embargo, en la actualidad, el diagnóstico se ha facilitado mediante la implementación de exámenes inmunohistoquímicos (IHQ), los que son rápidos, seguros y simples.

Dada la importancia que tienen las fimbrias como factor de virulencia de E. coli en la presentación de diarrea en cerdos lactantes, se realizó el presente estudio con el objetivo de implementar dos técnicas IHQ para la identificación y localización de fimbrias en los diferentes segmentos del intestino delgado, en cerdos neonatos que no recibieron calostro y quie fueron inoculados experimentalmente con diferentes cepas de E. coli. Además se compararon dichas técnicas con el Test de aglutinación, que se realizó con las cepas de E. coli que se aislaron por cultivo bacteriológico.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales de Experimentación: se utilizaron 25 lechoes neonatos separados de sus madres inmediatamente después del parto a fin de evitar la ingestión de calostro, contacto con la cerda y con el medio ambiente.

Cepas de E. coli Utilizadas: las cepas bacterianas utilizadas en la presente investigación (E. coli F4, F5, F6 y F41) forman parte del cepario del Instituto de Microbiología de la Facultad de Ciencias, de la Universidad Austral de Chile. Dichas cepas se desarrollaron en medio agar CFA (Colonization Factor Antigen) con el propósito de favorecer y estimular la producción de fimbrias siguiendo el procedimiento descrito por Evans y col. (1979).

Una vez comprobada la presencia de fimbrias en las cepas aisladas, por el método de aglutinación, se prepararon inóculos suspendiendo la cepa de E. coli en un tubo con solución buffer (108 – 109 bacterias/ml), de acuerdo al procedimiento descrito por McFarland's (Mac Faddin, 1980).

Grupos Experimentales: se constituyeron cinco grupos de 5 cerdos cada uno (cuadro 1), los cuales fueron mantenidos a 25-30ºC, durante 24 horas, alimentados con Glucosa al 5%/1 vía ora, siendo posteriormente eutanasiados con sobre dosis de pentobarbital sódico/2 vía intracardíaca. En los Grupos IV y V se descartaron dos cerditos, uno de cada grupo, por presentar marcada debilidad al momento de la inoculación.