Patogenicidad de una colección de cepas nativas de Metarhizium spp. y Beauveria spp. (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta de insectos

Para los ensayos de patogenicidad se utilizaron larvas de A. cervinus, y adultos de O. sulcatus y A. superciliosus. Las larvas de A. cervinus fueron colectadas desde un huerto de frambuesas (Rubus idaeus L.) de 4 años, ubicado en Parral, VIII Región, en los meses de enero y febrero de 1998. Los adultos de O. sulcatus fueron colectados en febrero de 1998 en un huerto de frambuesas de la localidad de San Pablo, Osorno, X Región. Adultos de A. superciliosus se colectaron en enero de 1999 desde un huerto de frambuesa ubicado en San Carlos, VIII Región.

Las larvas fueron mantenidas en cajas con tierra pasteurizada y raicillas de frambuesa desinfectadas. Los adultos fueron mantenidos en cajas con trozos de polietileno de baja densidad, y hojas y tallos de frambuesa lavados. Todos los individuos fueron mantenidos en una cámara a temperatura constante de 20ºC.

Origen del inóculo

Los aislamientos de Metarhizium y Beauveria provinieron de insectos muertos encontrados en terreno y de una colecta de suelos realizada a lo largo del país por el Programa de Control Biológico del CRI Quilamapu de INIA. Para las muestras de suelo se utilizó el método del cebado (Goettel e Inglis, 1997) con larvas de la polilla de la cera (Galleria melonella), las que fueron criadas en confinamiento y dieta artificial. Cinco larvas de último estadío fueron depositadas en el interior de tubos plásticos de 5 x 15 cm, junto con la muestra de suelo. Luego de 5 días las larvas se extrajeron e incubaron en cámara húmeda para el desarrollo de posibles entomopatógenos. Las estructuras fungosas que se desarrollaron sobre las larvas muertas fueron cultivadas en placas de Petri de 6 cm de diámetro, con agar papa dextrosa (APD, DIFCO) y repicadas hasta obtener un cultivo puro. Luego, cada aislamiento fue traspasado a tubo de ensayo con APD y conservado en frío (5°C), además se mantuvo una contramuestra en nitrógeno líquido (-196ºC).

La identificación de las cepas se realizó mediante observaciones macro y microscópicas de la morfometría de conidias y conidioforos. Estas mediciones fueron comparadas con claves dicotómicas (Barnett y Hunter, 1987; Samson et al., 1988; Humber, 1997) para la identificación de los géneros de hongos. Para la realización de este trabajo solo se utilizaron aislamientos identificados de Metarhizium y Beauveria, ya que otros géneros detectados solo fueron ocasionales. El origen de las cepas utilizadas para cada insecto se indica en los Cuadros 1, 2 y 3. La selección de cepas dependió de la oportunidad de contar con cultivos homogéneos y en fase de esporulación, al momento en que estuvo disponible en forma masiva la plaga a evaluar. Lo anterior significó que no siempre fue posible evaluar todos los aislamientos, sobre las tres especies de insectos.

Cuadro 1. Origen de las cepas, mortalidad, probabilidad de similitud con el testigo (c 2) y tiempo de esporulación en adultos de Aegorhinus superciliosus inoculados con distintas aislaciones de Metarhizium y Beauveria. Table 1. Aegorhinus superciliosus origin and adult mortality after inoculation with different Metarhizium y Beauveria isolates, goodness of fit probability (c 2) between each isolate and the control, and time to sporulation of dead insects.

1 S (n° de insectos muertos/(n° día x n° total de insectos)), calculado hasta 6 días después de la inoculación. 2 Probabilidad de c 2 para tabla de contingencia de 2×2 entre el testigo y el respectivo Indice de Mortalidad. 3 Indica el promedio de días entre mortalidad y esporulación. 4 Corresponde a praderas mixtas de gramíneas y tréboles de crecimiento espontáneo.

Cuadro 2. Origen de las cepas, mortalidad, probabilidad de similitud con el testigo (c 2) y tiempo de esporulación en larvas de Asynonychus cervinus inoculados con distintas aislaciones de Beauveria spp. Table 2. Asynonychus cervinus origin and larvae mortality after inoculation with different Beauveria isolates, goodness of fit probability (c 2) between each isolate and the control, and time to sporulation of dead insects.

1 S (n° de insectos muertos/(n° día x n° total de insectos)), calculado hasta 4 días después de inoculación. 2 Probabilidad de c 2 para tabla de contingencia de 2×2 entre el testigo y el respectivo Indice de Mortalidad. 3 Indica el promedio de días entre mortalidad y esporulación. 4 Corresponde a praderas mixtas de gramíneas y tréboles de crecimiento espontáneo. 5 Corresponde a praderas sembradas de mezclas de gramíneas y tréboles.

Cuadro 3. Origen de las cepas, mortalidad, probabilidad de similitud con el testigo (c 2) y tiempo de esporulación en adultos de Otiorhynchus sulcatus inoculados con distintas aislaciones de Metarhizium. Table 3. Otiorhynchus sulcatus origin and adult mortality after inoculation with different Metarhizium isolates, goodness of fit probability (c 2) between each isolate and the control, and time to sporulation of dead insects.

1 S (n° de insectos muertos/(n° día x n° total de insectos)), calculado hasta 15 días después de inoculación. 2 Probabilidad de c 2 para tabla de contingencia de 2×2 entre el testigo y el respectivo Indice de Mortalidad. 3 Indica el promedio de días entre mortalidad y esporulación. 4 Corresponde a praderas mixtas de gramíneas y tréboles de crecimiento espontáneo.

Pruebas de patogenicidad

Para obtener inóculo fresco para las pruebas de patogenicidad, se sembró cada aislamiento en placas Petri con APD y se incubó a 25°C por 20 días aproximadamente, hasta obtener el cubrimiento de la placa con micelio y conidias. Las conidias fueron aplicadas en seco sobre los insectos, utilizando para la inoculación de cada individuo, un trozo de 10 mm de diámetro de agar colonizado por el hongo. O. sulcatus fue inoculado con 24 aislamientos de Metarhizium originarios de la zona Sur y Centro-Sur de Chile; A. cervinus con 37 aislamientos de Beauveria de distintas zonas del país, y en A. superciliosus se evaluaron 10 aislamientos de Metarhizium y 9 de Beauveria. Las larvas inoculadas fueron mantenidas en placas con suelo pasteurizado y raíces de frambuesa desinfectadas, las que fueron cambiadas periódicamente, y los adultos en placas con hojas lavadas de frambuesa. Se evaluó cada 24 h la mortalidad de insectos y el momento de la aparición de signos del hongo.

El diseño experimental utilizado fue uno completamente al azar con 5 repeticiones por aislamiento, utilizando un insecto como unidad experimental. Los resultados obtenidos fueron comparados calculando el índice de mortalidad para cada aislamiento (IM), el que corresponde a la sumatoria del número de insectos muertos cada día (NI), dividido por el producto entre el número del día (ND) por el número total de individuos (NT), de acuerdo a la siguiente fórmula:

IM = å (NI/ (ND x NT))

Este índice buscó favorecer a los aislamientos que causaron mayor mortalidad en los primeros días postinoculación, de manera de aumentar la exigencia para elegir los aislamientos más agresivos. Los ensayos se evaluaron hasta el momento en que uno de los aislamientos logró el 100% de mortalidad de insectos. Todos los aislamientos fueron comparados a través de la prueba de c 2, evaluando la hipótesis de independencia de cada índice de mortalidad en relación al testigo, confrontados en tablas de contingencia de 2×2 (Gomez y Gomez, 1984).

RESULTADOS Y DISCUSION

Los aislamientos presentaron diferencias en patogenicidad, de acuerdo al test de c 2, para las diferentes plagas evaluadas. Para A. superciliosus, 17 de las 19 aislaciones aplicadas causaron mortalidad para esta especie, siendo M430 originaria de Osorno (X Región) y B306 del Valle de Chaca (I Región), las que presentaron mayor índice de mortalidad y fueron diferentes al testigo a P£ 0,05. El testigo y los aislamientos M146 y B73 no presentaron mortalidad mientras duró el ensayo (Cuadro 1 y Figura 1). Luego de algunos días de incubación en cámara húmeda, se observó emisión de micelio y posteriormente de esporas en las zonas menos esclerosadas del tegumento del insecto, lo que coincide con lo citado por otros autores (Alves y Pereira, 1998).

Figura 1. Mortalidad de adultos de Aegorhinus superciliosus inoculados con distintas aislamientos de Metarhizium spp. y Beauveria spp. Figure 1. Aegorhinus superciliosus adult mortality after inoculation with different Metarhizium and Beauveria spp. isolates.

En el caso de A. cervinus, de los 36 aislamientos de Beauveria evaluados, sólo 24 causaron mortalidad a esta plaga a los tres días de inoculación, en tanto los 12 aislamientos restantes no provocaron mortalidad de larvas, al igual que el testigo (Figura 2). Con el aislamiento B179, originario de Pumanzano, Chiloé (X Región), se alcanzó el mayor índice de mortalidad y fue estadísticamente diferente al testigo a P = 0,031 (Cuadro 2). Las larvas muertas por Beauveria adquirieron una consistencia dura en un principio, para luego de dos días de incubación observarse los primeros signos del hongo, que correspondieron a micelio blanquecino que paulatinamente quedó cubierto de esporas blancas.

Figura 2. Mortalidad de Asynonychus cervinus inoculados con distintas aislamientos de Beauveria spp. Figure 2. Asynonychus cervinus larvae mortality after inoculation with different Beauveria spp. isolates.

En O. sulcatus, de los 24 aislamientos de Metarhizium evaluados, 15 causaron mortalidad y 9 aislamientos más el testigo fueron inocuos mientras duró el ensayo (Figura 3). El aislamiento M151b (Río Chamiza, X Región) produjo un 100% de mortalidad y fue diferente al testigo a P = 0,045 (Cuadro 3). Además, M151b produjo una rápida emisión de esporas sobre el cuerpo del insecto, lo que es importante para su posterior diseminación en terreno (Dr. D. Moore, 1998, comunicación personal). El bajo número de aislamientos que resultaron estadísticamente diferentes al testigo se debe al exigente índice de mortalidad, el cual favorece los aislamientos que provocan alta mortalidad los primeros días de postinoculación. La finalidad de este índice fue obtener el mejor aislamiento para futuras pruebas de dosificación y eficacia, sin embargo, se debe tener presente que también existieron otros aislamientos patogénicos a las diferentes plagas evaluadas, pero que resultaron mas lentos en causar enfermedad en los insectos.

Figura 3. Mortalidad de adultos de Otiorhynchus sulcatus inoculados con distintos aislamientos de Metarhizium spp. Figure 3. Otiorhynchus sulcatus adult mortality after inoculation with different Metarhizium spp. isolates.

Es importante destacar que los aislamientos que resultaron patogénicos para alguna especie, no siempre causaron mortalidad en otra plaga, lo que nos permite sugerir la existencia de especificidad en las distintas cepas, justificando la realización de pruebas preliminares y prospecciones en busca del aislamiento más efectivo para determinada plaga. La especificidad es una de las características de los hongos entomopatógenos, la cual es citada como una ventaja al no dañar organismos benéficos, o desventaja cuando existen mezclas de especies plagas en el cultivo (Glare, 1992; Tanada y Kaya, 1993; Alves, 1998). Esta característica es causada por variabilidad en cuanto a la capacidad de adherencia y/o penetración de la conidia en el integumento, además de su actividad toxicogénica (Vey et al., 1982). La primera barrera que opone el insecto a la penetración del patógeno es la cutícula, la cual difiere marcadamente entre el estadío larval o el adulto, por lo cual no necesariamente un buen aislamiento de entomopatógeno para adulto va a ser igualmente efectivo para la larva. Este diferencia deberá tenerse presente en las futuras evaluaciones de susceptibilidad de especies de insecto.

También llamó la atención la susceptibilidad de las diferentes plagas evaluadas a aislamientos geográficamente separados. Por ejemplo, en el caso de A. superciliosus, los dos aislamientos más patogénicos fueron de Osorno (X región) y Valle de Chaca (I región), ambas localidades separadas aproximadamente por 3.000 km. La especificidad de las cepas puede estar dada por adaptaciones patológicas al compartir el mismo nicho o, por el contrario, no haber compartido nunca el mismo ambiente (Ferron, 1978; Tanada y Kaya, 1993). Lo anterior podría explicar la alta patogenicidad de cepas geográficamente aisladas. Por otro lado, ambos géneros poseen un amplio rango de hospederos, lo cual explica que estos hongos se encontraran en ambientes tan disimiles, como son las muestras del Lago Chungará, ubicado en la I Región (B294), y el aislamiento de Futalelfú en la X Región (M142).

Tanto Beauveria como Metarhizium pertenecen a la clase Hyphomycetes, dentro de la división Deuteromycotina, la cual se caracteriza por producir sus conidias libres, en lugar de estar encerradas dentro de un cuerpo fructífero. Esto permite que las esporas queden inmediatamente disponibles para repetir el ciclo a partir de los insectos parasitados. Además, los Hyphomycetes son más productivos, de ciclos más cortos y relativamente fáciles de producir en forma masiva, por lo cual no es casualidad que estos dos géneros sean los más frecuentemente citados y utilizados en patología de insectos (Ferron, 1978; Glare, 1992; Tanada y Kaya, 1993; Shah, et al., 1997; Alves, 1998).

A pesar que se han detectado con anterioridad este tipo de hongos en Chile (Dutky, 1957; Vásquez, 1977; France, et al., 1998; Guerrero y Carrillo, 1998) y se han realizado pruebas de patogenicidad, no ha existido hasta la fecha una prospección sistemática. Los antecedentes de uso de hongos entomopatógenos en Chile muestran resultados no siempre satisfactorios, debido principalmente a que las cepas utilizadas fueron colectadas en otros países o no se realizó una selección previa con varios aislamientos (Dutky, 1957; Ripa y Rodríguez, 1989).

El desarrollo de este tipo de control biológico ofrece una alternativa más de control de plagas, especialmente para el caso de los escarabeidos, los que han sido considerados como las plagas del futuro (Jackson, 1992). A diferencia de otras familias de insectos, relativamente pocas especies de hongos son patogénicas a Escarabeidae, ya que éstos han desarrollado métodos efectivos para contrarrestar a los entomopatógenos que habitan en el suelo (Glare, 1992; Tanada y Kaya, 1993). Sin embargo, los resultados de este trabajo incentivan la búsqueda de nuevos hongos entomopatógenos en Chile, de manera de encontrar nuevos y mejores aislamientos para el control de estas plagas.

CONCLUSIONES

De los resultados obtenidos se concluye que existen aislamientos nativos de los hongos Beauveria y Metarhizium con actividad patogénica a Aegorhinus superciliosus, Asynonychus cervinus y Otiorhynchus sulcatus. Además, estos hongos muestran especificidad para las distintas especies de insectos, lo que obliga a realizar pruebas de patogenicidad con numerosas cepas, antes de seleccionar la más agresiva. En laboratorio, los mejores aislamientos muestran un alto potencial de control de los insectos evaluados, sin embargo se requiere evaluar su efectividad en terreno.

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