Linfocitos TCD4 señuelo como tratamiento a la infección por VIH (página 2)

El objetivo de la terapia antirretroviral durante la infección aguda por HIV-1 es reducir el número de células infectadas, preservar la respuesta inmune específica para HIV-1 y de ser posible, reducir el punto de equilibrio viral a largo plazo. En diversos estudios recientes se ha mostrado que el tratamiento de la infección aguda por HIV-1 permite la supresión viral a largo plazo, conlleva a la preservación y al incremento de las respuestas de células T de ayuda específicas para HIV-1 y permite la conservación de una población viral muy homogénea.

Los primeros estudios piloto en pacientes que recibieron tratamiento durante la infección aguda por HIV-1 y que posteriormente se sometieron a interrupciones estructuradas del tratamiento, muestran que la respuesta inmune contra HIV-1 podría estimularse [Rosenberg 2000]. La mayoría de los pacientes pudieron suspender la terapia posteriormente y presentaron al menos un control temporal de la replicación viral, con puntos de equilibrio viral que en algunos pacientes se mantuvieron por debajo de 5,000 copias/ml durante más de 3 años.

Sin embargo, en la mayoría de los individuos en este estudio [Kaufmann 2004], así como en otros

estudios que evaluaron el control viral después del tratamiento de la infección primaria [Markowitz 1999], hubo rebote de la carga viral durante el seguimiento a largo plazo, lo que requirió del inicio de la terapia.

Revisión de agentes antirretrovirales

En la actualidad se encuentran disponibles cuatro clases de agentes antirretrovirales para el tratamiento de la infección por HIV: análogos de nucleósidos y nucleótidos (NRTIs), inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (NNRTIs), inhibidores de proteasa (PIs) e inhibidores de fusión, con T-20 como

prototipo. Más de 20 fármacos han sido aprobados para utilizarse, incluso fórmulas de agentes antirretrovirales, tanto individuales como combinados .

Una serie de otros fármacos y de nuevas clases de éstos están casi terminados y se espera que se aprueben en unos cuantos años. La investigación también se enfoca en estrategias inmunomoduladoras, con vacunas o citocinas (interferones, interleucinas).

Tabla 2.1: Agentes antirretrovirales (1)

Inhibidores de la Transcriptasa Inversa Análogos de Nucleósidos y

Nucleótidos (NRTIs)

Nombre comercial                  Abreviación                Fármaco         Fabricante

Combivir.                                      CBV                         AZT+3TC               GSK

Emtriva.                                        FTC                        Emtricitabina        Gilead

Epivir.                                       3TC 3TC,                     lamivudina              GSK

Hivid.                                       ddC ddC,                     zalcitabina           Roche

Retrovir.                                    AZT AZT,                     zidovudina              GSK

Trizivir.                                          TZV                         AZT+3TC+ABC       GSK

Truvada.                                   FTC+TDF                                                 Gilead

Videx.                                         ddI ddI,                      didanosina             BMS

Viread.                                           TDF                       Tenofovir               Gilead

Zerit.                                        d4T D4T,                       estavudina            BMS

Ziagen.                                         ABC                         Abacavir               GSK

Inhibidores de la Transcriptasa Inversa no Análogos de Nucleósidos

(NNRTIs)

Rescriptor.                                   DLV                         Delavirdina           Pfizer

Sustiva.                                        EFV                         Efavirenz               BMS

Viramune.                                    NVP                        Nevirapina         Boehringer Ingelheim

Inhibidores de la Proteasa (PIs)

Agenerase.                                  APV                          Amprenavir             GSK

Crixivan.                                       IDV                          Indinavir                 MSD

Fortovase.                                SQV-FTV                      Saquinavir              Roche

Invirase.                                   SQV-INV                      Saquinavir             Roche

Inhibidores de Fusión

Fuzeon.                                   T-20                             Enfuvirtide             Roche

(1)

Perspectivas en el tratamiento

Los medicamentos que actúan en la fusión de VIH con la membrana celular constituirían otro de los hitos en la obtención de productos medicamentosos para seres humanos. Los investigadores descubrieron fortuitamente que los péptidos que correspondían a las secuencias breves de gp41 inhibían la penetración de VIH en las células (Jiang y col. 1993; Wild y col. 1994)

Los péptidos en cuestión rompen la interacción de las secuencias n36 y c34 de la glucoproteina gp41. Uno de los peptidops de 36 aminoacidos conocido como T20 se liga al surco hidrófobo de la espiral enrollada N36 que bloquea eficazmente la penetración de VIH-1 en la celulas que este invade de preferencia.

La resistencia a T20 surgio por mutaciones en gp41 (Rimsky y col. 1998).

Células Señuelo:

Este nombre lo utilizó inicialmente, desde los cincuenta, un histotecnólogo que trabajaba con el Profesor Leopold Koss: Andrew Ricci, quien llamaba así a células con cambios nucleares reactivos que hacían confundir con células malignas (de allí "células trampa"). En la primera edición del libro de citopatología del Dr. Koss, en 1968, antes de clasificarse el virus, ya él postulaba que muchas de estas alteraciones podrían deberse a una infección viral (Koss LG. Diagnostic Cytology and its Histopathologic Bases. 2º ed. Philadelphia, JB Lippincott, 1968). Actualmente la denominación "decoy cells" se utiliza exclusivamente para designar a las células con inclusiones características del PV en la orina.

Células señuelo como tratamiento:

Un equipo de científicos aragoneses dirigidos por el Dr. Alejandro Tres trabaja desde enero de 2007 en un proyecto que consiste en atacar al enemigo desde dentro, y que ellos mismos han dado en definir como un "Caballo de Troya" para el cáncer. Estas células son cargadas magnéticamente y se espera sean atraídas por el tumor para luego por medio de resonancia generar calor dentro de ellas y destruir las células neoplásicas.

Antecedentes de su uso en tratamiento para el VIH:

No fue posible encontrar referencias a investigaciones con el mismo blanco de tratamiento ni utilizando células humanas modificadas para inhibir la reproducción vírica.

MARCO DE REFERENCIA

1.- Manual de avances en el tratamiento VIH :

Gustavo Reyes-Terán

HIV Medicine, 2006 – EurasiaHealth, 831 pp;

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

¿Puede el uso de linfocitos T CD4 señuelos ser el tratamiento resolutivo para infección por VIH y sus manifestaciones clínicas?

JUSTIFICACIÓN.

El VIH y su manifestación clínica el SIDA ha sido considerada la enfermedad del siglo por su alta incidencia y mortalidad. Cerca de 40 millones de personas se encontraban infectadas al final del año 2004 y se espera que para el año 2020 la cifra aumete a 70 millones (2)

Aunque existen más de dos docenas de productos diferentes actualmente, disponibles para el tratamiento de la infección por HIV, hay una creciente necesidad de fármacos nuevos. Esto es cierto no sólo para los pacientes con virus multirresistentes que están esperando nuevas opciones de tratamiento.

Se anticipan problemas significativos, relacionados con una toxicidad a largo plazo y con la adherencia, con las terapias que posiblemente necesistarán prolongarse durante décadas enteras, puesto que la erradicación del HIV no es posible en la actualidad.

Como resultado, hay una necesidad urgente de fármacos nuevos que sean más fáciles de tomar, que tengan elevadas barreras genéticas contra el desarrollo de resistencia y sobre todo, que sean menos tóxicos. Los fármacos nuevos deben ser más potentes que aquéllos disponibles hoy en día, para poder alcanzar finalmente la meta de la erradicación.

Este estudio supone la creación de un tratamiento de bajo costo y fácil fabricación, con pocos o sin efectos secundarios que mejorara la calidad de vida de cerca de 40 millones de personas y que supondrá un ahorro para estas de casi 20 mil millones de dólares al año (3).

OBJETIVO

1.- Determinar la doxiciclina ejerce una inhibición en la síntesis de proteínas sobre linfocitos T CD4 humanos.

2.- Determinar si el efecto de inhibición de la síntesis de proteínas de la doxiciclina sobre Linfocitos T CD4 es permanente o transitorio.

3.- Conocer el efecto de la doxiciclina sobre los receptores y sobre la membrana de Linfocitos T.

2.- Determinar si el uso de Linfocitos T CD4 señuelo puede resolver la infección por VIH en humanos.

HIPÓTESIS.

Los linfocitos T señuelo serán linfocitos estructuralmente igual al de cualquier linfocito no infectado en un paciente con VIH pero sin la capacidad de sintetizar cualquier proteína lo que evitara que estas células puedan participar en la replicación de los virones.

Los virones serán incapaces de diferenciar aquellos linfocitos sin capacidad replicativa de aquellos que si la poseen y fundirán sus membranas indiscriminadamente, la carga genetica de aquellos virones que entren en contacto con linfocitos T señuelo quedara inutilizable dentro del linfocito T señuelo.

Los linfocitos T señuelo serán capaces de recibir tantos virones de VIH como cualquier otro linfocito sano, habrá mas cantidad de linfocitos T señuelo en el plasma del paciente por lo que las probabilidades de que el viron quede inutilizado será mayor de que encuentre a un linfocito con capacidad replicativa, lo que reducirá la carga viral y a la larga la eliminará.

La doxiciclina es un medicamento antimicrobiano que actúa inhibiendo la transpeptidacion en las células bacterianas, el efecto adverso mas común en grandes dosis es su acción de inhibición de transpeptidacion sobre las células humanas.

En este estudio se pretende utilizar el efecto secundario de la doxiciclina en grandes dosis para inhibir de forma permanente la transpetidacion en linfocitos t in vitro.

DISEÑO

10. 1. Se estudiaran 75 cultivos de linfocitos T CD4 humanos obtenidos mediante citometria de flujo y cultivados en medio Eagle

            Se hará un estudio comparativo con cultivos controles sin doxiciclina ni carga viral.

10.2. El estudio será abierto en esta fase de la investigación.

a)       10.3. El investigador tendra una influencia experimental en esta fase.

10.4. Tiempo en que suceden los eventos.

Prospectivo. los datos obtenidos serán de eventos que se presenten en el futuro

10.5. Relación que guardan entre sí los datos.

b) Longitudinal. los datos se obtienen del mismo sujeto en más de una ocasión y se relacionan entre si

MATERIALES Y MéTODO

11.1. Las muestras de linfocitos T CD 4 serán obtenidas de individuos sanos.

Las muestras virales se obtendran de pacientes VIH (Virus de la inmunodeficiencia humana) positivos y con diagnostico de SIDA (Síndrome de inmunodeficiencia adquirida) causada por este virus.

11.4. Definición de variables

11.5. Descripción de procedimientos.

SEPARACIÓN DE LINFOCITOS T

1.1)    Separación de mononucleares en sangre.

MATERIALES

-Tubos de plástico de centrífuga de 15 ml.

-Pipetas Pasteur de distintos tamaños.

-Centrífuga

-Pipetas automáticas de distintos tamaños.

-Cámara de Neubauer.

-Cubreobjetos.

-Microscópio óptico.

-Ficoll-Histopaquededensidad 1.078.

-Ficoll-Histopaque de densidad 1.119.

-Tampón fosfato PBS.

PROCEDIMIENTO

En un tubo cónico de centrífuga, de 15 mililitros, se depositan los dos gradientes de Ficoll-Histopaque de densidades diferentes, una que se coloca primero de densidad 1.119 y otra que se coloca lentamente sobre la anterior, de densidad 1.078.

Sobre estos dos colchones de Ficoll-Histopaque de 3 ml de volumen cada uno, se añaden muy suavemente otros 5 ml de sangre diluida 1:1 en PBS, que ha sido obtenida estérilmente por  venopunción en tubos que contienen heparina litio como anticoagulante. La sangre diluida se deja resbalar por las paredes del tubo para que se deposite sobre el gradiente de Ficoll de densidad 1.078.

Los tubos se centrifugan a 2.500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación se observan dos halos opacos en la interfase: el superior correspondiente a las células mononucleares y el inferior a las polinucleares. Ambos halos se recogen por separado y se lavan las células tres veces con PBS.

Los botones celulares resultantes se resuspenden en 1 ml o más de PBS cada uno, según el tamaño del botón, se cogen 50 microlitros de cada muestra, con pipeta de precisión tipo Hamilton, y se extiende en cámaras de Neubauer separadas para su contaje en microscópio.

La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de cristal en forma de porta, cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 01 mm con respecto a la central, y en esta última hay grabado un retículo cuadrangular. La banda central puede estar, a su vez, subdividida en dos semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retículo idéntico.

1.2) Separación de linfocitos T de linfocitos B

UNI-SORB (Referencia U-01) 

Columna en lana de nilón lista para su uso, para la preparación de fracciones enriquecidas en linfocitos T y linfocitos B a partir de preparación de linfocitos totales.

PROCEDIMIENTO DE SEPARACIÓN

1. Quitar el tapón protector del grifo.

2. Sujetar la columna volcada y abrir el grifo. Levantar la tira de la cápsula metálica en la parte superior de la columna.

3. Inyectar lentamente a través del tapón de caucho rosa (debajo de la cápsula metálica), la cantidad suficiente de una solución al 5% de Suero Bovino Fetal en el PBS para cubrir enteramente la malla de nilón 1 x 10 ml. Volcar la columna para permitir al medio de cultivo en exceso fluirse y a las burbujas de aire evacuarse.

4. Preparar los linfocitos para la centrifugación por gradiente de densidad (referencia UNI-SEP con LYMPHOPREP)

5. Obtener una suspensión de 108 células en 2 ml de solución de Suero Bovino Fetal en el PBS.

6. Volcar la columna e inyectar lentamente la suspensión de células a través del tapón rosa, grifo abierto.

7. Cerrar el grifo y dejar incubar la columna durante 60 minutos a temperatura ambiente.

8. Quitar el tapón de aluminio y el tapón de caucho de la parte superior.

9. Abrir el grifo y colectar el eluyente. Lavar la malla de nilón con medio de cultivo (2 x 10 ml) para quitar totalmente las células no adherentes.

10. Para recoger las células B, llenar la columna con medio de cultivo (10 ml) y comprime la malla con el pistón (recomendamos el pistón de una jeringuilla de uso único de 5 ml de 13 mm de diámetro)

11. Centrifuga las células colectadas y retirar el sobrenadante. Resuspender el culote de células con 10 ml de medio de cultivo adecuado.

Obtención de los cultivos

Añada un Diagrama de flujo. Describa el desarrollo de la investigación y todos los procedimientos con que obtendrá sus datos, quién y cómo los realizará. Ejem: cuestionarios, técnicas quirúrgicas y/o de laboratorio, análisis de expedientes, etc., de tal forma que cualquier investigador pudiera realizar la investigación

11.6. Hoja de captura de datos.

Diseñe una hoja de vaciado de datos donde se registren todas las variables y  parámetros de medición.

11.7. Calendario.

1.- Revisión bibliográfica indique el tiempo que invertirá mes(es)

2.- Elaboración del protocolo: indique el tiempo que invertirá mes(es)

3.- Obtención de la información. indique el tiempo que invertirá mes(es)

4.- Procesamiento y análisis de los datos. indique el tiempo que invertirá mes(es)

S.- Elaboración del informe técnico final. indique el tiempo que invertirá mes(es)

6.- Divulgación de los resultados. indique el tiempo que invertirá mes(es)

Fecha de inicio: indique la fecha de inicio considerando desde la investigación bibliográfica. Fecha de terminación: indique la fecha de terminación (agregue los meses de cada actividad a la fecha de inicio)

11.8. Recursos.

1 1.8. 1. Recursos Humanos.

Investigador: Nombre del investigador principal

Actividad actividad asignada 

Número de horas por semana número de horas por semana que dedicará a la investigación.

Investigador: Nombre del investigador responsable

Actividad actividad asignada 

Número de horas por semana número de horas por semana que dedicará a la investigación.

Investigador: Nombre del investigador(es) asociado(s)

Actividad actividad asignada  

Número de horas por semana número de horas por semana que dedicará(n) a la investigación.

11.8.2. Recursos materiales.

Los recursos que se requiere adquirir son:

Liste el material que se requerirá en la investigación.

Detalle descripción, costo y proveedor

1.8.3. Recursos financieros.

(Atención, si contempla financiamiento de la industria farmacéutica, es obligatorio hacer una cita en la Dirección de Investigación para la realización del convenio correspondiente)

Desglose la cantidad erogada para cada uno de los siguientes rubros:

*Sueldo a mayo 2004

(1) Número de horas a la semana que dedica al protocolo

(2) Número de semanas que durará el protocolo

Los recursos se obtendrán de:

Indique la fuente de obtención y monto de los recursos económicos

VALIDACIÓN  DE DATOS

 (Seleccione las opciones)

I) Se utilizará estadística descriptiva: medidas de tendencia central y dispersión: rango, media, mediana, moda, desviación estándar, proporciones o porcentajes.

II) Por tener dos o más muestras, se utilizará estadística inferencial.

Pare el (los) parámetro(s) principal(es): Indique el parámetro que considerará para llegar a la conclusión

a) escala nominal. Prueba de Chi cuadrada

b) escala ordinal. Prueba de Chi cuadrada

c) escala de intervalo: Prueba de homogeneidad de Varianza; si ésta demuestra homogeneidad, entonces T de Student  o Análisis de Varianza; si no hay homogeneidad de varianza se usará estadística no paramétrica. El nivel de significancia para rechazar la hipótesis nula (Ho) será de p<0.05.

III) Por involucrar pruebas diagnósticas, se determinará: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo.

IV) Por medir asociación, se utilizará: Análisis de Correlación lineal, Coeficiente de correlación de Spearman, otras.

V)  Para casos y controles: se medirá fuerza de asociación, razón de Momios y Chi-cuadrada de Mantel-Haenszel.

VI) Otra(s) prueba(s) estadística(s)

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

Se usarán tablas y/o gráficas (pastel, barras, histogramas, líneas, puntos).

CONSIDERACIONES éTICAS.

"Todos los procedimientos estarán de acuerdo con lo estipulado en el Reglamento de la ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud.

Seleccione de los siguientes enunciados el que mejor se ajuste a su estudio, una vez confirmado por su asesor borre los demás y este párrafo:

Título segundo, capítulo I, Artículo 17, Sección I, investigación sin riesgo, no requiere consentimiento informado.

Título segundo, capítulo I, Artículo 17, Sección II, investigación con riesgo mínimo, se anexa hoja de consentimiento informado

Título segundo, capítulo I, Artículo 17, Sección III, investigación con riesgo mayor al mínimo, se anexa hoja de consentimiento informado.

Título Segundo, Capítulo II. De la investigación en comunidades

Artículos 28-33

Título Segundo, Capítulo III De la investigación en menores de edad o incapaces, Artículos 34-39

Título segundo, Capítulo IV De la investigación en mujeres en edad fértil, embarazadas, durante el trabajo de parto, puerperio, lactancia, recién nacidos; de la utilización de embriones, óbitos y fetos y de la fertilización asistida, Artículos 40-56

Título segundo, Capítulo V De la investigación en grupos subordinados. Artículo 57. Estudiantes, trabajadores de laboratorios y hospitales, empleados y otros. Artículo 58. Cuando se realice en estos grupos, en la Comisión de ética deberá participar un o más representantes de la población en estudio capaz de representar los valores morales, culturales y sociales y vigilar:

I.                     que la negación a participar no afecte su situación escolar, o laboral.

II.                   Que los resultados no sean utilizados en perjuicio de los participantes

III.                  Que la institución o patrocinadores se responsabilicen del tratamiento y en su caso de indemnización por las consecuencias de la investigación.

Título segundo, Capítulo VI De la investigación en órganos, tejidos y sus derivados, productos y cadáveres de seres humanos artículos 59 (obtención, conservación, utilización preparación suministro y destino final.) y 60 (además del debido respeto al cadáver humano, la observación del título decimocuarto en cuanto a la materia de control sanitario de la disposición de órganos, tejidos y cadáveres de seres humanos.)

Titulo tercero. De la investigación de nuevos recursos profilácticos, de diagnóstico, terapéuticos y de rehabilitación. Capítulo I Artículos 61-64

Cuando se realice investigación en seres humanos sobre nuevos (o se modifiquen) recursos profilácticos, dx, terapéuticos o rehabilitación, además deberán solicitar autorización de la Secretaría presentando documentación requerida (ver Ley)

Titulo tercero Capítulo II De la investigación farmacológica, Artículos 65-71

Título séptimo. De la investigación que incluya la utilización de animales de experimentación. Capítulo único. Artículos 121-126

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Goodman y Gilman, Las bases Farmacológicas de la terapeutica, 10° Ed. 2004, 1367: 1390

(1) Christian Hoffmann, Jürgen Rockstroh, and Bernd Sebastian Kamps (Editors)

Flying Publisher 2006 825 pp

(2) 2006 AIDS epidemic update : December 2006 (UNAIDS/WHO, November 2006)

Autor:

Rafael Antonio Calderón Cortés

Facultad de Medicina Unidad Torreón de la Universidad Autónoma de Coahuila

México

Enero – Marzo de 2006